Name: Długoterminowy test toksyczności śmiertelnej ze skorupiakiem Artemia franciscana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Poznaj protokół oceny długoterminowej toksyczności śmiertelnej z użyciem Artemia franciscana. Metoda obejmuje 14-dniowe narażenie larw na substancje chemiczne i odpady przemysłowe w celu wyznaczenia stężeń śmiertelnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opracowane przez Loredanę Manfrę z Instytutu Ochrony Środowiska i Badań (ISPRA-Department of Environmental Quality Monitoring) oraz Federicę Savorelli z Regionalnej Agencji Ochrony Środowiska (Emilia-Romagna, Włochy).
Członkowie referencyjni podgrupy roboczej ds. skorupiaków z rodzaju Artemia w ramach Grupy Metod Biologicznych – Woda Słona/Słonawa i Osady Komisji UNICHIM ds. Jakości Wody (instytutu normalizacji technicznej działającego w sektorze chemicznym).
Nagranie i montaż: Marco Pisapia z ISPRA (Web Unit). 
Koordynacja produkcji: Anna Maria Cicero i Erika Magaletti z ISPRA (Departament Monitorowania Jakości Środowiska).
Pragniemy podziękować Regionalnej Agencji Ochrony Środowiska Emilii-Romanii, Oddziałowi w Ferrarze, Grupie Metod Biologicznych – Wody Słone / Słonawe i Osady Komisji ds. Jakości Wody UNICHIM oraz Lucianie Migliore z Uniwersytetu Tor Vergata (Rzym) za ich współpracę; Rosselli Boscolo i Massimo Gabellini z ISPRA (Departament Zapobiegania i Łagodzenia Skutków) za wsparcie finansowe; Fabio Matassie oraz London School of Languages w Rzymie za wsparcie językowe.

