Name: Czasoprzestrzenna manipulacja aktywnością małej GTPazy na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnej kontroli aktywności małych GTPaz przy użyciu światła UV i systemu foto-klatkowania rapamycyny w żywych komórkach. Technika ta umożliwia badanie szlaków sygnałowych na poziomie subkomórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie to było wspierane przez fundusze badawcze NIH (DK090868 oraz GM092930 dla T.I.). Wniosek patentowy dotyczący klatkowego analogu rapamycyny jest obecnie w toku.

1. Transfekcja plazmidowego DNA
<ol>
	<li>Do 37,5 μl dH2O dodać plazmidowe DNA: 0,5 μg FRB przytwierdzonego do błony (dalej określanego jako LDR) oraz 0,5 μg FKBP-Tiam1 (białko 1 indukujące inwazję i przerzuty w chłoniakach limfocytów T: aktywator Rac) znakowanego białkiem fluorescencyjnym. Dodać 1 μl FuGENE HD.</li>
	<li>Wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. W międzyczasie przejść do kroków 1.3-1.8.</li>
	<li>Każdą studzienkę komory 8-studzienkowej przemyć 50 μl poli-D-lizyny.</li>
	<li>Środek każdej studzienki przemyć dH2O.</li>
	<li>Komórki NIH-3T3 o konfluencji 80-85% poddać trypsynizacji i rozcieńczyć do 10 ml pożywki hodowlanej (DMEM z 10% FBS).</li>
	<li>Odebrać 375 μl zawiesiny i wirować przy 1750 rpm przez 3 minuty.</li>
	<li>Odssać pożywkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.</li>
	<li>Dodać 750 μl DMEM z 10% FBS i resuspendować.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową dodać do roztworu dH2O/DNA/FuGENE HD i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 250 μl zawiesiny komórek/DNA (wystarczy na maksymalnie 3 studzienki).</li>
	<li>Transfekowane komórki inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 15-18 h.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu cRb-A
<ol>
	<li>Zsyntezować addukt klatkowanej rapamycyny z biotyną (cRb). Szczegóły znajdują się w sekcji „Schemat syntezy cRb”. W skrócie, grupy klatkujące i biotynowe przygotowuje się osobno. Grupę klatkującą koniuguje się następnie z rapamycyną (LC lab), a produkt łączy się z grupą biotynową za pomocą reakcji typu click7, aby otrzymać cRb.</li>
	<li>Przygotować roztwór stokowy cRb o stężeniu 1 μM w DMSO.</li>
	<li>Rozpuścić 1 mg awidyny w 250 μl PBS w probówce Eppendorfa o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Do rozpuszczonej awidyny dodać 1 μl roztworu stokowego cRb. Wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min, aby otrzymać roztwór koniugatu cRb-awidyna (cRb-A).</li>
	<li>Usunąć niezwiązane małe cząsteczki i oczyścić cRb-A przy użyciu kolumny do chromatografii wykluczania cząsteczkowego.</li>
</ol>
3. Mikroskopia i oświetlenie światłem na poziomie subkomórkowym
<ol>
	<li>Poddaćy transfected komórki głodzeniu surowiczemu w DMEM bez FBS przez 12 godzin.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę z komórek i dodać 250 μl przygotowanego 400 nM roztworu cRb-A (z kroku 2.6).</li>
	<li>W celu wizualizacji dynamiki białek w żywych komórkach z rozdzielczością subkomórkową przed i po naświetlaniu zastosowano mikroskopię dysku obrotowego (Ryc. 2a). Naświetlanie UV uzyskano poprzez połączenie optyki dla światła UV LED (365 nm) ze światłem epi-fluorescencyjnym (Ryc. 2b).</li>
	<li>Do rejestrowania obrazów fluorescencyjnych transfected komórek co 15 sekund wykorzystano oprogramowanie MetaMorph.</li>
	<li>Zdefiniować współrzędne i rozmiar plamki naświetlania, używając szklanej płytki pokrytej barwnikami fluorescencyjnymi wzbudzanymi światłem UV. Rozmiar można zmieniać poprzez zastosowanie obiektywów o różnych powiększeniach oraz wybór światłowodów o różnej średnicy rdzenia.</li>
	<li>Po określeniu poziomu tła dla marszczenia błony (membrane ruffling), naświetlić światłem UV peryferie komórek. Dwa następne kroki służą skontrastowaniu wcześniejszych efektów lokalnych.</li>
	<li>Naświetlić komórki globalnie światłem 365 nm dostarczanym przez lampę rtęciową.</li>
	<li>Rozpuścić uwolnioną z klatki, a więc oryginalną rapamycynę w DMSO, a następnie w PBS (stężenie końcowe 400 nM), i dodać roztwór do komory obrazowania w celu wywołania efektów globalnych.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład reprezentatywnych wyników przedstawiono na Rysunku 3. Naświetlanie światłem UV niewielkiego obszaru w pobliżu krawędzi komórki szybko indukowalo tworzenie się lokalnych fałdów błony (ruffles) wyłącznie w obszarze naświetlanym i w jego bezpośrednim sąsiedztwie. Aby potwierdzić, że była to rzeczywiście aktywność lokalna, zastosowano następnie globalne naświetlanie komórek promieniami UV lub dodano rapamycynę do pożywki, co w obu przypadkach wywołało globalne tworzenie się fałdów w całej błonie. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej podzielono komórki docelowe na cztery kwadranty i policzono częstotliwość powstawania fałdów w każdym z nich po stymulacji lokalnej, a także po stymulacji globalnej w różnych warunkach, w tym w grupach kontrolnych (Rysunek 4). Tylko ta kombinacja naświetlania UV, cRb-A oraz odpowiednich konstruktów FKBP-FRB indukuje lokalne fałdowanie błony.
