Czasoprzestrzenna manipulacja aktywnością małej GTPazy na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Ten film pokazuje metodę, w której światło UV jest wykorzystywane do manipulowania aktywnością białka na błonie plazmatycznej. Aby to zrobić, komórki są transfekowane białkiem FRB zakotwiczonym w błonie i białkiem połączonym FK BP, które jest przedmiotem zainteresowania. Do podłoża dodaje się pochodną rapamycyny umieszczoną w klatce fotograficznej.

Następnie podczas obrazowania żywych komórek światło UV jest nakładane na określony obszar komórki. Łącznik między rapamycyną a biotyną jest rozszczepiony, uwalniając chemiczny dimeryzator i jego produkt uboczny, uwolniony dimeryzator dyfunduje do komórek i indukuje dimeryzację między białkiem znakowanym FKBP a FRB zakotwiczonym w błonie plazmatycznej w napromieniowanym obszarze. Bez promieniowania UV FKBP i FRB nie łączą się, a więc nie wywołują żadnego efektu.

Analiza danych ujawnia wysoce zlokalizowaną rekrutację białka skondensowanego FKBP w oparciu o jego efekt fizjologiczny. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak farmakologia i genetyka, jest połączenie szybkości działania, swoistości docelowej i rozdzielczości przestrzennej. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię przerzutów nowotworowych, które są konsekwencją migracji komórek nowotworowych.

W związku z tym manipulacja aktywnością kluczowych czynników migracyjnych może ujawnić jej dokładny mechanizm molekularny, co jest warunkiem koniecznym do jej leczenia i wyleczenia. Procedurę zademonstrują Chris Paul Meyer, doktorant i Bob de Rose, technik z mojego laboratorium. Rozpocznij ten protokół od połączenia następujących elementów w sterylnym mikro probówce wirówkowej plazmid, DNA, FRB na uwięzi fluorescencyjnie oznaczonej FKBP, TIA jeden i wody dejonizowanej dodaj jeden mikrolitr kilka genów HD do mieszaniny i wiruj.

Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Podczas inkubacji dodać 50 mikrolitrów poli delycyny do każdej studzienki szklanej ośmiodołkowej strony i inkubować przez jedną minutę, aby pokryć powierzchnię, a następnie zassać roztwór i przemyć środek każdej studzienki 50 dejonizowaną wodą. Następnie trypsyna to 80 do 85% zlewających się NIH trzech komórek T.

Po odłączeniu komórek dodać 10 mililitrów DMEM zawierających 10% FBS, przenieść 375 mikrolitrów zawiesiny do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować przy 1,500 G przez trzy minuty. Po wirowaniu ostrożnie zassać podłoże. Dodaj 750 mikrolitrów DMEM z 10% FVS i Resus.

Zawiesić osad, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Na koniec dodaj zawiesinę komórek do roztworu do transfekcji i za pomocą końcówki pipety delikatnie wymieszaj, dodaj 250 mikrolitrów zawiesiny do transfekcji komórek do każdej studzienki komory. Przesuń go i inkubuj.

37 stopni Celsjusza przez 15 do 18 godzin. Do syntezy klatki rapamycyny, addukt biotyny. Zacznij od przygotowania jednomilimolowego roztworu podstawowego CRB w DMSO w sterylnej probówce fuge w oddzielnej 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej, rozpuść jeden miligram awadonu w 250 mikrolitrach PBS.

Następnie sprzęgnąć ugrupowanie w klatce z rapamycyną. Dodać 0,5 mikrolitra roztworu podstawowego CRB do rozpuszczonego AVID w mieszaninie przez kilkakrotne odwrócenie, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby otrzymać CRB AVID w sprzężonym roztworze w celu wykluczenia niezwiązanych małych cząsteczek i oczyszczenia CRBA, należy zrównoważyć kolumnę wykluczającą o wielkości G 25 z 300 mikrolitrami PBS.

Powtórz pięć razy po wyrównaniu kolumny. Załaduj 125 mikrolitrów roztworu CRBA na środkowe łoże kolumny. Następnie wirować roztwór przez dwie minuty w temperaturze 800 G W temperaturze pokojowej zebrać przepływ w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej po transfekcji komórek.