1. Standard Metoda
Nasze badanie polega na narażeniu larw Artemia na szereg stężeń substancji lub próbkę testową w celu wyznaczenia stężenia lub stopnia rozcieńczenia, które spowoduje śmierć 50% organizmów (LC50) narażonych przez 14 dni w warunkach zdefiniowanych w niniejszej metodzie. Jeśli jest to konieczne i możliwe, można również wyznaczyć: a) poziom stężenia powodujący śmierć 20% narażonych organizmów (LC20); b) najwyższy analizowany poziom stężenia, który nie powoduje wyższej śmiertelności niż w przypadku kontroli negatywnej (NOEC); najniższy testowany poziom stężenia, który po 14 dniach powoduje wyższą śmiertelność niż w przypadku kontroli negatywnej (LOEC).
2. Materiały do badań
2.1 Jaja Artemia
Do przeprowadzenia testów wymagane są larwy Artemia franciscana w wieku poniżej 48 godzin (naupliusy), w stadium II lub III, uzyskane z nowo wyklutych jaj5. Certyfikowane jaja lub cysty wykorzystywane do testów są dostępne w sprzedaży, np. z Quality Assurance Research Division, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, U.S.A. lub z Laboratory for Biological Research in Aquatic Pollution, University of Ghent, Belgia. 
2.2 Rozcieńczenie wodą
Jako woda do rozcieńczeń można zastosować syntetyczną wodę morską, przygotowaną poprzez rozpuszczenie uznanych odczynników o czystości analitycznej lub dostępnego komercyjnie preparatu w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. W sprzedaży dostępne są gotowe mieszanki soli do przygotowania optymalnej wody morskiej, np. mieszanki Instant Ocean. Zaleca się stosowanie wody do rozcieńczeń o zasoleniu równym 35 (±2) PSU, stężeniu tlenu rozpuszczonego przekraczającym 80% wartości nasycenia oraz temperaturze 25 (±2) °C. Po napowietrzaniu przez 48 godzin i filtracji przez filtry o porowatości co najmniej 0,45 μm, roztwór do rozcieńczeń może być przechowywany przez maksymalnie 30 dni w ciemności w temperaturze 0-4 °C.
2.3 Hodowla alg
Zaleca się, aby organizmy testowe były karmione mikroalgami Dunaliella tertiolecta, które rosną wykładniczo i osiągają zagęszczenie od 1,3x106 do 2,0x106 cells/ml. Badania na próbkach środowiskowych wymagają kultur o zagęszczeniu przekraczającym 2,0x106 cells/ml6. Sugeruje się, aby Dunaliella tertiolecta rosła w pożywce zawierającej wodę morską (30 (±2) PSU i 20 (±1) °C) z dodatkiem niezbędnych składników odżywczych, minerałów i witamin. Niektóre wskazówki dotyczące składu i przygotowania pożywki dla alg znajdują się w Dodatku. Sugerowane początkowe zagęszczenie komórek wynosi około 105 cells/ml. Kulturę alg utrzymuje się w pomieszczeniu z termostatem w temperaturze 20 (± 1) °C, oświetlonej lampami fluorescencyjnymi o natężeniu 3000 (± 300) lx, z fotoperiodem wynoszącym 16 godzin światła i 8 godzin ciemności.
Do karmienia można wykorzystać również inne gatunki fitoplanktonu, jednak konieczne byłoby przeprowadzenie badań porównawczych z tymi gatunkami w celu znalezienia gatunku „równoważnego” Dunaliella tertiolecta, ponieważ warunki eksperymentalne (np. początkowe zagęszczenie komórek, oświetlenie, temperatura, skład pożywek i czas ekspozycji) różnią się w zależności od gatunku fitoplanktonu. Ponadto należy wziąć pod uwagę tolerancję mikroalg na różne zanieczyszczenia, ponieważ wpływ zanieczyszczeń na wzrost i rozwój fitoplanktonu oddziałuje również na Artemia.
2.4 Substancja referencyjna
Substancją odniesienia w tym teście jest dodecylosiarczan sodu.
2.5 Szkło laboratoryjne
Oprócz standardowego wyposażenia laboratoryjnego potrzebne są następujące materiały:
<ol>
 <li> Pojemniki testowe, w tym zlewki borokrzemowe o pojemności 100 ml (18 do przeprowadzania testów i 18 do przenoszenia roztworów).
 </li>
 <li> Kolba (np. kolba 500 ml) do przygotowania roztworu wzorcowego. </li>
 <li> Sześć kolb (np. kolby 200 ml) do przygotowania roztworów testowych. </li>
 <li> Szklane lub polistyrenowe płytki Petri o średnicy 5 cm z wyjmowanymi pokrywkami, służące do aktywacji cyst i przenoszenia Artemia z naczynia wylęgowego do pojemników testowych. </li>
 <li> Szklane pipety Pasteura (z końcówkami zaokrąglonymi nad płomieniem) do przenoszenia naupliów. </li>
 <li> Szklane kaniule lub jednorazowe plastikowe pipety Pasteura o pojemności 3 ml (do przycięcia) do przenoszenia Artemia. </li>
 <li> Mikropipety i pipety pomiarowe do przygotowania roztworów testowych. </li>
 <li> Sześć cylindrów miarowych (np. cylindry 50 ml) do przenoszenia roztworów testowych z kolb do pojemników testowych. </li>
</ol>