<img alt="Schemat lokalnej dimeryzacji; proces chemiczny wyzwalany UV, struktury cRb-A i HE-Rapa, błona plazmatyczna." src="/files/ftp_upload/3794/3794fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat przestrzennie ograniczonej dimeryzacji białek z wykorzystaniem koniugatu klatkowanej rapamycyny z awidyną (cRb-A) i światła UV. Naświetlanie UV rozrywa łącznik między rapamycyną a biotyną, co prowadzi do uwolnienia chemicznego dimeryzatora (HE-Rapa, C40-O-(2-hydroksyetyl) rapamycyna) oraz jego produktu ubocznego. Uwolniony dimeryzator dyfunduje następnie do komórek i indukuje dimeryzację między FKBP-POI (białkiem badanym) a zakotwiczonym w błonie plazmatycznej FRB wyłącznie w sąsiedztwie obszaru naświetlanego (niebieskie koło). Bez naświetlania UV białka FKBP i FRB nie łączą się (czerwony krzyżyk), w związku z czym nie występuje żaden efekt. (Copyright@ACS2011) 6
<img alt="Układ konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej; analiza wzbudzenia optycznego i emisji; schemat urządzenia." src="/files/ftp_upload/3794/3794fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zdjęcie zmodyfikowanego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. (a) Widok z przodu mikroskopu konfokalnego (odwrócony Axiovert 200, Zeiss). (b) Zbliżenie, widok z góry jednostki sprzęgającej dla fluorescencji EPI i oświetlenia UV.
<img alt="Zmiana morfologii komórki na obrazach mikroskopowych wykazująca różnice strukturalne przed i po traktowaniu." src="/files/ftp_upload/3794/3794fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przestrzennie ograniczona formacja fałdów błonowych w transfekowanej komórce NIH3T3 indukowana lokalnym napromieniowaniem UV. Konfokalne obrazy fluorescencyjne komórki fibroblasta NIH3T3 transfekowanej FKBP-Tiam1 (aktywator Rac) z etykietą YFP oraz LDR (zakotwiczone w błonie FRB), która została poddana napromieniowaniu w ograniczonym obszarze w pobliżu krawędzi światłem LED o długości fali 365 nm przez 15 s, zaczynając od 210 s, w obecności koniugatu cRb-A w medium. Po tym zabiegu nastąpiło ogólne naświetlanie lampą rtęciową przez 1 s w 1063 s oraz ogólna aplikacja rapamycyny do stężenia końcowego 400 nM w 1560 s. Komórka nie wykazywała niemal żadnej aktywności fałdowania na początku (a), lecz wykazała przestrzennie ograniczone fałdowanie po lokalnym naświetlaniu (żółte koło) (b). Komórka wykazała globalną formację fałdów po ogólnym naświetlaniu i dodaniu rapamycyny (c-d), co wskazuje, że lokalna formacja fałdów była spowodowana przestrzennie ograniczoną aktywacją Rac. Pasek skali: 10 μm. (Copyright@ACS2011) 6
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający częstotliwość tworzenia fałdów (ruffles) w różnych warunkach UV dla traktowania cRb-A i awidyną." src="/files/ftp_upload/3794/3794fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Częstotliwość tworzenia fałdów (ruffles) w kwadrantach transfektowanych komórek NIH3T3. Lokalną irradiację UV z użyciem cRb-A oraz następującą po niej globalną irradiację UV przeprowadzono na 13 komórkach. Dodanie cRb-A (bez irradiacji UV), lokalną irradiację UV z awidyną lub bez niej zastosowano odpowiednio na 13, 5 i 6 komórkach. W żadnej z obserwowanych komórek nie stwierdzono tworzenia fałdów po dodaniu cRb-A bez irradiacji UV, ani po lokalnej irradiacji UV z awidyną lub bez niej w medium zbiorczym. Dane zbierano z komórek o niskim podstawowym poziomie tworzenia fałdów, ale posiadających zdolność do tworzenia fałdów indukowanego rapamycyną, co sprawdzano po każdym eksperymencie, potwierdzając globalne tworzenie fałdów w wyniku dodania rapamycyny (stężenie końcowe 400 nM). Wyniki te wykazały, że cRb-A oraz lokalna irradiacja UV są niezbędne do lokalnego tworzenia fałdów w komórkach. (Copyright@ACS2011) 6
Skróty:
FKBP: białko wiążące FK506 
FRB: białko wiążące FKBP-rapamycynę 
Tiam1: białko 1 indukujące inwazję i przerzuty chłoniaka komórek T (Rac GEF) 
LDR: linker Lyn-DSAG-FRB (Lyn: N-końcowe 11 aminokwasów kinazy Lyn) 
HE-Rapa: C40-O-(2-hydroksyetylo)rapamycyna 
cRb: klatkowana rapamycyna z grupą biotyny 
cRb-A: cRb sprzężone z awidyną

