Name: Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) przy użyciu tkanki Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania stanu chromatyny in vivo w tkankach Drosophila. Technika ta umożliwia analizę interakcji białko-DNA w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować zespołowi dr. Keji Zhao (NIH/NHLBI) za pomoc w dostarczeniu wyników sekwencjonowania. Chcielibyśmy również podziękować projektowi genomu UCSC za możliwość wykorzystania Przeglądarki Genomowej (Genome Browser) do wizualizacji zmapowanych odczytów sekwencjonowania.
Praca ta była wspierana przez grant R00HD055052 NIH Pathway to Independence Award oraz R01HD065816 z NICHD, fundację Lucile Parkard Foundation oraz fundusze startowe Johns Hopkins University przyznane X.C.

(Cała procedura ChIP trwa około dwóch dni. Przygotowanie bibliotek ChIP do sekwencjonowania wysokoprzepustowego zajmuje kolejne 2-3 dni.)
1. Disekcja i przygotowanie tkanki do eksperymentu ChIP (~1 milion komórek)
<ol>
 <li>Wypreparować interesującą tkankę (np. 200 par jąder Drosophila) w zimnym roztworze PBS + 1x inhibitor proteaz (rozpuścić 1 pellet koktajlu inhibitorów proteaz w 1,5 mL 1x PBS, aby otrzymać 7x roztwór zapasowy) + PMSF (stężenie końcowe 100 μg/mL). Przepłukać tkankę dwukrotnie i zawiesić ją ponownie w 200 μL tego samego roztworu PBS z inhibitorami.</li>
 <li>Aby utrwalić próbkę, dodać 5,5 μL 37% formaldehydu (formaldehyd podgrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 min przed użyciem). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, mieszając na vortexie co 5 minut.</li>
 <li>Umieścić próbkę na lodzie na 2 minuty, aby tkanka osiadła. Przepłukać 2x za pomocą 450 μL PBS (z inhibitorami proteaz i PMSF). Próbkę można teraz przechowywać w temperaturze -20 °C. Powtórzyć procedurę preparacji kilka razy, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału do analizy ChIP.</li>
</ol>
2. Przygotowanie supernatantu z koniugacją białko-DNA do analizy ChIP
<ol>
 <li>Przenieść odpowiednią ilość próbki z kroku 1.3 do probówki Eppendorf o pojemności 1,75 mL.</li>
 <li>Usunąć PBS z próbki tkanki. Dodać 200 μL buforu do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 lub NP-40, 5 mM maślanu oraz 1x koktajlu inhibitorów proteaz). Do buforu do lizy dodać świeży roztwór stokowy PMSF (końcowe stężenie PMSF 0,5 mM). Homogenizować za pomocą homogenizatora niebieskiego (Fisher Cat# 749521-1590) aż do całkowitego rozpadu tkanek bez tworzenia agregatów, a następnie inkubować w RT (temperaturze pokojowej) przez 10 minut.</li>
 <li>Sonikacja: użyć sonikatora z mikrokońcówką (Misonix HS-XL200) przy mocy 20. Sonikować przez 10 s, a następnie chłodzić na lodzie przez 50 s. Powtórzyć 4–5 razy (optymalny czas sonikacji należy dobrać empirycznie, ponieważ dłuższa sonikacja prowadzi do powstania mniejszych fragmentów. W przypadku ChIP z użyciem przeciwciał przeciwko modyfikacjom histonów zwykle sonikujemy chromatynę do wielkości około 200–300 bp; w przypadku czynników transkrypcyjnych lub regulatorów chromatyny (np. białek Polycomb) zwykle sonikujemy chromatynę do 200–1000 bp. Niemniej jednak optymalną wielkość fragmentów należy przetestować empirycznie. Uwaga: PROBÓWKĘ NALEŻY PRZEZ CAŁY CZAS TRZYMAĆ NA LODZIE, TAKŻE PODCZAS SONIKACJI, ABY zapobiec nagrzaniu próbki!).</li>
 <li>Rozcieńczyć próbkę, dodając 1,8 mL buforu RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% deoksycholan sodu, 1% Triton X-100, z inhibitorami proteaz i PMSF w stężeniach opisanych wcześniej). Odstawić 40 μL jako kontrolę wejściową (input), dodając 2 μL 5M NaCl i inkubować w 65 °C przez noc (O/N) w celu odwrócenia sieciowania.</li>
 <li>Aby skoniugować przeciwciało z kuleczkami, dodać 40 μL kuleczek Protein A do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml, następnie dodać 600 μL PBS i mieszać na rotatorze w 4 °C przez 2 minuty, oddzielić kuleczki magnesem i usunąć nadsącz. Dodać 100 μL PBS oraz przeciwciało docelowe (ilość przeciwciała należy dobrać empirycznie). Inkubować w RT przez 1 godzinę lub w 4 °C przez 4 godziny.</li>
 <li>Usunąć nadsącz z kuleczek za pomocą magnesu i dodać do kuleczek 1 mL ekstraktu z chromatyny z kroku 2.4. Rotować w 4 °C przez noc (O/N).</li>