3. Aktywacja cyst
3.1. Szalki Petriego zawierające cysty + dolewanie wody
W celu przygotowania organizmów testowych, na 48 godzin przed badaniem, 20 mg cyst umieszcza się w płytce Petri zawierającej 12 ml wody do rozcieńczeń.
3.2. Inkubacja na świetle i w ciemności
Szalkę Petriego utrzymuje się w temperaturze 25 (±2) °C i przy natężeniu światła 4000 (±1000) lux (lumenów na metr kwadratowy) przez jedną godzinę.
3.3. Wymiana pożywki z wykorzystaniem mikroskopu
Po 24 godzinach wykluwające się larwy przenosi się do nowej szalki Petriego wypełnionej sztuczną wodą. Przenoszenie odbywa się przy użyciu mikroskopu, tj. z wykorzystaniem źródła światła, dzięki któremu fototropowe larwy migrują w stronę wiązki światła. Do przenoszenia używa się szklanej pipety Pasteura, dbając o to, aby przenosić wyłącznie nowo wyklute larwy, a nie cysty lub larwy wciąż znajdujące się w błonach.
3.4. Inkubacja w ciemności
Szalkę zawierającą larwy umieszcza się w ciemnej komorze termostatycznej na 24 godziny w temperaturze 25 (±2) °C.
4. Przygotowanie roztworów testowych
4.1. Odważenie substancji i przeniesienie do kolby
Zaleca się, aby roztwór wzorcowy substancji badanej przygotować poprzez rozpuszczenie 0,5 g substancji w kolbie o pojemności 500 ml. Kolbę dopełnia się wodą dejonizowaną lub destylowaną, a roztwór miesza do całkowitego rozpuszczenia substancji badanej. Roztwory należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem, chyba że nie jest znane, czy substancja jest stabilna w roztworze. W takim przypadku roztwór wzorcowy można przygotować do dwóch dni przed badaniem.
4.2. Przygotowanie kontroli negatywnej, dodawanie wody do rozcieńczania i alg za pomocą pipety 10 ml
Kontrolę negatywną przygotowuje się w kolbie (np. o objętości 200 ml), dodając alikwot zawiesiny glonów do wody do rozcieńczeń w taki sposób, aby uzyskać gęstość 105 cells/ml.
4.3. Przygotowanie roztworów testowych: dodawanie wody do rozcieńczenia, alg i roztworu standardowego
Sugeruje się, aby roztwory testowe przygotować w pięciu kolbach o pojemności 200 ml, dodając roztwór wzorcowy do wody rozcieńczającej w określonych ilościach, tak aby uzyskać pożądane stężenia do testów. W celu karmienia organizmów można zastosować alikwoty zawiesiny mikroalg Dunaliella tertiolecta, dodając je podczas przygotowywania roztworów testowych do osiągnięcia gęstości 105 cells/ml. Zaleca się następującą kolejność dodawania: woda rozcieńczająca, zawiesina alg i roztwór wzorcowy. Po przygotowaniu roztwory testowe należy wykorzystać w analizie tak szybko, jak to możliwe.
4.4. Przenoszenie roztworów z kolby do naczyń testowych, a następnie na szalki Petriego
Do naczyń testowych za pomocą cylindra miarowego wprowadza się równe ilości (50 ml) roztworów testowych. Dla każdego stężenia wykonuje się trzy powtórzenia. Dla każdej serii testów przygotowuje się naczynie kontrolne z ilością wody do rozcieńczeń równą objętości roztworów testowych. Do szalek Petriego wprowadza się równe objętości (około 12 ml) roztworów testowych. Dla każdej serii testów wykorzystuje się kontrolną szalkę Petriego.
5. Przygotowanie do testów
5.1. Nauplii w stadium II-III
Czterdzieści osiem godzin po aktywacji cyst nauplii osiągają II-III stadium larwalne i mogą być wówczas wykorzystane do testów.
5.2. Przenoszenie naupliów do szalek Petriego przy użyciu mikroskopu
Szalka Petriego używana do aktywacji cyst zostaje wyjęta z komory termostatycznej. Niewielka ilość larw zostaje przeniesiona do szalek Petriego zawierających roztwory kontrolne i badawcze. Czynność tę należy przeprowadzić pod mikroskopem, używając pipety o odpowiednio dużej średnicy, tak aby nie uszkodzić organizmów. Na tym etapie testu przenoszenie można przeprowadzić za pomocą szklanej pipety Pasteura (z końcówką zaobloną nad płomieniem) oraz przy zastosowaniu bocznego źródła światła, które pobudza Artemia do agregacji.
5.3. Przenoszenie naupliów z szalek Petriego do naczyń testowych przy użyciu mikroskopu
Dziesięć larw przenosi się z szalek Petri z roztworami testowymi do pojemników testowych. Operację tę należy przeprowadzić przy użyciu pipety Pasteura i mikroskopu. Zaleca się, aby podczas przenoszenia larw nie przekraczać objętości 1 mL, aby nie wpływać na całkowitą objętość układu testowego.
5.4. Wypełnione pojemniki przykryto parafilmem
Zlewki testowe są przykryte parafilmem (z pozostawieniem szczeliny dla przepływu powietrza) i utrzymywane w temperaturze 25 (±2) °C przez cały czas trwania testu oraz przy oświetleniu 900 (±100) lx z fotoperiodem wynoszącym 14 godzin światła i 10 godzin ciemności.