<ol><li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420, 629-635 (2002).</li>
<li>Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTP-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTP-binding proteins.</a> Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).</li>
<li>Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+regulation+of+small+GTPases+as+revealed+by+probes+based+on+the+principle+of+Forster+Resonance+Energy+Transfer+%28FRET%29%3A+Implications+for+signaling+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).</li>
<li>Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+translocation+strategy+to+rapidly+activate+and+inhibit+small+GTPase+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways.</a> Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).</li>
<li>Komatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific%2C+rapid+induction+of+molecular+activities+and+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering.</a> Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).</li>
<li>Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photocleavable+rapamycin+conjugate+for+spatiotemporal+control+of+small+GTPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am+.Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity.</a> J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li>
<li>Kennedy, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li>
<li>Wu, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).</li>
<li>Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+controlled+protein+assembly%3A+techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemically controlled protein assembly: techniques and applications.</a> Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).</li>
<li>Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemically+induced+changes+of+PtdIns%284%2C5%29P2+gate+KCNQ+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels.</a> Science. 314, 1454-1457 (2006).</li>
<li>Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+inducible+changes+in+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+levels+influence+multiple+regulatory+functions+of+the+lipid+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells.</a> J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisaliśmy technikę wykorzystującą nowy związek klatkowy (caged compound) wraz z systemem heterodimeryzacji FKBP-FRB w celu manipulowania aktywnością Rho GTPazy w precyzyjnej lokalizacji subkomórkowej w skali czasu sekund.
Niniejsze podejście posiada trzy ograniczenia. Po pierwsze, ponieważ metoda opiera się na zapobieganiu lub umożliwianiu dyfuzji dimeryzatora przez błonę plazmatyczną, docelowa lokalizacja komórkowa musi znajdować się w obrębie błony plazmatycznej lub jej bezpośrednim sąsiedz...

przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych gtpaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamiczna regulacja małych guanozynotrifosfataz (GTPaz) z rodziny Rho z dużą precyzją czasoprzestrzenną jest niezbędna dla wielu funkcji i zdarzeń komórkowych1, 2. Ich dynamiczny charakter w czasie i przestrzeni został ujawniony dzięki wizualizacji ich aktywności oraz lokalizacji w czasie rzeczywistym3. Aby uzyskać głębsze zrozumienie ich roli w różnorodnych funkcjach komórkowych na poziomie molekularnym, kolejnym krokiem powinno być zaburzenie aktywności białek w precyzyjnie określonej lokalizacji subkomórkowej i czasie.
Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy metodę indukowanej światłem, kontrolowanej przestrzennie i czasowo aktywacji małych GTPaz poprzez połączenie dwóch technik: (1) indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz (2) metody fotoklatkowania rapamycyny. Wykorzystując zapośredniczoną przez rapamycynę heterodimeryzację FKBP-FRB, opracowaliśmy metodę szybkiej, indukowalnej aktywacji lub inaktywacji małych GTPaz, w tym Rac4, Cdc424, RhoA4 i Ras5, w której rapamycyna indukuje translokację GTPaz połączonych z FKBP lub ich aktywatorów do błony plazmatycznej, w której zakotwiczony jest FRB. W celu połączenia z tym systemem heterodimeryzacji opracowaliśmy również system fotoklatkowania analogów rapamycyny. Związek fotoklatkowany to mała cząsteczka, której aktywność jest tłumiona przez fotolabilną grupę ochronną, zwaną grupą klatkującą. Aby całkowicie stłumić aktywność heterodimeryzacji, zaprojektowaliśmy klatkowaną rapamycynę przywiązaną do makrocząsteczki w taki sposób, aby powstały duży kompleks nie mógł przekroczyć błony plazmatycznej, co prowadzi do praktycznego braku aktywności tła jako chemicznego dimeryzatora wewnątrz komórek6. Rysunek 1 przedstawia schemat naszego systemu. Dzięki połączeniu tych dwóch systemów lokalnie zrekrutowaliśmy aktywator Rac do błony plazmatycznej w skali sekund i osiągnęliśmy indukowaną światłem aktywację Rac na poziomie subkomórkowym6.

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Dynamiczna regulacja rodziny małych guanozynotrifosfataz (GTPaz) Rho z dużą precyzją czasoprzestrzenną jest niezbędna dla różnych procesów komórkowych...