 <li>Przenieść próbkę ChIP na magnes i usunąć nadsącz. Przemyć kuleczki następującymi buforami w 4 °C przez 10 minut każdy: 
 2x 1 mL buforu RIPA [1,89 mL „buforu RIPA” + 315 μL 7x inhibitorów proteaz + 20 μL PMSF]; 
 2x 1 mL buforu RIPA + 0,3 M NaCl [1,89 mL buforu RIPA + 220 μL 3 M NaCl]; 
 2x 1 mL buforu LiCl (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC); 
 1x 1 mL 1x TE + 0,2% Triton X-100; 
 1x 1 mL 1x TE. </li>
 <li>W celu odwrócenia sieciowania resuspendować kuleczki w 100 μL buforu TE + 3 μL 10% SDS + 5 μL proteinazy K (20 mg/mL). Inkubować w 65 °C przez noc (O/N).</li>
 <li>Oddzielić kuleczki magnesem i przenieść nadsącz do nowej probówki. NADSĄCZ ZAWIERA PRÓBKĘ DNA. Przemyć kuleczki 100 μL TE + 0,5 M NaCl i połączyć oba nadsącze.</li>
 <li>Przeprowadzić ekstrakcję próbki DNA fenolowo-chloroformową. Dodać 200 μL mieszaniny fenol:chloroform:IAA (25:24:1) i wymieszać w wirówce typu vortex. Wirować przy 14k przez 5 minut w RT. Alternatywnie DNA można wyekstrahować za pomocą zestawu do oczyszczania PCR firmy Qiagen.</li>
 <li>Przenieść nadsącz/fazę wodną do nowej probówki i dodać akrylamid liniowy do końcowego stężenia 20 μg/mL (alternatywnie można użyć 1 μL glikogenu w stężeniu 20 mg/mL na każdy 1 mL nadsączu. Glikogen stosuje się do późniejszych analiz qPCR lub PCR, natomiast akrylamid liniowy do analiz sekwencyjnych). Dodać 20 μL 3M NaOAc i 500 μL 100% EtOH. Dobrze wymieszać i inkubować w 80 °C przez 10 minut. Wirować z maksymalną prędkością przez 20 minut w 4 °C.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i przemyć 300 μL 70% EtOH. Osuszyć na powietrzu i resuspendować próbkę w 50 μL buforu TE. Próbkę można teraz przechowywać w -20 °C. Próbka może być wykorzystana do analizy ilościwym PCR (qPCR) (Rycina 1).</li>
</ol>
3. Analiza DNA poddanego immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)
3a. Analiza DNA z ChIP przy użyciu qPCR
<ol>
 <li>Rozcieńczć DNA genomowe w następujących stężeniach w celu przygotowania krzywej wzorcowej: nie programmerskie, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.</li>
 <li>Dla każdej pary starterów przygotować qPCR w duplikacie na płytce 96-dołkowej z DNA genomowym z kroku 3a.1, kontrolą input oraz DNA po ChIP: 
 10 μL 2x SYBR PCR mix (Fermentas, K0222); 
 1 μL 10 μM startera forward; 
 1 μL 10 μM startera reverse; 
 x μL DNA po ChIP (kontrola input lub DNA genomowe); 
 y μL wody wolnej od nukleaz H2O w celu dostosowania objętości reakcji do 20 μL. </li>
 <li>Odwirować płytkę 96-dołkową za pomocą Mini plate spinner (Labnet).</li>
 <li>Przeprowadzić qPCR w systemie ABI 7300 real time PCR (lub innym systemie PCR w czasie rzeczywistym) stosując następujące warunki: 
 Etap 1: 50 °C przez 2 min, 1 cykl; 
 Etap 2: 95 °C przez 10 min, 1 cykl; 
 Etap 3: 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, 40 cykli; 
 Etap 4 (etap dysocjacji): 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, 95 °C przez 15 s. </li>
 <li>Sprawdzić krzywą dysocjacji: Jeden pik na wykresie dysocjacji termicznej sugeruje obecność pojedynczego amplikonu z reakcji PCR. Więcej niż jeden pik wskazuje na produkt niespecyficzny dla danej pary starterów; takich danych z qPCR nie należy używać.</li>
 <li>Wyznaczyć fazę liniową amplifikacji wykładniczej reakcji PCR dla każdego zestawu starterów, obliczając wzór określający ilość DNA na podstawie wartości Ct (cycle threshold), w oparciu o krzywą wzorcową z serii rozcieńczeń DNA genomowego z kroku 3a.1.</li>
 <li>Jeśli wartości Ct dla DNA po ChIP oraz kontroli input mieszczą się w zakresie liniowym wartości Ct, obliczyć wzbogacenie DNA po ChIP względem input, uwzględniając czynnik rozcieńczenia DNA po ChIP oraz kontroli input z kroku 2.4.</li>
</ol>
3b. Przeprowadź amplifikację DNA z ChIP w celu sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
<ol>
 <li>Naprawa końców mieszaniny DNA po ChIP (należy użyć zestawu Epicentre DNA END-Repair), przygotować na lodzie: 
 1-34 μl genomiczne DNA z kroku 2.12 (od 0,1 do 5 μg) 
 5 μl 10x bufor do naprawy końców 
 5 μl mieszanina dNTP o stężeniu 2,5 mM 
 5 μl 10 mM ATP 
 Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. μl H2Aby dostosować objętość reakcji do 49 μl 
