Name: Radioaktywna hybrydyzacja in situ do wykrywania różnych wzorców ekspresji genów w tkance (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 38 s
Description: Poznaj radioaktywną hybrydyzację in situ do wykrywania wzorców ekspresji genów w tkankach kręgowców. Ta metoda umożliwia ilościową detekcję mRNA o niskiej obfitości z zachowaniem integralności tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Jarvis za udoskonalenie protokołu na przestrzeni lat.

<ol><li>Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probes+for+rare+mRNAs+reveal+distributed+cell+subsets+in+canary+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain.</a> Neuron. 1, 249-261 (1988).</li>
<li>Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+glutamate+receptors+in+avian+neural+pathways+for+learned+vocalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization.</a> J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).</li>
<li>Haesler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Jarvis, E. D., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Motor-driven gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).</li>
<li>Holzenberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+expression+of+insulin-like+growth+factor+II+in+the+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain.</a> J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).</li>
<li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).</li>
<li>Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole-mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).</li>
<li>Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+nonradioactive+detection+of+mRNA+in+tissue+sections%3A+novel+application+of+the+whole-mount+in+situ+hybridization+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol.</a> J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).</li>
<li>Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dusp1+immediate+early+gene+is+regulated+by+natural+stimuli+predominantly+in+sensory+input+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).</li>
<li>Braissant, O., Wahli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+in+situ+hybridization+protocol+using+non-radioactively+labelled+probes+to+detect+abundant+and+rare+mRNAs+on+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica%22%5BJournal%5D)">A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections.</a> Biochemica. 1, 10-16 (1998).</li>
<li>Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+receptors+in+a+songbird+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dopamine receptors in a songbird brain.</a> J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).</li>
<li>Wada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+neuroethological+approach+for+identifying+and+characterizing+a+cascade+of+behaviorally+regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).</li>
<li>Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+shift+functional+connectivity+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).</li>
<li>Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+behavioral+and+genomic+responses+to+social+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity.</a> PLoS. Biol. 3, e363(2005).</li>
<li>Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+gene+regulation+by+territorial+singing+behavior+in+freely+ranging+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds.</a> Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).</li>
<li>Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+whom+the+bird+sings%3A+context-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">For whom the bird sings: context-dependent gene expression.</a> Neuron. 21, 775-788 (1998).</li>
<li>Feenders, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mapping+of+movement-associated+areas+in+the+avian+brain%3A+a+motor+theory+for+vocal+learning+origin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin.</a> PLoS One. 3, e1768(2008).</li>