Niniejszy film demonstruje metodę, w której światło UV jest wykorzystywane do manipulowania aktywnością białka w błonie plazmatycznej. W tym celu komórki są współtransfected białkiem FRB zakotwiczonym w błonie oraz białkiem zainteresowania połączonym z FKBP. Do pożywki dodawany jest pochodna rapamycyny z fotoklatką.Następnie podczas obrazowania żywych komórek światło UV jest kierowane na konkretny obszar komórki. Łącznik między rapamycyną a biotyną zostaje rozszczepiony, uwalniając chemiczny dimeryzator oraz produkt uboczny; uwolniony dimeryzator dyfunduje do wnętrza komórek i indukuje dimeryzację białka docelowego znakowanego FKBP oraz zakotwiczonego w błonie plazmatycznej białka FRB w obszarze napromieniowanym. Bez promieniowania UV białka FKBP i FRB nie wiążą się ze sobą, co skutkuje brakiem efektu.Analiza danych wykazuje silnie zlokalizowaną rekrutację białka zainteresowania z fuzją FKBP na podstawie jego efektu fizjologicznego. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak podejście farmakologiczne i genetyczne, jest połączenie szybkości działania, specyficzności celu i rozdzielczości przestrzennej. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię przerzutów nowotworowych, które są następstwem migracji komórek rakowych.W związku z tym manipulacja aktywnością kluczowych czynników migracji może ujawnić ich dokładny mechanizm molekularny, co jest warunkiem niezbędnym do wdrożenia odpowiedniego leczenia i terapii. Procedurę zaprezentują Chris Paul Meyer, doktorant, oraz Bob de Rose, technik z mojego laboratorium. Rozpocznij ten protokół, łącząc w sterylnej probówce do mikrocentryfugi następujące składniki: plazmid DNA, membranowo związany FRB, fluorescencyjnie znakowany FKBP, TIA one oraz wodę dejonizowaną; dodaj jeden mikrolitr a few gene HD do mieszaniny i wymieszaj w wstrząsarce typu vortex.Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Podczas inkubacji dodaj 50 µL polilizyny do każdej studni szklanej komory ośmiostudniowej i inkubuj przez jedną minutę w celu pokrycia powierzchni, następnie odessaj roztwór i przemyj środek każdej studni 50 µL wody dejonizowanej. Następnie użyj trypsyny do 80-85% konfluencyjnych komórek NIH 3T3.Po odklejeniu komórek należy dodać 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS, przenieść 375 µl zawiesiny do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 1 500 g przez trzy minuty. Po wirowaniu należy ostrożnie odessać medium. Następnie dodać 750 µl DMEM z 10% FVS i resuspenderować.Resuspend osad, delikatnie pipetując zawartość w górę i w dół kilka razy. Następnie dodać zawiesinę komórkową do roztworu do transfekcji i, mieszając delikatnie końcówką pipety, przenieść 250 µL zawiesiny do transfekcji komórek do każdej studni komory. Wsunąć i inkubować.37 °C przez 15 do 18 godzin. Aby zsyntezować klatkowy addukt rapamycyny z biotyną, należy zacząć od przygotowania 1 mM roztworu zapasu CRB w DMSO w sterylnej probówce do wirówki; w oddzielnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml rozpuścić 1 mg avadonu w 250 µl PBS.Następnie należy sprzęgać grupę maskującą z rapamycyną. Do rozpuszczonego AVID dodać 0,5 µL roztworu zapasowego CRB, wymieszać poprzez kilkukrotne odwrócenie probówki, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby uzyskać koniugat CRB AVID, usunąć niezwiązane małe cząsteczki i oczyścić CRBA, należy zrównoważyć kolumnę do chromatografii wykluczania żelowego G 25 przy użyciu 300 µL PBS.Powtórz czynność pięć razy po wyrównaniu kolumny. Nałóż 125 µL roztworu CRBA na centralną część łoża kolumny. Następnie odwiruj roztwór przez dwie minuty przy 800 ×g w temperaturze pokojowej, zbierając przelew do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL po transfekcji komórek.Wymień medium na DMEM bez FBS, aby poddać komórki głodzeniu surowiczym, a następnie inkubuj przez 12 godzin. Po inkubacji delikatnie odessaj medium i dodaj 250 µL przygotowanego 1 µM roztworu CRBA. Następnie, aby zwizualizować dynamikę białek w żywych komórkach, użyj konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym z oświetleniem UV oraz sprzężoną optyką dla diody UV LED o długości fali 365 nm.Przy użyciu światła fluorescencyjnego epi. Określ współrzędne i rozmiar plamki oświetleniowej, używając szklanej płytki powlekanej barwnikami fluorescencyjnymi wzbudzanymi światłem UV. Pozwala to na precyzyjne dostrojenie obszaru poddanego naświetlaniu.Umieść szkiełko z komorą zawierające komórki na stoliku, używając obiektywu 100x i fluorescencji epifluorescencyjnej. Ustaw ostrość na komórki i znajdź pojedynczą komórkę. Przystąp do obrazowania komórek po ustaleniu poziomów tła efektu fizjologicznego.W tym przypadku pomiar marszczenia błony (membrane ruffling) przeprowadzono poprzez naświetlanie światłem UV wybranego kwadrantu komórki, uwalniając w ten sposób zablokowaną rapamycynę, którą uprzednio rozpuszczono w DMSO, a następnie w PBS do stężenia końcowego 400 nanomolar. Do komory obrazowania dodano 100 mikrolitrów roztworu w celu wywołania efektów globalnych. Obrazy fluorescencyjne rejestrowano co 15 sekund przez 20 minut, aby ustalić, czy lokalna aktywacja białka RAC może indukować lokalne tworzenie się marszczeń.Komórki NIH 3T3 zostały przetransfekowane FKbp aktywatorem RAC z tagiem YFP, TIA1 oraz zakotwiczonym w błonie LDR. Lokalnego naświetlania FRB na brzegu komórki, wskazanego żółtym okręgiem, towarzyszyło globalne naświetlanie lampą rtęciową przez jedną sekundę, rozpoczynając od 1063 sekundy. Jak widać tutaj, na początku niemal nie występowało marszczenie błony.Jednakże, po lokalnym naświetlaniu, zaobserwowano przestrzennie ograniczone marszczenie po naświetlaniu globalnym i dodaniu rapamycyny, która powoduje translokację FK bp TIA one do błony komórkowej. Komórka wykazała globalną formację marszczeń, co wskazuje, że wcześniej zaobserwowana lokalna formacja marszczeń była spowodowana przestrzennie ograniczoną aktywacją rack. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej komórki docelowe podzielono na cztery kwadranty i określono częstotliwość powstawania marszczeń w każdym kwadrancie po stymulacji lokalnej, jak i globalnej, co przedstawiono na tym wykresie.Żadna z obserwowanych komórek nie wykazała tworzenia fałdów (ruffles) w obecności CRBA bez naświetlania UV lub przy lokalnym naświetlaniu UV, z dodatkiem lub bez dodatku Aden w medium sypkim. Jednakże, po dodaniu CRBA i przeprowadzeniu naświetlania UV, tworzenie fałdów zaobserwowano na podobnym poziomie, około 90% we wszystkich kwadrantach przy naświetlaniu globalnym; natomiast gdy naświetlano tylko kwadrant pierwszy, częstotliwość tworzenia fałdów wyniosła 100% w porównaniu do 30%, 25% i 30% w kwadrantach od drugiego do czwartego. Wyniki te wskazują, że lokalne odblokowanie (uncaging) rapamycyny może być wykorzystane do wywołania silnie zlokalizowanych efektów fizjologicznych w pojedynczej komórce.W tym przypadku przedstawiono marszczenie błony wywołane aktywacją systemu rack. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak za pomocą światła uzyskać czasowo-przestrzenną kontrolę nad aktywnością małych białek GTPazy. Metoda ta może zostać zastosowana w każdym procesie fizjologicznym zależnym od translokacji specyficznych białek do błony plazmatycznej.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby dla każdego badania przygotować świeże roztwory, odczynniki i komórki. Należy pamiętać, że praca z promieniowaniem UV może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak okulary ochronne z filtrem UV.

