Name: Wypolerowane i wzmocnione okienko z cieńszą czaszką do długoterminowego obrazowania mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę tworzenia stabilnego okienka czaszkowego u myszy do długoterminowego obrazowania mózgu. Technika ta umożliwia powtarzalne badania dynamiki komórkowej i przepływu krwi bez zapalenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez American Heart Association (stypendium podoktorskie dla AYS) oraz National Institutes of Health (granty MH085499, EB003832 oraz OD006831 dla DK). Dziękujemy Beth Friedman i Pablo Blinder za uwagi do manuskryptu.

1. Przygotowanie do operacji i
<ol>
 <li>Oczyść narzędzia chirurgiczne, poddając je sonikacji w mieszaninie Maxizyme i Surgical Milk w myjce ultradźwiękowej. Przed każdym eksperymentem wysterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie.</li>
 <li>Upewnij się, że wszystkie niezbędne odczynniki i materiały jednorazowe są dostępne. Lista odczynników i materiałów jednorazowych znajduje się w Tabeli 2. Odczynniki i materiały jednorazowe mające kontakt z odsłoniętą tkanką powinny być, w miarę możliwości, sterylne.</li>
 <li>Zwiez zwierzę. Typowe środki znieczulające odpowiednie do badań przeżywalności opisano w Tabeli 1. Upewnij się, że osiągnięto chirurgiczną głębokość znieczulenia, sprawdzając brak odruchu na uciśnięcie palca u nogi. Optymalny wiek myszy to od 3 do 6 tygodni. Czaszki młodszych myszy są miększe i trudniejsze do ścieńczenia. Starsze mysze mają grubsze czaszki, które bardziej krwawią podczas procedury ścieńczania.</li>
 <li>Zabezpiecz zwierzę w aparacie stereotaktycznym 1. Lista sprzętu chirurgicznego znajduje się w Tabeli 2.</li>
 <li>Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37°C, korzystając z sondy rektalnej z regulacją sprzężenia zwrotnego i mata grzewczego.</li>
 <li>Nałóż maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
 <li>Krótko ogol skórę głowy za pomocą małej maszynki elektrycznej.</li>
 <li>Oczyść skórę głowy Betadine, a następnie przemyj 70 % (v/v) alkoholem izopropylowym.</li>
 <li>W razie potrzeby sprawdź za pomocą pulsoksymetru, czy tętno i częstotliwość oddechów mieszczą się w normie. W przypadku myszy wartości te powinny oscylować odpowiednio wokół 10 Hz i 2 Hz.</li>
 <li>Podgrzej porcję sterylnie przefiltrowanego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) do 37°C (125 mM NaCl, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4) (wszystkie odczynniki firmy Sigma)2.</li>
</ol>
2. Montaż ramy głowy
<ol>
 <li>Za pomocą pęsety i nożyczek chirurgicznych usunąć skórę z całej grzbietowej powierzchni czaszki. Przyciąć skórę bocznie do krawędzi mięśni skroniowych po obu stronach czaszki oraz tylnie do mięśni szyi (Rys. 1A).</li>
 <li>Za pomocą ostrza skalpela usunąć cienką okostną z powierzchni czaszki.</li>
 <li>Oczyścić czaszkę wilgotnym aplikatorem z watką i osuszyć jej powierzchnię strumieniem powietrza z puszki do przedmuchiwania. Następnie nałożyć cienką warstwę kleju cyjanoakrylanowego na całą powierzchnię czaszki. Pozostawić klej do całkowitego wyschnięcia. Warstwa ta jest niezbędna do właściwego przylegania cementu stomatologicznego w kolejnych krokach. Klej cyjanoakrylanowy nie wymaga sterylizacji.</li>
 <li>Przymocować metalowy łącznik do powierzchni czaszki, z dala od obszaru planowanego okna. W przypadku preparatów znieczulonych do czaszki można przymocować małą nakrętkę za pomocą kropli kleju cyjanoakrylanowego, którą później można przykręcić do zestawu obrazującego za pomocą śruby (Rys. 1B, 1L i 1N). Tylną stronę nakrętki należy zakleić taśmą, aby zapobiec dostaniu się kleju do gwintu podczas mocowania do czaszki. Nakrętka i taśma powinny zostać wysterylizowane w autoklawie przed operacją.</li>
