Name: Progresywny stosunek reagowania na smaczne pokarmy o wysokiej zawartości tłuszczu i cukru u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj metodę progresywnego stosunku reagowania do oceny motywacji pokarmowej u myszy. Protokół obejmuje ograniczenie pokarmu i trening naciskania dźwigni w celu pomiaru efektów nagradzających pożywienia wysokokalorycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten był wspierany przez granty z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (355881) oraz Canadian Foundation for Innovation.

*Najważniejsze etapy.
1. Sprzęt i oprogramowanie
<ol>
	<li>Trening i testowanie przeprowadzane są w operantowych komorach dla myszy wyposażonych w dwie ultra-lekkie, chowane dźwignie1 umieszczone po obu stronach otworu na pokarm (patrz Tabela 1). Nad każdą dźwignią znajduje się lampka sygnalizacyjna, a na górze klatki lampka oświetlająca. Dystrybutor peletu znajduje się na zewnątrz komory. Każda komora jest umieszczona w wyciszającej kabinie z wentylatorem. Komory są połączone z komputerem PC z oprogramowaniem MedPC IV za pomocą szafki interfejsu „Smart Control”.</li>
</ol>
Uwaga: W przypadku braku dźwigni ultralekkich zaleca się stosowanie kontaktu nosem (nose-poke) jako reakcji operacyjnej w badaniach nad myszami. Jednakże, przy dostępności obu opcji, sugerujemy wybór dźwigni ultralekkich jako bardziej wiarygodnego miernika motywacji, ponieważ reakcje kontaktu nosem mogą być wyzwalane przez węszenie eksploracyjne.
<ol start="2">
	<li>Programy MedPC wykorzystywane do przeprowadzania zadań operacyjnych są napisane w kodzie notacji Medstate, którego użytkownik może nauczyć się z pomocą dostarczonego podręcznika programowania. Programowanie zapewnia użytkownikowi elastyczność w modyfikowaniu istniejących kodów lub generowaniu unikalnych parametrów eksperymentalnych. Niektóre kody można uzyskać bezpłatnie z „Medstate Notation Repository” firmy Med Associates pod adresem <a href="http://www.mednr.com" target="_blank">http://www.mednr.com</a>. Dodatkowe kody można zakupić od firmy Med Associates.</li>
</ol>
2. Aklimatyzacja myszy i restrykcje żywieniowe
<ol>
	<li>Po przyjeździe myszy są trzymane w grupach przez co najmniej 10 dni w celu aklimatyzacji do odwróconego 12-godzinnego cyklu światło/ciemność, z zapewnionym dostępem ad libitum do standardowej karmy i wody. W naszym przypadku stosujemy dorosłe myszy C57BL/6 zakupione od Charles River (St. Constant, QC). Wszystkie manipulacje z myszami oraz eksperymenty behawioralne są przeprowadzane podczas cyklu ciemnego. Wszystkie procedury obejmujące wykorzystanie zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami CRCHUM.</li>
	<li>Następnie myszy są trzymane pojedynczo i poddawane restrykcji pokarmowej (70% dziennego spożycia pokarmu) do momentu osiągnięcia 90-95% masy ciała z okresu swobodnego żywienia, aby ułatwić nabycie reakcji naciskania dźwigni. Myszy otrzymują dzienną porcję pokarmu w klatce domowej po zakończeniu sesji. Po osiągnięciu utraty masy ciała na poziomie 5-10%, dzienna przydzielona ilość pokarmu jest korygowana, aby ustabilizować niższą masę ciała na resztę okresu treningowego. Po spełnieniu przez myszy kryteriów nabycia (patrz poniżej), zostają one przywrócone do schematu żywienia ad libitum. Myszy odzyskują utraconą masę ciała w ciągu około 3-4 dni.</li>
	<li>Przez 3 kolejne dni przed pierwszą sesją treningową myszy są oswajane w pomieszczeniu testowym. W dniu poprzedzającym rozpoczęcie treningu do klatki domowej wprowadza się 10-15 granulek wysokotłuszczowych i wysokocukrowych (HFHS), aby zapobiec potencjalnemu wpływowi neofobii pokarmowej na wyniki w warunkowaniu operacyjnym. Stosujemy beztłuszczowe, precyzyjne granulki pokarmowe HFHS o masie 20 mg (dostępne również 14 mg), w których 48,9% Kcal stanowi tłuszcz (Bio Serv, Frenchtown, NJ).</li>
</ol>
3. Trening operantowy
<ol>
	<li>Myszy są początkowo trenowane w naciskaniu dźwigni w schemacie wzmocnienia o stałym stosunku (FR)-1, w którym pojedyncze naciśnięcie dźwigni powoduje podanie granulatu pokarmowego do pojemnika. Tylko jedna dźwignia jest wyznaczona jako „aktywna” (wyzwalająca podanie nagrody pokarmowej), a przydział dźwigni prawej i lewej jest zrównoważony pomiędzy myszami. Ważne jest wprowadzenie co najmniej 5-sekundowego czasu oczekiwania (timeout, TO) do schematu FR1 (FR1/TO-5), podczas którego dodatkowe naciskanie dźwigni nie skutkuje podaniem granulatu pokarmowego. Okres TO pozwala myszom na zjedzenie granulatu, jednak można zastosować dłuższe czasy oczekiwania, jeśli eksperymentator uzna to za konieczne dla danego modelu mysiego. Każda sesja treningowa FR trwa 1 godzinę lub do momentu podania 50 granulatów.</li>
