Name: Mysi model astmy indukowanej alergenami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę tworzenia myszego modelu astmy indukowanej alergenami poprzez wrażliwienie i prowokację ovalbuminą. Naucz się oceniać reaktywność dróg oddechowych oraz poziomy IgE w surowicy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH HL093196 (R.C.R.) oraz Atlanta Research and Education Foundation (AREF).

I. Sensybilizacja i ekspozycja na alergen (patrz Rysunek 1)
A. Do wyzwania wewnątrztachealnego
<ol>
	<li>W celu wstępnej sensytyzacji, myszom samcom lub samicom szczepów C57BL/6 lub BALB/c (w wieku 6-8 tygodni) wstrzyknąć dootrzewnowo w dniu 0 oraz ponownie w dniu 7 20 μg owalbuminy (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zemulgowanej w 0,2 ml sterylnego roztworu fosforanowego buforu solnego (PBS) zawierającego 2 mg wodorotlenku glinu (Sigma-Aldrich) lub 2 mg wodorotlenku glinu w 0,2 ml sterylnego PBS jako kontrolę.</li>
	<li>Przeprowadzić prowokację antygenem w odpowiednich dniach (np. w dniach 14, 16, 18 i 20). Procedura prowokacji znajduje się poniżej.</li>
	<li>Zanestetyzować mysz poprzez dootrzewnowy (i.p.) zastrzyk mieszaniny ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Upewnić się, że mysz pozostaje w pełnej anestezji przez co najmniej 10 min.</li>
	<li>Ustawić powierzchnię operacyjną pod kątem 45 stopni lub większym. Umieścić mysz na tej powierzchni stroną brzuszną do góry, z głową u góry.</li>
	<li>Zaczepić nitkę pod przednimi siekaczami, aby odciągnąć głowę do tyłu. Wyrównać położenie łap, aby upewnić się, że tchawica jest prosta, i przymocować nogi taśmą etykietową. Namoczyć miejsce operacyjne 70% EtOH i przetrzeć.</li>
	<li>Zastosować bupiwakainę (0,1 do 0,2 ml 0,25% roztworu) miejscowo w miejscu nacięcia.</li>
	<li>Uchwycić skórę w okolicy gardła pęsetą i delikatnie odciągnąć na zewnątrz. Wykonać niewielkie pionowe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi. Zminimalizować wielkość nacięcia.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę 1 ml z 50 μl PBS lub 0,1% OVA w PBS i włożyć ją do pipety repetytoryjnej (Tridak Stepper, Torrington, CT). Trzymać pipetę w jednej ręce, a drugą odciągać tkanki pęsetą, aby odsłonić tchawicę.</li>
	<li>Trzymając strzykawkę jak najbardziej równolegle do tchawicy, wprowadzić igłę przez ścianę tchawicy i wstrzyknąć roztwór.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu utrzymać mysz w pozycji pionowej, aby umożliwić roztworowi osadzenie się w płucach.</li>
	<li>Delikatnie i w sposób sterylny zbliżyć brzegi rany pęsetą i zamknąć szwem.</li>
	<li>Umieścić mysz na podgrzewaczce w pozycji na grzbiecie i pozostawić do wybudzenia, aż odzyska pełną sprawność ruchową. Po wybudzeniu zwrócić mysz do pomieszczenia dla zwierząt i codziennie monitorować pod kątem objawów seromy, stanu zapalnego, infekcji oraz rozstępów rany, aż do jej całkowitego zagojenia.</li>
</ol>
B. W przypadku wyzwania poprzez nebulizację
<ol>
	<li>Umyszy należy uodpornić w dniu 0. przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 20 μg OVA (Sigma-Aldrich) zemulgowanej w 0,2 ml sterylnego PBS zawierającego 2 mg wodorotlenku glinu (Sigma-Aldrich) lub 2 mg wodorotlenku glinu w 0,2 ml sterylnego PBS jako kontroli.</li>
	<li>W 14. dniu wykonaj dawkę przypominającą sensytyzacji poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>W dniu 21.Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia., 22nd, 23rd, 24th oraz 25th dzień po wstępnej sensytyzacji poddano myszy ekspozycji na nebulizowaną 1% owalbuminę (OVA) lub sam PBS przez 30 min, z wykorzystaniem nebulizatora ultradźwiękowego (Buxco Research Systems, Wilmington, NC).</li>
	<li>Umieść myszy w komorze głównej WBP; poddaj je aklimatyzacji w komorze pletyzmograficznej przez co najmniej 10 min.</li>
	<li>Za pomocą kubka nebulizatora podać 1 ml 0,1% OVA w sterylnym PBS lub sam sterylny PBS, zgodnie z opisem w krokach 4–6 poniżej. Nebulizować przez 30 min.</li>
	<li>Zdejmij pojemnik nebulizatora i wylej pozostały roztwór.</li>