 <li>W przypadku preparatów do obrazowania w stanie czuwania przymocować sztywniejszy, niestandardowy łącznik z dwoma punktami mocowania (Rys. 1M i 1N). Wywiercić dwa otwory w czaszce nad przeciwległą półkulą korową za pomocą wiertła o średnicy ½ mm, a następnie wprowadzić dwie śruby samowiercące #000. Śruby te pomogą zakotwiczyć uchwyt głowy w czaszce. Wykonać tylko jeden pełny obrót śruby, aby uniknąć wywierania nacisku na leżącą poniżej korę. Następnie przymocować niestandardową metalową poprzeczkę za pomocą małej kropli kleju cyjanoakrylanowego nad móżdżkiem. Pozostawić klej cyjanoakrylanowy do całkowitego wyschnięcia. Ten metalowy łącznik znacznie ogranicza stopnie swobody i ułatwia ponowne zlokalizowanie tego samego pola obrazowania w badaniach podłużnych. Szeroka poprzeczka zapewnia wystarczająco dużo miejsca do umieszczenia elektrod i stymulacji wibrys. Szczegółowe plany wykonania niestandardowego uchwytu głowy i urządzenia mocującego są dostępne online (<a href="http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html">http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html</a>). Śruby i poprzeczka powinny zostać wysterylizowane w autoklawie przed operacją.</li>
 <li>Pokryć całą powierzchnię czaszki, z wyłączeniem miejsca na okno, warstwą cementu stomatologicznego (Rys. 1C i 1D). Upewnić się, że wszystkie odsłonięte krawędzie skóry są przykryte cementem. Składniki cementu stomatologicznego nie wymagają sterylizacji.</li>
</ol>
3. Tworzenie polerowanego i wzmocnionego okna z cienkiej czaszki (PoRTS)
<ol>
 <li>Należy upewnić się, że wiertła są ostre i unikać ich ponownego użycia. Przy niskiej prędkości wiertła stomatologicznego należy zcieńczyć obszar o wymiarach 2 mm na 2 mm nad korą somatosensoryczną, używając wiertła ½ mm. Należy naprzemiennie zwilżać czaszkę roztworem ACSF i osuszać jej powierzchnię delikatnym strumieniem powietrza z puszki ze sprężonym powietrzem; zwilżanie służy do chłodzenia, a osuszanie do cieńczenia. Wymaga to cieńczenia przez warstwę gąbczastą czaszki, co może spowodować krwawienie, które można opanować poprzez płukanie ACSF (Rys. 1E). Czaszka zaczyna się uginać pod lekkim naciskiem wiertła, gdy jej grubość wynosi ~50 μm, a naczynia oponowe powinny być widoczne przez wilgotną kość (Rys. 1F). Przy tej grubości małe białe plamki w obrębie kości staną się widoczne przez kilka sekund bezpośrednio po zwilżeniu suchej powierzchni czaszki.</li>
 <li>Na tym etapie należy jeszcze bardziej zcieńczyć kość. Należy użyć niższej prędkości obrotowej wiertła, tj. 1000 rpm, co pozwala na ścieranie powierzchni czaszki przy jedynie lekkim dotyku. Należy wykonywać małe, kontrolowane ruchy, trzymając wiertło jak długopis i przykładając siłę wyłącznie w kierunku bocznym. Kość powinna mieć końcową grubość ~10 do 15 μm (Rys. 1G). Gdy kość jest wystarczająco cienka, małe białe plamki w kości nie będą już widoczne po zwilżeniu suchej powierzchni czaszki.</li>
 <li>Obszar okna należy wypolerować proszkiem z tlenku cyny. Należy przymocować gotowy wkład wiertarski, który został zanurzony w silikonowym uszczelniaczu akwariowym i wyjęty, tworząc zwężający się wierzchołek (wstawka, Rys. 1H). Silikonowy wierzchołek powinien zostać przygotowany co najmniej jeden dzień przed operacją i wysterylizowany 70% izopropanolem przed użyciem. Na okno należy nałożyć małą szczyptę proszku wraz z kroplą ACSF (Rys. 1H). Zawiesinę należy mieszać nad oknem przez maksymalnie dziesięć minut, delikatnie dotykając końcówką ruchomego wierzchołka powierzchni czaszki. Proszek z tlenku cyny należy dokładnie wypłukać z okna za pomocą ACSF, a następnie dokładnie osuszyć kość delikatnym strumieniem powietrza. Nieregularności powierzchni oraz przylegające odłamki kostne pozostałe po wierceniu w poprzednich krokach powinny zostać usunięte po polerowaniu (Rys. 1H i 1I). Proszku z tlenku cyny nie trzeba sterylizować.</li>