<li>Chen, C. C., Fernald, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+two+gonadotropin-releasing+hormone+receptor+types+in+a+cichlid+fish+suggest+functional+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization.</a> J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Radioaktywna hybrydyzacja in situ ekspresji mRNA jest szeroko stosowana w wielu celach, w tym do badania regionalnej organizacji tkanek, typów komórek oraz funkcjonalnej aktywności mózgu2-5,10,12-14. To ostatnie zastosowanie dotyczy genów, których ekspresja mRNA w mózgu jest zależna od zwiększonej aktywności neuronalnej, często nazywanych genami zależnymi od aktywności lub genami wczesnymi (immediate early genes). Przy takich zastosowaniach nasza metoda była stosowana u wielu gatunków, w tym u ptaków, ssaków (np. człowieka), ryb i płazów; w wielu tkankach, w tym w mózgu, skórze i mięśniach; oraz w różnym wieku, w tym u piskląt/noworodków, osobników młodocianych, dorosłych, a tutaj w przekrojach całych embrionów2,3,5,15-17. Cechy szczególne naszego protokołu obejmują: (1) zapewnia on równowagę między specyficznością anatomiczną a specyficznością ilościową. Aby określić ilość ekspresji genu na kliszy rentgenowskiej, wykonujemy cyfrowe zdjęcia obrazów (np. Rys. 1A i 1B), używamy funkcji histogramu programu Photoshop (Adobe) do pomiaru gęstości pikseli w obszarach zainteresowania i odejmujemy poziomy tła na kliszy poza tkanką, ale wciąż na szkiełku podstawowym2,4. Aby określić ilość ekspresji na poziomie komórkowym, wykonujemy zdjęcia ziaren srebra nad komórkami przy dużym powiększeniu (40-100X; Rys. 4). Następnie używamy funkcji threshold i measure programu Image J opracowanego przez Wayne'a Rasbanda w NIH, aby policzyć liczbę ziaren srebra na obrazie, odejmujemy liczbę ziaren tła w podobnym obszarze bez komórek na szkiełku podstawowym, a następnie dzielimy przez liczbę komórek, aby uzyskać wartości ekspresji na komórkę4,18. (2) Może charakteryzować się stosunkowo wysoką przepustowością, umożliwiając jednoczesne przetwarzanie 100-200 szkiełeczek dzięki szczelnemu zamknięciu szkiełek przykrywek za pomocą kąpieli w oleju mineralnym. Standardowe metody hybrydyzacji in situ wymagają więcej czasu na uszczelnienie szkiełeczek za pomocą parafilmu, lakieru do paznokci i innych środków, co powoduje, że szkiełka zajmują dużo miejsca; (3) jest bardzo czuła w przypadku transkryptów o niskiej liczebności dzięki zastosowaniu siarczanu dekstranu i roztworu Denhardta w buforze hybrydyzacyjnym2,13; (4) podejście obrazowe w ciemnym polu daje obrazy o wysokim kontraście dzięki wykonywaniu zdjęć w oświetleniu ciemnego pola na mikroskopie stereoskopowym4,5. Ponadto pozwala na czułą detekcję niewielkich zmian w ekspresji genów, takich jak ekspresja genów zależnych od aktywności, w celu zidentyfikowania konkretnych obszarów mózgu aktywowanych podczas percepcji i realizacji określonych zachowań19. Ograniczeniami w porównaniu z protokołami nieradioaktywnymi są fakt, że te ostatnie oferują wyraźniejszą rozdzielczość komórkową i dokładniejszą lokalizację mRNA wewnątrz komórki, a praca z emulsją jest bardzo wrażliwa na manipulację i światło. Naszą metodę można łączyć z innymi metodami, takimi jak nieradioaktywna hybrydyzacja in situ, aby znakować ekspresję mRNA więcej niż jednego genu w tej samej tkance10,17,20. Może być ona łączona z immunocytochemią w celu znakowania ekspresji zarówno RNA, jak i białka w tej samej próbce, aby współlokalizować mRNA z określonymi typami komórek10. Modyfikacje protokołu niezbędne dla takich eksperymentów z podwójnym znakowaniem zostały opisane w cytowanych referencjach.
Podsumowując, nasze podejście ułatwia zrozumienie czasu i lokalizacji komórkowej ekspresji genów w celu poznania organizacji regionów, aktywności funkcjonalnej tkanek oraz funkcji genów.