6. Wymiana pożywki i suplementu pokarmowego
6.1. Kontrola przeżywalności
Dwa dni po rozpoczęciu testu, a następnie po 5, 7, 9 i 12 dniach, Artemia jest obserwowana pod mikroskopem w celu weryfikacji przeżywalności oraz wymiany medium i suplementu pokarmowego.
W każdym naczyniu testowym zlicza się liczbę żywych organizmów. Po obserwacji pod mikroskopem i lekkiej stymulacji mechanicznej (np. dotknięciu larw szklaną pipetą Pasteura) organizmy, które nie wykazują żadnego ruchu przez około 10 sekund, należy uznać za martwe.
6.2. Przygotowanie roztworu testowego poprzez pobranie alg za pomocą pipety 10 ml oraz pobranie testowanej substancji za pomocą mikropipety. Przeniesienie roztworów z kolby do naczyń testowych
Podczas testowania roztwory testowe należy okresowo wymieniać i przygotowywać w dniu, w którym mają zostać użyte. Roztwory testowe sporządza się z wcześniej przygotowanego roztworu wzorcowego.
6.3. Przeniesienie Artemia za pomocą uciętej pipety Pasteura ze starych naczyń testowych do trzech nowych naczyń
Przenoszenie Artemia odbywa się za pomocą pipety o odpowiednio szerokiej średnicy, aby nie uszkodzić organizmów. Na tym etapie można zastosować plastikową pipetę Pasteura o pojemności 3 ml (po uprzednim odcięciu końcówki).
6.4. Larwy w zlewce zawierającej żywe lub martwe Artemia
Po 14 dniach ekspozycji, pod koniec testu, zlicza się liczbę przeżyłych larw i zapisuje ją w arkuszu roboczym. Oblicza się i zapisuje wartości LC50 i/lub LC20, NOEC oraz LOEC po 14 dniach, a także, w razie potrzeby, przedziały ufności na poziomie 95 % oraz zastosowane metody obliczeniowe.
7. Reprezentatywne wyniki
Po zakończeniu testu (14 dni) oblicz procent śmiertelności dla każdego stężenia zgodnie z poniższym wzorem: 
(Ms/N) * 100
Gdzie:
Ms to średnia liczba osobników, które padły w analizowanej próbce
N to całkowita liczba osób narażonych
Tabela 1 przedstawia przykładowe dane z testu (14 d) z wykorzystaniem Artemia eksponowanych na dodecylosiarczan sodu.
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td >Stężenia (mg/l)</td>
 <td colspan="3" >Liczba martwych osobników w każdej powtórce</td>
 <td >Śmiertelność (%)</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >&nbsp;</td>
 <td >I</td>
 <td >II</td>
 <td >III</td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Kontrola negatywna</td>
 <td >0</td>
 <td >2</td>
 <td >1</td>
 <td >10</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >1.56</td>
 <td >1</td>
 <td >2</td>
 <td >0</td>
 <td >10</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >3.12</td>
 <td >2</td>
 <td >0</td>
 <td >2</td>
 <td >13</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >6.25</td>
 <td >3</td>
 <td >2</td>
 <td >3</td>
 <td >27</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >12.5</td>
 <td >8</td>
 <td >9</td>
 <td >10</td>
 <td >90</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >25.0</td>
 <td >10</td>
 <td >10</td>
 <td >10</td>
 <td >100</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >50.0</td>
 <td >10</td>
 <td >10</td>
 <td >10</td>
 <td >100</td>
 </tr >
 </tbody>
</table>
Ponadto należy wyznaczyć wartość LC50 za pomocą graficznego wykresu logarytmicznego Gaussa lub stosując odpowiednie metody statystyczne (na przykład metodę Spearmana-Karbera lub metodę Probit). Obliczona wartość LC50 dla danych z tabeli 1 wynosi 8,18 (7,15-9,37) mg/l. Jeśli maksymalne przetestowane stężenie spowodowało śmiertelność niższą niż 50%, nie należy przystępować do obliczania wartości LC50, która byłaby wówczas niewiarygodna lub wręcz niemożliwa do obliczenia. W takim przypadku właściwe byłoby powtórzenie testu poprzez rozszerzenie zakresu badanych stężeń. Alternatywnie wartość LC50 można określić jako większą niż najwyższe przetestowane stężenie, podając ewentualnie procent śmiertelności przy tym stężeniu oraz najwyższe stężenie, przy którym nie stwierdzono efektu.
Wyniki uznaje się za ważne, jeśli po zakończeniu testów spełnione zostały następujące warunki:
<ol class="lalpha">
 <li> średnia śmiertelność w grupie kontrolnej wynosi ≤ 20 %;
 </li>
 <li> w przypadku zastosowania dodecylosiarczanu sodu, wartość LC50 po 14 dniach mieści się w przedziale 8,0 (±5) mg/l.
 </li>
</ol>
Jeśli powyższe warunki nie zostały spełnione, wszystkie dane uzyskane z tej samej partii organizmów należy uznać za nieważne i powtórzyć badanie.