	<li>*Kryteria nabycia: Kryteria stosowane do określenia nabycia warunkowej odpowiedzi operantowej podtrzymywanej pokarmem obejmują: (1) minimalną liczbę reakcji aktywnych i otrzymanych nagród; (2) miarę rozróżniania między dźwignią aktywną a nieaktywną oraz (3) stabilność wyników między sesjami. Za spełnienie kryteriów nabycia uznaje się myszy wykazujące rozróżnienie ≥3:1 dla dźwigni aktywnej względem nieaktywnej i otrzymujące ≥ 20 nagród na sesję przez trzy kolejne sesje10. Zaobserwowaliśmy, że większość (~75%) myszy C57BL6 wymaga około 7-10 dni treningu, aby spełnić kryteria nabycia. Myszy, które do tego czasu nie osiągną kryteriów nabycia, przechodzą dalszy trening przez dodatkowe 5-7 dni. Wykluczamy myszy z testów (~5% przypadków), gdy brak jest postępów do piątego dodatkowego dnia treningowego. Należy pamiętać, że upośledzone nabycie reakcji operantowej może być wynikiem określonych interwencji farmakologicznych i genetycznych, a zatem powinno zostać udokumentowane.</li>
	<li>Po trzech kolejnych sesjach uzyskania ≥ 20 granulatów, schemat jest zwiększany do FR5/TO-5 sekund, w którym 5 aktywnych naciśnięć dźwigni wyzwala podanie granulatu pokarmowego. Trening w schemacie FR5 trwa trzy dni.</li>
	<li>*Następnie myszy są trenowane w schemacie wzmocnienia o stosunku progresywnym (PR). Schemat stosunku reakcji podczas testów PR można obliczyć zgodnie z metodą Richardsona i Robertsa (1996)11, stosując następujący wzór (zaokrąglony do najbliższej liczby całkowitej): 
	= [5e (R*0.2)] - 5 
	gdzie R jest równe liczbie nagród pokarmowych już zdobytych plus 1 (tj. kolejny wzmocniacz). Zatem liczba reakcji wymaganych do otrzymania nagrody pokarmowej następuje w kolejności: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95 i tak dalej. Ostatni ukończony stosunek stanowi punkt przełamania (breakpoint).</li>
	<li>Sesja PR trwa maksymalnie 1 godzinę. Brak naciśnięcia dźwigni w dowolnym 10-minutowym odstępie czasu skutkuje zakończeniem sesji. Wyniki w schemacie wzmocnienia PR uznaje się za stabilne, gdy liczba nagród zdobytych w jednej godzinnej sesji odchyla się o ≤10% przez co najmniej 3 kolejne dni.</li>
</ol>
4. Testy progresywnego stosunku i walidacja
<ol>
	<li>Aby zwalidować utrzymywane przez pożywienie reagowanie operacyjne w zadaniu PR, można ocenić reagowanie w punkcie przełamania (breakpoint) po manipulacjach znanych z modulowania nagrody pokarmowej. Stosunkowo łatwym do przeprowadzenia testem jest deprywacja pokarmowa, która zwiększy stan motywacyjny myszy względem pokarmu, a tym samym podniesie punkty przełamania. Myszy muszą zostać najpierw przetestowane w zadaniu PR podczas okresu karmienia ad libitum, aż do osiągnięcia stabilnych wyników bazowych. Dzień po ostatnim dniu „bazowym” pokarm zostaje usunięty z klatki domowej, a następnie myszy są testowane w zadaniu PR 24 godziny po rozpoczęciu postu.</li>
	<li>Zbadaliśmy również, czy obwodowe podanie anoreksyjnego hormonu leptyny wywrze przeciwny wpływ na progi punktu przełamania. Leptynę (A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, NIDDK) rozpuszczono w sterylnym PBS. Testowanie PR przeprowadzono po wstrzyknięciu PBS drogą IP jednego dnia, a następnie po wstrzyknięciu leptyny (5 mg/kg) następnego dnia. Leptynę wstrzykiwano na godzinę przed testem PR. Punkty przełamania porównano za pomocą testu t dla prób zależnych (GraphPad Prism).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Podczas badania zdolności deprywacji pokarmowej do modulowania odpowiedzi w punkcie przełamania (breakpoint) w schemacie wzmacniania PR, spodziewamy się znaczącego wzrostu punktów przełamania, jak pokazano na Rysunku 1. W tym eksperymencie 24-godzinny okres deprywacji pokarmowej spowodował ok. 3,6-krotny wzrost punktów przełamania w porównaniu z wynikami uzyskanymi w bazowym stanie swobodnego żywienia, co sugeruje, że deprywacja pokarmowa zwiększa efekty nagradzające pokarmu. W przeciwieństwie do tego, obwodowe podanie hormonu anorektycznego leptyny (5 mg/kg, IP) na godzinę przed testem powinno zmniejszyć odpowiedź w punkcie przełamania, jak pokazano na Rysunku 2.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący dane punktów przełomowych w stanie bazowym i po 24-godzinnej głodówce; zaznaczono analizę statystyczną." src="/files/ftp_upload/3754/3754fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Głodówka zwiększa efekty nagradzające pożywienia. 24 h głodówki znacząco zwiększyły punkty przełomowe w harmonogramie wzmocnień o progresywnym stosunku (PR) u myszy (n=4). Średnia±SEM; *p&lt;.05.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący poziomy punktu przełamania dla grupy kontrolnej (Vehicle) i leptyny, wskazujący istotność statystyczną." src="/files/ftp_upload/3754/3754fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Leptyna zmniejsza nagrodę pokarmową u myszy. Obwodowe podanie leptyny (5 mg/kg) obniżyło progi odpowiedzi punktu przełamania PR u myszy (n=4). Średnia±SEM; *p&lt;0.05.

