Name: Rozwarstwienie dorosłej łagiewki myszy i zakażenia komórkami podporowymi za pośrednictwem adenowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwienia łagiewki dorosłej myszy i zakażenia komórek podporowych adenowirusem. Technika ta umożliwia badanie biologii komórek rzęskowych i mechanizmów regeneracji w uchu wewnętrznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy są wdzięczni dr. Shimonowi P. Francisowi za przygotowanie mikrografii konfokalnych.
Praca ta była wspierana przez Wydział Badań Intramuralnych w Narodowym Instytucie Zaburzeń Słuchu i Innych Zaburzeń Komunikacji (National Institute on Deafness and Other Communication Disorders). Dodatkowe wsparcie zapewnił grant NIDCD 5R01 DC007613.

1. Disekcja i hodowla utriculi
<ol>
 <li>Uśmierć dorosłą mysz (w wieku 4 tygodni lub starszą) zgodnie z zatwierdzonym protokołem i dokonaj dekapitacji.</li>
 <li>Nacinij zewnętrzny przewód słuchowy po obu stronach głowy i odciągnij skórę do przodu w stronę nosa. Przetnij głowę od tyłu do przodu i usuń mózg z obu stron, aby odsłonić labirynt kostny.</li>
 <li>Odetnij czaszkę od kostnej ślimaka i przenieś labirynt kostny (łącznie z bąbelkiem słuchowym) do komory z laminarnym przepływem powietrza wyposażonej w mikroskop sekcyjny (Uwaga: prace z adenowirusami należy prowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II).</li>
 <li>W komorze przenieś każdą ślimaka do 35mm naczynia hodowlanego zawierającego sterylną pożywkę sekcyjną (M199, Gibco/Invitrogen #12350) (Rysunek 1A).</li>
 <li>Jeśli bąbelek słuchowy jest nadal nienaruszony (można go usunąć podczas sekcji ogólnej, wsuwając paznokieć między bąbelek a wierzchołek ślimaka), użyj dwóch pęset (jednej nr 3 i jednej nr 5), aby go rozbić (Rysunek 1B).</li>
 <li>Zidentyfikuj punkty orientacyjne preparatu kostnej ślimaka: wierzchołek, podstawę, kosteczki słuchowe, okno owalne i okno okrągłe, korzeń VIII nerwu czaszkowego, kanały półkoliste (Rysunek 1 C, D).</li>
 <li>Umieść ucho wewnętrzne w naczyniu stroną przyśrodkową do góry, tak aby okna owalne i okrągłe oraz wierzchołek znajdowały się na dnie naczynia, a korzeń VIII nerwu był skierowany do góry. Przytrzymaj preparat pęsetą nr 3 w okolicy kanałów półkolistych (Rysunek 1D).</li>
 <li>Za pomocą skalpela z ostrzem nr 11 odetnij wierzchołek ślimaka tuż powyżej korzenia nerwu (Rysunek 1D).</li>
 <li>Obróć preparat tak, aby odcięta część była skierowana do góry. Użyj przedniego kanału półkolistego jako uchwytu do stabilizacji preparatu (Rysunek 1E).</li>
 <li>Używając pęsety nr 5, usuń ślimaka w obrębie modiolusa aż do podstawy. W miejscu, gdzie obszar haczykowaty ślimaka zakręca w dół, użyj cienkiej sondy (połówka złamanej pęsety nr 55), aby unieść ostatnią kostną półkę spiralnej blaszki kostnej (Rysunek 1F), odsłaniając woreczek. Bezpośrednio pod woreczkiem znajduje się stopka strzemiączka, która jest ważnym punktem orientacyjnym. Utricula znajduje się bezpośrednio obok stopki strzemiączka (Rysunek 1G) i jest otoczona kością. Użyj sondy, aby odłupać wystarczającą ilość kości, by odsłonić około 1/3 utriculi. Ostrożnie usuń utriculę za pomocą pęsety nr 55 (Rysunek 1H). Procedura ta zazwyczaj prowadzi do usunięcia pigmentowanego nabłonka dachowego podczas wyciągania utriculi z preparatu kostnego. Jeśli jednak utricula zostanie usunięta z nienaruszonym nabłonkiem dachowym, dach można usunąć za pomocą pęsety nr 55.</li>
 <li>Utricule do infekcji adenowirusowej (lub do eksperymentów z obrazowaniem na żywo) muszą mieć usunięte otokonie podczas sekcji (przed infekcją). W tym przypadku użyj strzykawki z Luer-Lock wypełnionej pożywką sekcyjną i wyposażonej w igłę o małej średnicy (zazwyczaj 26-28 G). Przytrzymaj utriculę za krawędź pęsetą nr 55 (Rysunek 1I). Przybliż czubek igły do utriculi tak, aby ścięcie igły było skierowane w dół. Użyj strumienia pożywki sekcyjnej, aby zdmuchnąć otokonie (Rysunek 1J). Alternatywnie otokonie można usunąć, wyczesując je narzędziem z rzęsą (Ted Pella, Inc. #113). Utricule, które nie będą poddane infekcji adenowirusowej, są zazwyczaj hodowane swobodnie pływając w 24-dołkowych płytkach hodowlanych z nienaruszonymi otokonie (patrz poniżej w sekcji usuwania otokonie po utrwaleniu, co jest łatwiejsze).</li>
 <li>Po wysekowaniu wszystkich utriculi zmień pożywkę sekcyjną na sterylną pożywkę hodowlaną: DMEM F12 (Gibco #11320) uzupełnioną o 5% FBS oraz 50 U/ml penicyliny G (Sigma).</li>
 <li>Utricule hoduje się w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Jeśli hodowle mają być utrzymywane przez więcej niż 48 godzin, co drugi dzień należy wymienić połowę pożywki hodowlanej. Hodowle można utrzymywać przez tydzień lub dłużej.</li>
</ol>
2. Infekcja komórek wspierających adenowirusem

