Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zidentyfikowanie obszarów ekspresji konkretnego genu oraz charakterystyka czasu i poziomów tej ekspresji, aby przyczynić się do zrozumienia funkcji genu. Osiąga się to poprzez szybkie pobranie i przygotowanie tkanki do użycia w procedurze, co pozwala zachować jej integralność. W drugim kroku tkanka jest poddawana obróbce w celu zmniejszenia nieswoistego wiązania sond rybo.

Następnie sondy ribo są hybrydyzowane z tkanką, a wiązanie sondy RIBA jest wizualizowane. Wykorzystując film rentgenowski lub emulsję światłoczułą, uzyskuje się wyniki wskazujące lokalizację i poziom ekspresji genów na podstawie obrazów rentgenowskich lub analizy mikroskopowej w ciemnym i jasnym polu. Przy użyciu oprogramowania Image J wykonuje się kilka krytycznych kroków, które muszą zostać przeprowadzone prawidłowo, ponieważ wiele osób popełnia w nich błędy; jednym z nich jest zapobieganie tłu.

Istnieje szereg czynników, które mogą powodować występowanie tła, takich jak niewłaściwa saturacja lub hybrydyzacja w nieprawidłowej temperaturze. Innym problemem jest kontaminacja RNA, która doprowadzi do degradacji sondy RNA. Należy zatem dbać o to, aby wszystkie materiały i warunki były wolne od RNaz.

Po trzecie, podczas zanurzania szkiełek w emulsji należy upewnić się, że w ciemni nie występują żadne wycieki światła ani ekspozycja emulsji na światło na żadnym z etapów tego procesu, który może trwać do trzech tygodni. Technikę tę zaprezentuje Hun Chen, stażysta podoktorski w moim laboratorium. Po pobraniu świeżego mózgu i opłukaniu go w 1× PBS, należy zatopić mózg w medium OCT tissue tech, zanurzając go w formie zawierającej medium w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że mózg jest zorientowany w sposób odpowiedni do sekcjonowania. Następnie, po spryskaniu suchego lodu etanolem, zamroź tkankę, umieszczając blok w mieszaninie etanolu i suchego lodu. Uważając, aby etanol nie dostał się do wnętrza bloku, przetnij zamrożoną tkankę w kriostacie na sekcje o grubości od 10 do 12 µm i nanieś je na szkiełka super plus przeznaczone do tkanek mózgowych i embrionalnych.

Optymalna temperatura cięcia mieści się w zakresie od -18 °C do -20 °C. Przechowywać skrawki w pudełku na preparaty w temperaturze -80 °C. Przenieść preparaty z przechowywania w -80 °C do metalowego statywu na suchym lodzie.

Następnie, pracując w certyfikowanej dygestorium, umieść kasetę w roztworze 4% paraformaldehydu, który został uprzednio podgrzany do temperatury o trzy do pięciu stopni Celsjusza wyższej od temperatury pokojowej. Inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyjmij kasetę z paraformaldehydu i przemyj preparaty, zanurzając kasetę w PBS 15 razy. Powtórz ten etap płukania dwukrotnie, za każdym razem używając świeżego roztworu PBS.

Następnie zanurz preparaty w świeżo przygotowanym buforze do acetylacji na 10 minut, aby zredukować nieswoiste wiązanie sondy RIBA. Potem przemyj preparaty w ten sam sposób co wcześniej, lecz tym razem stosując jako roztwór płuczący 2× SSPE. Odwodnij tkankę, przeprowadzając ją przez serię etanolu 70%, 95% i 100%, przez dwie minuty w każdym roztworze.

Następnie suszyć preparaty w dygestorium przez co najmniej 10 do 15 minut. Po syntezie sondy RIBA, zgodnie z instrukcjami w protokole pisemnym, obliczyć wymaganą objętość sondy RIBA oraz roztworu do hybrydyzacji niezbędną dla wszystkich preparatów. Podgrzać mieszaninę do hybrydyzacji sondy Ribo do 65 °C przez pięć minut.

Aby zdenaturować sondę Ribo, nanieś pipetą 100 µL roztworu do hybrydyzacji sondy Ribo i rozprowadź go wzdłuż szkiełka nakrywki. Następnie użyj drugiego szkiełka nakrywki, aby równomiernie rozprowadzić roztwór po tkance i szkiełku. Umieść preparat poziomo, stroną górną do góry, w metalowym statywie, a gdy wszystkie preparaty będą gotowe, powoli zanurz statyw w kąpieli olejowej o temperaturze 65 °C na minimum cztery godziny i maksimum 16 godzin.

Olej tworzy szczelną powłokę wokół szkiełek przykrywek; po inkubacji należy usunąć nadmiar oleju z metalowego statywu zawierającego preparaty. Następnie należy umieścić statyw w szklanej lub metalowej kuwecie z chloroformem w dygestorium. Płukanie należy powtórzyć w drugiej kuwecie ze świeżym chloroformem.