 1 μl Mieszanina enzymów do naprawy końców (polimeraza DNA T4 + polinukleotydowa kinaza T4) 
 Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Produkt reakcji oczyścić za pomocą zestawu Qiagen MinElute Reaction. 
 Zestaw do oczyszczania. Eluuj w 30 μl Bufor elucyjny (EB). </li>
 <li>Dodanie nadwieszeń A na końcach 3': 
 30 μl eluat produktu DNA z kroku 3b.1 
 5 μl 10x bufor NEB nr 2 
 10 μl 1 mM dATP 
 2 μl dH2O 
 3 μl 5 j./ μl Fragment Klenowa (3'→5' exo-) 
 Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °COczyścić produkt reakcji za pomocą zestawu MinElute ReactionCleanup. Eluować do 10 μl EB. </li>
 <li>Ligacja linkerów Solexa: 
 10 μl eluowanego DNA z kroku 3b.2 
 10 μl ddH2O2O 
 2.5 μl 10x bufor do ligazy T4 DNA 
 1 μl Mieszanina oligonukleotydów adaptorowych od Illumina (rozcieńczona 1:10 ze stoku) 
 2.5 μl T4 DNA ligaza (400 jednostek/μl) 
 Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Produkt reakcji oczyścić za pomocą zestawu MinElute ReactionCleanup. Eluować do 20 μl EB. Próbkę można teraz przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Próbkę elowanego DNA z kroku 3b.3 poddaj elektroforezie z wykorzystaniem aparatu E-gel. Wyizoluj z żelu prążek o wielkości 300–500 bp i oczyść go za pomocą zestawu Qiagen Gel Extraction (krok ten pozwala na usunięcie samoligowanych linkerów o wielkości ~125 bp powstałych w wyniku ligacji oligonukleotydów adaptorowych). Eluuj w 12 μl EB. </li>
 <li>Amplifikuj bibliotekę, używając starterów paired-end (PE) firmy Illumina: 
 10.5 μl eluowanego DNA z kroku 3b.4 
 12.5 μl mieszaniny master mix (2X Phusion HF, Finnzymes) 
 1 μl startera PCR PE1 primer 1 
 1 μl startera PCR PE2 primer 2 
 Warunki PCR: 
 98 °C przez 30 s 
 (98 °C 10 s, 65 °C 30 s 72 °C 30 s), powtórzyć 20 cykli 
 72°C przez 5 minut. </li>
 <li>Próbki z kroku 3b.5 można wykorzystać do analizy ChIP-seq po wybraniu fragmentów DNA o odpowiedniej wielkości (300–500 bp) przy użyciu standardowego 2% żelu agarozowego. Próbkę można teraz przechowywać w temperaturze -20 °CNajlepiej jest izolować każdą próbkę ChIP na oddzielnym żelu, aby zapobiec kontaminacji. Próbki można przekazać do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.</li>
</ol>
3c. Analiza rurociągiem Solexa
<ol>
 <li>Odczyty sekwencjonowania o długości 25 bp uzyskano z potoku analitycznego Illumina Genome Analyzer (GA).</li>
 <li>Wszystkie odczyty dopasowano do genomu Drosophila (dm3) przy użyciu oprogramowania ELAND (Efficient Local Alignment of Nucleotide Data), dopuszczając do dwóch niedopasowań w stosunku do sekwencji referencyjnej.</li>
 <li>Do dalszych analiz zachowano odczyty zmapowane jednoznacznie. W przypadku wielu identycznych odczytów zachowano do trzech kopii, aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia błędów wynikających z amplifikacji PCR.</li>
 <li>Wyniki z potoku GA przekonwertowano do plików BED (browser extensible data).</li>
 <li>W celu wygenerowania plików wig do przesłania do przeglądarki UCSC w celu wizualizacji, wykorzystano skrypt w języku python opisany w poprzedniej publikacji3, przyjmując rozmiar okna 4 bp oraz rozmiar fragmentu DNA 160 bp.</li>
 <li>Do klasyfikacji genów Drosophila na geny wyciszone i ekspresjonowane wykorzystano wartość cyfrową RPKM (reads/per kilobase merged exonic region/per million mapped reads). Geny z RPKM = 0 zaklasyfikowano do grupy wyciszonych, a geny z RPKM ≥ 1 do grup ekspresjonowanych, które można podzielić na trzy podgrupy: geny o niskim, umiarkowanym i wysokim poziomie ekspresji, przy czym każda grupa zawiera zbliżoną liczbę genów.</li>
 <li>Do porównania poziomu modyfikacji histonów i ekspresji genów wykorzystano skrypt w języku python opisany w poprzedniej publikacji3.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przykłady wyników ChIP-qPCR z wykorzystaniem jąder mutantów bam (bag of marbles) przedstawiono na Rysunku 14. W jądrach mutantów bam dochodzi do zaburzenia przejścia z proliferujących spermatogoniów do różnicujących się spermatocytów5, 6. Jądra bam wykorzystujemy jako źródło niedróżnicowanych komórek linii płciowej, które są wzbogacone w tym typie tkanki. Geny różnicowania niezbędne do różnicowania plemników, takie jak male-specific transcription factor 87 (mst87F), don juan (dj) i fuzzy onion (fzo), nie są ekspresowane w jądrach bam. Geny te wykazują wysoki stopień wzbogacenia w represyjną modyfikację histonów H3K27me37 (Rysunek 1A), lecz są pozbawione aktywnej modyfikacji histonów H3K4me38 (Rysunek 1B), co stanowi sygnaturę chromatyny, którą określiliśmy jako „monowalentną”7. Wzbogacenie w H3K27me3 lub H3K4me3 jest określane poprzez normalizację względem konstytutywnie ekspresowanego genu Cykliny A (CycA)4.