Ważne: Praca z adenowirusami wymaga procedur i certyfikacji poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Skonsultuj się z instytucjonalnym inspektorem ds. bezpieczeństwa biologicznego w celu uzyskania wytycznych i przeszkolenia w zakresie procedur BSL2.
<ol>
 <li>Wypreparować utriculi w opisany wyżej sposób, używając medium doysekcyjnego (bez surowicy). Usunąć otokonie zgodnie z powyższą instrukcją.</li>
 <li>Przed przystąpieniem do infekcji przenieść jedną utriculę (komórkami rzęsistymi do góry) do każdego dołka mini-tacki Nunc (Fisher #12-565-68) zawierającej 15 μL bezzsurowiczego DMEM F12 (jest to istotne, ponieważ surowica może dezaktywować wirusa). Przenoszenie jest łatwiejsze przy użyciu mikrokuretki 1,5 mm (#10082-15 z Fine Science Tools).</li>
 <li>Stosowany przez nas Ad-GFP to serotyp 5 z usuniętymi wirusowymi genami E1 i E3 oraz ludzkim promotorem CMV sterującym transgenem (GFP). Wirus ten został pozyskany z Vector BioLabs (Philadelphia, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a>). Wirusy stokowe są dostarczane w mianach 1,0-4,0×1010 PFU/ml. Dodać 0,5-2 μl wirusa stokowego do każdego dołka zawierającego utriculę (Rycina 1L). Rzeczywista ilość zależy od konkretnego wirusa i miana stoku. Zazwyczaj infekujemy każdą utriculę dawką 1,0-4,0×107 PFU. </li>
 <li>Inkubować utricule w medium zawierającym wirusa w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 2 godziny. Po 2 godzinach przenieść utricule z powrotem do 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej medium hodowlane z surowicą. Hodować utricule przez noc w temperaturze 37 °C/5% CO2.</li>
 <li>Utricule można wykorzystać następnego dnia do eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek lub utrwalić do immunochemii komórek rzęsistych (patrz poniżej). Ekspresja wirusowego transgenu zwiększa się z czasem, więc jeśli po 24 godzinach od infekcji ekspresja transgenu jest niska, korzystne może być hodowanie komórek przez dodatkowe 24 godziny w medium z surowicą. W przypadku zaobserwowania toksyczności wobec komórek rzęsistych należy zmniejszyć ilość użytego wirusa. </li>
</ol>
3. Fixacja utriculi, usuwanie otokoniów i immunochemia
<ol>
 <li>Po zakończeniu okresu hodowli utrykulę należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (na platformie kołyszącej) lub przez noc w temperaturze 4 °C. Utrykuły należy przemyć (3 razy, po 15 min każdorazowo) w 0,1 M (1X) buforze fosforanowym Sorensena o pH 7,4. Kroki te wykonuje się w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek.</li>
 <li>Usuwanie otokonii: Uwaga: Otokonie muszą zostać usunięte przed infekcją adenowirusową (patrz krok 1.11 powyżej). Jednakże utrykuły, które nie mają być zainfekowane, mogą być hodowane i utrwalane z nienaruszonymi otokoniami. W takim przypadku należy zastosować opisane tutaj kroki w celu usunięcia otokonii po utrwaleniu. Należy sprawdzić, czy na utrykułach pozostało zpigmentowane nabłonki dachowe. Wszelkie pozostałości nabłonka dachowego należy ostrożnie usunąć za pomocą dwóch pęset #55. Aby usunąć otokonie, należy zastąpić bufor fosforanowy Sorensena 750-1000 μl dekalkyfikatora Cal-Ex (Fisher #CS510-1D). Cal-Ex należy pozostawić na utrykułach przez 1 minutę i 40 sekund (nie przekraczać 2 minut). Cal-Ex należy zastąpić 0,1 M buforem fosforanowym Sorensena i przemyć (5 razy, po 5 min każdorazowo).</li>