	<li>Nebulizację można przeprowadzić u wszystkich myszy jednocześnie, wykorzystując komorę do nebulizacji.</li>
</ol>
II. Oznaczanie nadreaktywności dróg oddechowych na metacholinę
A. Nieinwazyjny pomiar nadreaktywności dróg oddechowych za pomocą pletyzmografii całego ciała (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC)
<ol>
	<li>Przed otwarciem butelki z metacholną w proszku należy pozwolić jej ogrzać się do temperatury pokojowej (metacholina jest bardzo higroskopijna i w przypadku pochłonięcia wody tworzą się bezużyteczne grudki). Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 200 mg/ml w sterylnym PBS, a następnie wykonać seryjne rozcieńczenia dwukrotne (np. 100, 50, 25, 12,5 i 6,25 mg/ml). Przechowywać roztwory w niskiej temperaturze.</li>
	<li>Przygotować sprzęt w następujący sposób: połączyć główny wlot WBP z nebulizatorem, wlot przepływu bocznego z pompą powietrzną, a wylot WBP z pułapką gazową za pomocą szczelnych gumowych rurek. Przymocować przetwornik ciśnienia, aby połączył wyloty głównej i referencyjnej komory WBP. Połączyć przetwornik ciśnienia z przedwzmacniaczem za pomocą dostarczonych kabli, a przedwzmacniacz z komputerem PC za pomocą odpowiedniej karty akwizycji danych.</li>
	<li>Zkalibrować przedwzmacniacz za pomocą oprogramowania zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Umieścić myszy w głównej komorze WBP; poddać je aklimatyzacji w komorze pletyzmograficznej przez co najmniej 10 min, a następnie rejestrować odczyty bazowe (Penhbase) przez 3 min.</li>
	<li>Wlać 1 ml sterylnego PBS do naczynia nebulizatora. Prowadzić nebulizację przez 2 min, a następnie monitorować zmienne oddechowe przez kolejne 6 min podczas fazy osuszania. Wyjąć naczynie nebulizatora i usunąć pozostały PBS.</li>
	<li>Wlać 1 ml metacholiny o stężeniu 6,25 mg/ml do naczynia nebulizatora i powtórzyć nebulizację przez 2 min oraz 6-minutowy cykl monitorowania.</li>
	<li>Powtórzyć pomiar z metacholiną o stężeniach 12,5, 25, 50 i 100 mg/ml, stosując ten sam 2-minutowy okres nebulizacji i 6-minutowy cykl monitorowania.</li>
	<li>Wyjąć myszy z komór i przenieść je z powrotem do klatek.</li>
	<li>Ponownie napełnić naczynie nebulizatora 1 ml sterylnego PBS i przeprowadzić kolejną sekwencję w celu przepłukania rurek.</li>
	<li>Wyłączyć przepływy powietrza, rozłożyć urządzenie i wytrzeć do czysta wszystkie komory przed badaniem drugiej grupy zwierząt.</li>
</ol>
B. Inwazyjny pomiar reaktywności dróg oddechowych za pomocą wentylatora sterowanego komputerowo (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canada)
<ol>
	<li>Zważ mysz i podaj znieczulenie poprzez dożylne (i.p.) wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu w dawce 60 mg na kg masy ciała.</li>
	<li>Po uzyskaniu odpowiedniego stopnia znieczulenia ustaw myszy w pozycji brzuszno-grzbietowej w celu wykonania tracheotomii.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę szyi 70% etanolem. Na miejsce nacięcia nałóż miejscowo bupiwakainę (0,1 do 0,2 ml 0,25% roztworu). Natnij i rozchyl skórę szyi. Rozsuń mięśnie szyi i odsłoń tchawicę.</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonaj w tchawicy nacięcie o długości 1 do 2 mm (należy uważać, aby nie przeciąć tchawicy całkowicie) i ostrożnie wprowadź rurkę intubacyjną. Obwiąż tchawicę szwem, aby zapobiec wyciekowi powietrza.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze pletyzmografu całego ciała i podłącz wprowadzoną rurkę tchawiczą do respiratora.</li>
	<li>Uruchom wentylację mechaniczną. Ustaw odpowiednią częstotliwość oddechów oraz objętość oddechową (odpowiednio 150 oddechów/min oraz 200 μl dla myszy o masie 20 g). Upewnij się, że klatka piersiowa porusza się synchronicznie z respiratorem. Jeśli mysz "walczy" z respiratorem (samodzielnie oddycha), wstrzyknij więcej środka znieczulającego i poczekaj na synchronizację.</li>
	<li>Po pomiarach wyjściowych utrzymuj myszy w stanie wentylacji bazowej przez kolejne 3 min, a następnie wykonaj 2gi zestaw pomiarów impedancji. Ten 2gi zestaw pomiarów wyjściowych służy do obliczenia średnich wartości bazowych.</li>
