Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem tkanek Drosophila

Niniejsza procedura pozwala na uzyskanie danych z immunoprecypitacji chromatyny z wypreparowanej tkanki muchy, aby dokładnie odzwierciedlić stan chromatyny in vivo w tkankach Drosophila. W tym przypadku setki jąder są pobierane poprzez dyssekcję ręczną. Testy immunoprecypitacji chromatyny są przeprowadzane z użyciem przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania.

Następnie przeprowadzono ilościową analizę R-T-P-C-R w celu potwierdzenia wzbogacenia specyficznego regionu genomowego w oczyszczonym DNA z chipa. Alternatywnie, sekwencjonowanie wysokoprzepustowe próbki z chipa pozwala na wygenerowanie profilu w całym genomie. Ostatecznie analiza chipowa wypreparowanej tkanki dostarcza obrazu stanu chromatyny w komórkach w ich warunkach fizjologicznych.

Niniejszy protokół został zoptymalizowany do analizy tkanek wyizolowanych bezpośrednio z organizmu. W celu uzyskania informacji o stanach chromatyny i epigenetyce w rzeczywistych warunkach fizjologicznych, zaprezentujemy zastosowanie metody ChIP u muszki owocówki drosophila w celu zbadania stanu chromatyny. Protokół ten można zastosować również u innych organizmów, takich jak mysz lub zebrafish.

Wizualna demonstracja tego protokołu jest kluczowa dla uzyskania DNA o niewystarczającej jakości i ilości, aby można było je wykorzystać do analizy na chipach lub do generowania bibliotek sekwencyjnych w sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym. Najpierw wypreparuj interesującą tkankę – w tym przypadku około 200 par jąder drozoful – w zimnym PBS zawierającym inhibitor proteazy i 100 µg/mL PMSF. Po dwukrotnym wypłukaniu tkanki, resuspenduj ją w 200 µL tego samego roztworu PBS z inhibitorami.

Następnie utrwalono próbkę, dodając 5,5 µL podgrzanej 37% formaldehydu. Inkubowano w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po każdym pięciu minutach mieszczano próbkę w wortexie, a następnie pozostawiono tkankę do osadzenia na lodzie.

Przepłucz dwukrotnie 450 µL PBS zawierającego inhibitory. Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C. Połączyć 200 próbek jąder oph w probówce typu einor o pojemności 1,75 mL.

Odssać bufor i ponownie zawiesić próbki w 200 µL buforu do lizy. Całkowicie rozbić tkankę homogenizatorem typu „blue”, upewniając się, że nie pozostały żadne agregaty, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie poddaj próbkę fragmentacji za pomocą sonikacji mikropłytką, pozostawiając ją na lodzie przez 50 sekund. Powtórz ten proces cztery-pięć razy, aby uzyskać optymalną wielkość fragmentów dla celu ChIP. Następnie rozcieńcz próbkę 1,8 mililitrami buforu ripper, aby przygotować zapas ekstraktu chromatyny. Dla powodzenia analizy ChIP krytyczne jest empiryczne określenie wielkości fragmentów DNA.

Aby przejść do eksperymentu z wykorzystaniem chipa, należy przeprowadzić elektroforezę w żelu. W przypadku próbki kontrolnej wejściowej należy pobrać 50 µL. Dodać 2 µL NaCl o stężeniu 5 M i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc.

Aby odwrócić sieciowanie, należy przystąpić do konjugacji przeciwciała z białkiem. Kulki proteiny A znajdują się w 1,5 mililitrowej probówce Fendor. Należy dodać 40 µL kulek proteiny A oraz 600 µL PBS, a następnie inkubować w ruchu obrotowym w temperaturze 4 °C przez dwie minuty.

Następnie poddaj kulki działaniu magnesu i odlej nadsącz. Teraz dodaj 100 µL PBS oraz odpowiednie przeciwciało. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Po zebraniu kulek za pomocą magnesu, należy dodać 1 mL ekstraktu chromatyny z tkanki. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w rotacji. Następnie próbkę ChIP należy przyłożyć do magnesu i usunąć nadfiltrat.