 <li>Utrykuły należy inkubować w borowodorku sodu (Sigma #452882, 1% w wodzie dejonizowanej) przez 10 min. Utrykuły należy przemyć w 0,1 M buforze fosforanowym Sorensena (5 razy, po 5 min każdorazowo).</li>
 <li>Utrykuły należy umieścić w roztworze blokującym (PBS + 2% albuminy surowicy bydlęcej + 0,8% normalnej surowicy koziej + 0,4% Triton X-100) na 3 godziny w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej.</li>
 <li>Należy dodać przeciwciała pierwszorzędowe i inkubować przez noc w 4 °C. Przeciwciała anty-Myosin 7a (Proteus Biosciences #25-6790 lub #MYO7A 138-1 z Developmental Studies Hybridoma Bank) w rozcieńczeniu 1:100 w roztworze blokującym znakują wszystkie komórki rzęsate. Aby oddzielnie oznakować komórki rzęsate strialne i niestrialne, zastosowano protokół podwójnego znakowania z wykorzystaniem monoklonalnych przeciwciał anty-kalmodulina (Sigma #C 3545; 1:150) oraz poliklonalnych przeciwciał anty-kalbindyna (Chemicon #AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Przeciwciała drugorzędowe (zazwyczaj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa fluor z Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) rozcieńcza się 1:500 w roztworze blokującym i inkubuje przez 4 godziny w ciemności w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej.</li>
 <li>Utrykuły należy zamontować na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Utricule hodowane tą metodą zachowują pełny zestaw zarówno komórek rzęsek, jak i komórek podporowych (Rycina 2). Komórki rzęsek w zdrowych kulturach wykazują okrągłe profile jądrowe otoczone cienkimi obszarami cytoplazmy, które są dodatnie pod względem miozyny 7a (Rycina 2, górny panel). Komórki podporowe (znakowane przeciwciałem anty-Sox2) są mniejsze i gęściej upakowane niż komórki rzęsek (Rycina 2, dolny panel). Adenowirus infekuje 25-50% komórek podporowych w utricule, natomiast żadne komórki rzęsek nie zostają zainfekowane (Rycina 2, panele Ad-GFP). Należy zauważyć, że optymalny miano roboczy każdego adenowirusa musi zostać ustalony empirycznie, ponieważ zbyt wysokie miano wirusa może prowadzić do śmierci komórek rzęsek. Ponadto obszary uszkodzeń mechanicznych (powstałe podczas mikrodissekcji) absorbują duże ilości wirusa. Obszary te są łatwo rozróżnialne dzięki ciągłej linii komórek z bardzo wysokim poziomem ekspresji GFP i brakiem komórek rzęsek. Kontrastuje to z rozproszoną ekspresją GFP w komórkach podporowych nieuszkodzonej kultury (Rycina 2). 
<img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Proces dysekcji struktury komórek rzęsatych ucha wewnętrznego; badanie anatomiczne pod mikroskopem, schematy z opisami." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Dysekcja utriculi. A: Bąbel słuchowy (AB). B: Bąbel zostaje rozbity przy użyciu dwóch mocnych pęset. C: Kostna ślimaka (RW = okno owalne, S = tętnica strzemiączkowa, C = ślimak, ST = strzemiączko). D: Do odcięcia wierzchołka ślimaka powyżej VIII nerwu czaszkowego (8th N) używa się ostrza skalpela (SB). ASC = przedni kanał półkolisty. E: Preparat jest mocno trzymany pęsetą nr 3, z jednym ramieniem włożonym do przedniego kanału półkolistego (ASC), a drugim opartym o najbardziej zewnętrzną kość (strzałki). Labirynt błoniasty zostaje usunięty pęsetą. F: Po usunięciu labiryntu błoniastego, w pobliżu obszaru haczykowatego widoczny jest podstawowy zwój kostnej blaszki spiralnej. Pod tę kostną półkę wsuwa się cienką sondę, aby ją unieść i usunąć (strzałka). G: Po usunięciu saccule, utricula (U) jest widoczna bezpośrednio obok podstawy strzemiączka (SF). H: Utricula (U) zostaje usunięta pęsetą nr 55 (strzałka). SF = podstawa strzemiączka. I: Utricula z częściowo usuniętymi otolitami (O), pod którymi widoczny jest nabłonek sensoryczny (SE). J: Otolity (O) zostają usunięte z utriculi za pomocą strumienia medium podawanego strzykawką z igłą 26 G. Cień igły (S) jest widoczny na dole obrazu. K: Utricula z usuniętymi otolitami i widocznym nabłonkiem sensorycznym (SE). L: Infekcja adenowirusowa: każdą utriculę (U) umieszcza się w oddzielnej studience mini-tacki. Komórki podporowe są infekowane adenowirusem poprzez pipetowanie wirusa do studzienki (P = końcówka pipety).
<img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.2.jpg" alt="Schemat komórki rzęsek oraz mikroskopia fluorescencyjna wykazująca ekspresję białek Ad-GFP, Myosin 7a i Sox2." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Infekcja komórek podporowych za pośrednictwem adenowirusa. Utriculae zostały zainfekowane adenowirusem sterującym ekspresją zielonego białka fluorescencyjnego (Ad-GFP). Przedstawiono obrazy konfokalne warstwy komórek rzęsek oraz warstwy komórek podporowych w tym samym obszarze jednej utriculi. Komórki rzęsek są znakowane przeciwciałem przeciwko Myosin 7a (magenta). Komórki podporowe są znakowane przeciwciałem przeciwko Sox2 (czerwony). Schemat przedstawia strukturę nabłonka sensorycznego utriculi oraz rozmieszczenie komórek rzęsek (HC) i komórek podporowych (SC). Położenie przekrojów konfokalnych (optycznych) pokazanych na panelach górnym (U) i dolnym (L) zaznaczono przerywanymi liniami na schemacie. Panele górne: na obrazach konfokalnych wykonanych na poziomie jąder komórek rzęsek sygnał Ad-GFP pojawia się w przestrzeniach między komórkami rzęsek i nie nakłada się na marker komórek rzęsek Myosin 7a. Panele dolne: w przekrojach konfokalnych na poziomie jąder komórek podporowych sygnał Ad-GFP kolokuje się z markerem komórek podporowych Sox-2. Infekcja Ad-GFP prowadzi do ekspresji GFP wyłącznie w komórkach podporowych; żadne komórki rzęsek nie zostały zainfekowane.
<img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący liczbę komórek rzęsatych i podporowych w warunkach kontrolnych i po podaniu Ad-GFP." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Infekcja adenowirusowa nie powoduje śmierci komórek rzęsatych ani komórek podporowych. Utriculae zostały zainfekowane Ad-GFP w stężeniu 4×108 PFU/ml. Utriculae oznakowano przeciwciałami przeciwko miozynie 7a (marker komórek rzęsatych) oraz Sox2 (marker komórek podporowych). Liczba komórek rzęsatych i podporowych była taka sama w utriculae kontrolnych i utriculae zainfekowanych Ad-GFP.