<table><tbody><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>VWR</td><td>MK242002</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>BDH1109</td><td></td></tr><tr><td>Octan fioletu krezolowego</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Thermo scientific</td><td>Microm HM550</td><td></td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td>100mM</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>VWR</td><td>15160-215</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Superfrost plus marki Fisher</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>VWR</td><td>BDH0506-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F7508</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw GENECLEAN</td><td>Q-Bio gene</td><td>1001-200</td><td></td></tr><tr><td>Film Kodak BioMax MR</td><td>Sigma</td><td>Z350370</td><td></td></tr><tr><td>Emulsja Kodak NTB</td><td>Carestream Health</td><td>8895666</td><td></td></tr><tr><td>Wywoływacz Kodak Professional D19</td><td>Kodak</td><td>1462593</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalacz Kodak Professional</td><td>Kodak</td><td>1971746</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>VWR</td><td>IC15169491</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR</td><td>SX0600-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Poly A</td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>rATP</td><td>Promega</td><td>P1132</td><td>10mM</td></tr><tr><td>rCTP</td><td>Promega</td><td>P1142</td><td>10mM</td></tr><tr><td>rGTP</td><td>Promega</td><td>P1152</td><td>10mM</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td>40Units/&amp;mu;l </td></tr><tr><td>S&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt; UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG039C001MC</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Safety-Solve</td><td>Safety Solve Research Products International</td><td>111177</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>3M</td></tr><tr><td>Fosforan sodu zasadowy</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu kwaśny</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA SP6</td><td>Promega</td><td>P1085</td><td></td></tr><tr><td>Metalowy statyw do barwienia</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>5x bufor do transkrypcji</td><td>Promega</td><td>P1181</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>VWR</td><td>IC15216391</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>VWR</td><td>101449-446</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109509001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Roztwory:&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;Odczynniki do otrzymywania ribosond: 1,5 &amp;mu;l matrycy DNA (0,2-0,3 &amp;mu;g/&amp;mu;l), 2 &amp;mu;l 5x zoptymalizowanego buforu do transkrypcji, 1 &amp;mu;l 100mM DTT (dołączony do polimerazy z firmy Promega, dokładnie wymieszać w temperaturze pokojowej), 0,3 &amp;mu;l RNasinu (40 jednostek/&amp;mu;l), 1,5 &amp;mu;l roztworu mieszanki rybonukleotydów AGC, 3,5 &amp;mu;l S&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt; UTP oraz 1 &amp;mu;l polimerazy RNA. Uzupełnić do 10 &amp;mu;l wodą wolną od nukleaz.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór mieszanki rybonukleotydów AGC: zmieszać równe ilości 10mM ATP, GTP i CTP.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór octanu sodu do wytrącania EtOH w celu usunięcia wolnego S&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt; UTP: 40 &amp;mu;l wody wolnej od RNazy i DNazy, 5 &amp;mu;l 3M octanu sodu oraz 125 &amp;mu;l 100% EtOH.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Bufor do hybrydyzacji (stok 10 ml): 5 ml 100% dejonizowanego formamidu, 600 &amp;mu;l 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8,0), 240 &amp;mu;l 0,5M EDTA (pH = 8,0), 100 &amp;mu;l 100x roztworu Denharta, 100 &amp;mu;l 1M DTT, 250 &amp;mu;l 20 mg/ml tRNA, 125 &amp;mu;l 20 mg/ml poly A oraz 1 g siarczanu dekstranu sodu. Dodać wodę traktowaną DEPC, aby uzyskać objętość całkowitą 10 ml. Intensywnie wstrząsnąć, a następnie inkubować w 55 &amp;deg;C aż do całkowitego rozpuszczenia siarczanu dekstranu sodu. Przechowywać bufor do hybrydyzacji w -20 &amp;deg;C (stabilny przez ok. 6 miesięcy). &lt;/li&gt; &lt;li&gt;4% buforowany roztwór paraformaldehydu: do kolby przeznaczonej do paraformaldehydu dodać 40 g paraformaldehydu w 760 ml wody destylowanej, podgrzewać do 50 &amp;deg;C na płycie grzejnej przy jednoczesnym mieszaniu. Dodać 320 &amp;mu;l 10N NaOH, aby ułatwić rozpuszczenie paraformaldehydu. Po rozpuszczeniu (ok. 10 min) dodać 100 ml 10x PBS i uzupełnić objętość wodą destylowaną do 1 litra. Mieszać i podgrzewać roztwór, aż paraformaldehyd się rozpuści. pH powinno wynosić 7,4.