 <li>Należy wyciąć kwadratowe kawałki szkiełka podstawowego nr 0, nieco mniejsze niż rozmiar okna. Za pomocą rylca należy delikatnie naciąć oddzielne linie poziome i pionowe w szkiełku, używając linijki. Następnie szkiełko należy umieścić w szalce Petriego i uderzyć szalką o krawędź stołu, aby oddzielić kawałki szkła. Całą szalkę Petriego można następnie poddać autoklawowaniu, aby zapewnić sterylność.</li>
 <li>Obok osuszonego okna należy położyć dopasowane rozmiarem szkiełko podstawowe. Za pomocą końcówki złamanego drewnianego aplikatora z watą należy nałożyć małą ilość kleju cyjanoakrylowego na okno, a następnie szybko docisnąć docięty kawałek szkiełka do kleju. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem. Szkiełko należy delikatnie docisnąć do powierzchni czaszki i przytrzymać przez kilka sekund (Rys. 1J i 1O). Należy pozostawić klej do całkowitego wyschnięcia przez 15 minut. Nadmiar kleju cyjanoakrylowego można usunąć z górnej powierzchni szkiełka za pomocą ostrza skalpela po jego wyschnięciu. Krawędzie szkiełka należy uszczelnić cementem stomatologicznym, tworząc lekko wypukłą studzienkę do utrzymania wody dla soczewki zanurzeniowej (Rys. 1K i 1O).</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie
<ol>
 <li>Po operacji umieść zwierzę w ciepłej klatce. Monitoruj zwierzę okresowo, aż całkowicie wybudzi się z anestezji.</li>
 <li>Jeśli preparat ma przetrwać więcej niż jeden dzień, podaj buprenorfinę (0,03 μg na g masy gryzonia) w celu przeciwbólowczym. Zazwyczaj obrazowanie zwierzęcia przeprowadzamy co najmniej jeden dzień po początkowej implantacji.</li>
</ol>
5. Przygotowanie do obrazowania
<ol>
 <li>Ustabilizuj zwierzę na stole optycznym do obrazowania, używając ramki jako podpórki pod głowę (Rys. 1L i 1M). Aparaturę unieruchamiającą można wykonać z dostępnych komercyjnie komponentów optomechanicznych firmy Qioptiq lub ThorLabs. Nasza oddzielna płyta umożliwia transport zwierzęcia wraz z wszystkimi urządzeniami do monitorowania fizjologicznego jako jedna jednostka między salą operacyjną a pracownią obrazowania dwufotonowego 3.</li>
 <li>Jeśli planowane jest obrazowanie przepływu krwi, wstrzyknij 0,05 mL 5% (w/v) fluorescencyjnego barwnika dekstranowego rozpuszczonego w jałowej soli fizjologicznej, albo przez żyłę ogonową, albo przez żyłę podoczną, aby oznakować surowicę krwi (Rys. 2A oraz 2C do 2H) 4-7. Zabieg ten musi być wykonany w znieczuleniu ogólnym. Podanie do żyły podocznej może być łatwiejsze dla osób początkujących, ponieważ roztwory dekstranu są bardziej lepkie. Żyłę ogonową może być trudno zlokalizować u myszy o ciemnym umaszczeniu, a żyła ta ma tendencję do zapadania się po nieudanym wstrzyknięciu. Do obrazowania naczyń krwionośnych z emisją zieloną należy użyć dekstranu z izotiocyjanianem fluoresceiny. Do emisji czerwonej należy użyć dekstranu Texas Red. W przypadku dekstranów o wysokiej masie cząsteczkowej barwnik pozostanie w krążeniu przez kilka godzin. Alternatywnie, zwierzęta z endogennymi znacznikami fluorescencyjnymi można obrazować bezpośrednio przy odpowiedniej długości fali wzbudzenia dwufotonowego. Roztwór dekstranu można mrozić w alikwotach do późniejszego użycia.</li>
 <li>Delikatnie oczyść powierzchnię okna wilgotnym aplikatorem z bawełnianą końcówką.</li>
