Name: In Ovo Elektroporacja w embrionalnej siatkówce piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Naucz się elektroporacji in owo w siatkówce embrionalnej kurczaka. Ta metoda umożliwia precyzyjne dostarczenie materiału genetycznego do komórek progenitorowych siatkówki i wizualizację typów komórkowych na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować panu Maazowi Enverowi za udostępnienie kamery HD (Cannon VIXIA HFS100). Praca ta była częściowo wspierana przez granty z NIH (EY018738), New Jersey Commission on Spinal Cord Research (08-3074-SCR-E-0 oraz 10-3091-SCR-E-0) oraz Busch Biomedical Research Award.

Ponieważ niektóre części protokołu są wykonywane zgodnie z wcześniejszymi opisami w innych filmach JoVE2 oraz publikacjach3, z niewielkimi modyfikacjami, nie będziemy ich tutaj szczegółowo omawiać.
1. Obsługa jaj i przygotowanie igły
<ol>
 <li>Jaja można przechowywać w chłodziarce do wina w temperaturze około 13°C przez maksymalnie 1 tydzień. Jeśli temperatura będzie zbyt wysoka, zarodki zaczną rozwijać się anomalnie, natomiast niższa temperatura powoduje wysoką śmiertelność. Po przygotowaniu do inkubacji należy wyjąć jaja z chłodziarki i ustawić je pionowo, tępym końcem do góry. Przed umieszczeniem w inkubatorze o temperaturze 37,5°C należy pozostawić jaja w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.</li>
 <li>Inkubuj jaja przez 96-100 godzin, co odpowiada około 4. dobie embrionalnej, aby uzyskać zarodki w stadium 22 według skali Hamburgera i Hamiltona4-5.</li>
 <li>Przygotuj igły do mikropipety z wyciągniętych szklanych kapilar i odłam końcówkę za pomocą pęsety pod mikroskopem stereoskopowym, aby uzyskać otwór o średnicy około 0,1 μm i zwężeniu o długości 20 mm. Igły z większymi końcówkami mają trudności z przebiciem błony witelinowej, natomiast igły z mniejszymi końcówkami utrudniają pobieranie i podawanie roztworu DNA.</li>
 <li>Przymocuj igłę do strzykawki Hamilton Gastight o pojemności 0,1 ml zamontowanej na mikromanipulatorze. Do połączenia igły ze strzykawką użyj krótkiego odcinka silikonowej rurki Masterplex. Ze względu na szczelność połączeń nie ma potrzeby dodawania oleju mineralnego do uszczelnienia tego elementu.</li>
 <li>Wymieszaj na kawałku parafilmu 2 μl roztworu plazmidowego DNA reporterowego o stężeniu od 3-6 μg/μl oraz 0,2 μl barwnika fast green (0,025%). Barwnik fast green pomoże w wizualizacji iniekcji. Powoli pobierz mieszaninę do igły.</li>
 <li>Aby oddzielić błonę witelinową od błony wewnętrznej, delikatnie obróć jajo o około 180°, odczekaj kilka minut, a następnie obróć je z powrotem do pozycji wyjściowej i przygotuj do elektroporacji.</li>
 <li>Przetrzyj pęsetę i skorupkę jaja 70% etanolem, aby zapobiec infekcji zarodka.</li>
 <li>Za pomocą pęsety w rozmiarze AA wykonaj mały otwór w skorupce jaja bezpośrednio nad komorą powietrzną. Należy uważać, aby nie pęknęła skorupka. Usuwaj małe fragmenty jeden po drugim, aż powstanie małe okienko. Ostrożnie usuń błonę wewnętrzną za pomocą pęsety, nie dotykając błony witelinowej.</li>
</ol>
2. Iniekcja i elektroporacja
<ol>
 <li>Aby zapobiec uszkodzeniu mózgu lub serca, ustaw igłę po stronie przeciwległej do głównego pęczka naczyń krwionośnych wchodzących do oka, skierowaną w stronę dzioba.</li>
 <li>Przebij błonę witelinową, twardówkę, siatkówkę i ciało szkliste za pomocą gwałtownego, lekkiego pchnięcia igły. Jeśli igła przebije oko na wylot, nie powinno to stanowić problemu, chyba że dojdzie do uszkodzenia głównej żyły krwi.</li>
 <li>Powoli wycofaj igłę do krawędzi otworu i ustaw ją prawie stycznie do zewnętrznej ściany gałki ocznej.</li>
 <li>Wprowadź igłę do przestrzeni podsiatkówkowej między twardówką a siatkówką.</li>