Następnie przeprowadź płukanie zebranych kulek w 1 ml buforu w temperaturze 4°C przez 10 minut podczas każdego płukania, po czym resuspenduj kulek w 100 µL buforu TEA. Aby odwrócić sieciowanie kompleksów białko-DNA, dodaj 3 µL 10% SDS oraz 5 µL Proteinazy K w stężeniu 20 mg/mL. Inkubuj w temperaturze 65°C przez noc.

Odwirować kuleczki za pomocą magnesu. Przenieść nadsącz zawierający DNA do nowej probówki. Przepłukać kuleczki raz, a następnie połączyć nadsącze zawierające DNA.

Następnie DNA należy oczyścić za pomocą ekstrakcji fenol-chloroformowej i przenieść górną warstwę wodną do nowej probówki. DNA wytrąca się przy użyciu 20 µg/mL liniowej akrylamidu lub glikogenu, 20 µL 3 M octanu sodu oraz 500 µL 100% etanolu.

Wymieszać dokładnie i inkubować w temperaturze -80 °C przez 10 minut. Wytrącić DNA poprzez wirowanie. Odlać supernatant i, po wysuszeniu na powietrzu, przemyć osad raz 300 µL 70% etanolu.

Resuspend granulki DNA w 50 µL buforu TE. Próbki DNA z nacięć należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotuj rozcieńczenia seryjne genomowego DNA do krzywej standardowej.

W płytce 96-dołkowej, wykorzystując matryce z rozcieńczonej kontroli wejściowej genomowego DNA lub DNA po trawieniu (chipped DNA), przygotuj reakcje qPCR o objętości 20 µL w duplikacie, a następnie odwiruj płytkę w wirówce do miniplate'ów. Próbkę z płytki poddaj analizie w systemie PCR w czasie rzeczywistym w celu walidacji danych. W pierwszej kolejności zweryfikuj obecność pojedynczego piku na wykresie dysocjacji termicznej, co świadczy o powstaniu pojedynczego amplikonu w reakcji PCR.

Następnie wykreśl krzywą wzorcową. Wykorzystując dane z serii rozcieńczeń genomowego DNA, oblicz wzór pozwalający wyznaczyć ilość DNA na podstawie cyklu progowego Ct. Wyznacz również fazę liniową wykładniczej amplifikacji PCR dla każdego zestawu starterów.

Jeśli wartość CT dla próbek DNA z chipa oraz próbek kontrolnych wejściowych (input) mieści się w zakresie liniowym wartości CT, należy obliczyć stopień wzbogacenia DNA z chipa w stosunku do próbki wejściowej. Rozcień i poddaj naprawie końców 0,1 do 5 µg DNA z chipa w reakcjach o objętości 50 µL zawierających polimerazę DNA T4 oraz polinukleotydową kinazę T4. Zgodnie z instrukcją producenta inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie oczyść DNA, korzystając z zestawu do oczyszczania reakcji MinLu. Kontynuuj, dodając nawisy do końca 3' za pomocą polimerazy DNA, dużego fragmentu CLA NOW oraz DATP; inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37°C. Ponownie przeprowadź reakcję przez kolumnę wirową, aby oczyścić i skoncentrować DNA.

Następnie przeprowadź ligację z oligonukleotydowym adapterem. Wymieszaj z ligazą DNA T4 od firmy Illumina i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie poddaj próbkę oczyszczaniu za pomocą zestawu MinLu reaction cleanup kit.

Elucja DNA w 20 µL. Następnie próbkę DNA należy rozdzielić metodą elektroforezy za pomocą aparatu egel. Wyciąć z żelu prążek o wielkości od 200 do 400 par zasad i oczyścić go przy użyciu zestawu do ekstrakcji z żelu KYOGEN.

Następnie należy przeprowadzić amplifikację biblioteki przy użyciu starterów dla sekwencjonowania par końców (paired-end), enzymów fusion HF i pH firmy Illumina przez 20 cykli PCR. Następnie na standardowym żelu 2% AOSE należy wyizolować fragmenty DNA o długości od 200 do 400 par zasad do sekwencjonowania wysokoprzepustowego w oprogramowaniu Ellen. Wszystkie odczyty należy zmapować do genomu drosophila, dopuszczając do dwóch niezgodności z sekwencją referencyjną.