 <li>W przypadku długotrwałego obrazowania preparatów znieczulonych, wstrzykuj jałowy roztwór Ringera z mleczanami dootrzewnowo w objętości 3 μL na gram co 2 godziny, aby utrzymać poziom płynów ustrojowych i zapotrzebowanie energetyczne.</li>
 <li>Podczas obrazowania zwierząt w stanie czuwania ogranicz unieruchomienie głowy do zaledwie kilku godzin naraz, aby zredukować poziom stresu. Między sesjami obrazowania przekładaj zwierzę do klatki domowej w celu zapewnienia pożywienia i wody.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Prawidłowo wykonane okno umożliwi obrazowanie na głębokości do 250 μm poniżej powierzchni opony miękkiej przez kilka miesięcy. Metoda ta była wykorzystywana do badania in vivo przepływu krwi w naczyniach włosowatych 4, 8, aktywacji mikrogleju 8, 9 oraz struktury dendrytów w miąższu kory mózgu 8. W jednym z przykładów wykorzystujemy obrazowanie dwufotonowe do ukazania unaczynienia kory u znieczuczonej myszy Thy1-yellow fluorescent protein (YFP), po uprzednim znakowaniu surowicy krwi poprzez dożylny wtrysk dekstranu Texas Red (Rys. 2A). Naczynia opony twardej są często widoczne nieco powyżej powierzchni kory, w obrębie opony twardej (Rys. 2C, strzałka). Duże tętniczki i żyłki oponowe znajdują się na powierzchni kory (Rys. 2D). Naczynia penetrujące odgałęziają się od tej sieci powierzchniowej i wnikają do kory, gdzie rozgałęziają się w gęste łoże kapilarne zasilające tkankę korową (Rys. 2E do 2H). Drzewa dendrytyczne głębokich neuronów kory wykazujących ekspresję YFP, będących sygnałem endogennym dla tej linii myszy, mogą być obrazowane równocześnie w drugim kanale 10 (Rys. 2B do 2H). Sygnał drugiej harmoniki kości był zbierany w trzecim kanale i może służyć do oceny grubości ścienionej czaszki po zebraniu stosów obrazów (Rys. 2A do 2C).
Dynamika naczyniowa kory jest w znacznym stopniu modyfikowana przez środki znieczulające 11. W drugim przykładzie prezentujemy wideo obrazujące spontaniczną wazoaktywność, zarejestrowane za pomocą mikroskopii dwufotonowej u oswojonej, budzącej się myszy. Wyraźne oscylacje wazomotoryczne średnicy światła naczynia są widoczne w arteriolce oponowej, ale nie w sąsiedniej wenuli. Ten podstawowy zakres wazoaktywności ulega zmniejszeniu podczas znieczulenia uretanem 4. Aby ilościowo określić spontaniczne i wywołane zmiany w przepływie krwi, stosujemy dostosowane techniki skanowania liniowego w celu zarejestrowania zarówno średnicy naczyniowej, jak i prędkości erytrocytów w poszczególnych naczyniach. Szczegółowe zasoby dotyczące ilościowego obrazowania przepływu krwi z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej są dostępne 3, 12.
<img alt="Przygotowanie okna czaszkowego PoRTS u gryzoni; schematy chirurgiczne krok po kroku i konfiguracja eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Procedura wykonania okna PoRTS. (A do K) Obrazy kolejnych kroków procedury tworzenia okna PoRTS. Szczegółowe instrukcje znajdują się w tekście. β = bregma i λ = lambda. (L) System śruby i nakrętki do stabilizacji głowy podczas obrazowania preparatów znieczulonych. (M) Specjalistyczny, obrabiany mechanicznie uchwyt poprzeczny do preparatów w stanie czuwania. W tym przykładzie zaimplantowano również konektor do wielokrotnych rejestracji elektrokortykogramu. (N) Schemat przedstawiający widok grzbietowy uchwytu głowy oraz położenie poszczególnych elementów. Nakrętka użyta w panelu L stanowi alternatywę dla poprzeczki użytej w panelu M. W przypadku uchwytu z poprzeczką dodaje się dwie wkręty samowiercące #000 w celu zwiększenia stabilności preparatów do obrazowania w stanie czuwania. (O) Schemat przedstawiający przekrój poprzeczny okna PoRTS.