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Bufor do acetylacji: 13,6 ml trietanolaminy oraz 2,52 ml bezwodnika octowego w 1 litrze wody destylowanej.&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór 20x SSPE: 3M NaCl, 200 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O oraz 200 mM EDTA w wodzie destylowanej. Dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą 10N NaOH. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Bufor 10x PBS: 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; oraz 2,4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; w wodzie destylowanej. Dostosować pH roztworu do 7,0 i uzupełnić objętość całkowitą do 1 litra. &lt;/li&gt; &lt;li&gt;Drugi roztwór do przemywania: 0,1% &amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanolu i 50% formamidu w 2x SSPE&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór octanu fioletu krezolowego: 3% octanu fioletu krezolowego w wodzie z kranu (woda destylowana uniemożliwia prawidłowe barwienie), rozpuszczony przez noc przy mieszaniu w kolbie w temperaturze pokojowej. Przefiltrować za pomocą ssania próżniowego przez 1-milimetrowy papier filtracyjny Whatman i lejek Büchnera. &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Znajomość czasu, poziomu, lokalizacji komórkowej oraz typu komórek, w których ekspresowany jest gen, przyczynia się do zrozumienia jego funkcji. Każdą z tych cech można określić za pomocą hybrydyzacji in situ mRNA wewnątrz komórek. Przedstawiamy tutaj metodę radioaktywnej hybrydyzacji in situ zmodyfikowaną według Clayton et al. (1988)1, która z powodzeniem funkcjonuje w naszym laboratorium od wielu lat, szczególnie w przypadku mózgów dorosłych kręgowców2-5. Długie komplementarne sondy RNA (cRNA) do sekwencji docelowej umożliwiają wykrywanie transkryptów o niskiej obfitości6,7. Włączenie radioaktywnych nukleotydów do sond cRNA pozwala na dalsze zwiększenie czułości wykrywania transkryptów o niskiej obfitości oraz na analizy ilościowe, przeprowadzone za pomocą światłoczułej kliszy rentgenowskiej lub emulsji naniesionej na tkankę. Metody detekcji te zapewniają długoterminowy zapis ekspresji genu docelowego. W porównaniu z metodami z wykorzystaniem sond nieradioaktywnych, takimi jak znakowanie DIG, metoda hybrydyzacji z sondą radioaktywną nie wymaga wielokrotnych etapów amplifikacji z użyciem przeciwciał HRP i/lub zestawu TSA w celu wykrycia transkryptów o niskiej obfitości. W związku z tym metoda ta zapewnia liniową zależność między intensywnością sygnału a ilością docelowego mRNA na potrzeby analizy ilościowej. Pozwala ona na jednoczesne przetwarzanie 100–200 slajdów. Metoda ta sprawdza się również w przypadku różnych stadiów rozwojowych embrionów. Większość badań rozwojowych nad ekspresją genów wykorzystuje całe embriony i podejścia nieradioaktywne8,9, częściowo dlatego, że tkanka embrionalna jest bardziej delikatna niż tkanka dorosła i wykazuje mniejszą kohezję między komórkami, co utrudnia dostrzeżenie granic między populacjami komórek w przekrojach tkankowych. W przeciwieństwie do tego, nasze podejście radioaktywne, dzięki szerszemu zakresowi czułości, pozwala na uzyskanie wyższego kontrastu w rozdzielczości ekspresji genów między obszarami tkanki, co ułatwia dostrzeżenie granic między populacjami. Stosując tę metodę, badacze mogą ujawnić możliwe znaczenie nowo zidentyfikowanego genu i dalej przewidzieć funkcję badanego genu.

Niniejszy protokół jest z powodzeniem stosowany do ilościowego wykrywania poziomów i wzorców przestrzennych ekspresji mRNA w wielu typach tkanek u różnych gatunków kręgowców. Metoda ta umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej zawartości oraz jednoczesne przetwarzanie setek preparatów. Przedstawiamy ten protokół na przykładzie profilowania ekspresji podczas formowania się embrionalnego mózgu ptaków.

Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Znajomość czasu, poziomu, lokalizacji komórkowej oraz typu komórek, w których ekspresowany jest dany gen, przyczynia się do zrozumienia funkcji tego genu. ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie obszarów ekspresji konkretnego genu oraz charakterystyka czasu i poziomów tej ekspresji, aby przyczynić się do zrozumienia funkcji genu. Osiąga się to poprzez szybkie pobranie i przygotowanie tkanki wykorzystywanej w procedurze, co pozwala zachować jej integralność. W drugim kroku tkanka poddawana jest obróbce w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania sond rybo.Następnie sondy ribo są hybrydyzowane z tkanką, a następnie wizualizuje się wiązanie sondy RIBA. Z wykorzystaniem filmu rentgenowskiego lub emulsji światłoczułej uzyskuje się wyniki wskazujące lokalizację i poziom ekspresji genów na podstawie obrazów rentgenowskich lub analizy mikroskopowej w polu ciemnym i jasnym. Przy użyciu oprogramowania Image J wykonuje się kilka krytycznych kroków, które muszą być przeprowadzone prawidłowo, ponieważ wielu badaczy popełnia w nich błędy; jednym z nich jest zapobieganie powstawaniu tła.Istnieje szereg czynników, które mogą powodować pojawienie się tła, takich jak niewłaściwa saturacja lub hybrydyzacja w niewłaściwej temperaturze. Kolejnym problemem jest kontaminacja RNazami, które zdegradują sondę RNA. Należy zatem dbać o to, aby wszystkie elementy pozostawały wolne od RNaz.Po trzecie, podczas zanurzania szkiełek w emulsji należy upewnić się, że w ciemni nie występują żadne wycieki światła ani ekspozycja emulsji na światło na wszystkich etapach tego procesu, który może trwać trzy tygodnie. Technikę tę zaprezentuje Hun Chen, postdoktor w moim laboratorium. Po pobraniu świeżego mózgu i przemyciu go w 1x PBS, należy zatopić mózg w medium OCT tissue tech, zanurzając go w formie zawierającej medium w temperaturze pokojowej.Należy upewnić się, że mózg jest zorientowany w sposób odpowiedni do sekcjonowania. Następnie, po spryskaniu suchego lodu etanolem, zamrozić tkankę, umieszczając blok w mieszaninie etanolu i suchego lodu. Uważając, aby etanol nie dostał się do wnętrza bloku, przy użyciu kriotomu pociąć zamrożoną tkankę na sekcje o grubości od 10 do 12 mikronów i osadzić je na szkiełkach typu super plus przeznaczonych do tkanek mózgowych i embrionalnych.Optymalna temperatura cięcia mieści się w zakresie od -18 °C do -20 °C. Przekroje należy przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze -80 °C. Szkiełka należy przenieść z przechowywania w -80 °C do metalowego statywu na suchym lodzie.Następnie, pracując w certyfikowanej dygestorium, umieść kasetkę w roztworze 4% paraformaldehydu, który został uprzednio podgrzany do temperatury o trzy do pięciu stopni Celsjusza wyższej od temperatury pokojowej. Inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyjmij kasetkę z paraformaldehydu i przemyj preparaty, zanurzając kasetkę w PBS 15 razy. Powtórz ten etap płukania dwukrotnie, używając za każdym razem świeżego roztworu PBS.Następnie zanurz preparaty w świeżo przygotowanym buforze do acetylacji na 10 minut, aby zredukować nieswoiste wiązanie sondy RIBA. Potem wypłucz preparaty w sposób opisany wcześniej, ale tym razem stosując roztwór SSPE 2× jako płyn do płukania. Odwodnij tkankę, przeprowadzając ją przez serię stężeń etanolu: 70%, 95% i 100%, przez dwie minuty w każdym roztworze.Następnie wysusz preparaty w dygestorium przez co najmniej 10 do 15 minut. Po syntezie sondy RIBA, zgodnie z instrukcjami w protokole pisemnym, oblicz wymaganą objętość sondy RIBA i roztworu do hybrydyzacji potrzebną dla wszystkich preparatów. Podgrzej mieszaninę do hybrydyzacji sondy Ribo do 65 °C przez pięć minut.Aby zdenaturować sondę Ribo, nanieś pipetą 100 µL roztworu hybrydyzacyjnego sondy Ribo i rozprowadź go na szkiełku nakrywkowym. Następnie użyj drugiego szkiełka