In Ovo Elektroporacja w embrionalnej siatkówce piskląt

Cześć, jestem Mohammed Islam. Jestem doktorantem w laboratorium dr Lee na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu Rutger. Dzisiaj pokażę Ci, jak wykonać celowaną iniekcję siatkówki i elektroporację innovo.

W zarodku chi będziemy mieli siatkówkę embrionalną kurczaka na etapie czwartego dnia Embry, czyli około 96 godzin po zapaleniu. Technika ta jest uważana za nowatorską metodę badania rozwoju siatkówki. Metoda ta jest ukierunkowana na komórki progenitorowe siatkówki, co daje możliwość wizualizacji wszystkich typów komórek siatkówki na poziomie pojedynczej komórki.

Może być również stosowany do badań nad zyskiem lub utratą funkcji, w których gen będący przedmiotem zainteresowania może być ukierunkowany na badanie, prawidłowy rozwój lub chorobę siatkówki. X może być przechowywany w chłodziarce do wina w temperaturze około 13 stopni CS przez okres do jednego tygodnia. Jeśli temperatura jest zbyt wysoka, zarodki zaczną rozwijać się nieprawidłowo, podczas gdy niższa temperatura powoduje wysoką śmiertelność.

Gdy będziesz gotowy do inkubacji, wyjmij jajka z chłodziarki do wina i ustaw jajka pionowo większym końcem do góry. Jaja należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny przed umieszczeniem ich w inkubatorze 37,5 Gcel Yes. Wysiaduj jaja przez około 96 godzin, czyli około czwartego dnia Embry.

Aby uzyskać zarodki, które znajdują się w stadium hamburgera i Hamiltona, należy użyć igieł do mikropipet PP ze szklanych kapilar basenowych i przełamać końcówkę pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą pęsety, aby uzyskać otwór końcówki o średnicy około 0,1 mikrometra i stożek o średnicy dwóch milimetrów. Igły z większymi końcówkami mają trudności z przebijaniem błony witaminowej. Podczas gdy mniejsze końcówki mają trudności z załadowaniem i dostarczeniem roztworu DNA, przymocuj igłę do strzykawki żołądkowej Hamilton zamontowanej na mikromanipulatorze.

Użyj małego kawałka silikonowej rurki master plex do przymocowania igły do strzykawki. Ponieważ połączenia są związane, więc nie ma potrzeby dodawania oleju mineralnego Aby uszczelnić to nasadkę, wymieszaj dwa mikrolitry roztworu plazmidu reporterowego DNA o stężeniu od trzech do sześciu mikrogramów na mikrolitr i 0,2 mikrolitra szybkiej zieleni na kawałku obwodowego szybko zielonego barwnika, który pomoże uwidocznić wstrzyknięcie, powoli załaduj igłę mieszaniną, aby uwolnić życiodajną błonę od błony wewnętrznej. Delikatnie obróć jajko o około 180 stopni i odczekaj kilka minut.

Następnie obróć go z powrotem do pierwotnej pozycji i ustaw na elektroporację. Przetrzyj kleszcze i skorupkę jajka 70% etanolem, aby uniknąć infekcji zarodka. Zrób mały otwór w jajku bezpośrednio nad komórką powietrzną za pomocą kleszczy.

Uważaj, aby nie rozbić skorupki jajka. Usuwaj małe kawałki pojedynczo, aby zrobić małe okno. Ostrożnie usuń błonę wewnętrzną za pomocą kleszczy, nie dotykając błony życiowej, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu lub serca.

Ustawić igłę przeciwlegle do głównego pęczka naczyń krwionośnych wchodzących do oka, jak wskazuje strzałka i skierowaną w stronę dzioba. Przebij przez życiową błonę, twardówkę, siatkówkę i ciało szkliste. Nagle, moje pchnięcie igłą, jeśli igła przebije drugi koniec oka, powinno być w porządku, chyba że uszkodzi jakąś główną żyłę krwionośną.

Powoli odciągnij igłę na krawędzi otworu i umieść ją prawie stycznie do zewnętrznej ściany gałki ocznej. Włóż igłę do przestrzeni podsiatkówkowej między twardówką a siatkówką. Wstrzyknij DNA, aż będziesz mógł uwidocznić zielony roztwór, wypełniający bok gałki ocznej i wpychający siatkówkę do wewnątrz, tworząc wybrzuszenie.

Oto kolejny dobry przykład udanego wstrzyknięcia z utworzeniem wybrzuszenia, i jest to zilustrowane na tym schemacie. Jeśli umieszczenie igły nie było prawidłowe, zobaczysz, że roztwór DNA rozprzestrzenia się w ciele szklistym, wypełniając środek gałki ocznej. Ponadto, jeśli zbyt mocno uszkodzisz siatkówkę, zobaczysz, że roztwór DNA wychodzi z gałki ocznej.

Powoli wyjmij igłę i natychmiast umieść elektrody równolegle wewnątrz jajka. Po namoczeniu w PBS należy wcisnąć elektrody w dół, aby zanurzyć się w płynie owodniowym w taki sposób, aby wstrzyknięte oko znajdowało się między elektrodami. Unikaj dotykania elektrod jakiejkolwiek głównej żyły krwionośnej lub serca podczas ich umieszczania.

Elektrody ujemne powinny znajdować się w miejscu wstrzyknięcia, aby DNA mogło być transportowane z przestrzeni podsiatkówkowej do siatkówki w kierunku elektrody dodatniej. Elektrolit siatkówki za pomocą pięciu impulsów 15 V przez 50 milisekund w odstępach 950 milisekund. Ostrożnie wyjmij elektrody i uszczelnij okienko jaja kawałkami przezroczystej taśmy klejącej, etykietę i opatrz datą wstrzyknięte jajo przed włożeniem go z powrotem do inkubatora.

Zazwyczaj ukończenie całego procesu operacji elektrycznej zajmuje około trzech do pięciu minut. Ekspresję GFP można zaobserwować już po ośmiu godzinach od operacji elektrycznej. Możesz jednak poczekać, aż zarodek osiągnie pożądany stan przed pobraniem komórki jajowej.

Mam nadzieję, że ten film był pomocny w przeprowadzeniu własnego eksperymentu. Dziękuję za oglądanie.