Następnie zanurz statyw w roztworze 0,1% beta-merkaptoetanolu i 2x SSPE, aby poluzować szkiełka przykrywki i rozpuścić nadmiar roztworu do hybrydyzacji. Następnie przenieś preparaty do drugiej porcji świeżego roztworu 0,1% beta-merkaptoetanolu i 2x SSPE. Przenieś odsłonięte preparaty do nowego statywu w kuwecie zawierającej 0,1% beta-merkaptoetanolu w 2x SSPE i inkubuj w tym roztworze przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar nieprzypisanego sondy RNA.

Następnie przenieś kasetkę z preparatami do uprzednio podgrzanego dwukrotnego roztworu SSPE plus 50% głównego roztworu szerokiego w temperaturze 65 stopni Celsjusza, zawierającego beta ME i etanol do stężenia końcowego 0,1%, i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Po inkubacji zutylizuj ten oraz wszystkie poprzednie wodne roztwory płuczące, a także szkiełka nakrywki jako odpady radioaktywne. Następnie przemyj preparaty dwukrotnie w podgrzanym 0,1-krotnym roztworze SSPE w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut w każdym cyklu.

Następnie odwodnij tkankę, stosując serię roztworów etanolu o stężeniach 70%, 95% i 100% przez dwie minuty w każdym roztworze. Na koniec wysusz preparaty w dygestorium przez co najmniej 30 minut. W pierwszej kolejności należy określić, czy w tkance występuje sygnał promieniotwórczy.

Umieść wysuszone preparaty w kasecie filmowej, pracując w ciemni przy użyciu bezpiecznego oświetlenia; nad preparatami umieść film rentgenowski. Upewnij się, że preparaty przylegają do strony emulsyjnej filmu, a następnie zamknij kasetę. Poddaj preparaty ekspozycji na film od jednego do siedmiu dni, w zależności od oczekiwanej liczebności transkryptów.

Po zakończeniu ekspozycji wywołać film rentgenowski w standardowym wywoływaczu i utrwalaczu. Sygnał hybrydyzacji pojawi się jako czarne obszary na filmie, powstałe w wyniku naświetlenia ziaren srebra w emulsji, co pozwoli określić rozdzielczość komórkową i zobaczyć sygnał bezpośrednio w tkance. Preparaty zanurza się w emulsji fotograficznej, a następnie poddaje barwieniu kontrastowemu.

Jeśli preparaty mają zostać przeciwbarwione fioletem krystalicznym, przekroje muszą zostać odbarwione zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Na tym etapie, pracując w ciemni, należy nalać wodę destylowaną do probówki. Odmierzyć emulsję NTB i rozcieńczyć ją wodą destylowaną w stosunku jeden do jednego.

Po roztopieniu emulsji w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20 do 30 minut, należy przenieść ją do szklanego pojemnika do zanurzania w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20 do 30 minut. Poziom rozcieńczonej emulsji powinien teraz zakrywać wszystkie skrawki na szkiełku w momencie jego zanurzenia. W przypadku dużej liczby szkiełek może być konieczne użycie dodatkowej ilości emulsji.

Następnie zanurz szkiełka w rozcieńczonej emulsji w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie wysusz zanurzone szkiełka w zamkniętym, szczelnym przed światłem pojemniku przez noc w ciemni lub w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dwie do trzech godzin przy wyłączonym świetle. Po wysuszeniu przenieś szkiełka do kasetki. Oklej krawędzie czarną taśmą izolacyjną, a następnie owiń folią aluminiową.

Przechowywać kasetki w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub tygodni; przed rozpoczęciem wywoływania ogrzać preparaty do temperatury pokojowej. Następnie, pracując w ciemni, wyjąć statyw z preparatami z kasetek i wywoływać je w wywoływaczu codec D 19 w temperaturze 16 °C przez 3–5 minut. Następnie wypłukać wywołane preparaty w wodzie z kranu w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Następnie inkubuj preparaty dwukrotnie w roztworze utrwalającym w temperaturze 19°C po sześć minut każdy; podczas drugiej inkubacji w utrwalaczu można zapalić światło w pomieszczeniu. Teraz płucz preparaty pod bieżącą wodą w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Następnie, używając żyletki, zeskrob emulsję z tyłu preparatu, gdy jest on jeszcze mokry.

Na koniec przeprowadź kontrastowanie przy użyciu 0,3% fioletu krystalicznego, a następnie, jeśli jest to konieczne, odwodnij i zamontuj preparaty zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Usuń nadmiar emulsji z tyłu szkiełek przedmiotowych, zwilżając je wodą i skrobiąc żyletką. Opłucz szkiełka w 80% roztworze etanolu i przetrzyj delikatnie raz lub dwa razy, aby usunąć zanieczyszczenia i kurz.