nakrywkowego, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na tkance i szkiełku. Umieść preparat poziomo, stroną górną do góry, w metalowym statywie, a gdy wszystkie preparaty będą gotowe, powoli zanurz statyw w kąpieli olejowej o temperaturze 65 °C na minimum cztery godziny i maksymalnie 16 godzin.Olej tworzy szczelną powłokę wokół szkiełek nakrywkowych po inkubacji tkanek; należy usunąć nadmiar oleju z metalowego statywu zawierającego preparaty. Następnie należy umieścić statyw w szklanej lub metalowej kuwecie z chloroformem, korzystając z dygestorium. Płukanie należy powtórzyć, używając drugiej kuwety ze świeżym chloroformem.Następnie zanurz statyw w roztworze 0.1% betta me cap etanolu i dwukrotnego roztworu SSPE, aby poluzować szkiełka nakrywki i rozpuścić nadmiar roztworu hybrydyzacyjnego. Następnie przenieś slajdy do drugiego roztworu świeżego 0.1% betta me cap TER etanolu i dwukrotnego roztworu SSPE. Przenieś odsłonięte slajdy do nowego statywu w kuwecie zawierającej 0.1% beta macca TER etanol w dwukrotnym roztworze SSPE i inkubuj w tym roztworze przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar niezwiązanej sondy RNA.Następnie przenieś kasetę z szkiełkami do podgrzanego do 65°C roztworu 2×SSPE z dodatkiem 50% formamidu jako głównego roztworu do denaturacji, zawierającego β-ME i etanol w stężeniu końcowym 0,1%, i inkubuj w temperaturze 65°C przez jedną godzinę. Po inkubacji zutylizuj ten oraz wszystkie poprzednie wodne roztwory płuczące, a także szkiełka zakrywkowe jako odpady promieniotwórcze. Następnie przemyj szkiełka dwukrotnie w podgrzanym do 65°C roztworze 0,1×SSPE, inkubując przez 30 minut po każdym razie.Następnie odwodnij tkankę, przeprowadzając ją przez serię roztworów etanolu 70%, 95% i 100% przez dwie minuty w każdym roztworze. Na koniec wysusz preparaty w dygestorium przez co najmniej 30 minut. W pierwszej kolejności należy ustalić, czy w tkance występuje sygnał radiacyjny.Umieścić wysuszone preparaty w kasecie do zdjęć, pracując w ciemni przy świetle bezpiecznym, a następnie nałożyć folię rentgenowską na preparaty. Upewnić się, że preparaty są skierowane stroną emulsji folii, a następnie zamknąć kasetę. Naświetlać folię preparatami od jednego do siedmiu dni, w zależności od spodziewanej liczby transkryptów.Po zakończeniu naświetlania należy wywołać film rentgenowski w standardowym wywoływaczu i utrwalaczu. Sygnał hybrydyzacji pojawi się na filmie w postaci czarnych obszarów wynikających z naświetlenia ziaren srebra w emulsji, co pozwala na określenie rozdzielczości komórkowej i zaobserwowanie sygnału bezpośrednio w tkance. Preparaty na szkiełkach są zanurzane w emulsji fotograficznej, a następnie poddawane barwieniu kontrastowemu.Jeśli preparaty mają zostać poddane barwieniu kontrastowym fioletem krystalicznym, należy przeprowadzić delikatną delipidację przekrojów zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Następnie, pracując w ciemni, należy nalać wodę destylowaną do probówki. Nabrać emulsję NTB i rozcieńczyć ją wodą destylowaną w stosunku jeden do jednego.Po roztopieniu emulsji w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20 do 30 minut, przelej ją do szklanego naczynia do zanurzania w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C przez 20 do 30 minut. Poziom rozcieńczonej emulsji powinien teraz pokrywać wszystkie przekroje na preparacie podczas jego zanurzania. W przypadku dużej liczby preparatów może być konieczne użycie dodatkowej emulsji.Następnie zanurz preparaty w rozcieńczonej emulsji w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C, a następnie wysusz je w zamkniętym, światłoszczelnym pojemniku przez noc w ciemni lub w inkubatorze w temperaturze 37°C przez dwie do trzech godzin przy wyłączonym oświetleniu. Po wysuszeniu przenieś preparaty do kasetki. Oklej krawędzie czarną taśmą izolacyjną, a następnie owiń całość folią aluminiową.Przechowywać kasety w