<ol><li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii%5BTitle%5D)+AND+%22Tr.+J.+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li>
<li>Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPersoone%2C+G+%22Artemia+Research+and+its+Applications.+Morphology%2C+Genetics%2C+Strain+characterization+Toxicology%22">Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology</a>. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).</li>
<li>Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+genus+Artemia+in+ecotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Envir.+Poll%22%5BJournal%5D)">Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing.</a> Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).</li>
<li>APAT IRSA-CNR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Metodi+analitici+per+le+acque+Manuali+e+Linee+guida+29%2F2003%22">Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003</a>. Terzo Metodo, 8060(2003).</li>
<li>Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Artemia+nauplii+for+toxicity+tests+%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%9C+a+critical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotox.+Env.+Saf%22%5BJournal%5D)">The use of Artemia nauplii for toxicity tests â€“ a critical analysis.</a> Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).</li>
<li>Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Set+up+of+a+standard+methodology+for+14-day+bioassay+on+Artemia+franciscana+and+A.+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Amb%22%5BJournal%5D)">Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica.</a> Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).</li>
<li>Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+toxicity+of+arsenic+to+the+Great+Salt+Lake+brine+shrimp%2C+Artemia+franciscana%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotox.+Environ.+Saf%22%5BJournal%5D)">Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana.</a> Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).</li>
<li>Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+chronic+site-specific+water+quality+standard+for+selenium+in+the+Great+Salt+Lake%2C+Utah%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA.</a> Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).</li>
<li>Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Commissione+UNICHIM+%22Qualit%C3%A1+dell%27acqua%22+Gruppo+di+Lavoro+%22Metodi+Biologici%22+Sottogruppo+%22Acque+salate%2Fsalmastre+e+sedimenti%22%22">Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti"</a>. , UNICHIM. (2010).</li>
<li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Artemia jest jednym z najcenniejszych organizmów testowych dostępnych do badań ekotoksyczności, a dotychczasowe badania pozwalają stwierdzić, że możliwe jest zastosowanie kilku opcji związanych z wykorzystaniem Artemia w toksykologii i ekotoksykologii. Cechy, które czynią ten organizm odpowiednim gatunkiem do bioassayów, to: szeroki zasięg geograficzny, wysoka zdolność adaptacji do niekorzystnych warunków środowiskowych i zróżnicowanych składników odżywczych, stosunkowo prosta hodowla i utrzymanie labor...