	<li>Podaj PBS lub wyzwania metacholiną (MCh) (6,25, 12,5, 25, 50 i 100 mg/ml), kierując przepływ inspiracyjny z respiratora przez nebulizator ultradźwiękowy.</li>
	<li>Po każdym wyzwaniu MCh (6,25, 12,5, 25, 50 i 100 mg/ml) przywróć tłok do podawania Vt 10 ml/kg przy 120 oddechach/min i wykonaj pomiary impedancji.</li>
</ol>
III. Pomiar infiltracji komórkowej do przestrzeni powietrznej
A. Wykonaj płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL)
<ol>
	<li>Po pomiarze AHR uśmiercić myszy za pomocą CO2 i ułożyć każdą mysz na plecach na podkładce chirurgicznej.</li>
	<li>Namoczyć dany obszar 70% EtOH.</li>
	<li>Zaczynając od dolnej części brzucha, rozciąć jamę brzuszną i usunąć skórę oraz górną warstwę mięśni, przesuwając się w górę w stronę żeber.</li>
	<li>Po odsłonięciu żeber za pomocą nożyczek ostrożnie przebić przeponę. Płuca powinny zapaść się, oddalając od przepony. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić płuc ani serca.</li>
	<li>Odciąć klatkę piersiową, aby w pełni odsłonić płuca i serce (należy unikać przecinania dużych naczyń krwionośnych, aby zapobiec wypełnieniu pola operacyjnego krwią).</li>
	<li>Używając strzykawki 1 ml z igłą 27G (strzykawki BD, Franklin Lakes, NJ), nakłuć komory serca i powoli oraz ostrożnie odciągnąć tłok strzykawki, aby pobrać krew. Należy uważać, aby nie doprowadzić do zapadnięcia się serca.</li>
	<li>Wyizolować surowicę z pobranej krwi zgodnie ze standardowym protokołem. Przechowywać w temperaturze -70 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Odciąć skórę i tkanki z okolic gardła, aż do odsłonięcia tchawicy. Usunąć wystarczającą ilość tkanek, aby swobodnie pracować w polu operacyjnym (ponownie: unikać przecinania dużych naczyń krwionośnych).</li>
	<li>Za pomocą zakrzywionych nożyczek rozciąć tkanki pod tchawicą, aby udrożnić dostęp.</li>
	<li>Przesunąć końcówkę zakrzywionej pęsety pod tchawicę i chwycić koniec nici chirurgicznej. Przeciągnąć nić pod tchawicą.</li>
	<li>Związać luźny półwęzeł wokół tchawicy w dolnej części gardła.</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć nacięcie o wielkości odpowiedniej dla kaniuli, powyżej nici chirurgicznej.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić kaniulę do otworu i w głąb tchawicy, poza miejsce zawiązania nici. Delikatnie naciskać do przodu, aż kaniula pojawi się tuż przy wejściu do płuc (zbyt głębokie wprowadzenie: przebicie płuc; zbyt płytkie: zapadnięcie się tchawicy podczas próby odzyskania BAL).</li>
	<li>Zaciągnąć nić i zawiązać pełny węzeł, aby uszczelnić tchawicę wokół kaniuli.</li>
	<li>Przymocować strzykawkę (zawierającą 1 ml PBS) do kaniuli i delikatnie wtłoczyć płyn do płuc. Poszczególne płaty płuc powinny powoli się rozszerzać. Nie przepełniać. Dla dorosłej myszy 0.9-1.0 ml to absolutne maksimum; 0.8 ml może być bezpieczniejszą objętością. Strzykawkę należy przymocować do kaniuli luźno, w przeciwnym razie istnieje ryzyko uszkodzenia przy próbie odłączenia.</li>
	<li>Odssać płyn z płuc. W przypadku napotkania oporu (zassanie tkanki do kaniuli), powoli przesunąć kaniulę głębiej w płuca i kontynuować odsysanie. Można również spróbować obracać kaniulę w miejscu. W ostateczności wycofać kaniulę częściowo; w takim przypadku istnieje jednak znacznie większe ryzyko zapadnięcia się tchawicy.</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę od kaniuli, przelać płyn BAL do pojemnika i powtórzyć czynność 2 razy, używając świeżego roztworu PBS.</li>
	<li>Przechowywać roztwór BAL w lodzie do czasu wirowania.</li>
	<li>Wykorzystać płyn BAL oraz surowicę do pomiaru poziomu specyficznych dla OVA przeciwciał IgE, używając dostępnych komercyjnie zestawów ELISA do oznaczania IgE u myszy (MD Bioproducts, St. Paul, MN).</li>
</ol>
B. Policz komórki i określ różnicowanie
<ol>
	<li>Odwiruj płyn z BAL przez 5 min przy ~600 × g, 4 °C.</li>
	<li>Delikatnie resuspenduj osad komórkowy w PBS i przechowuj na lodzie.</li>
	<li>Napełnij standardową komorę Neubauera rozcieńczoną zawiesiną komórkową i policz komórki.</li>