 <li>Wstrzykuj DNA tak długo, aż zobaczysz zielony roztwór wypełniający bok gałki ocznej i wypychający siatkówkę do wewnątrz, tworząc wybrzuszenie.</li>
 <li>Jeśli umiejscowienie igły jest nieprawidłowe, roztwór DNA będzie rozprzestrzeniać się wewnątrz ciała szklistego, wypełniając środek gałki ocznej. Ponadto, w przypadku zbyt dużego uszkodzenia siatkówki, roztwór DNA będzie wypływać z gałki ocznej.</li>
 <li>Powoli wyjmij igłę i natychmiast umieść elektrody równolegle wewnątrz jaja po uprzednim namoczeniu ich w PBS. Wsuń elektrody tak, aby zanurzyły się w płynie owodniowym w taki sposób, by wstrzyknięte oko znajdowało się pomiędzy nimi. Podczas umieszczania elektrod unikaj dotykania głównych naczyń krwionośnych lub serca. Elektroda ujemna powinna znajdować się po stronie wstrzyknięcia, aby DNA mogło być transportowane z przestrzeni podsiatkówkowej do siatkówki w kierunku elektrody dodatniej. Przeprowadź elektroporację siatkówki, stosując 5 impulsów o napięciu 15V przez 50 ms w odstępach 950 ms.</li>
 <li>Ostrożnie wyjmij elektrody i uszczelnij okno w jaju za pomocą kawałków przezroczystej taśmy klejącej.</li>
 <li>Oznacz i datuj wstrzyknięte jajo przed umieszczeniem go z powrotem w inkubatorze. Zazwyczaj cały proces elektroporacji trwa od 3 do 5 minut.</li>
 <li>Ekspresja GFP może być widoczna już 8 godzin po elektroporacji. Można jednak poczekać, aż zarodek osiągnie pożądany stopień rozwoju przed pobraniem materiału.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
W naszym badaniu wykorzystujemy różne konstrukty plazmidowe do analizy regulacji ekspresji genów zaangażowanych w rozwój komórek siatkówki. W tym filmie użyto pCAG-GFP (kontrola transfekcji) w celu potwierdzenia prawidłowości wstrzyknięcia i elektroporacji. Można jednak zastosować dowolny konstrukt plazmidowy z genem reporterowym (GFP, RFP itp.). Pomimo że ekspresja GFP może być widoczna już 8 godzin po elektroporacji, zazwyczaj rozpoczynamy pobieranie zarodków w 6. dniu (E6) i później. Elektroporowane siatkówki wypreparowano z zarodka i przeanalizowano pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym przed zatopieniem i sekcjonowaniem. Po udanej elektroporacji ekspresja genu reporterowego jest zazwyczaj widoczna w co najmniej jednej czwartej siatkówki (Rys. 1). Transfekowane tkanki siatkówki poddano dalszej analizie poprzez sekcjonowanie w celu wyraźnej wizualizacji morfologii komórek. Immunohistochemia z zastosowaniem markerów specyficznych dla typów komórek (Brn3a, Pax6 itp.) pozwoliła na charakteryzację specyficznej dla komórek ekspresji GFP (Rys. 2).
<img src="/files/ftp_upload/3792/3792fig1.jpg" align="Figure 1" alt="Mikroskopia fluorescencyjna białek znakowanych GFP w komórkach zarodkowych; wizualizacja lokalizacji białek." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 1. Pomyślna elektroporacja plazmidu raportowego skutkuje pozytywną ekspresją GFP. Siatkówki embrionów kurzych zostały poddane iniekcji i elektroporacji w 4. dniu inkubacji, a następnie pobrano je w 6. dniu inkubacji. Pomyślnie przetransfekowano co najmniej 25% siatkówki (A=widok z góry, B=widok z dołu). Pasek skali = 1mm.
<img src="/files/ftp_upload/3792/3792fig2.jpg" align="Figure 2" alt="Obraz mikroskopii konfokalnej, analiza ekspresji Brn3a/GFP i Pax6/GFP w tkance nerwowej." data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 2. Charakterystyka komórek siatkówki wykazujących ekspresję GFP z wykorzystaniem immunohistochemii. Tkanki siatkówki wykazujące ekspresję GFP w stadium E7 zostały utrwalone i poddane sekcjonowaniu. Następnie przekroje te zabarwiono różnymi markerami swoistymi dla komórek. Do identyfikacji komórek zwojowych użyto Brn3a (A), natomiast do identyfikacji komórek poziomych, amakrynowych i zwojowych użyto Pax6 (B). Pasek skali = 50 μm.