długoterminowy test toksyczności letalnej z wykorzystaniem skorupiaka artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Nasza działalność badawcza koncentruje się na wykorzystaniu metod biologicznych do oceny jakości środowiska, ze szczególnym uwzględnieniem wód słonych/sosnowych oraz osadów. Wybór wskaźników biologicznych musi opierać się na rzetelnej wiedzy naukowej i, w miarę możliwości, na dostępności zestandaryzowanych procedur. W niniejszym artykule przedstawiamy zestandaryzowany protokół wykorzystujący morskiego skorupiaka Artemia do oceny toksyczności substancji chemicznych i/lub morskich matryc środowiskowych. Naukowcy sugerują, że solniczka (Artemia) jest odpowiednim kandydatem do opracowania standardowego bioanalizy do powszechnego zastosowania na świecie. Opublikowano szereg prac na temat toksycznego wpływu różnych substancji chemicznych i toksyn na solniczkę (Artemia). Główną zaletą tego skorupiaka w badaniach toksyczności jest ogólna dostępność suchych cyst; mogą one być natychmiast użyte w testach, co eliminuje konieczność prowadzenia trudnych hodowli1,2. Testy toksyczności oparte na cystach są tanie, stale dostępne, proste i wiarygodne, stanowiąc tym samym istotną odpowiedź na rutynowe potrzeby screeningu toksyczności, wymogi monitoringu przemysłowego lub cele regulacyjne3. Zaproponowana metoda przyjmuje śmiertelność jako punkt końcowy. Zliczono liczbę osobników, które przeżyły, i obliczono procent zgonów. Larwy uznawano za martwe, jeśli nie wykazywały żadnego ruchu wewnętrznego ani zewnętrznego podczas kilkusekundowej obserwacji4. Procedura ta została zestandaryzowana poprzez przetestowanie substancji referencyjnej (dodecylosiarczan sodu); niektóre wyniki przedstawiono w niniejszej pracy. Artykuł ten towarzyszy filmowi opisującemu przeprowadzenie procedury testowania toksyczności, prezentującemu wszystkie kroki związane z protokołem.