	<li>Pobierz alikwoty zawierające 2 × 104 komórek w objętości od 10 do 40 μl do cytospinowania. W razie potrzeby rozcieńcz komórki.</li>
	<li>Do cytospinowania wymieszaj 2 × 104 komórek, 130 μl PBS oraz 10 μl FBS. Przenieś całą mieszaninę komórkową do podwójnego lejka do cytospinowania i wiruj przez 10 min przy 700 rpm, używając podwójnych szkiełek do próbek powtórzonych.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 h przed barwieniem.</li>
	<li>Zbarw szkiełka, używając barwnika Diff-Quick (Siemens, Newark, DE).</li>
</ol>
IV. Reprezentatywne wyniki
Nadmierny skurcz dróg oddechowych po bodźcach prowokacyjnych jest charakterystyczną cechą kliniczną astmy. Opisujemy dwie metody pomiaru takiej nadreaktywności dróg oddechowych na metacholinę u myszy uczulonych i eksponowanych na OVA: pletyzmografię całego ciała (Rysunek 2) oraz pomiar wymuszonych oscylacji przy użyciu systemu flexiVent (Rysunek 3). Obie metody wykazują, że uczulenie i ekspozycja na OVA wywołują nadreaktywność dróg oddechowych u myszy.
Zapalenie dróg oddechowych z przewagą eozynofilów jest kolejną charakterystyczną cechą zarówno klinycznej astmy, jak i alergicznej choroby dróg oddechowych u myszy. Jak pokazano na Rysunku 4, uczulenie i ekspozycja na OVA znacznie zwiększają całkowitą liczbę komórek, które można odzyskać z dróg oddechowych za pomocą BAL. Szczególnie wzrasta liczba eozynofilów, a w mniejszym stopniu neutrofili.
Dowody wskazują, że alergiczna choroba dróg oddechowych wynika z nadprodukcji przeciwciał IgE przeciwko antygenom uczulającym. Uczulenie i ekspozycja na OVA z wykorzystaniem opisanych przez nas protokołów zwiększa poziomy IgE zarówno w surowicy, jak i w płynie BAL u leczonych myszy (Rysunek 5).
<img alt="Oś czasu badania na myszach: wstrzyknięcie OVA drogą IP, prowokacja wewnątrzoskrzelna, oznaczone fazy, od aklimatyzacji do końca badania." src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat eksperymentalny dla indukowanego OVA alergicznego astmy. Myszy poddano dwukrotnej sensybilizacji drogą i.p. przy użyciu 20 μg OVA zemulgowanego w 2 mg wodorotlenku glinu w 0,2 ml sterylnego PBS lub 2 mg wodorotlenku glinu w 0,2 ml samego sterylnego PBS, a następnie w określonych punktach czasowych przeprowadzono prowokację drogą i.t. roztworem 0,1% OVA lub sterylnym PBS lub zastosowano codzienną 30-minutową ekspozycję na nebulizowany 1% OVA w PBS lub sam PBS dostarczany za pomocą nebulizatora ultradźwiękowego (Buxco). Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej ekspozycji na OVA określono reaktywność dróg oddechowych. Następnie pobrano płyn z BAL, próbki krwi, komórki płuc i tkanki do dalszej analizy.
<img alt="Wykres odpowiedzi na metacholinę; stosunek Penh OVA vs PBS, pomiar skurczu oskrzeli." src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ocena indukowanej alergenem nadreaktywności dróg oddechowych metodą nieinwazyjną. Myszy (n=4/grupa) poddano uczuleniu i prowokacji OVA. Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej prowokacji określono nadreaktywność dróg oddechowych na wziewaną metacholinę przy użyciu pletyzmografii całego ciała zgodnie z opisem w protokole. Wyznaczono parametr Penh i przedstawiono go jako stosunek Penh (średni Penh w 8-minutowym odstępie czasu z metacholiną podzielony przez średni Penh w 8-minutowym odstępie czasu z PBS). *, P &lt; 0.05 względem PBS.
<img alt="Opór i elastancja dróg oddechowych w grupie OVA-PBS w funkcji metacholiny, wykres oporu w czasie, badanie astmy." src="/files/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Ocena nadreaktywności dróg oddechowych indukowanej alergenem metodą inwazyjną (wymuszonych oscylacji). Myszy (n=4/grupa) poddano sensytyzacji i ekspozycji na OVA. Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej ekspozycji oznaczono nadreaktywność dróg oddechowych na zwiększające się stężenia wziewnej metacholiny metodą wymuszonych oscylacji (flexiVent) zgodnie z opisem w protokole. A, B) Opór dróg oddechowych; C) Elastancja płuc. *, P &lt; 0.05 względem PBS.
 