<ol><li>Fulton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appetite+and+reward%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Appetite and reward.</a> Front. Neuroendocrinol. 31, 85-103 (2010).</li>
<li>Zheng, H., Lenard, N. R., Shin, A. C., Berthoud, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appetite+control+and+energy+balance+regulation+in+the+modern+world%3A+reward-driven+brain+overrides+repletion+signals%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Appetite control and energy balance regulation in the modern world: reward-driven brain overrides repletion signals.</a> International journal of Obesity. 33, Suppl 2. S8-S13 (2009).</li>
<li>Skinner, B. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkinner%2C+BF+%22The+Behavior+of+Organisms%3A+An+Experimental+Analysis%22">The Behavior of Organisms: An Experimental Analysis</a>. , Appelton-Century. (1938).</li>
<li>Hodos, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+ratio+as+a+measure+of+reward+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive ratio as a measure of reward strength.</a> Science. 134, 943-944 (1961).</li>
<li>Hodos, W., Kalman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increment+size+and+reinforcer+volume+on+progressive+ratio+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Anal.+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of increment size and reinforcer volume on progressive ratio performance.</a> J. Exp. Anal. Behav. 6, 387-392 (1963).</li>
<li>Stafford, D., LeSage, M. G., Glowa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive-ratio+schedules+of+drug+delivery+in+the+analysis+of+drug+self-administration%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Progressive-ratio schedules of drug delivery in the analysis of drug self-administration: a review.</a> Psychopharmacology. , 139-169 (1998).</li>
<li>Glass, M. J., O'Hare, E., Cleary, J. P., Billington, C. J., Levine, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+naloxone+on+food-motivated+behavior+in+the+obese+Zucker+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The effect of naloxone on food-motivated behavior in the obese Zucker rat.</a> Psychopharmacology (Berl). 141, 378-384 (1999).</li>
<li>Brennan, K., Roberts, D. C., Anisman, H., Merali, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+differences+in+sucrose+consumption+in+the+rat%3A+motivational+and+neurochemical+correlates+of+hedonia%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Individual differences in sucrose consumption in the rat: motivational and neurochemical correlates of hedonia.</a> Psychopharmacology (Berl). 157, 269-276 (2001).</li>
<li>Vaughan, C., Moore, M., Haskell-Luevano, C., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+motivated+behavior+of+melanocortin-4+receptor+knockout+mice+under+a+progressive+ratio+schedule%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Food motivated behavior of melanocortin-4 receptor knockout mice under a progressive ratio schedule.</a> Peptides. 27, 2829-2835 (2006).</li>
<li>Haluk, D. M., Wickman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+study+design+variables+and+their+impact+on+food-maintained+operant+responding+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of study design variables and their impact on food-maintained operant responding in mice.</a> Behav. Brain Res. 207, 394-401 (2010).</li>
<li>Richardson, N. R., Roberts, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+ratio+schedules+in+drug+self-administration+studies+in+rats%3A+a+method+to+evaluate+reinforcing+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy.</a> J. Neurosci. Methods. 66, 1-11 (1996).</li>
<li>Jewett, D. C., Cleary, J., Levine, A. S., Schaal, D. W., Thompson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuropeptide+Y%2C+insulin%2C+2-deoxyglucose%2C+and+food+deprivation+on+food-motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Effects of neuropeptide Y, insulin, 2-deoxyglucose, and food deprivation on food-motivated behavior.</a> Psychopharmacology (Berl). 120, 267-271 (1995).</li>
<li>Fulton, S., Woodside, B., Shizgal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+brain+reward+circuitry+by+leptin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modulation of brain reward circuitry by leptin.</a> Science. 287, 125-128 (2000).</li>
<li>Figlewicz, D. P., Bennett, J. L., Naleid, A. M., Davis, C., Grimm, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+insulin+and+leptin+decrease+sucrose+self-administration+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Intraventricular insulin and leptin decrease sucrose self-administration in rats.</a> Physiol. Behav. 89, 611-616 (2006).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu wideo są sponsorowane przez Med Associates, Inc.