Niniejsza praca dotyczy opracowania i standaryzacji wartościowego protokołu metodycznego służącego do określania długoterminowej (14-dniowej) toksyczności letalnej substancji chemicznych, ścieków przemysłowych lub komunalnych oraz ciekłych próbek środowiskowych wobec słonawodnego skorupiaka Artemia franciscana.

Długoterminowy test toksyczności letalnej z wykorzystaniem skorupiaka Artemia franciscana

Nasze działania badawcze koncentrują się na wykorzystaniu metod biologicznych do oceny jakości środowiska, ze szczególnym uwzględnieniem wód słonych/sosnowych...

Jesteśmy Laura Manfra i Federica Selli, badaczkami z Wyższego Instytutu Ochrony Środowiska i Badań (ISRA), z oddziału Laboratorium Monitoringu Jakości Środowiska w zakresie Fitoplanktonu, Ekotoksykologii i Ekologii. Nasza działalność badawcza koncentruje się na wykorzystaniu metod biologicznych do oceny jakości środowiska, ze szczególnym uwzględnieniem wody słonej, wody słonawej oraz osadów. Nasza najnowsza praca dotyczy opracowania i standaryzacji wartościowego protokołu metodologicznego służącego do wyznaczania długoterminowej, 14-dniowej toksyczności letalnej wywoływanej przez substancje chemiczne, odpady przemysłowe, ścieki oraz ciekłe próbki środowiskowe w odniesieniu do morskiego skorupiaka artemia franciscana.W niniejszym filmie opisano przeprowadzenie proceduralnego badania toksyczności. Nasze badanie polega na wystawieniu larw artii na szereg stężeń substancji lub próbkę testową w celu określenia poziomu stężenia lub rozcieńczenia, który spowodowałby śmierć 50% wystawionych organizmów w ciągu 14 dni, przy zachowaniu warunków określonych w tej metodzie. W razie potrzeby i możliwości można również wyznaczyć następujące parametry.Poziom stężenia powodujący śmierć 20% organizmów poddanych ekspozycji; najwyższy analizowany poziom stężenia, który nie determinuje wyższej śmiertelności niż w przypadku kontroli negatywnej; najniższy testowany poziom stężenia, który po 14 dniach determinuje wyższą śmiertelność niż w przypadku kontroli negatywnej. Do przeprowadzenia badań nasz zespół potrzebował larw *Franciscana* w wieku poniżej 48 godzin, w stadium drugim lub trzecim, uzyskanych z nowo wyklutych jaj. Jako wodę do rozcieńczeń można stosować syntetyczną wodę morską, przygotowaną poprzez rozpuszczenie odczynników uznanych za czyste analitycznie lub gotowego preparatu komercyjnego w wodzie destylowanej lub dejonizowanej.Po 48-godzinnym inkubowaniu i filtracji przez filtry o porowatości co najmniej 0,45 µm, rozcieńczenie można przechowywać w ciemności przez maksymalnie 30 dni. W temperaturze 4°C należy podawać organizmom testowym mikroalgi Ella Ter, które rosną wykładniczo przy gęstościach od 1,3 × 10⁶ do 2,0 × 10⁶ komórek/ml. Substancją referencyjną w tym teście jest dodecylosiarczan sodu.Oprócz standardowego wyposażenia laboratoryjnego będą potrzebne następujące naczynia testowe, w tym zlewki borokrzemowe o pojemności 100 ml, kolba o pojemności 500 ml do przygotowania roztworu wzorcowego, sześć kolb o pojemności 100 ml do przygotowania roztworów testowych, szklane lub polimerowe szalki Petriego o średnicy 5 cm z wyjmowanymi pokrywkami, które służą do aktywacji cyst i przenoszenia artia z naczynia do wylęgu do naczyń testowych. Szklane pipety Pasteura z końcówkami zaokrąglonymi nad płomieniem do przenoszenia noli, szklane rurki kanulowe lub jednorazowe plastikowe pipety o pojemności 3 ml (przycięte) do przenoszenia artia, mikropipety oraz pipety pomiarowe do przygotowania roztworów testowych. Sześć cylindrów pomiarowych o pojemności 50 ml do przenoszenia roztworów testowych z kolb do naczyń testowych w celu przygotowania organizmów testowych.Na 48 godzin przed badaniem umieść 20 mg cyst w szalce Petri zawierającej 12 ml wody do rozcieńczeń. Przechowuj szalkę w temperaturze 25 °C przy natężeniu światła 4 000 lmk przez jedną godzinę. Po 24 godzinach przenieś wyklute larwy do nowej szalki Petri wypełnionej wodą sztuczną.Przeprowadzić transfer pod mikroskopem z wykorzystaniem źródła światła, aby fototropiczne larwy w fazie wyklucia migrowały w stronę wiązki światła. Do transferu użyć szklanej pipety Pasteura, upewniając się, że przenoszone są jedynie nowo powstałe larwy, a nie same cysty lub larwy wciąż znajdujące się w błonach. Płytkę zawierającą larwy umieścić w ciemnej komorze termostatycznej na kolejne 24 godziny w temperaturze 25 °C.Roztwór wzorcowy substancji badanej należy przygotować, rozpuszczając pół grama substancji w kolbie o pojemności 500 mililitrów. Uzupełnić wodą dejonizowaną lub destylowaną i mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Roztwory należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem, chyba że nie jest znana stabilność substancji w roztworze.W takim przypadku roztwór wzorcowy można przygotować do dwóch dni przed badaniem. Należy przygotować kontrolę negatywną w kolbie o pojemności 200 ml, dodając odpowiednią ilość zawiesiny glonów do wody rozcieńczającej, tak aby uzyskać gęstość 10⁵ komórek/ml. Roztwory testowe należy przygotować w kolbach o pojemności od 5 do 100 ml, dodając roztwór wzorcowy do wody rozcieńczającej w określonej ilości, aby uzyskać pożądane stężenia do badania.Aby nakarmić organizmy, należy użyć zawiesiny mikroalg duna teta, dodając ją podczas przygotowywania roztworów testowych aż do osiągnięcia gęstości 10⁵ cells milliliters. Przed rozpoczęciem zalecamy zachowanie następującej kolejności dodawania: rozcieńczalnik, woda, zawiesina alg, a następnie roztwór standardowy. Za pomocą cylindra miarowego wprowadź do naczyń testowych równe objętości, po 50 milliliters, roztworów testowych.Dla każdej serii badań przygotuj trzy powtórzenia dla każdego stężenia. Przygotuj naczynie kontrolne z ilością wody do rozcieńczeń równą objętości roztworów testowych. Wlej do szalek Petri równą objętość roztworów testowych, wynoszącą około 12 mililitrów.Dla każdej serii testów przygotuj szalkę Petriego z kontrolą. 48 godzin po aktywacji cyst nymfy osiągną drugie i trzecie stadium larwalne i będą gotowe do testów. Wyjmij szalkę Petriego użytą do aktywacji cyst z komory termostatycznej.Przenieś niewielką ilość larw do szalek Petri zawierających roztwory kontrolne i testowe. Na tym etapie testu przeniesienie można przeprowadzić za pomocą szklanej pipety pasterowskiej o końcówce zaokrąglonej nad płomieniem, wykorzystując bocznie umieszczone źródło światła, które zachęca artie do agregacji. Przenieś 10 larw z roztworów testowych.Przenieście szalki Petriego do pojemników testowych. Wykonajcie również tę operację, korzystając z pipety i szkiełek nakrywkowych; przykryjcie zlewki testowe parafilią, pozostawiając szczelinę dla przepływu powietrza i utrzymując je w temperaturze 25 °C przez cały czas trwania testu. Zastosujcie natężenie oświetlenia 900 lumenów na metr kwadratowy z fotoperiodyzmem 14 godzin światła i 10 godzin ciemności po upływie dwóch dni od rozpoczęcia badań.Następnie po 5, 7, 9 i 12 dniach należy zaobserwować artie pod mikroskopem i zweryfikować ich przeżywalność. Podczas testowania organizmy, które nie wykazują żadnego ruchu przez około 10 sekund, należy uznać za martwe; należy okresowo wymieniać pożywkę i organizmy uzupełniające pożywienie, przygotowując roztwory testowe w tym samym dniu, w którym mają zostać użyte. Należy okresowo wymieniać roztwory testowe, przygotowując je w dniu ich zastosowania.Przygotuj roztwory testowe z wcześniej sporządzonego roztworu standardowego. Przeprowadź transfer ARTIA, używając pipety EPI PET o wystarczająco szerą średnicy, aby nie uszkodzić organizmów w tej fazie. Można zastosować plastikową pipetę o średnicy trzech milimetrów, którą należy odciąć po 14 dniach ekspozycji.Po zakończeniu testów należy policzyć liczbę przeżyłych larw i wpisać wynik do arkusza roboczego. Obliczyć wartości lc 50 i/lub lc 20, NOEC oraz LOEC po 14 dniach i podać uzyskane wyniki. Zastosowano przedziały ufności na poziomie 95% oraz odpowiednie metody obliczeniowe.Jeśli po zakończeniu testowania spełnione zostały następujące warunki: średnia śmiertelność w grupach kontrolnych wynosi mniej niż lub równo 20% przy użyciu siarczynu sodu. LC50 po 14 dniach mieści się w przedziale 8,0 mg/L. Jeśli powyższe warunki nie zostały spełnione, wszystkie dane uzyskane z tej samej partii organizmów należy uznać za nieważne i powtórzyć testowanie.