<img alt="Różnicowe liczenie komórek w płynie BAL; wykres słupkowy z obrazami mikroskopowymi; analiza traktowania PBS vs OVA." src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Liczenie komórek w płynie BAL. Myszy (n=4/grupa) poddano sensybilizacji i ekspozycji na OVA. Dwadzieścia cztery godziny po ostatniej ekspozycji (Góra) pobrano komórki BAL i policzono całkowitą liczbę komórek zgodnie z opisem w protokole. (Dół) Przygotowano preparaty metodą cytospin i zabarwiono je barwnikiem Diff-Quick. Tot = całkowita liczba komórek; Eos = eozynofile; Neu = neutrofile; Mac = makrofagi; Lym = limfocyty. *, P &lt; 0.05 względem PBS.
<img alt="Poziomy swoistych przeciwciał IgE przeciw OVA, wykres słupkowy; porównanie surowicy i BALF; traktowanie PBS i OVA." src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Swoiste przeciwciała IgE przeciw OVA. Myszy (n=4/grupa) poddano sensytyzacji i wyzwoleniu za pomocą OVA. Dwadzieścia cztery godziny po ostatnim wyzwoleniu zmierzono poziom IgE w płynie z BAL oraz w surowicy krwi pobranej poprzez punkcję serca, zgodnie z opisem w protokole. *, P &lt; 0.05 względem PBS.