Zadania warunkowania instrumentalnego stanowią skuteczną metodę oceny zmian w motywacyjnych właściwościach pokarmu. Procedury eksperymentalne szczegółowo opisane w niniejszym artykule umożliwiają wytrenowanie myszy w naciskaniu dźwigni w celu otrzymania nagrody pokarmowej oraz stabilne reagowanie w schemacie wzmocnień PR.
Pomiar ilości spożytego pokarmu nie dostarcza takich samych wyników, jak miary odpowiedzi oparte na wysiłku, ponieważ nie wszystkie czynniki wpływające na przyjmowanie pokarmu modulują efekty nagradzające jedzenia. Na przykład wyczerpanie dostępnej glukozy poprzez obwodowe podanie 2-deoxyglucose u szczurów zwiększa ilość spożytego pokarmu dostępnego swobodnie, ale nie zmienia punktów przełamania (break points) w zadaniu PR dla pokarmu12. Reagowanie w punkcie przełamania PR może również odzwierciedlać zmiany w jakości nagród pokarmowych. Na przykład punkty przełamania są dodatnio skorelowane z koncentracją sacharozy, co dowodzi, że motywacja do spożycia sacharozy wzrasta w sposób zależny od słodkiego smaku8. Tutaj wykazujemy, że 24-godzinny głód u myszy znacznie zwiększa punkty przełamania PR dla pokarmu HFHS. Z kolei stwierdziliśmy, że obwodowe podanie anorektycznego hormonu leptyny znacząco zmniejsza punkty przełamania dla pokarmu HFHS u myszy. Wyniki te są spójne z wcześniej raportowanym działaniem głodzenia i leptyny na progi nagrody u szczurów12-14.
Podczas stosowania tego protokołu należy pamiętać, że nabycie warunkowej odpowiedzi operantowej podtrzymywanej pokarmem jest znacząco usprawniane przez regularne treningi (co 1-2 dni) oraz przez zwiększenie stanu motywacyjnego myszy poprzez zastosowanie reżimu ograniczenia dostępu do pokarmu. Ponadto, zapewnienie, że myszy wykazują relatywnie stabilną odpowiedź w ramach jednego schematu wzmocnień przed przejściem do bardziej złożonych schematów (np. z FR1 na FR5), jest kluczowe dla zminimalizowania zmienności wyników podczas testowania. Pomimo zastosowania tych kroków, nie jest rzadkością uzyskanie pewnej zmienności, zwłaszcza pomiędzy poszczególnymi myszami. Z tego powodu wysoce zaleca się stosowanie projektu wewnątrzobiektowego (z pomiarami powtarzanymi), jeśli jest to możliwe, aby wyeliminować zmienność międzyobiektową. Chociaż testowanie wewnątrzobiektowe nie jest możliwe w przypadku badania trwałych modyfikacji genetycznych (np. myszy z nokautem w porównaniu z myszami kontrolnymi), można je wykorzystać do badania wpływu leków, uszkodzeń lub ostrych manipulacji genetycznych (np. optogenetycznych).
Otyłość oraz choroby z nią związane stanowią narastający problem, co zwiększyło pilną potrzebę zidentyfikowania zaangażowanych w nie cząsteczek i szlaków neuronalnych. Narastające dowody podkreślają istotną rolę obwodów nagrody w mózgu w zapotrzebowaniu na jedzenie, zwiększeniu spożycia kalorii oraz przybieraniu na wadze. Zadanie PR jest cennym narzędziem do pomiaru wpływu manipulacji neurobiologicznych, genetycznych lub farmakologicznych na efekty nagradzające jedzenia.

<table><tbody><tr><td>Komory operacyjne dla myszy</td><td><a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Med Associates, Inc.</a></td><td>ENV-009A</td><td>Med Associates Inc.&lt;br/&gt;skrytka pocztowa 319 &lt;br/&gt; St. Albans, Vermont 05478, &lt;br/&gt; USA &lt;br/&gt; Tel.: (802) 527-2343</td></tr><tr><td>Inteligentny panel sterowania połączeniami z 8 wejściami/16 wejściami</td><td><a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Med Associates, Inc.</a></td><td>SG-716B</td><td></td></tr><tr><td>Ultralekka chowana dźwignia do myszy</td><td><a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Med Associates, Inc.</a></td><td>ENV-312</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik do peletu</td><td><a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Med Associates, Inc.</a></td><td>ENV-203</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlenie ogólne</td><td><a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Med Associates, Inc.</a></td><td>ENV-215</td><td></td></tr><tr><td>Bodziec świetlny</td><td><a href="http://www.med-associates.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Med Associates, Inc.</a></td><td>ENV-221</td><td></td></tr><tr><td>Bezpylna precyzyjna waga 20 mg do próbek wysokotłuszczowych &amp;amp; granulaty o wysokiej zawartości cukru</td><td>Bio-Serv</td><td>F-06649</td><td>Bio-Serv &lt;br/&gt; One 8th Street, Suite 1 &lt;br/&gt;Frenchtown, NJ 08825, USA &lt;br/&gt; Telefon: (800)-996-9908</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Specjalistyczny sprzęt i materiały</td></tr></tbody></table>

reagowanie w schemacie progresywnego stosunku wzmocnień dla smakołyków o wysokiej zawartości tłuszczów i cukrów u myszy