long-term-lethal-toxicity-test-with-the-crustacean-artemia-franciscana

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Długotrwałe testy toksyczności śmiertelnej na skorupiakach Artemia franciscana

Ten film przedstawia test krótkoterminowego przeżycia, który testuje leczenie ostrej toksyczności lub testuje szczep genetyczny pod kątem odporności na stan toksyczny. Przykładowy protokół pokazuje przykładowy test przeżycia, w którym robaki są testowane pod kątem ich odporności na stres oksydacyjny wywołany przez parakmet (PQ).

C. elegans (C. elegans) Test przeżycia: test toksyczności krótkoterminowej

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe może poważnie wpłynąć na rozwój z długoterminowymi skutkami. Przedstawiono szczegółowe protokoły ilustrujące strategię wykorzystującą skuteczny model laboratoryjny do badania wpływu wczesnej ekspozycji embrionalnej na bisfenol A. Zapewniamy testy płodności i behawioralne w celu monitorowania skuteczności naszych testów biologicznych narażenia na toksyny.

Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

W tym protokole pokazujemy, jak hodować dorosłe osobniki Astyanax mexicanus, hodować larwy i przeprowadzać immunohistochemię na rybach po larwie, aby porównać fenotypy morfotypów powierzchniowych i jaskiniowych.

Hodowla meksykańskiego Tetra Astyanax mexicanus w celu analizy fenotypów postlarwalnych i immunohistochemii całego wierzchowca

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Ta praca ma na celu ocenę i przegląd procedury biologicznego testu śmiertelności Artemia salina, również identyfikowanej jako test śmiertelności krewetek solankowych. Ta prosta i tania metoda dostarcza informacji na temat ogólnej toksyczności (traktowanej jako wstępna ocena toksyczności) próbek, a mianowicie produktów naturalnych.

Test biologiczny śmiertelności przy użyciu Artemia salina L.

Tutaj prezentujemy protokół hodowli izolowanych pojedynczych nicieni na stałych podłożach w celu śledzenia parametrów fizjologicznych przez całe życie i kwantyfikacji fluorescencji. Ten system hodowli obejmuje barierę kwasu palmitynowego wokół studni z pojedynczymi robakami, aby zapobiec ucieczce zwierząt, umożliwiając stosowanie interwencji awersyjnych, w tym bakterii chorobotwórczych i chemicznych czynników stresogennych.

Długotrwała hodowla poszczególnych Caenorhabditis elegans na pożywkach stałych do długotrwałego monitorowania fluorescencji i interwencji awersyjnych

Artykuł proponuje nowatorską metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, w oparciu o ruchliwość hemocytów Mytilus galloprovincialis. Metoda ta ma na celu przyczynienie się do opracowania bardziej etycznych i czułych badań narażenia toksykologicznego i ekotoksykologicznego.

Test toksykologiczny i ekotoksykologiczny oparty na ruchliwości hemocytów omułka (Mytilus galloprovincialis)

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj protokół oceny długoterminowej toksyczności śmiertelnej z użyciem Artemia franciscana. Metoda obejmuje 14-dniowe narażenie larw na substancje chemiczne i odpady przemysłowe w celu wyznaczenia stężeń śmiertelnych.

Długoterminowy test toksyczności letalnej z wykorzystaniem skorupiaka Artemia franciscana

Przeglądaj więcej filmów