<ol><li>Braman, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The global burden of asthma.</a> Chest. 130, 4S-12S (2006).</li>
<li>Akinbami, L. J., Mooman, J. E., Liu, X. Asthma Prevalence, Health Care Use, and Mortality: 2005-2009. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAkinbami%2C+LJ+%22National+Health+Statistics+Reports%22">National Health Statistics Reports</a>. 32, National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. 2005-2009 (2011).</li>
<li>Bates, J. H., Rincon, M., Irvin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of asthma.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 297, 401-410 (2009).</li>
<li>Drazen, J. M., Finn, P. W., De Sanctis, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+airway+responsiveness%3A+physiological+basis+of+observed+outcomes+and+analysis+of+selected+examples+using+these+outcome+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of airway responsiveness: physiological basis of observed outcomes and analysis of selected examples using these outcome indicators.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 593-625 (1999).</li>
<li>Epstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+mouse+models+of+allergic+asthma+mimic+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Do mouse models of allergic asthma mimic clinical disease.</a> Int. Arch. Allergy Immunol. 133, 84-100 (2004).</li>
<li>Blyth, D. I., Pedrick, M. S., Savage, T. J., Hessel, E. M., Fattah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+epithelial+changes+in+a+murine+model+of+atopic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and epithelial changes in a murine model of atopic asthma.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 425-438 (1996).</li>
<li>Martin, T. R., Gerard, N. P., Galli, S. J., Drazen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+responses+to+bronchoconstrictor+agonists+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary responses to bronchoconstrictor agonists in the mouse.</a> J. Appl. Physiol. 64, 2318-2323 (1988).</li>
<li>Hamelmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+airway+responsiveness+in+allergic+mice+using+barometric+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 766-775 (1997).</li>
<li>Gelfand, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro%3A+mice+are+a+good+model+of+human+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Pro: mice are a good model of human airway disease.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166, 5-8 (2002).</li>
<li>Shapiro, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+asthma%3A+Pro%3A+Allergic+avoidance+of+animal+%28model%5Bs%5D%29+is+not+an+option%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of asthma: Pro: Allergic avoidance of animal (model[s]) is not an option.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174, 1171-1173 (2006).</li>
<li>Zosky, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovalbumin-sensitized+mice+are+good+models+for+airway+hyperresponsiveness+but+not+acute+physiological+responses+to+allergen+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Ovalbumin-sensitized mice are good models for airway hyperresponsiveness but not acute physiological responses to allergen inhalation.</a> Clin. Exp. Allergy. 38, 829-838 (2008).</li>
<li>Nials, A. T., Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+allergic+asthma%3A+acute+and+chronic+allergen+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Mouse models of allergic asthma: acute and chronic allergen challenge.</a> Dis. Model. Mech. 1, 213-220 (2008).</li>
<li>Wenzel, S., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+trap%3A+It+still+yields+few+answers+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The mouse trap: It still yields few answers in asthma.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 174, 1173-1178 (2006).</li>
<li>Rayamajhi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+Intratracheal+Instillation+of+Mice+with+Analysis+of+Lungs+and+Lung+Draining+Lymph+Nodes+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (51), e2702(2011).</li>
<li>Swedin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+aerosol+and+intranasal+challenge+in+a+mouse+model+of+allergic+airway+inflammation+and+hyperresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of aerosol and intranasal challenge in a mouse model of allergic airway inflammation and hyperresponsiveness.</a> Int. Arch. Allergy Immunol. 153, 249-258 (2010).</li>
<li>Gueders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+asthma%3A+a+comparison+between+C57BL%2F6+and+BALB%2Fc+strains+regarding+bronchial+responsiveness%2C+inflammation%2C+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflamm. Res. 58, 845-854 (2009).</li>
<li>Zhu, W., Gilmour, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+allergic+lung+disease+in+three+mouse+strains+after+systemic+or+mucosal+sensitization+with+ovalbumin+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of allergic lung disease in three mouse strains after systemic or mucosal sensitization with ovalbumin antigen.</a> Immunogenetics. 61, 199-207 (2009).</li>
<li>Flandre, T. D., Leroy, P. L., Desmecht, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+somatic+growth%2C+strain%2C+and+sex+on+double-chamber+plethysmographic+respiratory+function+values+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice.</a> J. Appl. Physiol. 94, 1129-1136 (2003).</li>
<li>Hoymann, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+and+noninvasive+lung+function+measurements+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Invasive and noninvasive lung function measurements in rodents.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 16-26 (2007).</li>
<li>Chong, B. T., Agrawal, D. K., Romero, F. A., Townley, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+bronchoconstriction+using+whole-body+plethysmograph%3A+comparison+of+freely+moving+versus+restrained+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39, 163-168 (1998).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Komitet IACUC w Atlanta VAMC zgodnie z protokołem nr V010-10.