spatio-temporal-manipulation-small-gtpase-activity-at-subcellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywności małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali czasowej sekund w żywych komórkach

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury związane z nadekspresją i analizą małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych z wykorzystaniem techniki mikroiniekcji.

Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Tutaj opisujemy protokół do badania prenylacji i obciążenia guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) GTPazy Rho. Protokół ten składa się z dwóch szczegółowych metod, a mianowicie frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentu sprzężonego z GTPazą. Protokół może być używany do pomiaru prenylacji i obciążenia GTP różnych innych małych GTPaz.

Wykrywanie prenylacji małej GTPazy i wiązania GTP za pomocą frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentowego sprzężonego z GTPazą

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Typowe inhibitory mikrotubul, szeroko stosowane w badaniach podstawowych i stosowanych, mają dalekosiężny wpływ na komórki. Ostatnio fotostatyny pojawiły się jako klasa fotoprzełączalnych inhibitorów mikrotubul, zdolnych do natychmiastowej, odwracalnej, czasoprzestrzennie precyzyjnej manipulacji mikrotubulami. Ten protokół krok po kroku szczegółowo opisuje zastosowanie fotostatyn w żywym zarodku myszy preimplantacyjnej 3D.

Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Poznaj metodę precyzyjnej kontroli aktywności małych GTPaz przy użyciu światła UV i systemu foto-klatkowania rapamycyny w żywych komórkach. Technika ta umożliwia badanie szlaków sygnałowych na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów