Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest obserwacja wpływu pseudomona siro PV tomato na białka regulowane przez potencjał redoks w roślinach pomidora. Najpierw należy zaszczepić rośliny pomidora pseudomona siro PV PV tomato, aby wywołać infekcję patogenem i odpowiedź białkową. Następnie należy przeprowadzić barwienie DIAM benzine w celu zaobserwowania zmian w ilości reaktywnych form tlenu.

Następnie należy przeprowadzić znakowanie cystein metodą TMT, aby zbadać regulowane redoks cysteiny w białkach. Uzyskane wyniki pozwalają zmierzyć różnice między próbkami traktowanymi a kontrolnymi. Cześć, jestem Chen z katedry biologii i laboratorium proteomiki na Uniwersytecie Florydy.

Zaletą naszego znakowania CTMT w porównaniu do istniejących metod, takich jak znacznik z powłoką izotopową (isotope coated fin tag), znany również jako ASCA, jest możliwość multipleksowania przy jednoczesnej analizie białek reagujących na potencjał redoks na dużą skalę. Choć niniejsza demonstracja dostarczy wiedzy na temat białek pomidora regulowanych redoks w odpowiedzi na infekcję patogenem, eksperyment ten można zastosować w innych systemach, takich jak joof, myszy cu, inne rośliny oraz w kontroli warunków stresu. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po zaobserwowaniu znacznych różnic między eksperymentami ICAD, wynikających z dostępności jedynie dwóch znaczników.

Demonstracja VIR tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy znakowania i wzbogacania są trudne do opanowania. Należy zminimalizować różnice eksperymentalne między znakowanymi próbkami oraz ograniczyć obszary usuwane, aby zapewnić efektywne znakowanie. Przejdźmy do procedury. W celu przygotowania kultury inokulum wyhoduj dwie przesadzone sadzonki pomidora o podobnej wielkości w doniczkach o średnicy czterech cali.

Kożuch Pseudomonas syringae na płytce KBM. Zezbierz bakterie do 20 mililitrów wody i przygotuj inokulum bakteryjne o stężeniu około 10⁶ jednostek tworzących kolonie na mililitr. W jednym litrze buforu do inokulacji zanurz czterotygodniowe rośliny w roztworze inokulacyjnym z bakteriami na 30 sekund.

Następnie natychmiast przykryć przezroczystymi plastikowymi workami. Po upływie preferowanego czasu inokulacji zebrać w pełni rozwinięty liść, umieścić go stroną epidermy do góry w 1 mg/mL barwnika DAB i poddać infiltracji próżniowej przez 15 minut. Następnie inkubować liście w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc.

Następnie gotuj zabarwione liście w 95% ethanolu przez 10 minut, a potem przechowuj je w 75% ethanolu. Rozcieraj zebrane liście w ciekłym azocie w moździerzu, aż do uzyskania drobnego proszku. Następnie przeprowadź ekstrakcję fenolową zgodnie z opisem w tekście towarzyszącym.

Następnie wytrąć białka ekstrahowane fenolem, dodając pięciokrotność objętości zimnego 0,1 M octanu amonu w 100% metanolu. Odzyskać białka poprzez wirowanie, a następnie przeprowadzić przemycia osadu. Próbki zawiesić ponownie w 1,5 ml zimnego 70% etanolu i przenieść do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 2 ml.

Po wirowaniu należy odrzucić nadsącz etanolowy i krótko osuszyć osad w wirówce próżniowej (speed vac). Próbki należy rozpuścić w denaturującym buforze do ekstrakcji białek; po odwirowaniu w celu uzyskania osadu należy zebrać nadsącz i zmierzyć stężenie białka zgodnie z instrukcją producenta. Dla każdego z sześciu znaczników masy należy zacząć od 100 µg próbki białka w równej objętości świeżo przygotowanego, 200 mM buforu do alkilacji jodOAcetamidem, aby zablokować wolne grupy tiolowe; inkubować w 37 °C przez godzinę. Następnie, aby wytrącić białka, należy dodać 1 ml zimnego, 80% acetonu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc.

Odwiruj białko w celu uzyskania osadu, a następnie przeprowadź trzy przemycia 80% acetonem. Po wysuszeniu próbek na powietrzu na lodzie, ponownie zawieś osad w 50 µL buforu lizującego. Następnie, aby zredukować mostki dwusiarczkowe, dodaj 0,5 µL 100 mM TCEP i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Zsolubilizować tagi, dodając 20 µL acetonitrylu do probówek z odczynnikiem. Wymieszać w wirówce typu vortex i odwirować. Następnie, aby usunąć nadmiar TCEP, nanieść 50 µL próbki na kolumnę MicroCon 3 kDa. Dodać 50 µL buforu lizującego i wirować przez 15 minut przy 10 000 ×g i 4 °C.

Aby pobrać próbkę, należy wyjąć kolumnę, odwrócić ją nad czystą probówką i odwirować. W razie potrzeby sprawdzić pH próbki. Dostosować pH do wartości między siedem a osiem za pomocą jednomolowego kwasu solnego.