<ol><li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li>
<li>Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+hair+cell+death+requires+STAT1+and+is+attenuated+by+epigallocatechin+gallate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate.</a> J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).</li>
<li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+lateral+line+and+mouse+%28Mus+musculus%29+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li>
<li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li>
<li>Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+signaling+in+neomycin-induced+vestibular+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death.</a> Hear Res. , 221-221 (2006).</li>
<li>Matsui, J. I., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+hair+cell+death+and+regeneration%3A+two+halves+of+the+same+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation.</a> Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).</li>
<li>Ryals, B. M., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+after+acoustic+trauma+in+adult+Coturnix+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail.</a> Science. 240, 1774-176 (1988).</li>
<li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240, 1772-174 (1988).</li>
<li>Shang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cell+division+is+not+required+for+regeneration+of+auditory+hair+cells+after+ototoxic+injury+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).</li>
<li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).</li>
<li>Lahne, M., Gale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage-induced+activation+of+ERK1%2F2+in+cochlear+supporting+cells+is+a+hair+cell+death-promoting+signal+that+depends+on+extracellular+ATP+and+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium.</a> J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).</li>
<li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li>
<li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li>
<li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li>
<li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li>
<li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li>
<li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+%28HSP32%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors%2C+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment%2C+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li>
<li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li>
<li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Komórki rzęsate zmysłowe są podatne na obumieranie wywołane różnymi czynnikami stresowymi, w tym starzeniem się, urazami akustycznymi oraz ekspozycją na leki ototoksyczne, w tym antybiotyki aminoglikozydowe i cytostatyk cisplatynę. U ssaków śmierć komórek rzęsatych prowadzi do trwałej utraty słuchu i/lub zaburzeń równowagi. Modele in vitro są kluczowymi narzędziami w badaniach mających na celu określenie komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw śmierci komórek rzęsatych, a także badań ukierunko...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table><tbody><tr><td>Medium 199</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11320</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna (#55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta precyzyjna (#5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta (#3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Mini-taca Nunc</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-68</td><td></td></tr><tr><td>Adenowirus-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060*</td><td></td></tr><tr><td>Dekalcyfikator Cal-Ex</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS510-1D</td><td></td></tr><tr><td>borowodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-miozyna 7a (poliklonalne)</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-miozyna 7a (monoklonalne)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>MYO7A 138-1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-kalmodulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C 3545</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-kalbindyna</td><td>Chemicon International</td><td>AB1778</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1&lt;/strong&gt;. Odczynniki i narzędzia użyte do hodowli utriculi oraz infekcji adenowirusem</td></tr><tr><td colspan="4">* Uwaga: Ad-GFP jest zazwyczaj dostarczany przez Vector Biolabs w mianie zapasowym 1x10&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt; PFU/ml. Zamówiliśmy specjalną amplifikację, aby otrzymać wirusa zapasowego w mianie 1,2&amp;#215;10&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; PFU/ml. </td></tr></tbody></table>