Progressive-ratio Responding for Palatable High-fat and High-sugar Food in Mice

Produkty spożywcze bogate w tłuszcze i cukry w znacznym stopniu przyczyniają się do przejadania i rosnącego wskaźnika otyłości. Spożywanie smacznych pokarmów może wywoływać efekt nagrody, który wzmacnia powiązania między działaniem a rezultatem i utrwala przyszłe zachowania ukierunkowane na pozyskiwanie tych produktów. Rosnące dowody na to, że efekty nagrody związane z żywnością o wysokiej gęstości energetycznej odgrywają kluczową rolę w przejadaniu i rozwoju otyłości, zwiększyły zainteresowanie badaniem genów, cząsteczek i obwodów neuronalnych modulujących nagrodę żywieniową1,2. Wpływ nagrody różnych bodźców można badać, mierząc gotowość do wysiłku w celu ich uzyskania, na przykład w zadaniach warunkowania instrumentalnego3. Instrumentalne modele nagrody żywieniowej mierzą nabyte i dobrowolne reakcje behawioralne ukierunkowane na zdobycie pożywienia. Powszechnie stosowaną miarą siły nagrody jest procedura instrumentalna znana jako schemat wzmocnień o progresywnym stosunku (PR – progressive ratio).4,5 W zadaniu PR od badanego wymaga się wykonania coraz większej liczby reakcji instrumentalnych dla każdej kolejnej nagrody. Pionierskie badanie Hodos (1961) wykazało, że liczba reakcji wykonanych w celu uzyskania ostatniej nagrody, określana jako punkt przełamania (breakpoint), służy jako wskaźnik siły nagrody4. Podczas gdy procedury instrumentalne mierzące wyłącznie zmiany w tempie reakcji nie pozwalają oddzielić zmian siły nagrody od zmian w wydajności wykonawczej, punkt przełamania wynikający ze schematu PR jest dobrze zwalidowaną miarą efektów nagrody żywieniowej. Zadanie PR było szeroko stosowane do oceny wpływu nagrody narkotyków oraz pokarmów u szczurów (np.6-8), ale w mniejszym stopniu u myszy9. Zwiększone wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy oraz modeli myszy z otyłością indukowaną dietą zwiększyło zapotrzebowanie na behawioralne miary nagrody żywieniowej u myszy. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy materiały i procedury wykorzystywane do uczenia myszy reagowania (naciskania dźwigni) w celu otrzymania wysokotłuszczowych i wysokocukrowych peletów spożywczych w schemacie wzmocnień PR. Wykazujemy, że progi reakcji w punkcie przełamania wzrastają po krótkotrwałym głodzeniu i spadają po obwodowym podaniu hormonu anorektycznego leptyny, co tym samym potwierdza zasadność stosowania tego instrumentalnego paradygmatu żywieniowego u myszy.

Niniejszy raport szczegółowo opisuje protokół wykorzystany do pomiaru efektów nagradzających wysokotłuszczowej diety u myszy z wykorzystaniem zadania warunkowania sprawczego o stosunku progresywnym.

Reagowanie w schemacie progresywnego stosunku wzmocnień dla smakołyków o wysokiej zawartości tłuszczów i cukrów u myszy

Żywność bogata w tłuszcze i cukry w znacznym stopniu przyczynia się do przejadania się oraz wzrostu wskaźników otyłości. Spożywanie produktów smakowych może...