Modele zwierzęce alergicznej choroby dróg oddechowych stanowią istotne narzędzia w badaniach istotnych z punktu widzenia klinicznego obrazu astmy. Opracowano szereg różnych modeli, wykorzystujących różne gatunki i antygeny. Mysz, jako atrakcyjny i często stosowany gatunek laboratoryjny, oferuje również szereg zalet w modelowaniu alergicznej choroby dróg oddechowych.9,10 Chociaż modele te nie odwzorowują astmy pod każdym względem,11 a aspekty choroby przewlekłej są szczególnie trudne do odtworzenia,<...

<table><tbody><tr><td>Ovalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek glinu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239186</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek acetylo-&amp;#946;-metylocholiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2251</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa pentobarbitalu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>System do pletyzmografii całego ciała (WBP)</td><td>Buxco Research Systems</td><td></td><td>http://www.buxco.com</td></tr><tr><td>FlexiVent</td><td>SCIREQ, Inc.</td><td></td><td>http://www.scireq.com</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Diff-Quick</td><td>Siemens AG</td><td>B4132-1A</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta repetycyjna</td><td>Tridak</td><td>STP4001-0025</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model astmy indukowanej alergenem

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Astma jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności, dotykając około 300 milionów ludzi na całym świecie.1 Ponad 8% populacji USA cierpi na astmę, a jej rozpowszechnienie rośnie.2 Podobnie jak w przypadku innych chorób, modele zwierzęce alergicznej choroby dróg oddechowych znacznie ułatwiają zrozumienie leżącej u podstaw patofizjologii, pomagają w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i umożliwiają badania przedkliniczne możliwych nowych terapii. Modele alergicznej choroby dróg oddechowych opracowano u kilku gatunków zwierząt, jednak modele mysie są szczególnie atrakcyjne ze względu na niski koszt, łatwą dostępność oraz dobrze scharakteryzowany układ odpornościowy tych zwierząt.3 Dostępność różnych szczepów transgenicznych dodatkowo zwiększa atrakcyjność tych modeli.4 W niniejszej pracy opisujemy dwa mysie modele alergicznej choroby dróg oddechowych, w których jako antygen wykorzystuje się owalbuminę. Po wstępnej sensytyzacji poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, w jednym modelu wyzwanie antygenowe podaje się za pomocą nebulizacji, a w drugim drogą wewnątrztrachealną. Te dwa modele oferują komplementarne zalety, a każdy z nich naśladuje główne cechy ludzkiej astmy.5
Główne cechy ostrej astmy obejmują nadmierną reakcję dróg oddechowych na bodźce, takie jak metacholina (nadreaktywność dróg oddechowych; AHR), oraz bogatą w eozynofile zapalną zmianę w drogach oddechowych. Są to również wyraźne efekty wywołania reakcji na alergen w naszych modelach mysich,5,6 w związku z czym opisujemy techniki służące do ich pomiaru, a tym samym do oceny skutków manipulacji eksperymentalnych. W szczególności opisujemy zarówno inwazyjne7, jak i nieinwazyjne8 techniki pomiaru nadreaktywności dróg oddechowych, a także metody oceny nacieku komórek zapalnych do dróg oddechowych i płuc. Komórki zapalne dróg oddechowych pobiera się za pomocą lavage bronchoalveolarnego (płukania pęcherzykowego), natomiast histopatologia płuc służy do oceny markerów stanu zapalnego w całym narządzie. Techniki te stanowią potężne narzędzia do badania astmy w sposób, który nie byłby możliwy do zastosowania u ludzi.