disekcja utriculi u dorosłej myszy i infekcja komórek podporowych za pomocą adenowirusa

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Utrata słuchu i zaburzenia równowagi są często spowodowane obumieraniem mechanosensorycznych komórek rzęskowych, które pełnią funkcję komórek receptorowych w uchu wewnętrznym. Ponieważ nie istnieje linia komórkowa, która w satysfakcjonujący sposób reprezentowałaby komórki rzęskowe ssaków, badania nad tymi komórkami opierają się na pierwotnych kulturach organów. Najlepiej scharakteryzowany system modelowy in vitro dojrzałych komórek rzęskowych ssaków wykorzystuje kultury organów utriculi (utriculus) pobranych od dorosłych myszy (Rysunek 1) 1-6. Utricula jest organem przedsionkowym, a komórki rzęskowe utriculi są podobne pod względem budowy i funkcji do komórek rzęskowych w organie słuchu, czyli organie Cortiego. Preparat utriculi dorosłej myszy stanowi dojrzały nabłonek sensoryczny do badań nad sygnałami molekularnymi regulującymi przeżycie, homeostazę i śmierć tych komórek.
Komórki rzęskowe ślimaka ssaków są terminalnie zróżnicowane i nie ulegają regeneracji po utracie. U kręgowców niebędących ssakami śmierć komórek rzęskowych słuchowych lub przedsionkowych prowadzi do intensywnej regeneracji, która przywraca funkcje słuchu i równowagi 7, 8. Regeneracja komórek rzęskowych jest pośredniczona przez przypominające glebę komórki podporowe, które kontaktują się z powierzchniami bazolateralnymi komórek rzęskowych w nabłonku sensorycznym 9, 10. Komórki podporowe są również ważnymi mediatorami przeżycia i śmierci komórek rzęskowych 11. Opracowaliśmy niedawno technikę infekcji komórek podporowych w hodowlanych utriculach przy użyciu adenowirusa. Wykorzystując adenowirus typ 5 (dE1/E3) do dostarczenia transgenu zawierającego GFP pod kontrolą promotora CMV, stwierdziliśmy, że adenowirus specyficznie i efektywnie infekuje komórki podporowe. Efektywność infekcji komórek podporowych wynosi około 25-50%, a komórki rzęskowe nie są infekowane (Rysunek 2). Co istotne, odkryliśmy, że infekcja adenowirusowa komórek podporowych nie powoduje toksyczności wobec komórek rzęskowych ani komórek podporowych, ponieważ liczba komórek w utriculach zainfekowanych Ad-GFP jest równoważna liczbie komórek w utriculach niezainfekowanych (Rysunek 3). Zatem zapośredniczona przez adenowirusy ekspresja genów w komórkach podporowych hodowlanych utricul stanowi potężne narzędzie do badania roli komórek podporowych jako mediatorów przeżycia, śmierci i regeneracji komórek rzęskowych.