Celem następnego eksperymentu jest wyszkolenie i przetestowanie myszy w zadaniu motywowanym pokarmowo z wykorzystaniem progresywnego harmonogramu wzmocnień (progressive ratio schedule). Osiąga się to poprzez wstępne ograniczenie podaży pokarmu u myszy do 60–70% spożycia ad libitum, aż do uzyskania stabilnej redukcji masy ciała o 5–10%. Aby usprawnić nabywanie zachowania naciskania dźwigni motywowanego pokarmowo, myszy są następnie szkolone w naciskaniu dźwigni w celu otrzymania wysokotłuszczowej i wysokocukrowej nagrody pokarmowej w stałym stosunku 1:1 (fixed ratio one), z zastosowaniem procedury auto-kształtowania.Następnie myszy szkolono w reakcji na pokarm w ramach bardziej złożonych schematów wzmocnień, w tym stałego stosunku pięciu (fixed ratio five), a na koniec w zadaniu o stosunku progresywnym, które pozwala na wiarygodny pomiar efektów nagradzających pokarmu. Następnie, po uzyskaniu stabilnych wyników w schemacie stosunku progresywnego, myszy te były albo poddawane głodzeniu przez 12 do 24 godzin, albo otrzymywały doprzewłonowe wstrzyknięcie czynników retikularnych w celu walidacji zmian w zachowaniu motywowanym przez pokarm w schemacie progresywnego wzmocnienia. Wyniki tego eksperymentu wykazują, że głodzenie zwiększa zachowanie motywowane przez pokarm, podczas gdy podanie hormonu retikularnego leptyny zmniejsza zachowanie motywowane przez pokarm w przypadku nagród w postaci pokarmów o wysokiej zawartości tłuszczu i cukru.Zadania warunkowania wyższego rzędu stanowią przydatny sposób oceny efektów nagradzających i motywacyjnych różnych bodźców oraz zachowań. Zadanie o progresywnym stosunku (progressive ratio task) jest dobrze zwalidowanym schematem wzmocnień, szeroko stosowanym do oceny efektu nagradzającego substancji nadużywanych oraz naturalnych nagród, takich jak pokarm; choć częściej wykorzystywane w badaniach na szczurach, zastosowanie zadań operacyjnych o progresywnym stosunku u myszy staje się coraz istotniejsze w związku z rosnącą liczbą genetycznie zmodyfikowanych modeli mysich. W szczególności wykorzystanie modeli mysich w badaniach nad otyłością oraz uznanie, że nagradzający charakter smacznego, wysokokalorycznego jedzenia znacząco przyczynia się do nadmiernego jedzenia i otyłości, podkreśliło potrzebę pomiaru nagrody pokarmowej u myszy.W niniejszym opracowaniu wyjaśniamy i omawiamy metody stosowane w treningu i testowaniu myszy w zakresie naciskania dźwigni w celu uzyskania atrakcyjnej smakowo wysokotłuszczowej i wysokocukrowej karmy w progresywnym schemacie wzmocnień. Przed rozpoczęciem procedury należy upewnić się, że wszystkie czynności z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami. W razie potrzeby zaleca się przeprowadzanie testów w fazie ciemnej cyklu światło-ciemność.Aklimatyzować myszy do odwróconego cyklu światło-ciemność przez okres od siedmiu do 10 dni. W tym czasie myszy mają dostęp ad libitum do standardowej karmy i wody. Po tym 10-dniowym okresie aklimatyzacji myszy są kwaterowane pojedynczo i poddawane restrykcji pokarmowej poprzez dostarczanie od 60 do 70% ilości pokarmu przyjmowanego ad libitum, aż do osiągnięcia 90 do 95% masy ciała z okresu swobodnego karmienia.Ułatwia to nabycie reakcji naciskania dźwigni; myszy należy ważyć codziennie. Po osiągnięciu utraty masy ciała rzędu 5-10% ilość przydzielanego codziennie pokarmu jest dostosowywana w celu ustabilizowania niższej masy ciała przez resztę okresu treningu. Na trzy dni przed pierwszą sesją treningową przetransportuj myszy w ich klatkach macierzystych do pomieszczenia badawczego, następnie wyjmij każdą mysz z klatki pojedynczo i manipuluj nią przez dwie do trzech minut. Po manipulacji zwróć mysz do klatki macierzystej; aklimatyzuj myszy do pomieszczenia i manipulacji przez trzy kolejne dni, w tym w dniu poprzedzającym rozpoczęcie treningu.Do klatki domowej umieszcza się od 10 do 15 pelletów o wysokiej zawartości tłuszczu i cukru, aby zapobiec potencjalnemu wpływowi neofobii pokarmowej na wyniki warunkowania instrumentalnego. W tym badaniu zastosowano 20 mg beztużowych precyzyjnych pelletów pokarmowych o wysokiej zawartości tłuszczu i cukru, zawierających 49% tłuszczu wołowego. Każda komora operantowa dla myszy znajduje się w wygłuszonym boksie z wentylatorem.Komory operacyjne dla myszy są wyposażone w dwie ultralekkie chowane dźwignie umieszczone po obu stronach pojemnika z pokarmem. Nad każdą dźwignią znajduje się lampka bodźcowa, a u góry klatki lampka oświetlająca pomieszczenie. Podajnik pokarmu znajduje się na zewnątrz komory.Komory są połączone z komputerem PC z oprogramowaniem Med PC four za pomocą inteligentnej szafy sterującej. Myszy są wprowadzane do komory operacyjnej. Początkowy paradygmat treningowy opiera się na stałym schemacie wzmocnień (fixed ratio), w którym pojedyncze naciśnięcie dźwigni wywołuje podanie granulatu pokarmowego do pojemnika.Tylko jedna dźwignia jest wyznaczona jako aktywna i wyzwala podanie nagrody pokarmowej. Przypisanie dźwigni prawą i lewą jest zrównoważone