Analiza ChIP-seq z wykorzystaniem tego samego zestawu przeciwciał (tj. represyjnego H3K27me3 i aktywnego H3K4me3) w jądrach mutantów bam (Rysunek 2) potwierdziła wyniki qPCR przedstawione na Rysunku 1. W przypadku trzech badanych genów różnicowania końcowego mst87F, dj i fzo, ich regiony genomiczne są silnie wzbogacone w H3K27me3, ale nie w H3K4me3 (Rysunek 2A-2C). Z kolei konstytutywnie ekspresowany gen CycA wykazuje znaczące wiązanie H3K4me3, lecz niewielkie wiązanie H3K27me3 w pobliżu miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS) (Rysunek 2D).
Ponadto profile ChIP dla H3K27me3 oraz H3K4me3 w pobliżu TSS czterech klas genów o różnym poziomie ekspresji są zgodne z funkcją każdej z tych modyfikacji histonowych. Jak pokazano na Rysunku 3A, wzbogacenie H3K27me3 poniżej TSS jest odwrotnie skorelowane z poziomem ekspresji genów. Geny wyciszone wykazują najwyższy poziom H3K27me3, podczas gdy geny silnie eksprimowane nie wykazują wiązania H3K27me3. Dane te są zgodne z represyjną rolą H3K27me3 w ekspresji genów. W przeciwieństwie do tego, wzbogacenie H3K4me3 wokół TSS wykazało odwrotną korelację z poziomem ekspresji genów (Rysunek 3B), co jest zgodne z aktywną rolą H3K4me3 w ekspresji genów.
<img alt="Wykresy słupkowe ChIP dla H3K27me3 i H3K4me3; wzbogacenie genów względem CycA dla mst87F, dj, fzo, cyca." src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Analiza qPCR DNA poddanego immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) z użyciem przeciwciał przeciwko represyjnej modyfikacji histonowej H3K27me3 (A) lub aktywnej modyfikacji histonowej H3K4me3 (B) w jądrach mutantów bam wzbogaconych w komórki niedróżnicowane. (A) W jądrach mutantów bam geny różnicowania (Mst87F, dj, fzo) są wzbogacone w represyjną modyfikację histonową H3K27me3. (B) Geny różnicowania wykazują deficyt aktywnej marki H3K4me3. Poziom DNA z ChIP (ChIP DNA/input) w genie docelowym (Mst87F, dj lub fzo) został najpierw znormalizowany do poziomu DNA z ChIP w kontrolnym genie CycA. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe z trzech niezależnych powtórzeń biologicznych.
<img alt="Schemat ChIP-seq dla H3K27me3/H3K4me3 w regionach genów; wizualizacja danych dotyczących modyfikacji histonów." src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zrzuty ekranu z przeglądarki genomu UCSC przedstawiające wzbogacenie H3K27me3 i H3K4me3 w całych regionach genomicznych (A) Mst87F, (B) dj, (C) fzo oraz (D) genów CycA. Zakreślony region wzbogacony w H3K27me3 w części (D) odzwierciedla stan chromatyny nakładającego się genu CG7264, który wykazuje niską ekspresję w jądrach bam (RPKM=1), ale wysoką ekspresję w jądrach typu dzikiego wild-type (RPKM=130)8 (dane ChIP-seq z7). Sondy użyte w analizie ilościowej PCR wyników ChIP na Rycinie 1 są oznaczone na dole każdego wykresu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą rycinę</a>.
<img alt="Profil ekspresji genów w badaniu ChIP-seq dla H3K27me3; wykres przedstawia poziomy modyfikacji w stosunku do pozycji TSS." src="/files/ftp_upload/3745/3745fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Profile ChIP-seq z wykorzystaniem H3K27me3 i H3K4me3 w jądrach bam7. Cztery grupy genów (7 509 genów) zostały sklasyfikowane zgodnie z poziomami ich ekspresji na podstawie wyników RNA-seq8. Reprezentatywne klasy genów przedstawiono pod kątem wzbogacenia w konkretną modyfikację histonów, stosując sekwencje od 3kb powyżej do 3kb poniżej ich miejsc startu transkrypcji (TSS). Pozwala to na wygenerowanie profilu wzbogacenia w analizach ChIP-seq dla (A) H3K27me3 (K27) oraz (B) H3K4me3 (K4) w każdej grupie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.

