Name: Obrazowanie przyżyciowe węzła chłonnego podkolanowego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy, umożliwiającą obserwację migracji komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala na szczegółowe badanie dynamiki odpowiedzi immunologicznej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana z grantów NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick's Foundation, Dana Foundation, Gabrielle's Angel Foundation oraz programu „Hope-on-Wheels” firmy Hyundai Motors of America.

1. Montaż uchwytu dla myszy
<ol>
	<li>Nałóż pokrywkę szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm na odwróconą do dołu plastikową pokrywkę szalki Petriego o średnicy 100 mm. Szkło powinno ledwo dotykać środka plastikowej szalki. Używając szklanej pokrywki jako szablonu, odrysuj jej kształt na plastikowej pokrywce.</li>
	<li>Za pomocą wiertarki ręcznej (np. Dremel) usuń część plastikowej pokrywki szalki o średnicy 100 mm, aby utworzyć platformę w kształcie półksiężyca. Ta plastikowa pokrywka w kształcie półksiężyca będzie służyć jako podparcie dla górnej części tułowia myszy (Rycina 1a). Wywierć dwa otwory w pokrywce w kształcie półksiężyca, aby przymocować maskę gazową za pomocą metalowej opaski skręcanej. Przymocuj plastikową pokrywkę do krawędzi szklanej szalki Petriego, używając superglue lub równoważnego silnego kleju (Rycina 1b).</li>
	<li>Przyklej pokrywki dwóch probówek PCR z kopułkowym zamknięciem (odcięte w miejscu zawiasu) w odstępach 1 cm do środka dolnej szalki w celu zakotwiczenia płatów skóry podkolanowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy
Uwaga: Przy odpowiedniej wprawie przygotowanie myszy i kroki chirurgiczne powinny zająć od 20 do 30 minut.
<ol>
	<li>Zanurzyć mysz w narkozie za pomocą izofluranu (2 do 2,5% w fazie indukcji, 1,5 do 2% podczas operacji/obrazowania) domieszanego w stosunku 1:1 w mieszaninę O2 : powietrze przy przepływie 1L/min, stosując procedurę zatwierdzoną przez IACUC. Po znieczuleniu myszy zabezpieczyć maskę gazową na nosie za pomocą taśmy. Potwierdzić pełne znieczulenie myszy poprzez brak reakcji na uciśnięcia palców stopy i/lub ogona. Poziom izofluranu można odpowiednio dostosować, aby zapewnić pełną sedację zwierzęcia przy stabilnej, nieutrudnionej częstości oddechów w zakresie 60-80 oddechów/min.</li>
	<li>Użyć elektrycznego trymera do usunięcia sierści z prawej tylnej łapy i okolicy pachwinowej myszy.</li>
	<li>Omiotły luźną sierść i za pomocą patyczka kosmetycznego delikatnie nanieść niewielką warstwę kremu Nair na ogoloną okolicę. Po jednej minucie od pierwszej aplikacji usunąć preparat Nair i oczyścić odsłoniętą skórę wilgotnym ręcznikiem papierowym. Przed kontynuacją upewnić się, że mysz jest czysta i sucha.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonać niewielkie nacięcie o długości 2 do 3 mm w okolicy prawego kolana, aby odsłonić ścięgno prostownika.</li>
	<li>Nanieść klej Vetbond wzdłuż środka uchwytu do myszy, w miejscu, gdzie znajdować się będzie ciało i łapa zwierzęcia. Ostrożnie przymocować mysz do uchwytu, kierując prawe kolano w dół, aby odsłonić prawy dół podkolanowy. Zabezpieczyć ścięgno prawego kolana klejem Vetbond pomiędzy dwoma uchwytami do płatów skóry, aby pomóc w stabilizacji pola obrazowania.</li>
	<li>Wyprostować i przymocować taśmą przednie łapy oraz lewą tylną łapę do górnej platformy uchwytu.</li>
	<li>Użyć opaski zaciskowej, aby unieruchomić maskę gazową na miejscu.</li>
	<li>Umieścić uchwyt pod mikroskopem sekcyjnym. Węzeł chłonny (LN) musi pozostawać całkowicie nieruchomy, niezależnie od ruchów oddechowych myszy. Dlatego podczas przeprowadzania operacji należy podjąć środki ostrożności w celu zoptymalizowania stabilności łapy. Ustalić położenie ogona (zazwyczaj nad głową), które zapewni największą stabilność prawej łapy, a następnie przymocować ogon taśmą.</li>
</ol>
3. Operacja
<ol>
	<li>Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym należy utrzymywać temperaturę ciała myszy za pomocą grzejnika przestrzennego lub mata grzewczego. Dla skutecznego obrazowania węzła chłonnego podkolanowego kluczowe jest zachowanie odpowiedniej temperatury ciała przez cały czas trwania zabiegu, a także utrzymanie wilgotności tkanki poprzez stałe nakładanie ciepłego PBS na odsłoniętą tkankę.</li>