Zamień pożywkę na DMEM bez FBS, aby surowica zagłodzić komórki inkubować przez 12 godzin. Po inkubacji delikatnie odessać pożywkę i dodać 250 mikrolitrów przygotowanego jednomikromolowego roztworu CRBA. Następnie, aby zobrazować dynamikę białek w żywych komórkach, użyj mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i oświetleniem UV, aby połączyć optykę dla światła UV LED o długości 365 nanometrów.

Ze światłem fluorescencyjnym epi. Określ współrzędne i rozmiar plamki świetlnej za pomocą szklanej płytki pokrytej barwnikami fluorescencyjnymi wzbudzonymi światłem UV. Pozwala to na precyzyjne dostrojenie obszaru, który ma być naświetlany.

Umieść szkiełko komory z komórkami na stoliku za pomocą obiektywu 100 x i epifluorescencji. Ustaw ostrość komórek i znajdź komórkę. W przypadku obrazowania rozpocznij obrazowanie komórek po określeniu poziomów tła efektu fizjologicznego.

Tutaj mierzy się marszczenie błony, naświetla światłem UV w jednym wybranym kwadrancie komórki, rozpuszcza się bez klatki, a więc oryginalną rapamycynę w DMSO, a następnie w PBS do końcowego stężenia 400 nanomolowców. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu do komory obrazowania, aby wywołać efekty globalne. Rób obrazy fluorescencyjne co 15 sekund przez 20 minut, aby określić, czy zlokalizowana aktywacja RAC może wywołać lokalne tworzenie się falban.

Trzy komórki T trzy NIH transfekowano aktywatorem RAC oznaczonym YFP FK bp, TIA one i LDR, który jest zakotwiczony w błonie. Po miejscowym napromieniowaniu FRB na krawędzi komórki oznaczonej żółtym kółkiem, nastąpiło globalne oświetlenie lampą rtęciową przez jedną sekundę, począwszy od 1063 sekund. Jak widać tutaj, na początku prawie nie było marszczenia błony.

Jednak po miejscowym oświetleniu zaobserwowano przestrzenne potarganie po globalnym oświetleniu i dodaniu rapamycyny, która powoduje translokację FK bp TIA one do błony plazmatycznej. Komórka wykazywała globalne tworzenie się falban, co wskazuje, że wcześniej obserwowane lokalne powstawanie falban było spowodowane przestrzennie ograniczoną aktywacją stojaka. Do analizy ilościowej komórki docelowe podzielono na cztery ćwiartki i określono częstotliwość tworzenia się falban w każdym kwadrancie po lokalnej i następującej po globalnej stymulacji, jak widać na tym wykresie.

Żadna z obserwowanych komórek nie wykazywała powstawania falban z CRBA bez promieniowania uve lub miejscowym uve, promieniowaniem z lub bez Aden w podłożu masowym. Jednak po dodaniu CRBA i wykonaniu promieniowania UV zaobserwowano tworzenie się falban mniej więcej na tym samym poziomie, około 90% we wszystkich kwadrantach z globalnym promieniowaniem, gdy napromieniowany był tylko kwadrant pierwszy, częstotliwość tworzenia się falban wynosiła 100% w porównaniu do 30% 25% i 30% w kwadrantach od drugiego do czterech. Wyniki te wskazują, że miejscowe odblokowanie rapamycyny w klatce może być wykorzystane do wywołania wysoce zlokalizowanych efektów fizjologicznych w pojedynczej komórce.

W tym przypadku marszczenie membrany spowodowane aktywacją stojaka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak osiągnąć przestrzenną kontrolę czasową nad aktywnością małych g TPA za pomocą światła. Metodę tę można zastosować do każdego procesu fizjologicznego, który jest zależny od translokacji określonych białek do błony plazmatycznej.

Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o świeżym przygotowaniu roztworów, odczynników i komórek do każdego zabiegu. Nie zapominaj, że praca ze światłem UV może być bardzo niebezpieczna i zawsze należy nosić środki ostrożności, takie jak okulary UV.