<ol><li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li>
<li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li>
<li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li>
<li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bag-of-marbles%3A+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li>
<li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li>
<li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wszechstronność analiz ChIP opisanych w niniejszym protokole pozwala na ich zastosowanie w różnych tkankach, co stwarza możliwość badania stanu chromatyny w biologicznie istotnym systemie. Eksperymenty ChIP z wykorzystaniem komórek z hodowli są wygodne w wykonaniu, ponieważ można łatwo uzyskać ich dużą ilość. Jednakże komórki hodowlane niekoniecznie odzwierciedlają stan komórek w środowisku wielokomórkowym. Dzięki opracowaniu tej techniki z wykorzystaniem wypreparowanej tkanki z żywych zwierząt możemy odpowiedzieć na wie...

<table><tbody><tr><td>Kompletny Mini koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>47083-U</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek Kontes</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Liniowa poliakrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56575-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green/ROX qPCR Master Mix</td><td>Fermentas</td><td>K0223</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka do płytek</td><td>Labnet International</td><td>Z723533</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351101</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy procesor do małych objętości</td><td>Misonix</td><td>HS-XL2000</td><td>Model wycofany z produkcji</td></tr><tr><td>Dynabeads, Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>100-01D</td><td></td></tr><tr><td>Magnes Dynamag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:IAA</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Epicentre DNA END-Repair</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>ER0720</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MinElute Reaction Cleanup</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (3&amp;rsquo;&amp;#8594;5&amp;rsquo; exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza T4 DNA</td><td>Promega Corp.</td><td>M1794</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy adaptorowe</td><td>Illumina</td><td>PE-400-1001</td><td></td></tr><tr><td>Primery Paired-End 1.0 i 2.0</td><td>Illumina</td><td>1001783 1001 784</td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy E-Gel</td><td>Invitrogen</td><td>G6512ST</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion HF Mastermix</td><td>Finnzymes</td><td>F-531</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecypitacja chromatyny (chip) z wykorzystaniem tkanek drosophila