Zachowaj unikalnie zmapowane odczyty do dalszej analizy w przypadku wystąpienia wielu identycznych odczytów. Zachowaj do trzech kopii, aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia błędów wynikających z amplifikacji PCR. Następnie użyj skryptu w języku Python, aby przekonwertować wyniki z rurociągu GA do plików danych rozszerzalnych dla przeglądarki.

Ustaw rozmiar okna na cztery pary zasad oraz rozmiar fragmentu DNA na 160 par zasad. Klasyfikuj geny Drosophila na geny wyciszone i ekspresywne na podstawie RPKM. W przypadku liczb cyfrowych oznacz geny z RPKM równym zero.

Geny z wartością RPKM większą od jeden zaklasyfikuj jako grupę nieaktywną, a pozostałe do grupy wykazującej ekspresję, z podziałem na trzy podgrupy o niskim, umiarkowanym i wysokim poziomie ekspresji. Na koniec porównaj poziomy modyfikacji histonów oraz ekspresji genów, korzystając ze skryptu Python opisanego wcześniej w pracy basal 2007, „the bag of marbles”. W jądrach mutantów występuje zaburzenie przejścia z proliferujących spermatogonii do różnicujących się spermatocytów.

W tym eksperymencie chip QPCR wykorzystano jądra BAM jako źródło niezróżnicowanych komórek linii zarodkowej w celu zbadania stanu chromatyny kluczowych genów niezbędnych do różnicowania plemników, wzbogacenia modyfikacji histonowych: H3K27me3 lub H3K4me3. Poziom genów różnicowania określono poprzez normalizację względem konstytutywnie ekspresowanego genu cyklicznego. Geny różnicowania: czynnik transkrypcyjny specyficzny dla samców 87 Don Juan oraz fuzzy onion, które nie są ekspresowane w jądrach BAM, wykazują wysokie wzbogacenie w represyjną modyfikację histonową H3K27me3.

Co więcej, są one pozbawione aktywnej modyfikacji histonowej: H3K4me3. Jest to sygnatura chromatyny, którą określamy jako monowalentna w przeciwieństwie do walencyjności z obecnością zarówno H3K4me3, jak i histonu H3.

Wzbogacenie lizyny 27 trimetylowanej w genach różnicowania w embrionalnych komórkach macierzystych. Dane z sekwencjonowania ChIP z wykorzystaniem tego samego zestawu przeciwciał. Potwierdzenie wyników ChIP-qPCR przedstawionych na rysunku 1A: regiony genomiczne wszystkich trzech badanych genów różnicowania terminalnego są silnie wzbogacone w H3K27me3, ale nie w H3K4me3.

Z kolei konstytutywnie ekspresowana cyklina starzenia wykazuje wysoki poziom trimetylacji lizyny 4 histony 3, ale niski poziom trimetylacji lizyny 27 histony 3 w pobliżu miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Rycina ta przedstawia dane ChIP-seq dla dwóch modyfikacji histonów w pobliżu miejsc rozpoczęcia transkrypcji czterech klas genów o różnym poziomie ekspresji. Trymetylacja lizyny 27 histony 3 jest wzbogacona poniżej miejsc rozpoczęcia transkrypcji, co jest odwrotnie skorelowane z poziomem ekspresji genów.

Geny wyciszone wykazują najwyższy poziom trimetylacji lizyny 27 histony 3, natomiast geny silnie ekspresjonowane nie wykazują wiązania trimetylacji lizyny 27 histony 3, co jest zgodne z represyjną rolą trimetylacji lizyny 27 histony 3 w ekspresji genów. Odwrotnie, wzbogacenie modyfikacji trimetylacji lizyny 4 histony 3 w obrębie miejsc startu transkrypcji wykazało przeciwną korelację z poziomem ekspresji genów, co jest zgodne z aktywną rolą trimetylacji lizyny 4 histony 3 w ekspresji genów.

Po opanowaniu techniki, można ją prawidłowo przeprowadzić w ciągu dwóch do trzech dni. Pamiętaj o zachowaniu środków ostrożności podczas pracy z fenolem, chloroformem i formaldehydem. Mamy nadzieję, że niniejszy protokół pozwolił Państwu w pełni zrozumieć zasadę stosowania immunoprecypitacji chromatyny w celu analizy krajobrazu chromatyny w tkankach in vivo.