Mechanosensoryczne komórki rzęsate są komórkami receptorowymi ucha wewnętrznego. Najlepiej scharakteryzowany system modelowy in vitro dojrzałych komórek rzęsatych ssaków wykorzystuje hodowle organowe utriculów (utriculi) dorosłych myszy. Przedstawiamy metodę preparatyki utriculi dorosłej myszy oraz demonstrujemy zakażenie komórek podporowych w hodowlach utricul za pomocą adenowirusa.

Disekcja utriculi u dorosłej myszy i infekcja komórek podporowych za pomocą adenowirusa

Utrata słuchu i zaburzenia równowagi są często spowodowane obumarciem mechanosensorycznych komórek rzęsatych, które stanowią komórki receptorowe ucha wewnętrznego. Ponieważ istnieje...

Niniejsza prezentacja jest demonstracją procedur hodowli całych organów utriculi (utriculi) pobranych od dorosłych myszy. Zaprezentowane zostanie również zastosowanie adenowirusa do infekcji komórek podporowych hodowanej utriculi. Proces ten rozpoczyna się od starannego wypreparowania utriculi z ucha wewnętrznego.Drugim krokiem jest usunięcie nabłonka sklepienia. Następnie usuwa się otolity, pozostawiając nienaruszony nabłonek sensoryczny. Ostatnim etapem jest zainfekowanie komórek podporowych utriculi za pomocą adenowirusa.Techniki te mogą być stosowane w szerokim zakresie eksperymentów zaprojektowanych do badania dojrzałych komórek rzęskowych i komórek podporowych ssaków in vitro. Komórki receptorowe zmysłu w uchu wewnętrznym nazywane są komórkami rzęskowymi; komórki te odpowiadają za przekształcanie energii dźwiękowej lub ruchu głowy w sygnały nerwowe przesyłane do mózgu.Utrata słuchu jest często spowodowana obumarciem tych sensorycznych komórek rzęsatych. W celu zbadania mechanizmów leżących u podłoża śmierci sensorycznych komórek rzęsatych bardzo użyteczne jest posiadanie modelu in vitro. Metoda, którą zaprezentujemy, wykorzystuje hodowle całych organów utriculi (utricula) pob

dissection-adult-mouse-utricle-adenovirus-mediated-supporting-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Sekcja przedsionka dorosłych myszy i infekcja komórek wspierających oporządzonym adenowirusem

W tym filmie wykorzystujemy adenowirus niosący gen rekombinazy Cre do zakażenia pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy posiadających floxowany allel Rac1.

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Opisane podejście chirurgiczne po usznym pozwala na szybkie i bezpośrednie dostarczenie do błony bębenkowej ślimaka myszy, jednocześnie minimalizując utratę krwi i śmiertelność zwierząt. Metoda ta może być stosowana w terapii ślimakowej z wykorzystaniem podawania molekularnego, farmakologicznego i wirusowego myszom po urodzeniu przez błonę okienną okrągłą.

Metoda chirurgiczna dostarczania genów za pośrednictwem wirusa do ucha wewnętrznego myszy przez błonę okrągłego okienka

Przedstawiamy metodę izolowania dorosłego organu Cortiego jako trzech nienaruszonych zwojów ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa). Demonstrujemy również procedurę barwienia immunologicznego za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Razem techniki te pozwalają na badanie komórek rzęsatych, komórek podporowych i innych typów komórek znajdujących się w ślimaku.

Rozwarstwienie całej góry i immunofluorescencja ślimaka dorosłej myszy

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Tutaj opisujemy procedurę kanasitomii, która umożliwia miejscowe dostarczanie leku do uszu wewnętrznych dorosłych i noworodków myszy przez kanał półkolisty przy minimalnym uszkodzeniu słuchu i funkcji przedsionkowej. Ta metoda może być stosowana do inokulacji wektorów wirusowych, farmaceutyków i małych cząsteczek w uchu wewnętrznym myszy.

Kanostomia jako chirurgiczne podejście do miejscowego dostarczania leków do uszu wewnętrznego myszy dorosłych i noworodków

Trójwymiarowe organotypowe hodowle mysiej łagiewki i ślimaka w optycznie czystych żelach kolagenowych I zachowują wrodzoną morfologię tkanek, pozwalają na mechaniczną stymulację poprzez dostosowanie sztywności matrycy i umożliwiają dostarczanie genów za pośrednictwem wirusa.

Trójwymiarowe hodowle organotypowe narządów zmysłów przedsionkowych i słuchowych

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.

Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

Poznaj metodę rozwarstwienia łagiewki dorosłej myszy i zakażenia komórek podporowych adenowirusem. Technika ta umożliwia badanie biologii komórek rzęskowych i mechanizmów regeneracji w uchu wewnętrznym.

Disekcja utriculi u dorosłej myszy i infekcja komórek podporowych za pomocą adenowirusa

Przeglądaj więcej filmów