Wykonaj zdjęcia przy oświetleniu w ciemnym lub jasnym polu. Kroki skrobania i czyszczenia mogą wymagać powtórzenia dwa lub trzy razy, aby uzyskać dobre obrazy bez cząsteczek kurzu, które są łatwo widoczne w ciemnym polu pod mikroskopem stereoskopowym. Poniższe obrazy są przykładami autoradiografii hybrydyzacji in situ z klisz rentgenowskich.

Ten obraz z filmu rentgenowskiego przedstawia strzałkowy przekrój całej głowy kanarka zebra w 10. dniu embrionalnym, który został poddany hybrydyzacji z antysensowną sondą rybową do Fox P one. Czarne ziarna na filmie wskazują ekspresję mRNA; jak widać w obrębie mózgu, mRNA Fox P one jest tutaj wzbogacone w meso alium stri aum oraz grzbietowym wzgórzu. Obraz z filmu rentgenowskiego przedstawia przekrój z tego samego kanarka zebra, który został poddany hybrydyzacji z 90 cents RIBA sondą do Cuper.

TF dwa Co. TF dwa jest wzbogacony w obszarze palam alium oraz bardziej brzusznej części wzgórza. Poniższe obrazy są przykładami autoradiografii hybrydyzacji in situ z szkiełek zanurzonych w emulsji. Ten obraz w ciemnym polu, wykonany pod mikroskopem dissectingowym, przedstawia sagittalny przekrój całej głowy kanarka w szóstym dniu po wykluciu, który został poddany hybrydyzacji z antysensowną sondą RIBA przeciwko Fox P jeden.

Białe, odsłonięte ziarna srebra w emulsji nad tkanką wskazują ekspresję mRNA. Kolor czerwony reprezentuje barwienie fioletem krystalicznym. Pasek skali odpowiada jednemu milimetrowi.

Na obrazie przedstawiono przekrój tego samego ok. zebra finch, który został zhybrydyzowany z przeciwsensowną sondą rybo do coop TF two. Następne obrazy porównują znakowanie przeciwsensowne i sensowne, wykazując różne wzorce widoczne w autoradiografii na kliszach rentgenowskich przekrojów głowy zebra finch pobranych w 12. dniu embrionalnym. Linia przerywana wskazuje kontur całego mózgu, a litera C oznacza móżdżek.

Widać, że nić antysensowna PAC six jest wyrażona w mózgu, w szczególności w strefie komorowej. Sąsiedni przekrój zhybrydyzowany z nicią sensowną pack six nie wykazuje ekspresji tła w całej głowie embrionu, lecz widoczną ekspresję w warstwie pigmentowej siatkówki, podobnie jak w przypadku nici antysensownej. Poniższe obrazy przedstawiają w C dwa sygnały ekspresji genów oraz preparaty z emulsją pobrane z mózgu ziębika w późnych stadiach embrionalnych w widoku w polu jasnym i ciemnym.

Ten obraz w jasnym polu pokazuje ekspresję D one B w 10. dniu embrionalnym. Przy normalnej ekspozycji na emulsję etykieta, która wydaje się czarna, jest ledwo widoczna przy tym powiększeniu. Ten obraz przedstawia identyczny przekrój i powiększenie jak na poprzednim zdjęciu, ale w widoku ciemnego pola, gdzie znakowanie w prążkowiu i wzgórzu jest widoczne na biało.

Ten obraz w jasnym polu przedstawia ekspresję slit3 w 12. dniu embrionalnym. Po prześwietleniu emulsji czarna etykieta jest łatwo widoczna. SC oznacza położenie rdzenia kręgowego, a CB oznacza położenie móżdżku.

Kierunek rostralny skierowany jest w lewo. Przedstawiony tutaj obraz to ten sam przekrój i powiększenie, jednak wyświetlony w trybie ciemnego pola, co uwidacznia białe znakowanie w rdzeniu kręgowym, odpowiadające obrazowi w jasnym polu. Kolejne obrazy pokazują rozdzielczość ziaren srebra na poziomie komórkowym.

Przedstawiono tutaj znakowanie mRNA dla Fox P1 w przedmózgowiu kanarka zebrowego; ziarna srebra widoczne są jako czarne punkty nad komórkami barwionymi fioletem krystalicznym. Obraz ten pokazuje wysoką ekspresję w poszczególnych komórkach mesoalium dorosłego kanarka zebrowego. Ten obraz przedstawia niską ekspresję w poszczególnych komórkach sąsiedniego alium w tej samej sekcji.

Ekspresja mRNA Hi Fox P1 jest widoczna w komórkach mezoalium w 12. dniu embrionalnym.

Widoczne tutaj komórki embrionalne są mniejsze i gęściej upakowane w porównaniu z komórkami dorosłymi widocznymi na dwóch poprzednich obrazach. Na koniec, ten obraz przedstawia niską ekspresję nad komórkami w sąsiednim alium tego samego przekroju. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, w jakim typie komórek ekspresowany jest gen docelowy.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania hybrydyzacji in situ. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami radioaktywnymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony osobistej.