	<li>Skórę należy wysterylizować Betadynem. Używając sterylnych nożyczek, należy wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry w połowie prawej łydki, a następnie kontynuować cięcie pionowo w górę, aż do górnej części prawego uda.</li>
	<li>Na górze linii nacięcia pionowego należy wykonać dwa poziome nacięcia skóry, aby stworzyć płaty skórne po obu stronach.</li>
	<li>Oba płaty skórne należy odsunąć i przykleić za pomocą Vetbond. Napięcie skóry przed nałożeniem Vetbond dodatkowo poprawi stabilność nogi; należy jednak upewnić się, że napięcie skóry nie blokuje przepływu krwi (np. zmiany koloru lub średnicy naczynia). Należy kontynuować przyklejanie innych obszarów skóry, aby zapewnić stabilność nogi przed odsłonięciem węzła chłonnego. Wielkość myszy określi, ile dodatkowej skóry należy przykleić. Zazwyczaj większe myszy wymagają przyklejenia większej powierzchni skóry do uchwytu.</li>
	<li>Węzeł chłonny powinien znajdować się w dole podkolanowym, po prawej lub lewej stronie żyły podkolanowej, w zależności od ułożenia myszy w uchwycie. Należy ostrożnie oddzielić węzeł chłonny od otaczających go tkanek tłuszczowych i mięśni, używając mikropincet i kleszczyków do mikrodissekcji. Aby zminimalizować krwawienie i urazy, do rozdzielania tkanek należy stosować techniki rozsuwania za pomocą mikropincet. Należy ostrożnie odsłonić węzeł chłonny podkolanowy, nie naruszając integralności naczyń krwionośnych doprowadzających i odprowadzających oraz naczyń limfatycznych doprowadzających.</li>
	<li>W celu zwiększenia stabilności tkanki nad wilgotnym węzłem chłonnym można umieścić kwadratowe szkiełko nakrywkowe, które powinno ledwie dotykać węzła chłonnego, unikając przy tym okluzji naczyń. Szkiełko nakrywkowe można przymocować plasteliną po obu stronach myszy.</li>
	<li>Na tym etapie można dożylnie wprowadzić fluorescencyjne barwniki do naczyń o różnych wielkościach (np. TRITC-dekstran, minimum 70kDa), aby pomóc w uwidocznieniu relacji strukturalnych i integralności węzła chłonnego podczas obrazowania.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie obrazów w mikroskopii dwufotonowej**
<ol>
	<li>Gdy węzeł chłonny (LN) zostanie odpowiednio odsłonięty i osiągnięta zostanie stabilność, bezzwłocznie przenieś cały uchwyt dla myszy na stolik mikroskopu wyposażony w programowalną matę grzewczą z kontrolą temperatury przez sprzężenie zwrotne, znajdujący się w komorze mikroskopowej utrzymywanej w temperaturze 37°C. Dodaj wystarczającą ilość sterylnego, ciepłego (37°C) PBS lub HBSS, aby zanurzyć LN. Objętość będzie zależeć od wielkości i ułożenia myszy. Alternatywnie ciepły PBS lub HBSS można podawać bezpośrednio na wypreparowany LN za pomocą cienkiej szklanej pipety podłączonej do pompy perystaltycznej i przymocowanej taśmą do kolumny obiektywu imersyjnego. Przepływ cieczy powinien być taki, aby między soczewką a tkanką można było utrzymać stabilną kolumnę wody.</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę PBS lub HBSS na poziomie 37°C za pomocą maty grzewczej z sondą sprzężenia zwrotnego. Oddzielną sondę temperatury należy umieścić w uchwycie dla myszy, aby potwierdzić, że temperatura PBS mieści się w zakresie od 36,5 do 37,5°C. Można również użyć sondy rektalnej do monitorowania temperatury głębokiej ciała myszy doświadczalnej przez cały czas trwania sesji obrazowania.</li>
	<li>Użyj lampy epifluorescencyjnej, aby pomóc w odpowiednim ustawieniu LN pod obiektywem. Pozyskaj serie obrazów fluorescencyjnych w odstępach czasu odpowiednich dla badanej interakcji komórkowej (zazwyczaj od 10 sekund do 1 minuty pomiędzy każdą serią obrazów xyz).</li>
	<li>Często monitoruj stan zwierzęcia w komorze mikroskopowej poprzez kontrolę wizualną lub za pomocą systemu monitorowania zwierząt. Sprawdź, czy mysz jest w pełni znieczulona, oceniając brak reakcji na uszczypnięcia palców i/lub paznokci oraz stałą, nieutrudnioną częstość oddechów w zakresie 60-80 oddechów/min. Poziom izofluranu można odpowiednio dostosować, aby zapewnić pełną sedację zwierzęcia. Przy właściwym monitorowaniu i nawadnianiu obrazowanie zwierząt może trwać od 4 do 6 godzin, a być może dłużej.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu obrazowania uśmierć zwierzę w komorze CO2 zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem eutanazji. Nie wolno dopuścić do wybudzenia zwierzęcia z narkozy przed eutanazją.</li>
</ol>
** Ta procedura chirurgiczna może być również przydatna w innych formach obrazowania intravitalnego niż 2P-LSM.
5. Reprezentatywne wyniki