<ol><li>Doh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+retinal+cell+development+in+chick+embryo+by+immunohistochemistry+and+in+ovo+electroporation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques.</a> BMC. Dev. Biol. 10, (2010).</li>
<li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Ovo+Electroporations+of+HH+Stage+10+Chicken+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn.%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stage+series+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The stage series of the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).</li>
</ol>

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Facilities Committee na Uniwersytecie Rutgers.

Celowane wstrzyknięcie do siatkówki oraz elektroporacja in ovo w embrionalnej siatkówce w stadium E4 pozwalają na specyficzne ukierunkowanie na komórki progenitorowe siatkówki, co umożliwia wizualizację wszystkich sześciu głównych typów komórek siatkówki na poziomie pojedynczych komórek. Elektroporacja in ovo w stadium HH10 (~E1.5) ukierunkowana na pęcherzyk optyczny pozwala na transfekcję komórek, z których rozwija się oko. Jednakże komórki te charakteryzują się w tym czasie bardzo wysoką rotacją, a me...

<table><tbody><tr><td>Zapłodnione jaja kurcząt rasy White Leghorn wolne od patogenów (SPF)</td><td>Sunrise Farms (Catskill, NY)</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Inkubator do jaj kurzych</td><td>GQF Manufacturing</td><td>Model-1550</td><td>Ustawiony na 60% wilgotności i 37,5&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-4</td><td> </td></tr><tr><td>Strzykawka 0,1 ml</td><td>Hamilton Co</td><td>Gastight 1710</td><td>Alternatywnie można użyć strzykawki 1 ml</td></tr><tr><td>Silikonowy (nadtlenkowy) przewód Masterflex</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96400-13</td><td>Odciąć mały fragment (1 cm) do przymocowania szklanej igły do strzykawki</td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Dumont</td><td>AA</td><td> </td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301-M3</td><td> </td></tr><tr><td>Plazmidowe DNA</td><td></td><td></td><td>pCAG-GFP zostało udostępnione przez dr Connie Cepko</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>Rozcieńczyć do 0,025% w PBS</td></tr><tr><td>Generator impulsów</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BTX ECM 830</td><td>Generator fali prostokątnej</td></tr><tr><td>Elektrody</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BTX model 514</td><td>Elektrody były rozmieszczone w odstępach 3-5 mm</td></tr><tr><td>Monochromatyczny aparat cyfrowy</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiocam MRM</td><td> </td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop sekcyjny</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica MZ16FA</td><td> </td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td> </td></tr></tbody></table>

elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Zarodek siatkówki kurczaka jest doskonałym narzędziem do badania rozwoju siatkówki u wyższych kręgowców. Ze względu na duże rozmiary i rozwój zewnętrzny, manipulacja zarodkową siatkówką kurczaka przy użyciu technologii rekombinowanego DNA/RNA jest stosunkowo łatwa. Elektroporacja konstruktów DNA/RNA do zarodkowej siatkówki daje ogromną przewagę w badaniu regulacji genów w komórkach macierzystych/progenitorowych siatkówki podczas jej rozwoju. Dzięki technice elektroporacji można przeprowadzać różne rodzaje testów, takie jak testy genów reporterowych, nadekspresja genów, wyciszanie genów (shRNA) itp. Niniejszy film prezentuje celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację in ovo zarodkowej siatkówki kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Przedstawiamy tutaj szybką i wygodną technikę elektroporacji in ovo, w której plazmidowe DNA kodujące zielone białko fluorescencyjne (GFP) jako marker jest dostarczane bezpośrednio do podsiatkówkowej przestrzeni zarodka kurczaka, a następnie następują impulsy elektryczne ułatwiające pobieranie DNA przez komórki macierzyste/progenitorowe siatkówki. Nowa metoda iniekcji i elektroporacji siatkówki w dniu E4 umożliwia wizualizację wszystkich typów komórek siatkówki, w tym neuronów powstających w późniejszym etapie1, co było trudne przy zastosowaniu konwencjonalnej metody iniekcji i elektroporacji w dniu E1,52.