temperaturze 4°C przez okres od kilku dni do kilku tygodni; przed przystąpieniem do wywoływania ogrzać preparaty do temperatury pokojowej. Następnie, pracując w ciemni, wyjąć ramkę z preparatami z kaset i wywoływać je w wywoływaczu codec D 19 w temperaturze 16°C przez 3 do 5 minut. Następnie wypłukać wywołane preparaty w wodzie z kranu w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.Następnie inkubuj preparaty dwukrotnie w roztworze utrwalającym w temperaturze 19 °C po sześć minut za każdym razem; podczas drugiej inkubacji w utrwalaczu można zapalić światło w pomieszczeniu. Teraz przemyj preparaty w bieżącej wodzie o temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Następnie, używając żyletki, zeskrob emulsję z tyłu szkiełka, gdy jest ono jeszcze mokre.Na koniec przeprowadź przeciwbarwienie 0,3% fioletem krystalicznym, a następnie, jeśli jest to konieczne, odwodnij i zamontuj preparaty zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Usuń nadmiar emulsji z rewersu szkiełek, zwilżając je wodą i skrobiąc żyletką. Przepłucz szkiełka w 80% roztworze etanolu i przetrzyj delikatnie jeden lub dwa razy, aby usunąć zanieczyszczenia i kurz.Wykonaj zdjęcia przy oświetleniu w ciemnym polu lub jasnym polu. Kroki skrobania i czyszczenia mogą wymagać powtórzenia dwa lub trzy razy, aby uzyskać wysokiej jakości obrazy bez cząsteczek kurzu, które są łatwo widoczne w ciemnym polu pod mikroskopem stereoskopowym. Poniższe obrazy są przykładami autoradiografii hybrydyzacji in situ z filmów rentgenowskich.Ten obraz z filmu rentgenowskiego przedstawia strzałkowy przekrój całej głowy ptaka śpiewaka z gatunku zebra finch w 10. dniu embrionalnym, który został poddany hybrydyzacji z antysensowną sondą ribo do Fox P one. Czarne ziarna na filmie wskazują ekspresję mRNA, co widać w obrębie mózgu; mRNA Fox P one jest tutaj wzbogacone w meso alium stri aum oraz grzbietowym wzgórzu. Obraz z filmu rentgenowskiego przedstawia przekrój z tego samego ptaka zebra finch, który został poddany hybrydyzacji z sondą 90 cents RIBA do Cuper.TF two Co.TF two wykazuje wzbogacenie w obszarze palam alium oraz w bardziej brzusznych częściach wzgórza. Poniższe obrazy są przykładami autoradiografii hybrydyzacji in situ z preparatów z emulsją. Ten obraz w ciemnym polu, wykonany pod mikroskopem sekcyjnym, przedstawia cały przekrój strzałkowy głowy ziśpiewki w szóstym dniu po wykluciu, który został poddany hybrydyzacji z antysensowną sondą RIBA przeciwko Fox P one.Białe, wyeksponowane ziarna srebra w emulsji nad tkanką wskazują ekspresję mRNA. Kolor czerwony reprezentuje barwienie fioletem krezolowym. Pasek skali odpowiada jednej milimetrowi.Na obrazku przedstawiono przekrój tego samego zięby (zebra finch), u którego przeprowadzono hybrydyzację z antysensowną sondą rybową przeciwko coop TF two. Kolejne obrazy porównują znakowanie antysensowne i sensowne, co ukazuje różne wzory widoczne w autoradiografii na kliszach rentgenowskich przekrojów głowy zięby pobranych w 12. dniu embrionalnym. Linia przerywana wskazuje kontur całego mózgu, a litera C oznacza móżdżek.Można zauważyć, że nić antysensowna genu PAC six wykazuje ekspresję w mózgu, szczególnie w strefie komorowej. Sąsiedni przekrój zhybrydyzowany z nicią sensowną genu PAC six nie wykazuje ekspresji tła w obrębie głowy embrionu, lecz wyraźną ekspresję w warstwie pigmentowej siatkówki, analogicznie do nici antysensownej. Poniższe obrazy przedstawiają w C dwa sygnały ekspresji genu oraz preparaty z emulsją pobrane z mózgu kanarka w późnych etapach embrionalnych w widoku jasnego i ciemnego pola.To zdjęcie w jasnym polu pokazuje ekspresję D one B w 10. dniu embrionalnym. Przy normalnej ekspozycji na emulsję etykieta, która wydaje się czarna, jest ledwo widoczna przy tym powiększeniu. To zdjęcie przedstawia identyczny przekrój i powiększenie jak na poprzednim obrazie, ale w widoku ciemnego pola, wykazując białe znakowanie