Różne krążące komórki odpornościowe są rekrutowane do węzła chłonnego (LN) z różną prędkością po transferze adopcyjnym. W przypadku limfocytów CD4+ i CD8+ komórki te zaczynają docierać do LN poprzez żyłki wysokomiąższowe (HEV) kilka minut po transferze dożylnym (i.v.), a znaczne ich liczby pojawiają się w LN podkolanowym po 2 do 4 godzinach6,17-18. W odniesieniu do limfocytów B, znaczna ich liczba gromadzi się po 8 do 24 godzinach19. Aktywowane komórki dendrytyczne (DCs) powinny zacząć pojawiać się w drenującym LN podkolanowym od 8 do 16 godzin po wstrzyknięciu w poduszkę stopy3,11,16-17. Rycina 2a pokazuje, że nawet bez innych punktów orientacyjnych, struktury takie jak mieszkowe limfocyty B można łatwo rozpoznać po okrągłych, sferycznych skupiskach komórek widocznych w 2P-LSM19. Wykorzystując endogenny reporter fluorescencyjny, taki jak splenocyty ubiquitin-GFP (Rycina 2, Filmy uzupełniające 1 i 2), można śledzić migrację i zachowanie tych limfocytów przez wiele dni, nawet do tygodnia, w niestymulujących warunkach fizjologicznych. Dzięki wielokanałowym detektorom o wysokiej czułości możliwe jest pozyskanie multipleksowego zbioru danych obrazowych, który obejmuje zarówno informacje strukturalne, jak i dynamikę oddziaływań między wieloma partnerami komórkowymi17,19.
Przy prawidłowym wykonaniu technik chirurgicznych i starannym monitorowaniu warunków środowiskowych limfocyty powinny wykazywać charakterystyczną prędkość migracji, co przedstawiono na rysunkach 2c, 2d oraz w innych źródłach13-14,16. Limfocyty mogą również wykazywać różnice w prędkości migracji w zależności od obrazowanych podregionów węzła chłonnego (LN), dlatego dodatkowe punkty orientacyjne, takie jak naczynia krwionośne (uwidocznione poprzez wprowadzenie barwników naczyniowych), pomogą określić ogólną jakość obrazowania (np. właściwą kontrolę temperatury, minimalny uraz LN itp.)3,6,20.
<img alt="Układ do operacji na myszy ze schematem szalki Petriego; identyfikacja węzła chłonnego; eksperyment badawczy." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. Konstrukcja uchwytu dla myszy do obrazowania poplitowych węzłów chłonnych (LN). a) Schematy montażu uchwytu dla myszy; b) Reprezentatywne przygotowanie myszy do badania intravitalnego; c) Zmontowany uchwyt dla myszy; d) Powiększone widoki poplitowych LN po odsłonięciu chirurgicznym.
<img alt="Badanie ruchu limfocytów B i T; obrazy mikroskopowe (a, b) i wykresy częstotliwości (c, d) danych dotyczących prędkości." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 2. Analiza migracji limfocytów GFP+ w węźle chłonnym podkolanowym. (a) Migawka 3D pobrana z sekwencji obrazowania 2P-LSM węzła chłonnego podkolanowego u myszy biorcy C57BL/6, której 1 dzień przed obrazowaniem adoptywnie przeniesiono 1x107 limfocytów GFP+. Linia przerywana oznacza granicę mieszków limfocytów B; (b) Ścieżki migracji limfocytów podczas 1 godziny ciągłego obrazowania; c) Rozkład ogólnej prędkości migracji limfocytów. Średnia prędkość = 10.04 ± 4.26 μm/min (analiza łącznie 15 125 ścieżek); d) Różnicowy rozkład prędkości migracji komórek znalezionych w mieszkach limfocytów B (słupki otwarte; średnia prędkość = 8.79 ± 3.90 μm/min; analiza łącznie 1 525 ścieżek) i w strefie limfocytów T (słupki zamknięte; średnia prędkość = 13.77 ± 5.93 μm/min; analiza łącznie 1 250 ścieżek). Pasek skali = 50 μm.
Wideo dodatkowe 1. Obrazowanie intravitalne w czasie rzeczywistym za pomocą 2P-LSM w węźle chłonnym podszybowym myszy, zgodnie z opisem w Rysunku 2. Łącznie 1x107 limfocytów wyizolowano od myszy donora ubiquitin-GFP+ i przeniesiono adoptywnie dożylnie do myszy biorcy C57BL/6 na 24 godziny przed obrazowaniem. Seria obrazów fluorescencyjnych xy (750 μm x 750 μm) została wykonana przez stałe stosy z (kroki 5 μm, 13 kroków), aby uzyskać stos obrazowania xyz (750 μm x 750 μm x 65 μm); procedurę powtarzano co 20 sekund przez łącznie 60 minut, co pozwoliło na uzyskanie sekwencji obrazowania xyzt do analizy prędkości (Rysunki 2c, 2d). Prędkość odtwarzania = 450x. Pasek skali = 50 μm. Znacznik czasu = min:sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo dodatkowe</a>.
Film uzupełniający 2. Powiększenie sekwencji obrazowania z Filmu uzupełniającego 1 na granicy mieszka komórek B i strefy komórek T. Prędkość odtwarzania = 450x. Pasek skali = 25 μm. Znacznik czasu = min: sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby obejrzeć film uzupełniający</a>.