pomiędzy myszami. Trening wymaga również procedury kształtowania, w ramach której na dźwigni umieszcza się pokruszone pelety pokarmowe, aby wzmocnić zachowanie naciskania dźwigni.Podczas tego wstępnego treningu aktywna reakcja na dźwignię wyzwala podanie nagrody pokarmowej, a między naciśnięciem dźwigni a podaniem pokarmu nie występuje żadna przerwa. Gdy myszy nauczą się naciskać dźwignię pięć razy, rozpoczyna się okres przerwy (timeout), podczas którego dodatkowe naciskanie dźwigni nie skutkuje podaniem granulatu. Okres przerwy umożliwia myszom spożycie granulatu.W razie potrzeby można zastosować dłuższe okresy przerwy (timeout) po naciśnięciu aktywnej dźwigni w trakcie trwania takiej przerwy. Ponownie, skutkuje to wydaniem granulatu pokarmowego przy każdym stałym stosunku jeden do pięciu sekund. Sesja treningowa z przerwami trwa jedną godzinę lub do momentu wydania 50 granulatów.Operantne trenowanie kontynuuje się przez 7–10 dni, aż do momentu osiągnięcia kryteriów nabycia zachowania: myszy utrzymujące pobieranie pokarmu muszą wykazywać dyskryminację na poziomie równym lub wyższym niż 3:1 dla dźwigni aktywnej w stosunku do nieaktywnej oraz uzyskiwać 20 lub więcej nagród na sesję. Za osiągnięcie kryteriów nabycia uznaje się spełnienie tych warunków w trzech kolejnych sesjach. Myszy, które nie osiągną kryteriów nabycia w okresie od 7 do 10 dni, poddawane są dalszemu trenowaniu przez dodatkowe 5–7 dni.Myszy są wykluczane z testów, jeśli do piątego dnia treningu nie zostanie odnotowany postęp. Należy pamiętać, że upośledzenie nabytego warunkowania instrumentalnego może być wynikiem określonych interwencji farmakologicznych i genetycznych, w związku z czym powinno zostać udokumentowane. Po trzech kolejnych sesjach uzyskania 20 lub więcej peletów, schemat został zwiększony do protokołu FR 5 TO 5 s, w którym pięć naciśnięć dźwigni aktywnej wyzwala podanie peletu z pokarmem.Trening w schemacie FR 5 T 0,5 s trwa zazwyczaj od trzech do pięciu dni, aż do momentu ustabilizowania się odpowiedzi. Następnie zwierzę było trenowane w progresywnym schemacie wzmocnień (PR). Schemat stosunku odpowiedzi podczas testów PR można obliczyć zgodnie z metodą Richardsona i Robertsa, gdzie R jest równe liczbie już zdobytych nagród pokarmowych plus jeden.W związku z tym liczba reakcji wymaganych do otrzymania nagrody pokarmowej postępuje według schematu: 1, 2, 4 6 9 12 15, 20, 25, 32, 40 50, 62, 77, 95 i tak dalej. Ostatni zrealizowany stosunek stanowi punkt przełamania (break point). Sesja PR trwa maksymalnie jedną godzinę lub do momentu braku naciśnięcia dźwigni w dowolnym 10-minutowym przedziale czasowym.Skutkuje to zakończeniem sesji. Wyniki w harmonogramie wzmocnień PR uznaje się za stabilne, gdy liczba uzyskanych nagród w jednej godzinnej sesji nie odbiega o więcej niż 20% przez co najmniej trzy kolejne dni; aby potwierdzić pokarmowe podtrzymywanie reakcji operantowych w zadaniu PR, ocenia się reakcje w punkcie przełamania (breakpoint) po manipulacjach znanych z modulowania nagrody pokarmowej. Stosunkowo łatwym do przeprowadzenia testem jest deprywacja pokarmowa, która zwiększa stan motywacyjny myszy w odniesieniu do pokarmu, a tym samym podnosi punkty przełamania.Myszy są najpierw poddawane próbie w zadaniu PR w okresie karmienia ad libitum, aż do osiągnięcia stabilnych wyników bazowych w dniu następującym po ostatnim dniu pomiarów bazowych. Z klatek domowych usuwa się pokarm, a następnie myszy są badane w zadaniu PR od 12 do 24 godzin po rozpoczęciu postu; aby zbadać odwrotny efekt w zakresie progów punktu przełamania, można przetestować obwodową administrację hormonu przeciwstarego. Badanie PR z użyciem leptyny przeprowadza się po dawkach IP PBS jednego dnia, a następnie po wstrzyknięciu 5 mg/kg leptyny w dniu następnym.Leptynę wstrzykuje się na godzinę przed testem PR, co pokazano tutaj. Głodzenie zwiększa efekt nagradzający pokarmu; 24-godzinny post znacząco zwiększył punkty przełamania w harmonogramie wzmacniania o progresywnym stosunku u myszy, co pokazano tutaj. Leptyna zmniejsza nagrodę pokarmową u myszy, ponieważ obwodowe podanie leptyny obniżyło progi reakcji w punkcie przełamania. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że nabycie operacyjnego odpowiadania w celu utrzymania pokarmu jest znacznie usprawnione przez regularny trening oraz poprzez zwiększenie stanu motywacyjnego myszy poprzez wprowadzenie reżimu ograniczenia pokarmowego.Ponadto zapewnienie, aby myszy wykazywały stosunkowo stabilną reakcję w ramach jednego schematu wzmocnienia przed przejściem do bardziej złożonych schematów, jest kluczowe dla zminimalizowania zmienności wyników podczas testów. Otyłość i choroby z nią związane stanowią narastający problem, co zwiększyło pilną potrzebę zidentyfikowania zaangażowanych cząsteczek oraz szlaków neuronalnych. Schemat progresywnego stosunku jest cennym narzędziem do pomiaru wpływu manipulacji neurobiologicznych, genetycznych lub farmakologicznych na efekty nagradzające pokarmu.