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetyka pozostaje dynamicznie rozwijającą się dziedziną, która bada, w jaki sposób stan chromatyny wpływa na zróżnicowaną ekspresję genów w różnych typach komórek na różnych etapach rozwoju. Regulacja epigenetyczna przyczynia się do szerokiego spektrum procesów biologicznych, w tym do różnicowania komórkowego podczas rozwoju embrionalnego oraz do homeostazy w wieku dorosłym. Krytyczną strategią w badaniach epigenetycznych jest analiza tego, jak poszczególne modyfikacje histonów i czynniki chromatynowe regulują ekspresję genów. W tym celu powszechnie stosuje się immunoprecypitację chromatyny (ChIP), aby uzyskać obraz powiązań konkretnych czynników z DNA w badanych komórkach.
Technika ChIP zazwyczaj wykorzystuje hodowlane komórki jako materiał wyjściowy, które można uzyskać w dużej ilości i stopniu jednorodności, aby wygenerować powtarzalne dane. Istnieje jednak kilka zastrzeżeń: po pierwsze, środowisko hodowli komórek w szalce Petriego różni się od warunków in vivo, w związku z czym może nie odzwierciedlać endogennego stanu chromatyny komórek w żywym organizmie. Po drugie, nie wszystkie typy komórek można hodować ex vivo. Liczba linii komórkowych, z których można uzyskać materiał wystarczający do przeprowadzenia analizy ChIP, jest ograniczona.
W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przeprowadzania eksperymentu ChIP z wykorzystaniem tkanek Drosophila. Materiałem wyjściowym jest wypreparowana tkanka z żywego organizmu, co pozwala na dokładne odzwierciedlenie endogennego stanu chromatyny. Adaptacyjność tej metody do wielu różnych typów tkanek umożliwi badaczom odpowiedzi na znacznie więcej istotnych biologicznie pytań dotyczących regulacji epigenetycznej in vivo1, 2. Połączenie tej metody z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChIP-seq) pozwoli badaczom na dodatkowe uzyskanie obrazu krajobrazu epigenomicznego.