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Astma jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności, dotykając około 300 milionów ludzi na całym świecie.1 Ponad 8% populacji USA cierpi na astmę, ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest stworzenie modelu astmy u myszy. W pierwszym kroku myszy są uczulane na owalinę poprzez wstrzyknięcia dosztywnościenne. W drugim kroku myszy są poddawane ekspozycji na owalinę, drogą wewnątrztachealną lub poprzez nebulizację.Wywołuje to alergiczną reakcję dróg oddechowych podobną do zaostrzenia astmy u ludzi, którą można zmierzyć za pomocą testu z metylocholiną. Dodatkowo, w celu oceny nasilenia tych typowych cech astmy, można określić stopień infiltracji komórkowej w drogach oddechowych oraz poziom IgE w surowicy. W rezultacie u myszy rozwijają się objawy przypominające astmę, których nasilenie może być modyfikowane przez dalsze manipulacje eksperymentalne.Ten model zwierzęcy może pomóc w odpowiedzi na istotne pytania w dziedzinie astmy, takie jak wpływ leczenia konkretnymi lekami badawczymi lub modulowanie specyficznych szlaków sygnałowych. Procedurę tę zaprezentują dziś Irvin i Somia, studenci studiów doktoranckich w moim laboratorium. Przygotuj roztwór uczulający poprzez emulgowanie 1 mg/mL volinu w sterylnym PBS zawierającym 10 mg/mL wodorotlenku glinu. Myszy uczulaj poprzeztorepinyteuralne wstrzyknięcie 200 µL inokulum uczulająceg

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model muryny astmy wywołanej alergenem

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Opisana tutaj metoda pozwala na wizualizację zależnej od promotora IL-8 aktywacji stanu zapalnego w płucach myszy za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). To samo zwierzę może być poddawane BLI wielokrotnie przez okres do dwóch miesięcy od momentu dostarczenia konstruktu reporterowego lucyferazy.

Przejściowo transgenizowany model myszy IL-8 do długoterminowego monitorowania in vivo reakcji zapalnych

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Wysoka platforma może bez ograniczeń naprawiać szczury i całkowicie odsłaniać punkty akupunkturowe na plecach podczas manipulacji akupunkturą. W artykule opisano metody wytwarzania wysokiej platformy, ustanowiono szczurzy model astmy i zmierzono zmiany w funkcji oddechowej za pomocą nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) w czasie rzeczywistym.

Akupunktura w szczurzym modelu astmy

Ten protokół opisuje wielobarwną technikę immunofluorescencji do oceny szczurzego modelu alergicznego nieżytu nosa.

Znakowanie immunofluorescencyjne w skrawkach tkanki błony śluzowej nosa alergicznych szczurów z nieżytem nosa za pomocą wielokolorowego testu immunologicznego

Tutaj opisujemy pomiar kaszlu za pomocą nieinwazyjnego systemu pletyzmografii całego ciała (WBP) w czasie rzeczywistym oraz procedury normatywne pobierania próbek tkanek myszy i wprowadzamy pewne metody oceny stanu zapalnego dróg oddechowych.

Metody wykrywania kaszlu i zapalenia dróg oddechowych u myszy

Ten protokół opisuje rozwój modelu myszy z nadwrażliwością na kaszel, który może służyć jako idealny model do badania mechanizmów przewlekłego kaszlu.

Stworzenie modelu mysiego z nadwrażliwością na kaszel poprzez wdychanie kwasu cytrynowego

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Poznaj metodę tworzenia myszego modelu astmy indukowanej alergenami poprzez wrażliwienie i prowokację ovalbuminą. Naucz się oceniać reaktywność dróg oddechowych oraz poziomy IgE w surowicy.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Przeglądaj więcej filmów