<ol><li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node%3A+lessons+from+the+movies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li>
<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+friends+in+out-of-the-way+places%3A+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).</li>
<li>Huang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+landscape+of+in+vivo+immunity%3A+insights+from+dynamic+in+situ+imaging+of+secondary+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li>
<li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-recognition+promotes+the+foreign+antigen+sensitivity+of+naive+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes.</a> Nature. 420, 429-434 (2002).</li>
<li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+self-recognition+in+T+cell+responses+to+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen.</a> Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).</li>
<li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
<li>Celli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+dynamics+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo.</a> Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).</li>
<li>Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rulers+over+randomness%3A+stroma+cells+guide+lymphocyte+migration+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes.</a> Immunity. 25, 867-869 (2006).</li>
<li>Worbs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+stimulate+the+intranodal+motility+of+T+lymphocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).</li>
<li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((byways+and+breadcrumbs%3A+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>von Andrian, U. H., Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+cellular+traffic+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Homing and cellular traffic in lymph nodes.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).</li>
<li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CD8%2B+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).</li>
<li>Castellino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li>
<li>Halin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li>
<li>Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrafollicular+activation+of+lymph+node+B+cells+by+antigen-bearing+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells.</a> Science. 312, 1672-1676 (2006).</li>
<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+vision+for+dynamic+high-resolution+intravital+immune+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging.</a> Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ostatnie postępy w technikach obrazowania in situ o wysokiej rozdzielczości, w szczególności w 2P-LSM, wiążą się z rosnącym zainteresowaniem badaniem dynamicznego zachowania komórek in vivo. Technika obrazowania 4D w obrębie węzła chłonnego podkolanowego żywej myszy umożliwia przeprowadzanie takich analiz dynamicznego zachowania komórek odpornościowych w niezakłóconym mikrośrodowisku tkankowym. Zastosowanie 2P-LSM z wieloma detektorami obejmującymi całe widmo widzialne pozwala na jednoczesne zbieranie danych obrazowych z wielu populacji komórek. Można to obecnie osiągnąć poprzez wykorzystanie myszy z fluorescencyjnymi reporterami specyficznymi dla konkretnych komórek in vivo (np. Ubiquitin-eGFP, -RFP lub -eCFP) w połączeniu z adoptywnym transferem różnie znakowanych populacji komórek przy użyciu organicznych fluorescencyjnych barwników komórkowych (np. CFSE, SNARF-1 i Cell Tracker Orange), aby badać mechanizmy i funkcje komórkowe w obrębie węzła chłonnego. Oprócz bezpośredniej obserwacji oddziaływań między różnie śledzonymi populacjami komórek, wieloodpadowy zestaw danych obrazowych może zostać poddany dalszej analizie przy użyciu komercyjnie dostępnego oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. Imaris, BitPlane Inc.) w celu dokładniejszego wyjaśnienia zachowania i funkcji komórek. Istnieje szeroki wachlarz możliwości badania mechanizmów oddziaływań komórkowych z wykorzystaniem tych technik in vivo i in silico.
Głównym ograniczeniem opisanego tutaj podejścia eksperymentalnego jest złożoność techniczna właściwa dla zastosowanej metody chirurgicznej. Technika ta wymaga rygorystycznego szkolenia w celu zapoznania się z odpowiednią anatomią oraz precyzyjnymi procedurami technicznymi i umiejętnościami wymaganymi przez niniejszy protokół. Dodatkowe czynniki utrudniające obejmują trudność w minimalizowaniu uszkodzeń tkanek podczas eksploracji LN, optymalizację stabilności tkanek podczas obrazowania oraz zapobieganie uszkodzeniom termicznym i laserowym LN przed i w trakcie eksperymentów obrazowych. Zaburzenie któregokolwiek z tych czynników doprowadzi do nieoptymalnej ruchomości limfocytów, co w konsekwencji będzie utrudniać prawidłową interpretację wyników analizy danych obrazowych.

<table><tbody><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Baxter International Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Nair – balsam do depilacji</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka grzewcza </td><td>Watlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterownik maty grzewczej</td><td>Watlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powietrze i tlen&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda temperatury</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Graefe Iris, 7 cm zakrzywiona</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14141</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywa szklanej szalki do hodowli komórkowych 100x20 mm</td><td>Corning</td><td>70165-102</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywka naczynia do hodowli komórkowej z polistyrenu o wymiarach 100x20 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Betadine (10% roztwór do stosowania miejscowego powidonu z jodem)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Węzły chłonne (LNs) są wtórnymi narządami limfatycznymi, rozmieszczonymi strategicznie w całym organizmie, aby umożliwić wychwytywanie i prezentację obcych antygenów z tkanek obwodowych w celu zainicjowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Znajdując się na styku odpowiedzi immunologicznej wrodzonej i adaptacyjnej, węzeł chłonny stanowi idealne miejsce do badania oddziaływań między komórkami odpornościowymi1,2. Limfocyty (komórki T, komórki B i komórki NK), komórki dendrytyczne (DCs) oraz makrofagi stanowią główną część elementów komórkowych węzła chłonnego pochodzących z szpiku kostnego. Komórki te są strategicznie rozmieszczone w węźle chłonnym, co pozwala na efektywny nadzór nad autoantygenami oraz potencjalnymi antygenami obcymi3-5. Proces, w którym limfocyty skutecznie napotykają cognatywne antygeny, jest przedmiotem intensywnych badań w ostatnich latach i obejmuje integrację kontaktów molekularnych, w tym receptorów antygenowych, cząsteczek adhezyjnych, chemokin oraz struktur zrębowych, takich jak sieć włóknisto-siateczkowa2,6-12.
Przed opracowaniem obrazowania fluorescencyjnego in vivo w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości, badacze polegali na obrazowaniu statycznym, które dostarcza odpowiedzi jedynie w zakresie morfologii, położenia i architektury. Choć pytania te są fundamentalne dla naszego zrozumienia zachowania komórek odpornościowych, ograniczenia właściwe dla tej techniki nie pozwalają na analizę w celu rozszyfrowania ruchu limfocytów oraz wskazówek środowiskowych wpływających na dynamiczne zachowanie komórek. Niedawno opracowanie intravitalnej dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej (2P-LSM) umożliwiło badaczom obserwację dynamicznych ruchów i interakcji pojedynczych komórek w żywych węzłach chłonnych (LN) in situ12-16. W szczególności my oraz inni autorzy zastosowali tę technikę do obrazowania zachowania i interakcji komórkowych w obrębie poplitowego LN, gdzie jego zwarta, gęsta natura daje korzyść w postaci wielokrotnego pozyskiwania danych z dużego obszaru tkanki z różnorodnymi podstrukturami tkankowymi11,17-18. Należy zauważyć, że technika ta oferuje dodatkowe korzyści w porównaniu z metodami obrazowania tkanek eksplantowanych, które wymagają przerwania przepływu krwi, limfy i w konsekwencji dynamiki komórkowej systemu. Ponadto tkanki eksplantowane mają bardzo ograniczone okno czasowe, w którym tkanka pozostaje żywotna do obrazowania po eksplantacji. Przy odpowiednim nawadnianiu i monitorowaniu warunków środowiskowych zwierzęcia, czas obrazowania może zostać znacznie wydłużony dzięki tej technice intravitalnej. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółową metodę przygotowania poplitowego LN myszy w celu przeprowadzenia obrazowania intravitalnego.

Ostatnie postępy w mikroskopii dwufotonowej umożliwiły obrazowanie in situ żywych tkanek w modelach zwierzęcych w czasie rzeczywistym, co zwiększyło nasze możliwości badania zachowania komórek zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiamy przygotowania niezbędne do przeprowadzenia obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Węzły chłonne (WCh) są wtórnymi narządami limfatycznymi, rozmieszczonymi strategicznie w całym organizmie, aby umożliwić wychwytywanie i prezentację obcych ...

Ogólnym celem tej procedury jest odsłonięcie i stabilizacja węzła chłonnego podkolanowego do obrazowania in vivo. Zostaje to osiągnięte najpierw poprzez przygotowanie uchwytu dla myszy, który umożliwia stabilizację kończyny podczas zabiegu. Drugim krokiem jest prawidłowe umieszczenie znieczulonej myszy w uchwycie.Trzecim krokiem jest ostrożne odsłonięcie węzła chłonnego podszyjkowego bez uszkodzenia go ani okolicznych naczyń krwionośnych. Ostatnim etapem jest wykonanie obrazowania intravitalnego odsłoniętego węzła chłonnego podszyjkowego. W rezultacie, dzięki mikroskopii intravitalnej, można obserwować i analizować migrację oraz interakcje komórek odpornościowych w węźle chłonnym w czasie rzeczywistym.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki chirurgiczne są trudne do opanowania, a zapewnienie odpowiedniej stabilizacji węzła chłonnego bez jego uszkodzenia ma krytyczne znaczenie. Procedurę zaprezentuje Rachel Liu.Technik w naszym laboratorium rozpoczyna od położenia pokrywki szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm stroną górną do góry na odwróconej do góry dnem pokrywce plastikowej szalki Petriego o średnicy 100 mm, tak aby szkło ledwie stykało się z punktem centralnym plastikowej szalki. Używając szkła jako szablonu, należy odrysować linię w kształcie półksiężyca na plastikowej szalce. Następnie, używając wiertarki ręcznej, należy wyciąć z pokrywki plastikowej szalki o średnicy 100 mm platformę w kształcie półksiężyca.Wywierć dwa otwory w platformie, a następnie przymocuj plastikową pokrywkę do krawędzi szklanej szalki Petriego za pomocą mocnego kleju. Na koniec odetnij dwie kopułkowate zakrętki PCR od probówek w miejscu zawiasów i przyklej je w odstępach jednego centymetra od siebie na środku dna szalki. Po znieczuleniu myszy przymocuj maskę gazową nad nosem zwierzęcia za pomocą taśmy.Dostosuj poziom izofluranu, aby zapewnić pełną sedację zwierzęcia. Następnie za pomocą trymera elektrycznego usuń sierść z prawej tylnej łapy oraz okolic pachwiny myszy. Odstawy luźną sierść szczoteczką, a następnie za pomocą patyczka higienicznego delikatnie nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na ogoloną powierzchnię.Minutę po pierwszej aplikacji należy usunąć krem detory i oczyścić odsłoniętą skórę wilgotnym ręcznikiem papierowym. Po osuszeniu myszy należy wykonać nożyczkami małe nacięcie o długości od dwóch do trzech milimetrów w okolicy prawego kolana, aby odsłonić ścięgno prostownika. Następnie należy nałożyć klej Vet Bond wzdłuż środka uchwytu do myszy, w którym ciało i noga myszy zostaną ostrożnie umieszczone.Zabeziecz mysz w uchwycie, dociskając prawe kolano, aby odsłonić prawy dół podkolanowy. Następnie unieruchom ścięgno prawego kolana za pomocą vebo pomiędzy dwoma uchwytami do płatów skóry, aby pomóc w stabilizacji pola obrazowania. Następnie wyprostuj i przymocuj taśmą przednie kończyny oraz lewą tylną kończynę myszy do górnej platformy uchwytu.Przełóż dwie metalowe opaski zaciskowe przez otwory i użyj ich do przymocowania maski gazowej do pokrywy. Na koniec umieść uchwyt pod mikroskopem sekcyjnym. Ustaw ogon w pozycji, która zapewni największą stabilność prawej nogi, zazwyczaj powyżej głowy, jak pokazano tutaj.Następnie przyklej ogon taśmą. Podczas pracy pod mikroskopem sekcyjnym utrzymuj temperaturę ciała myszy za pomocą grzejnika pokojowego. Rozpocznij procedurę od sterylizacji skóry Betadyną, używając do tego sterylnych nożyczek.Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry na wysokości połowy prawej łydki i kontynuuj cięcie pionowo w górę, aż do górnej części prawego uda. Następnie wykonaj dwa poziome nacięcia skóry na górze linii cięcia pionowego, aby stworzyć płaty skórne po obu stronach. Zachowaj wilgotność tkanek poprzez ciągłe nakładanie ciepłego PBS na odsłoniętą tkankę.Napięty skórę, a następnie nałóż klej wet bond na płaty skóry, aby dodatkowo zwiększyć stabilność kończyny. Kontynuuj przyklejanie innych obszarów skóry, aby zwiększyć stabilność nogi przed odsłonięciem węzła chłonnego. Odsłonięcie węzła chłonnego bez uszkodzenia otaczających tkanek jest najtrudniejszym etapem tej procedury.Należy zachować szczególną ostrożność podczas oddzielania tkanki tłuszczowej i mięśni, aby nie uszkodzić otaczających naczyń krwionośnych i limfatycznych. Najlepszą metodą jest jednokrotne unoszenie i odsuwanie kilku pasm mięśniowych od węzła chłonnego podczas ich oddzielania. Następnie, używając pęsety i kleszczyków do mikrosekcji, należy ostrożnie rozsunąć otaczające tkanki tłuszczowe i mięśnie, eksponując węzeł chłonny podkolanowy, nie naruszając przy tym ciągłości doprowadzających i odprowadzających naczyń krwionośnych oraz doprowadzających naczyń limfatycznych.Po odpowiednim odsłonięciu węzła chłonnego i uzyskaniu stabilizacji, niezwłocznie przenieś cały zestaw uchwytu dla myszy na stolik mikroskopu do obrazowania dwufotonowego, wlewając do komory środowiskowej mikroskopu wystarczającą ilość sterylnego PBS o temperaturze 37 °C, aby zanurzyć węzeł chłonny. Utrzymuj temperaturę PBS na poziomie 37 °C, korzystając z podgrzewacza z sondą sprzężenia zwrotnego. Umieść oddzielną sondę temperatury w uchwycie dla myszy, aby potwierdzić, że temperatura PBS pozostaje w zakresie od 36,5 do 37,5 °C.Do monitorowania wewnętrznej temperatury ciała zwierzęcia doświadczalnego można również zastosować sondę rektalną. Aby ułatwić ustawienie węzła chłonnego pod obiektywem, należy użyć lampy epifluorescencyjnej. Następnie należy zarejestrować stosy obrazów fluorescencyjnych, stosując odstępy czasowe odpowiednie dla badanej interakcji komórkowej.Działanie.Często monitoruj stan zwierzęcia w komorze mikroskopowej poprzez inspekcję wizualną. Ten obraz 3D został wykonany z sekwencji obrazowania dwufotonową mikroskopią skaningową węzła chłonnego popal u myszy, której jeden dzień przed obrazowaniem dokonano adoptywnego transferu 1×10⁷ limfocytów GFP-dodatnich. Nawet bez innych punktów orientacyjnych.Struktury takie jak pęchy komórek B, oznaczone tutaj liniami przerywanymi, można łatwo rozpoznać po okrągłych, sferycznych komórkach. Na tej rycinie przedstawiono ścieżki migracji limfocytów zarejestrowane podczas godziny ciągłego obrazowania. Pozwala to na śledzenie wzorców migracji komórek, a także na złożoną analizę ich zachowania, taką jak prędkość, kierunkowość oraz interakcje międzykomórkowe.Zwróć uwagę na kształt OID migrujących limfocytów. Przedstawiono tutaj rozkład całkowitej prędkości migracji limfocytów przeniesionych adoptywnie, śledzonych w próbce węzła chłonnego, przy całkowitej liczbie 15 125 przeanalizowanych trajektorii. Ustalono, że średnia prędkość wynosiła od 6 do 14 µm/min.Wykres ten przedstawia rozkład różnicowy prędkości migracji komórek znajdujących się w foliku limfocytów B, reprezentowanym przez otwarte słupki danych, oraz w strefie limfocytów T, reprezentowanej przez wypełnione słupki danych. Średnio częstotliwość migracji komórkowej w foliku limfocytów B była wyższa niż częstotliwość migracji śledzonej w strefie limfocytów T. Mimo że komórki w strefie limfocytów T migrowały z wyższymi średnimi prędkościami w tym filmie z intravitalnej dwufotonowej mikroskopii skaningowej z odstępami czasu wykonanym w węźle chłonnym myszy, łącznie 1 × 10⁷ limfocytów wyizolowano z myszy donora z dodatnim sygnałem ubiquitin GFP i przeniesiono adoptywnie dożylnie do myszy biorcy na 24 godziny przed obrazowaniem, zgodnie z zapisem na filmie.Technika ta umożliwia dynamiczną wizualizację zachowania limfocytów w węźle chłonnym. Przedstawiono tutaj powiększony widok sekwencji obrazowania obszaru granicy między folikulem limfocytów B a strefą limfocytów T z poprzedniego filmu. Dzięki dokładnej analizie można rozróżnić zachowania komórek w różnych mikrośrodowiskach węzła chłonnego.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować uchwyt dla myszy odpowiedni do obrazowania węzła chłonnego podkolanowego, jak chirurgicznie odsłonić węzeł chłonny podkolanowy oraz jak przeprowadzić mikroskopię intravitalną w celu obserwacji zachowania komórek odpornościowych w C two.