W ostatnim czasie technologia sekwencjonowania wysokoprzepustowego znacznie zwiększyła czułość eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), co przyczyniło się do ich zastosowania z użyciem oczyszczonych komórek lub wyselekcjonowanych tkanek. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę wykorzystania techniki ChIP w tkankach Drosophila, która pozwala na badanie endogennego stanu chromatyny w dobrze scharakteryzowanym systemie biologicznym.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem tkanek Drosophila

Epigenetyka pozostaje dynamicznie rozwijającą się dziedziną, która bada, w jaki sposób stan chromatyny wpływa na różnicową ekspresję genów w odrębnych typach komórek w...

Niniejsza procedura pozwala na uzyskanie danych z immunoprecypitacji chromatyny z wypreparowanej tkanki muchy, aby dokładnie odzwierciedlić stan chromatyny in vivo w tkankach Drosophila. W tym przypadku setki jąder są pobierane poprzez dyssekcję ręczną. Testy immunoprecypitacji chromatyny są przeprowadzane z użyciem przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania.Następnie przeprowadzono ilościową analizę R-T-P-C-R w celu potwierdzenia wzbogacenia specyficznego regionu genomowego w oczyszczonym DNA z chipa. Alternatywnie, sekwencjonowanie wysokoprzepustowe próbki z chipa pozwala na wygenerowanie profilu w całym genomie. Ostatecznie analiza chipowa wypreparowanej tkanki dostarcza obrazu stanu chromatyny w komórkach w ich warunkach fizjologicznych.Niniejszy protokół został zoptymalizowany do analizy tkanek wyizolowanych bezpośrednio z organizmu. W celu uzyskania informacji o stanach chromatyny i epigenetyce w rzeczywistych warunkach fizjologicznych, zaprezentujemy zastosowanie metody ChIP u muszki owocówki drosophila w celu zbadania stanu chromatyny. Protokół ten można zastosować również u innych organizmów, takich jak mysz lub zebrafish.Wizualna demonstracja tego

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Precypitacja immunologiczna chromatyny (ChIP) z użyciem tkanki Drosophila

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych. <br...

Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Niniejszy protokół wideo przedstawia technikę zgniatania stosowaną w laboratorium Johansena w celu przygotowania politenicznych chromosomów Drosophila do znakowania przeciwciałami.

Przygotowanie preparatów zgniatanych wieloniciowych chromosomów Drosophila do znakowania przeciwciałami

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

ChIRP to nowatorska i szybka technika mapowania genomowych miejsc wiązania długich niekodujących RNA (lncRNAs). Metoda ta wykorzystuje specyficzność komplementarnych, kafelkowych oligonukleotydów, co pozwala na wyliczenie genomowych miejsc związanych z lncRNA.

Izolacja chromatyny poprzez oczyszczanie RNA (ChIRP)

Tkanki Drosophila często zawierają niejednorodną mieszaninę typów komórek. Aby zbadać ekspresję genów w określonych typach komórek z danej tkanki, jądra mogą być genetycznie znakowane, a następnie izolowane przy użyciu podejścia opartego na powinowactwie. Wyizolowane jądra mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak analiza ekspresji genów i immunoprecypitacja chromatyny.

Izolacja oznaczonych jąder z tkanek Drosophila w oparciu o powinowactwo do analizy ekspresji genów

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Ten protokół ma na celu wizualizację agregatów heterochromatyny w komórkach Drosophila polytene.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych Drosophila

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Poznaj metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do badania stanu chromatyny in vivo w tkankach Drosophila. Technika ta umożliwia analizę interakcji białko-DNA w warunkach fizjologicznych.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem tkanek Drosophila

Przeglądaj więcej filmów