Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie stabilnego, cienkiego okna w czaszce nad korą mózgu myszy, aby umożliwić wielokrotne obrazowanie bez naruszania środowiska wewnątrzczaszkowego. Osiąga się to najpierw poprzez przymocowanie uchwytu głowy, który pozwoli na stabilną stabilizację głowy pod aparaturą do obrazowania. Następnie należy ostrożnie zredukować grubość czaszki w obszarze nad grzbietową powierzchnią mózgu i wypolerować powierzchnię papierem ściernym o drobnej ziarnistości.

Następnie pokryj okno niewielką ilością kleju cyjanoakrylowego i nałóż szkiełko przedmiotowe, aby wzmocnić okno. Ostatnim krokiem jest przygotowanie zwierzęcia do obrazowania za pomocą mikroskopu dwufotonowego. W badaniach in vivo mikroskopia dwufotonowa służy do obrazowania drobnych struktur, takich jak tętnice, żyły, kapilary oraz dendryty neuronów, które mogą być obrazowane na głębokości do 250 micrometers w korze mózgowej przez wiele tygodni.

Główną zaletą tej techniki okna czaszkowego jest to, że czaszka nad korą nie zostaje całkowicie usunięta. Najpierw ścieńczamy czaszkę, aby uzyskać przejrzystość optyczną, a następnie wzmacniamy ją klejem cyjanoakrylowym i szkiełkiem przykrywkowym. Metoda ta powinna być przydatna do badania różnych linii fluorescencyjnych myszy transgenicznych w stanie znieczulenia lub w stanie OIC.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy wysterylizować w autoklawie wymagane narzędzia chirurgiczne, a następnie poddać znieczuleniu mysz w wieku około trzech do sześciu tygodni zgodnie z metodami opisanymi w załączonym manuskrypcie. Sprawdzić odruch poprzez ściśnięcie palca u stopy, aby upewnić się, że mysz znajduje się w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia. Następnie unieruchomić mysz w aparacie stereotaktycznym.

Utrzymaj temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C. W tym celu zastosuj termopodgiewacz z sondą rektalną z regulacją sprzężenia zwrotnego. Na oczy nałóż maść oftalmiczną, aby zapobiec ich wysychaniu.

Następnie należy ogolić skórę głowy za pomocą małej maszynki elektrycznej. Po tym kroku skórę głowy należy oczyścić Betadine, a następnie przemyć 70% isopropyl alcohol. Następnie pod mikroskopem należy ogrzać alikwot sterylnego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do 37 °C.

Za pomocą nożyczek chirurgicznych usuń skórę z całej grzbietowej powierzchni czaszki. Przytnij skórę bocznie do krawędzi mięśni skroniowych po obu stronach czaszki oraz tylnie do mięśni szyi. Następnie, używając ostrza skalpela, usuń cienką okostną z powierzchni czaszki.

Następnie osusz i oczyść czaszkę. Po tym kroku nanieś cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na powierzchnię czaszki. Pozostaw klej do całkowitego wyschnięcia.

Ta warstwa kleju jest niezbędna do zapewnienia prawidłowej adhezji cementu stomatologicznego. W kolejnych etapach, podczas przygotowania do obrazowania zwierząt w stanie czuwania, należy wywiercić otwory i wprowadzić dwa wkręty samowiercące nr 000 w przeciwległą powierzchnię czaszki.

Następnie do czaszki należy przymocować sztywny, wykonany na zamówienie łącznik z dwoma punktami mocowania. Znacznie ogranicza to stopnie swobody i ułatwia ponowne odnalezienie tego samego pola obrazowania w badaniach podłużnych. Szeroka poprzeczka zapewnia również wystarczającą przestrzeń do rozmieszczenia elektrod i stymulacji wibracyjnej.

Następnie pokryj całą powierzchnię czaszki, z wyjątkiem miejsca na okno, warstwą cementu stomatologicznego, upewniając się, że wszystkie odsłonięte brzegi skóry są zakryte cementem. Przed wykonaniem otworu w czaszce upewnij się, że wiertła są ostre i unikaj ich ponownego użycia. Użyj wiertarki stomatologicznej na niskich obrotach, aby zrobić otwór o wymiarach 2 mm na 2 mm nad korą somatosensoryczną, używając wiertła o średnicy 0,5 mm.

Następnie ścień powierzchnię suchej czaszki, robiąc to przez zaledwie kilka sekund na raz, okresowo nawilżając czaszkę płynem CSF, aby zapobiec przegrzaniu. Następnie wykonaj cieńczenie kości. Dalej zmniejsz prędkość obrotową wiertarki i zdejmuj warstwę z powierzchni czaszki, wykonując jedynie delikatne dotknięcia.

Wiertło powinno zbliżać się do powierzchni pod kątem około 30 stopni względem pionu. Należy kontynuować odcieńczenie kości poza warstwą naczyniową, aż do drugiej warstwy kostnej, powyżej powierzchni mózgu.

Należy prowadzić wiertło wykonując niewielkie, kontrolowane ruchy i przykładać siłę wyłącznie w kierunku bocznym. Gdy grubość kości wyniesie około 50 µm, naczynia peel powinny stać się wyraźnie widoczne przez zwilżoną kość. Przy tej głębokości w obrębie kości na kilka sekund pojawią się małe białe plamki.

Bezpośrednio po zwilżeniu suchej powierzchni czaszki końcowa grubość kości powinna wynosić około 10 do 15 mikronów. Gdy kość stanie się wystarczająco cienka, małe białe plamki w kości przestaną być widoczne po zwilżeniu suchej powierzchni czaszki. Teraz należy wypolerować okno proszkiem tlenku cyny.

Użyj małej szczypty proszku o rozmiarze odpowiadającym mniej więcej jednej czwartej powierzchni okna, a następnie wymieszaj go z CSF, tworząc zawiesinę, używając do tego gotowego wiertła z silikonowym końcem. Poleruj powierzchnię przez 10 minut, dokładnie wypłucz proszek tlenku cyny z okna i wysusz kość. Proces ten powinien pomóc w usunięciu wszelkich nierównych krawędzi pozostawionych przez wiertło podczas procedury ścieńczania.

Następnie wytnij kilka kwadratowych kawałków szkiełka nakrywkowego nr 0 o rozmiarze nieco mniejszym niż otwór okna. Za pomocą rylca delikatnie narysuj na szkiełku oddzielne linie poziome i pionowe. Przesuń krawędź prostokątną linijki tak, aby przełamać szkło bez jego rozbicia.

Następnie umieść szkiełko nakrywkę w szalce Petriego. Rozdziel kawałki szkła, uderzając szalką o krawędź stołu. Po tym kroku nałóż niewielką ilość kleju Sano ACRL na okienko, używając drewnianego końca złamanego aplikatora z bawełnianą końcówką.

Szybko umieść docięty kawałek szkiełka nakrywki na kleju. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywki po całkowitym wyschnięciu kleju przez 15 minut. Nadmiar kleju cyjanoakrylowego z górnej powierzchni szkiełka nakrywki usuń za pomocą ostrza skalpela.

Krawędzie okienka uszczelnij cementem dentystycznym. Następnie uformuj lekko wypukły otwór, który posłuży do utrzymania wody dla soczewki zanurzeniowej na koniec procedury. Umieść zwierzę w ciepłej klatce, aż całkowicie wybudzi się z narkozy.

W tym kroku należy ustabilizować zwierzę na stole optycznym do obrazowania, wykorzystując ramkę jako wsparcie dla głowy. Nasza oddzielna płyta umożliwia transport zwierzęcia wraz ze wszystkimi zmontowanymi urządzeniami do monitorowania parametrów fizjologicznych jako jednej jednostki pomiędzy miejscem przeprowadzania zabiegu chirurgicznego a stanowiskiem do obrazowania dwufotonowego. Jeśli wymagane jest obrazowanie przepływu krwi, należy wstrzyknąć 0,05 milliliters 5% fluorescencyjnego barwnika dekstranowego przez żyłę podorbitalną w celu oznakowania surowicy krwi.

Zabieg ten musi być przeprowadzony w znieczuleniu ogólnym, a barwnik zazwyczaj pozostaje w krwiobiegu przez kilka godzin. W celu utrzymania równowagi płynów ustrojowych i zapotrzebowania energetycznego, należy co dwie godziny wstrzykiwać do jamy otrzewnej płyn Ringera z mleczanem w objętości 3 µL/g. Wybudzić mysz poprzez zaprzestanie podawania izofluranu.

Godzinę po wybudzeniu mysz jest gotowa do obrazowania. Przykryj klatkę nad mikroskopem, aby zapobiec zanieczyszczeniu światłem. Poniżej przedstawiono przykład naczyń krwionośnych kory udowej u myszy YFP, znakowanej za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu sprzężonego z Texas red; naczynia oponowe są często widoczne nieco powyżej powierzchni kory w oponie twardej.

Duże tętnice i żyły powierzchowne znajdują się na powierzchni kory. Naczynia penetrujące odgałęziają się z tej sieci powierzchniowej i zanurzają w korze, gdzie rozgałęziają się w gęste łoże kapilarne zasilające tkankę korową. Ten film przedstawia układ naczyniowy na powierzchni kory u budzącej się myszy.

Spontaniczne oscylacje średnicy tętnicy można zaobserwować, gdy zwierzę znajduje się w stanie spokojnego spoczynku. Metoda ta powinna być użyteczna do badania szerokiej gamy fluorescencyjnych zwierząt w stanie znieczulonym lub w stanie czuwania.