Ogólnym celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację konstruktów DNA/RNA in ovo do siatkówki zarodka kurczaka w stadium 22-23 według skali Hamburgera i Hamiltona, co odpowiada około 4. dniu inkubacji (E4). Technika ta jest bardzo użyteczna w badaniu ekspresji genów, regulacji genów oraz zmian morfologicznych w rozwijającej się siatkówce kurczaka.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Siatkówka zarodka kurczaka jest doskonałym narzędziem do badania rozwoju siatkówki u wyższych kręgowców. Ze względu na duże rozmiary i rozwój zewnętrzny, jest ona...

Witam, nazywam się Mohammed Islam. Jestem doktorantem w laboratorium dr Lee w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Rutgers. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przeprowadzić celowaną iniekcję do siatkówki oraz elektroporację in vivo.W embrionie kurczaka będziemy badać zarodkową siatkówkę oka na czwartym dniu rozwoju (ED4), co odpowiada około 96 godzinom po zapłodnieniu. Technika ta jest uważana za nowatorską metodę badania rozwoju siatkówki. Metoda ta celuje konkretnie w komórki progenitorowe siatkówki, co umożliwia wizualizację wszystkich typów komórek siatkówki na poziomie pojedynczej komórki.Można go również zastosować w badaniach nad uzyskaniem lub utratą funkcji, w których gen zainteresowania może być ukierunkowany na badanie normalnego rozwoju lub choroby siatkówki. X można przechowywać w chłodziarce do win w temperaturze około 13 °C do jednego tygodnia. Jeśli temperatura będzie zbyt wysoka, zarodki zaczną rozwijać się nieprawidłowo, natomiast niższa temperatura spowoduje wysoką śmiertelność.Po przygotowaniu do inkubacji wyjmij jaja z chłodziarki do wina i ustaw je pionowo, szerszym końcem do góry. Pozostaw jaja w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny prz

in-ovo-electroporation-in-embryonic-chick-retina

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In Ovo Elektroporacja w siatkówce zarodkowej kurczaka

Elektroporacja in ovo zarodka kurczaka jest techniką pozwalającą na manipulacje genetyczne w embrionie ptaka. Typowe zastosowania tej metody obejmują analizę funkcjonalną genów oraz domniemanych elementów wzmacniających. Niniejszy film prezentuje elektroporację cewy nerwowej w embrionach kurczaka w stadium HH 10. Omówiono technikę iniekcji oraz prawidłową obsługę jaj.

Elektroporacja in ovo embrionów kurzych w stadium 10 według HH

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Hodowle embrionalnych komórek siatkówki kurcząt stanowią cenne narzędzia do badania biologii fotoreceptorów. Opracowaliśmy skuteczną technikę transferu genów opartą na elektroporacji plazmidowej siatkówki ex ovo przed hodowlą. Technika ta znacznie zwiększa wydajność transfekcji w porównaniu z obecnie dostępnymi protokołami, dzięki czemu manipulacja genetyczna jest możliwa dla tego systemu.

Efektywny transfer genów w siatkówkach piskląt w badaniach pierwotnych hodowli komórkowych: podejście do elektroporacji ex-ovo

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Opisujemy metody fluorescencyjnego znakowania stycznie migrujących komórek za pomocą elektroporacji, oraz obrazowania poklatkowego ruchu oznaczonej komórki w hodowli płaskiej w celu wizualizacji zachowania migrujących komórek w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt.

Wizualizacja migracji komórek stycznych w rozwijającym się tektum wzrokowym piskląt

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Naucz się elektroporacji in owo w siatkówce embrionalnej kurczaka. Ta metoda umożliwia precyzyjne dostarczenie materiału genetycznego do komórek progenitorowych siatkówki i wizualizację typów komórkowych na poziomie pojedynczych komórek.

Elektroporacja in ovo siatkówki zarodka kurczaka

Przeglądaj więcej filmów