Dodaj 5 µL odczynnika TMT do cystein i inkubuj reakcję przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, połącz próbki i dodaj równą objętość buforu do lizy próbek, gotuj przez pięć minut, a następnie rozdziel na gotowym żelu poliakrylamidowym 12%. Po trzykrotnym przemyciu żelu wodą filtrowaną, barw przez godzinę błękitem Coomassie i odbarwiaj przez noc w wodzie, bazując na stężeniu prążków białkowych. Podziel każdą ścieżkę żelu na 12 frakcji. Każdą frakcję potnij na kawałki o wielkości 1 mm i umieść w probówce o pojemności 1,5 mL.

Całkowicie zanurz kawałki żelu w 0,1 M wodorowęglanie amonu w 50% aceton Trylu. Następnie przykryj fragmenty 100% aceton Trylem na 15 minut. Usuń ciecz i wysusz kawałki za pomocą speed vac.

Następnie należy dodać taką samą objętość roztworu trypsyny i pozostawić na lodzie w celu rehydratacji. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 do 16 godzin w celu trawienia trypsyną. Następnie należy oddzielić ciekły ekstrakt białkowy od inkubowanych próbek.

Zatrzymaj reakcję i usuń pozostałości trawień białek, pokrywając fragmenty żelu 5% kwasem mrówkowym w 50% acetonitrylu. Następnie wstrząsaj fragmentami żelu przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś nadsącz do probówek z wyekstrahowanymi próbkami białek po wykonaniu dwóch kolejnych ekstrakcji.

Przesuszyć próbki w wirówce podciśnieniowej (speed vac) w probówkach o pojemności 0,5 ml. Przygotować 50% zawiesinę żywicy anti-TMT w TBS w stężeniu proporcjonalnym do intensywności odpowiedniego prążka białkowego. Przemyć żywicę trzykrotnie objętością kolumny jednokrotnego roztworu TBS, a następnie dodać 200 µL TBS do każdej próbki.

Następnie przenieś próbki na żywicę anty-TMT i mieszaj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie inkubuj na kołysarce przez noc w temperaturze 4 °C. Nałóż każdą próbkę na kolumnę. Przeprowadź płukanie kolumny za pomocą 200 µL każdego roztworu.

Następnie eluuj każdą próbkę trzykrotnie 200 µL 50% buforu do elucji i wysusz w próżni. Przesuś próbki w 12 µL 3% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym i wstrzyknij 5 µL bezpośrednio na kolumnę HPLC. Eluuj peptydy, stosując gradient zwiększonego stężenia acetonitrylu, zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym tekście.

Zastosuj spektrometrię mas do detekcji peptydów w ramach schematu analizy top 2 przez 3. Rozpocznij od pojedynczego etapu ms. Następnie uzyskaj trzy widma Ms/Ms z fragmentacją metodą wyższej energii w pułapce kolinearnej (HCD), po której następują trzy kolejne.

Ms.MS z dysocjacją indukowaną zderzeniem w celu identyfikacji białek. Analiza danych ze spektrometrii mas z wykorzystaniem rozgałęzionego schematu pracy. Implementacja kwantyzatora jonów reporterowych do wyznaczenia stosunku ilościowego.

Przetwórz również widmo MS MSM przez węzły selektora widm, normalizatora widm i grupownika widm, a następnie odpytaj dane w wyszukiwarce SeaQuest. Na tym obrazie przedstawiono przykłady liścia rośliny pomidora z grupy kontrolnej po lewej stronie oraz liścia inokulowanego Pseudomonas po prawej stronie po zabarwieniu liści przy użyciu DAB. Proces barwienia DES pozwala na wykazanie za pomocą barwnika histochemicznego obecności reaktywnych form tlenu w tkance liściastej.

Zgodnie z oczekiwaniami w kontroli nie obserwuje się istotnego barwienia, podczas gdy liście potraktowane pseudomonas wykazują dodatni wynik barwienia na produkcję nadtlenku wodoru. Przykład ten przedstawia dane wyjściowe z analizy proteomicznej, w której powierzchnia piku białka regulowanego różnicowo w zależności od stanu redoks dla każdej próbki umożliwia kwantyfikację absolutną. Stosunek powierzchni pików między próbkami kontrolnymi a inokulowanymi wskazuje na ilości względne.

W tym przypadku regulacja redox białka między próbką kontrolną a inokulowaną jest podobna. Piki o zbliżonej intensywności sugerują obecność mostków dwusiarczkowych, których nie reguluje zmiana sposobu traktowania próbek. Po opanowaniu technika ta może zostać prawidłowo wykonana w ciągu jednego tygodnia.

Należy pamiętać o utrzymywaniu próbek w niskiej temperaturze oraz o uporządkowaniu etykiet. Podczas pracy z fenolem należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic ochronnych i praca w dygestorium zgodnie z obowiązującą procedurą. W celu określenia innych modyfikacji systemu, takich jak kwas oleinowy i glutaminylacja, można przeprowadzić dodatkowe analizy, na przykład specyficzną spektrometrię mas modyfikacji potranslacyjnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić aktywację DIB standing CTMD oraz kwalifikację redox 16.