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie in vivo węzła chłonnego podkolanowego myszy

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Przedstawiono technikę wykonywania mikroskopii intravitalnej węzła chłonnego (LN) pachwinowego. Technika ta umożliwia badanie mikrokrążenia i struktury węzła chłonnego w czasie rzeczywistym, in vivo, zarówno w stanie homeostazy, jak i podczas infekcji. Metoda ta może zostać dostosowana do badań nad migracją komórek oraz do analizy innych lokalizacji węzłów chłonnych.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa węzła chłonnego pachwinowego

Niedawno opracowane techniki obrazowania z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) mogą pomóc w wyjaśnieniu roli, jaką układ limfatyczny odgrywa w przerzutowaniu nowotworów, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu ran oraz innych chorobach związanych z układem limfatycznym.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne naczyń limfatycznych myszy

Ten film demonstruje technikę preparacji w celu pobrania węzłów chłonnych drenujących podkolanowe z tylnych nóg myszy. Węzły chłonne odgrywają kluczową rolę w łączeniu odporności wrodzonej i nabytej, a pobieranie nienaruszonych węzłów chłonnych – z zachowaną strukturą tkankową i żywotnością komórek – może pomóc w badaniu miejscowych i ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych.

Metoda preparacji w celu pobrania mysich węzłów chłonnych drenujących podkolanowe do obrazowania ex vivo

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Przedstawiono protokół blokowania przepływu limfy poprzez chirurgiczne zszywanie doprowadzających naczyń limfatycznych.

Blokowanie przepływu limfy poprzez zszywanie aferentnych naczyń limfatycznych u myszy

Ten protokół ocenia drenaż limfatyczny po złamaniu poprzez łączenie obrazowania w bliskiej podczerwieni z użyciem zielonej indokyaninowej (ICG) z ultrasonografią w celu ilościowego określenia usuwania ICG podeszwowego i powiększenia węzłów chłonnych okołokolanowych u myszy.

Ocena drenażu limfatycznego z wykorzystaniem obrazowania ICG w bliskiej podczerwieni i ultradźwięków po złamaniu

Poznaj metodę obrazowania przyżyciowego węzła chłonnego podkolanowego myszy, umożliwiającą obserwację migracji komórek odpornościowych w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala na szczegółowe badanie dynamiki odpowiedzi immunologicznej in vivo.

Obrazowanie intravitalne węzła chłonnego podkolanowego myszy

Przeglądaj więcej filmów