progressive-ratio-responding-for-palatable-high-fat-high-sugar-food

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Progresywne reagowanie na przysmak Wysoko-tłuszczowa i Wysoko-cukrowa żywność u myszy

W niniejszym protokole opisujemy metodę uczenia operacyjnego u myszy, w której w roli wzmocnienia wykorzystuje się bodźce sensoryczne. Metoda ta nie wymaga wcześniejszego treningu ani ograniczeń pokarmowych i umożliwia badanie zachowań motywowanych bez użycia wzmocnień farmakologicznych lub naturalnych, takich jak pokarm.

Poszukiwanie doznań w warunkowaniu instrumentalnym u myszy

Obecne badanie ocenia nowatorską procedurę oceny wzmacniających efektów smacznych roztworów u szczurów laboratoryjnych: samodzielne podawanie wewnątrzustne. W tym celu mierzono reakcję instrumentalną (tj. naciskanie dźwignią) na wewnątrzustne wlewy słodkich roztworów o różnych stężeniach na podstawie ciągłych i progresywnych harmonogramów współczynników wzmocnienia.

Nowatorska procedura oceny wzmacniających właściwości degustatorów u szczurów laboratoryjnych: instrumentalne samodzielne podawanie wewnątrzustne

Zawartość tłuszczu w diecie wpływa zarówno na spożycie energii, jak i skład tkanki tłuszczowej u ssaków. Badając preferencje szczurów do pokarmów o wysokiej zawartości tłuszczu w serii eksperymentów z wyboru, możliwe jest przetestowanie różnic genetycznych i interwencji farmakologicznych dotyczących ich preferencji dla pokarmów o wysokiej zawartości tłuszczu.

Preferencja tłuszczowa: nowy model zachowań żywieniowych u szczurów

To badanie z powodzeniem zaadaptowało metody ludzkiego wideofluoroskopowego badania połykania (VFSS) do użycia z modelami chorób mysich w celu ułatwienia badań nad dysfagią translacyjną.

Adaptacja metod badania wideofluoroskopowego jaskółki u ludzi do wykrywania i charakteryzowania dysfagii w modelach choroby myszy

Obecny artykuł opisuje generację i charakterystykę metaboliczną myszy karmionych dietą wysokotłuszczową jako model insulinooporności i otyłości wywołanej dietą. Ponadto zawiera szczegółowe protokoły do wykonywania doustnego testu tolerancji glukozy i testu tolerancji insuliny, monitorując zmiany metabolizmu glukozy w całym organizmie in vivo.

Badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT)

Ten protokół opisuje użycie analizatora składu ciała i systemu monitorowania metabolizmu zwierząt do charakteryzowania składu ciała i parametrów metabolicznych u myszy. Jako przykład zastosowania tych technik podaje się model otyłości wywołanej przez żywienie wysokotłuszczowe.

Analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo

Ten protokół opisuje użycie bardzo smacznej diety stołówkowej w stylu zachodnim do modelowania przejadania się i otyłości u gryzoni. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy zarys selekcji, przygotowania i pomiaru żywności oraz wyjaśniamy czynniki metodologiczne, które pomagają w generowaniu solidnego i powtarzalnego fenotypu.

Smaczna dieta stołówkowa w stylu zachodnim jako niezawodna metoda modelowania otyłości wywołanej dietą u gryzoni

Prezentowany tutaj jest protokół do badania zachowań podobnych do depresji i anhedonów u szczurów. Łączy dwie dobrze znane metody behawioralne, preferencję sacharozy i testy hipofagii wywołanej nowością, z automatycznym systemem monitorowania spożycia żywności i płynów, aby pośrednio badać zachowanie gryzoni przy użyciu parametrów zastępczych.

Testy preferencji sacharozy i hipofagii wywołanej nowością u szczurów przy użyciu zautomatyzowanego systemu monitorowania spożycia pokarmu

Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Ograniczenie czasu przyjmowania pokarmu okazało się obiecującą interwencją mającą na celu złagodzenie chorób metabolicznych wywołanych przez dietę. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje budowę i zastosowanie zbudowanego we własnym zakresie wydajnego systemu do pomiaru i manipulowania rytmicznym przyjmowaniem pokarmu przez myszy.

Manipulacja rytmicznym przyjmowaniem pokarmu u myszy za pomocą niestandardowego systemu żywienia

Model objadania się został ustalony u myszy korzystających z przerywanego dostępu do M&amp;M's (bardzo smacznego pokarmu składającego się z tłuszczu i cukru). Myszy z przerywanym dostępem do tego wysokotłuszczowego i bogatego w cukier pokarmu wykazywały zachowania podobne do stresu, zwiększone spożycie kalorii i preferencję dla tego pokarmu w stosunku do standardowej karmy w porównaniu z myszami z ciągłym dostępem do pokarmu lub bez niego.

Model przerywanego napadowego spożycia u myszy

Poznaj metodę progresywnego stosunku reagowania do oceny motywacji pokarmowej u myszy. Protokół obejmuje ograniczenie pokarmu i trening naciskania dźwigni w celu pomiaru efektów nagradzających pożywienia wysokokalorycznego.

Reagowanie w schemacie progresywnego stosunku wzmocnień dla smakołyków o wysokiej zawartości tłuszczów i cukrów u myszy

Przeglądaj więcej filmów