w prążkowiu i wzgórzu.Ten obraz w jasnym polu przedstawia ekspresję slit3 w 12. dniu embrionalnym. Po nadmiernej ekspozycji emulsji wyraźnie widoczna jest czarna etykieta. SC oznacza położenie rdzenia kręgowego, a CB oznacza położenie móżdżku.Kierunek rostralny znajduje się po lewej stronie. Przedstawiony tutaj obraz to ten sam przekrój i powiększenie, jednak w widoku w ciemnym polu, ukazującym białe znakowanie w rdzeniu kręgowym, które odpowiada obrazowi w jasnym polu. Kolejne obrazy pokazują rozdzielczość ziaren srebra na poziomie komórkowym.Przedstawiono tutaj znakowanie mRNA Fox P1 w przedmózgowiu zięby dwukolorowej; ziarna srebra widoczne są jako czarne punkty nad komórkami barwionymi fioletem krystalicznym. Ten obraz wykazuje wysoką ekspresję w poszczególnych komórkach mesoalium u dorosłej zięby dwukolorowej. Ten obraz wykazuje niską ekspresję w poszczególnych komórkach sąsiedniego alium na tym samym przekroju.Ekspresja mRNA dla Hi Fox P1 jest widoczna w komórkach mezalium w 12. dniu embrionalnym.Komórki embrionalne widoczne tutaj są mniejsze i bardziej ściśle upakowane w porównaniu z komórkami dorosłymi widocznymi na dwóch poprzednich obrazach. Wreszcie, ten obraz przedstawia niską ekspresję w komórkach sąsiadującego alium tego samego przekroju. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład w jakim typie komórek ekspresowany jest gen docelowy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania hybrydyzacji in situ. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony osobistej.

radioactive-situ-hybridization-for-detecting-diverse-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Radioaktywna in situ hybrydyzacja w celu wykrycia zróżnicowanego wzorca ekspresji genów w tkankach

Ten film opisuje strategię sekwencyjnej hybrydyzacji, która polega na hybrydyzacji sond mRNA do określonego docelowego mRNA. Po hybrydyzacji sondy przeprowadza się wzmocnienie sygnału w celu zwiększenia rozdzielczości poprzez zmniejszenie stosunku sygnału do szumu podczas RNA-CISH próbek histologicznych.

Hybrydyzacja sondy i wzmocnienie sygnału w hybrydyzacji RNA in situ: technika wykrywania określonych sekwencji RNA w skrawkach tkanek

Ten film przedstawia protokół wykrywania sygnału podczas chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ. Technika ta może być stosowana do wizualnego diagnozowania aktywnej infekcji onkogennej w nienaruszonej próbce tkanki.

Wykrywanie sygnału RNA CISH: technika wykrywania sygnałów chromogennych podczas hybrydyzacji RNA in situ w nienaruszonych próbkach tkanek

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Tutaj opisujemy test hybrydyzacji in situ, który umożliwia czułe i specyficzne wykrywanie sekwencji tak krótkich jak 50 nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu na poziomie pojedynczej komórki. Test, który może być wykonywany ręcznie lub automatycznie, może umożliwić wizualizację wariantów splicingu, krótkich sekwencji i mutacji w kontekście tkanki.

Wizualizacja wariantów genetycznych, krótkich celów i mutacji punktowych w kontekście morfologicznym tkanki za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Opisujemy zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ z użyciem DIG, który jest szybki i możliwy do zastosowania u szerokiego zakresu gatunków roślin, w tym u świerka pospolitego. Dzięki kilku korektom, obejmującym m.in. zmienioną obróbkę RNazą oraz stężenie proteinazy K, protokół ten może być wykorzystywany w badaniach różnych tkanek i gatunków.

Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowalny dla świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin

Poznaj radioaktywną hybrydyzację in situ do wykrywania wzorców ekspresji genów w tkankach kręgowców. Ta metoda umożliwia ilościową detekcję mRNA o niskiej obfitości z zachowaniem integralności tkanek.

Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Przeglądaj więcej filmów