<img alt="Obrazowanie struktury naczyniowej i dendrytycznej; mikroskopia konfokalna, mapowanie głębokości czaszki; wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Obrazowanie dwufotonowe unaczynienia i struktury neuronalnej w korze mysiej. Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane przez okno PoRTS u myszy Thy1-YFP w 2. dniu po implantacji okna 10. Projekcja maksymalna z 150 μm tkanki w orientacji coronalnej, przedstawiająca odchudzoną czaszkę w relacji do unaczynienia (A) oraz dendrytów (B). Kość (kolor niebieski) została wykryta poprzez rejestrację fluorescencji drugiej harmonicznej przy emisji 450 nm i wzbudzeniu 900 nm 8. Unaczynienie (kolor czerwony) zostało oznakowane za pomocą dożylnie wstrzykniętego dekstranu Texas Red 70 kDa 6. Pola dendrytyczne neuronów (kolor zielony) są endogenne dla transgenicznej linii myszy Thy1-YFP. (C-H) Projekcje maksymalne z 50 μm tkanki w orientacji horyzontalnej na różnych głębokościach poniżej opony miękkiej. Dane pochodzą z tego samego stosu obrazów, który przedstawiono na panelach A i B. Naczynia oponowe mogą być widoczne tuż nad powierzchnią kory (strzałka w C).
Skróty
ACSF = sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy 
PoRTS = wypolerowane i wzmocnione okno w cienkiej czaszce 
YFP = żółte białko fluorescencyjne
iNależy upewnić się, że opisane procedury zostały zatwierdzone przez lokalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee).

<ol><li>Cetin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).</li>
<li>Kleinfeld, D., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+representation+of+vibrissa+movement+in+the+upper+layers+of+somatosensory+cortex+revealed+with+voltage+sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes.</a> Journal of Comparative Neurology. 375, 89-108 (1996).</li>
<li>Driscoll, J. D. Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDriscoll%2C+JD+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%22">Imaging in Neuroscience and Development</a>. Yuste, R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 927-937 (2011).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extends+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extends arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 108, 8473-8473 (2011).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+2-Photon+Imaging+of+Blood+Flow+in+the+Neocortex+through+a+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window.</a> J. Vis. Exp. (12), e678-e678 (2008).</li>
<li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reversible+changes+in+dendritic+spine+structure+in+vivo+gated+by+the+degree+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid reversible changes in dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia.</a> Journal of Neuroscience. 25, 5333-5338 (2005).</li>
<li>Takano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-mediated+control+of+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow.</a> Nature Neuroscience. 9, 260-267 (2006).</li>
<li>Drew, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Marker, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of Visualized Experiments. (43), e2059-e2059 (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+neural-hemodynamic+coupling+and+the+hemodynamic+response+function+in+the+awake+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Investigating neural-hemodynamic coupling and the hemodynamic response function in the awake rat.</a> Neuroimage. 32, 33-48 (2006).</li>
<li>Shih, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Kobat, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17, 13354-13364 (2009).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4, 1128-1144 (2009).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10, 549-551 (2007).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li>
<li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature Neuroscience. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Ascenzi, A., Fabry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+dissection+and+measurement+of+refractive+index+of+osteons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Technique for dissection and measurement of refractive index of osteons.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 6, 139-142 (1959).</li>
<li>Stosiek, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Dunn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cerebral+blood+flow+using+laser+speckle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cerebral blood flow using laser speckle.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 195-201 (2001).</li>
<li>Villringer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+perfusion+of+the+rat+brain+cortex%3A+An+in+vivo+confocal+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Capillary perfusion of the rat brain cortex: An in vivo confocal microscopy study.</a> Circulation Research. 75, 55-62 (1994).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li>
<li>Srinivasan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+for+the+quantitative+study+of+cerebrovascular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography for the quantitative study of cerebrovascular physiology.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31, 1339-1345 (2011).</li>
<li>Hu, S., Wang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+imaging+and+characterization+of+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature.</a> Journal of Biomedical Optics. 15, 011101-011101 (2010).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlecknell%2C+PA+%22Laboratory+animal+anesthesia%22">Laboratory animal anesthesia</a>. , Academic Press. San Diego. (1987).</li>
</ol>

Brak konfliktów interesów.

Obrazowanie dwufotonowe przez okno PoRTS wymaga transmisji przez odcieńczoną kość oraz oponę twardą, co osłabia światło lasera i wprowadza aberracje optyczne na większych głębokościach 8. Jednak pomimo tej wady, przy wzbudzeniu długością fali 900 nm możliwe jest uzyskanie głębokości obrazowania do 250 μm poniżej powierzchni pialnej. Większe głębokości obrazowania mogą być w zasadzie możliwe przy zastosowaniu dłuższych długości fal wzbudzenia 13. Główną zaletą tej metody jest brak stanu zapalnego kor...

polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo obrazowanie funkcji kory mózgu wymaga dostępu optycznego do mózgu bez naruszania środowiska wewnątrzczaszkowego. Przedstawiamy metodę tworzenia polerowanego i wzmocnionego okna z cieńszej czaszki (PoRTS) w czaszce myszy, które osiąga średnicę kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy. Czaszka jest cieńszona do grubości od 10 do 15 μm za pomocą wiertarki ręcznej w celu uzyskania przejrzystości optycznej, a następnie pokrywana klejem cyjanoakrylowym i szkiełkiem podstawowym, aby: 1) zapewnić sztywność, 2) zapobiec odrastaniu kości oraz 3) zredukować rozpraszanie światła spowodowane nierównościami powierzchni kości. Ponieważ czaszka nie zostaje przebita, znacznie ograniczony jest każdy stan zapalny, który mógłby wpłynąć na badany proces. Głębokość obrazowania do 250 μm poniżej powierzchni kory można osiągnąć przy użyciu dwufotonowej mikroskopii skaningowej. Okno to jest dobrze dostosowane do badania przepływu krwi w mózgu oraz funkcji komórkowych zarówno w preparatach z narkozą, jak i u zwierząt przebudzonych. Oferuje ono ponadto możliwość manipulowania aktywnością komórek za pomocą optogenetyki lub zakłócania przepływu krwi w wybranych naczyniach poprzez naświetlanie krążących fotosensybilizatorów.

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Obrazowanie funkcji kory mózgu in vivo wymaga dostępu optycznego do mózgu bez zaburzania środowiska wewnątrzczaszkowego. Przedstawiamy metodę tworzenia ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie stabilnego, cienkiego okna w czaszce nad korą mózgu myszy, aby umożliwić wielokrotne obrazowanie bez naruszania środowiska wewnątrzczaszkowego. Osiąga się to najpierw poprzez przymocowanie uchwytu głowy, który pozwoli na stabilną stabilizację głowy pod aparaturą do obrazowania. Następnie należy ostrożnie zredukować grubość czaszki w obszarze nad grzbietową powierzchnią mózgu i wypolerować powierzchnię papierem ściernym o drobnej ziarnistości.Następnie pokryj okno niewielką ilością kleju cyjanoakrylowego i nałóż szkiełko przedmiotowe, aby wzmocnić okno. Ostatnim krokiem jest przygotowanie zwierzęcia do obrazowania za pomocą mikroskopu dwufotonowego. W badaniach in vivo mikroskopia dwufotonowa służy do obrazowania drobnych struktur, takich jak tętnice, żyły, kapilary oraz dendryty neuronów, które mogą być obrazowane na głębokości do 250 micrometers w korze mózgowej przez wiele tygodni.Główną zaletą tej techniki okna czaszkowego jest to, że czaszka nad korą nie zostaje całkowicie usunięta. Najpierw ścieńczamy czaszkę, aby uzyskać przejrzystość optyczną, a następnie wzmacniamy ją klejem cyjanoakrylowym i szkiełkiem przykrywkowym. Metoda ta powinna być przydatna do badania różnych linii fluorescencyjnych myszy transgenicznych w stanie znieczulenia lub w stanie OIC.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wysterylizować w autoklawie wymagane narzędzia chirurgiczne, a następnie poddać znieczuleniu mysz w wieku około trzech do sześciu tygodni zgodnie z metodami opisanymi w załączonym manuskrypcie. Sprawdzić odruch poprzez ściśnięcie palca u stopy, aby upewnić się, że mysz znajduje się w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia. Następnie unieruchomić mysz w aparacie stereotaktycznym.Utrzymaj temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C. W tym celu zastosuj termopodgiewacz z sondą rektalną z regulacją sprzężenia zwrotnego. Na oczy nałóż maść oftalmiczną, aby zapobiec ich wysychaniu.Następnie należy ogolić skórę głowy za pomocą małej maszynki elektrycznej. Po tym kroku skórę głowy należy oczyścić Betadine, a następnie przemyć 70% isopropyl alcohol. Następnie pod mikroskopem należy ogrzać alikwot sterylnego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego do 37 °C.Za pomocą nożyczek chirurgicznych usuń skórę z całej grzbietowej powierzchni czaszki. Przytnij skórę bocznie do krawędzi mięśni skroniowych po obu stronach czaszki oraz tylnie do mięśni szyi. Następnie, używając ostrza skalpela, usuń cienką okostną z powierzchni czaszki.Następnie osusz i oczyść czaszkę. Po tym kroku nanieś cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na powierzchnię czaszki. Pozostaw klej do całkowitego wyschnięcia.Ta warstwa kleju jest niezbędna do zapewnienia prawidłowej adhezji cementu stomatologicznego. W kolejnych etapach, podczas przygotowania do obrazowania zwierząt w stanie czuwania, należy wywiercić otwory i wprowadzić dwa wkręty samowiercące nr 000 w przeciwległą powierzchnię czaszki.Następnie do czaszki należy przymocować sztywny, wykonany na zamówienie łącznik z dwoma punktami mocowania. Znacznie ogranicza to stopnie swobody i ułatwia ponowne odnalezienie tego samego pola obrazowania w badaniach podłużnych. Szeroka poprzeczka zapewnia również wystarczającą przestrzeń do rozmieszczenia elektrod i stymulacji wibracyjnej.Następnie pokryj całą powierzchnię czaszki, z wyjątkiem miejsca na okno, warstwą cementu stomatologicznego, upewniając się, że wszystkie odsłonięte brzegi skóry są zakryte cementem. Przed wykonaniem otworu w czaszce upewnij się, że wiertła są ostre i unikaj ich ponownego użycia. Użyj wiertarki stomatologicznej na niskich obrotach, aby zrobić otwór o wymiarach 2 mm na 2 mm nad korą somatosensoryczną, używając wiertła o średnicy 0,5 mm.Następnie ścień powierzchnię suchej czaszki, robiąc to przez zaledwie kilka sekund na raz, okresowo nawilżając czaszkę płynem CSF, aby zapobiec przegrzaniu. Następnie wykonaj cieńczenie kości. Dalej zmniejsz prędkość obrotową wiertarki i zdejmuj warstwę z powierzchni czaszki, wykonując jedynie delikatne dotknięcia.Wiertło powinno zbliżać się do powierzchni pod kątem około 30 stopni względem pionu. Należy kontynuować odcieńczenie kości poza warstwą naczyniową, aż do drugiej warstwy kostnej, powyżej powierzchni mózgu.Należy prowadzić wiertło wykonując niewielkie, kontrolowane ruchy i przykładać siłę wyłącznie w kierunku bocznym. Gdy grubość kości wyniesie około 50 µm, naczynia peel powinny stać się wyraźnie widoczne przez zwilżoną kość. Przy tej głębokości w obrębie kości na kilka sekund pojawią się małe białe plamki.Bezpośrednio po zwilżeniu suchej powierzchni czaszki końcowa grubość kości powinna wynosić około 10 do 15 mikronów. Gdy kość stanie się wystarczająco cienka, małe białe plamki w kości przestaną być widoczne po zwilżeniu suchej powierzchni czaszki. Teraz należy wypolerować okno proszkiem tlenku cyny.Użyj małej szczypty proszku o rozmiarze odpowiadającym mniej więcej jednej czwartej powierzchni okna, a następnie wymieszaj go z CSF, tworząc zawiesinę, używając do tego gotowego wiertła z silikonowym końcem. Poleruj powierzchnię przez 10 minut, dokładnie wypłucz proszek tlenku cyny z okna i wysusz kość. Proces ten powinien pomóc w usunięciu wszelkich nierównych krawędzi pozostawionych przez wiertło podczas procedury ścieńczania.Następnie wytnij kilka kwadratowych kawałków szkiełka nakrywkowego nr 0 o rozmiarze nieco mniejszym niż otwór okna. Za pomocą rylca delikatnie narysuj na szkiełku oddzielne linie poziome i pionowe. Przesuń krawędź prostokątną linijki tak, aby przełamać szkło bez jego rozbicia.Następnie umieść szkiełko nakrywkę w szalce Petriego. Rozdziel kawałki szkła, uderzając szalką o krawędź stołu. Po tym kroku nałóż niewielką ilość kleju Sano ACRL na okienko, używając drewnianego końca złamanego aplikatora z bawełnianą końcówką.Szybko umieść docięty kawałek szkiełka nakrywki na kleju. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywki po całkowitym wyschnięciu kleju przez 15 minut. Nadmiar kleju cyjanoakrylowego z górnej powierzchni szkiełka nakrywki usuń za pomocą ostrza skalpela.Krawędzie okienka uszczelnij cementem dentystycznym. Następnie uformuj lekko wypukły otwór, który posłuży do utrzymania wody dla soczewki zanurzeniowej na koniec procedury. Umieść zwierzę w ciepłej klatce, aż całkowicie wybudzi się z narkozy.W tym kroku należy ustabilizować zwierzę na stole optycznym do obrazowania, wykorzystując ramkę jako wsparcie dla głowy. Nasza oddzielna płyta umożliwia transport zwierzęcia wraz ze wszystkimi zmontowanymi urządzeniami do monitorowania parametrów fizjologicznych jako jednej jednostki pomiędzy miejscem przeprowadzania zabiegu chirurgicznego a stanowiskiem do obrazowania dwufotonowego. Jeśli wymagane jest obrazowanie przepływu krwi, należy wstrzyknąć 0,05 milliliters 5% fluorescencyjnego barwnika dekstranowego przez żyłę podorbitalną w celu oznakowania surowicy krwi.Zabieg ten musi być przeprowadzony w znieczuleniu ogólnym, a barwnik zazwyczaj pozostaje w krwiobiegu przez kilka godzin. W celu utrzymania równowagi płynów ustrojowych i zapotrzebowania energetycznego, należy co dwie godziny wstrzykiwać do jamy otrzewnej płyn Ringera z mleczanem w objętości 3 µL/g. Wybudzić mysz poprzez zaprzestanie podawania izofluranu.Godzinę po wybudzeniu mysz jest gotowa do obrazowania. Przykryj klatkę nad mikroskopem, aby zapobiec zanieczyszczeniu światłem. Poniżej przedstawiono przykład naczyń krwionośnych kory udowej u myszy YFP, znakowanej za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu sprzężonego z Texas red; naczynia oponowe są często widoczne nieco powyżej powierzchni kory w oponie twardej.Duże tętnice i żyły powierzchowne znajdują się na powierzchni kory. Naczynia penetrujące odgałęziają się z tej sieci powierzchniowej i zanurzają w korze, gdzie rozgałęziają się w gęste łoże kapilarne zasilające tkankę korową. Ten film przedstawia układ naczyniowy na powierzchni kory u budzącej się myszy.Spontaniczne oscylacje średnicy tętnicy można zaobserwować, gdy zwierzę znajduje się w stanie spokojnego spoczynku. Metoda ta powinna być użyteczna do badania szerokiej gamy fluorescencyjnych zwierząt w stanie znieczulonym lub w stanie czuwania.

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Okno z wyszczuplonym i wzmocnionym czaszkiem do długotrwałego obrazowania mózgu myszy

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Ten film przedstawia zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu okna czaszkowego w modelu mysim w celu zapewnienia stabilnego dostępu optycznego do różnych obszarów mózgu.

Implantacja okienka obrazowania czaszki w modelu mysim: zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu szkiełka nakrywkowego na bazie szkła w celu stabilnego dostępu optycznego do obszarów mózgu myszy

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Poznaj metodę tworzenia stabilnego okienka czaszkowego u myszy do długoterminowego obrazowania mózgu. Technika ta umożliwia powtarzalne badania dynamiki komórkowej i przepływu krwi bez zapalenia.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów