Name: Inżynieria i ewolucja wektorów terapii genowej syntetycznego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) poprzez tasowanie rodziny DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Poznaj metodę tasowania rodziny DNA do inżynierii wektorów AAV dla terapii genowej. Twórz biblioteki kapsydów z ponad milionem wariantów i selekcjonuj cząsteczki o pożądanych właściwościach w komórkach lub zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają wdzięczność za wyjątkowe wsparcie swojego laboratorium, członków zespołu oraz prowadzonych prac, udzielone przez Cluster of Excellence CellNetworks na Uniwersytecie w Heidelbergu, a także przez fundację Chica and Heinz Schaller (CHS). Z uznaniem odnotowujemy, że molekularna ewolucja AAV poprzez przetasowanie rodzin DNA stała się bardzo aktywną dziedziną od czasu naszej pierwotnej publikacji sprzed trzech lat i w związku z tym przepraszamy wszystkich autorów odpowiednich publikacji, których prac nie można było tutaj przytoczyć ze względu na ograniczenia miejsca.

<ol><li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+virus+evolution+to+vector+revolution%3A+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
<li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22humanized%22+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

W niniejszym opracowaniu przedstawiliśmy kluczowe kroki eksperymentalne oraz wytyczne dotyczące inżynierii kapsydu AAV za pomocą przetasowania rodzin DNA (DNA family shuffling) oraz ewolucji w komórkach lub w organizmach zwierzęcych. W istocie protokoły te są standaryzowanymi wersjami procedur, które po raz pierwszy opisaliśmy w dziedzinie AAV w 2008 roku3. Chociaż w licznych badaniach uzupełniających przeprowadzonych przez innych autorów zgłoszono wiele modyfikacji np.,10-13, nasze obecne ...

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenoimina (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>New England Biolabs</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania z żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw z polimerazą Phusion II</td><td>Finnzymes</td><td>F-540S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw z polimerazą HotStar Hifi</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Finnzymes</td><td>F-540S (część zestawu)</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (25 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015 (część zestawu)</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4855.2</td><td></td></tr><tr><td>Sód ampicyliny</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM, 100 &amp;mu;l)</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Iodiksanol (OptiPrep)</td><td>Axis-Shield</td><td>1114739</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>107241</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mega-prep plazmidów</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentryfuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Optima L90K</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirówki Quick-Seal</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulserXcell</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>Vapo Protect</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td>BIOER</td><td>MB-102</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Analizator FACS</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Cytomics FC500 MLP</td><td></td></tr><tr><td>Komórki MegaX DH10B T1R</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td></td></tr><tr><td>Benzonukleaza</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>101695</td><td></td></tr><tr><td>Adenowirus-5</td><td>ATCC</td><td>VR-5</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pBlueScript II KS(+)</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>212207</td><td></td></tr><tr><td>cap5F (miejsce Pac I na żółto, sekwencje specyficzne dla cap5 pogrubione): GACTCTTAATTAACAGGT&lt;strong&gt;ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC&lt;/strong&gt;</td><td>IDT</td><td>Starter customowy</td><td></td></tr><tr><td>cap5R (miejsce Asc I na zielono, sekwencje specyficzne dla cap5 pogrubione): GTGAGGGCGCGCC&lt;strong&gt;TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC&lt;/strong&gt;</td><td>IDT</td><td>Starter customowy</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (aav) za pomocą tasowania rodzin dna

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Wektory oparte na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) stanowią jedne z najskuteczniejszych i najbardziej obiecujących nośników dla terapeutycznego transferu genów u ludzi dzięki unikalnemu połączeniu korzystnych właściwości1. Należą do nich apatogenność wirusów dzikich oraz wysoce zaawansowane metodologie produkcji rekombinowanych wektorów o wysokim mianie, wysokiej czystości i jakości klinicznej2. Kolejną szczególną zaletą systemu AAV w porównaniu z innymi wirusami jest dostępność bogatego zbioru naturalnie występujących serotypów, które różnią się kluczowymi właściwościami, a jednocześnie mogą być łatwo przekształcane w wektory przy użyciu wspólnego protokołu1,2. Co więcej, szereg grup, w tym nasza, opracowało ostatnio strategie wykorzystania tych naturalnych wirusów jako matryc do tworzenia wektorów syntetycznych, które albo łączą cechy wielu serotypów wyjściowych, albo ulepszają właściwości pojedynczego izolatu. Odpowiednie technologie służące do osiągnięcia tych celów to albo przetasowanie rodzin DNA (DNA family shuffling)3, t.j. fragmentacja różnych genów kapsydu AAV, a następnie ich ponowne złożenie w oparciu o częściowe homologie (zazwyczaj &gt;80% dla większości serotypów AAV), albo prezentacja peptydów (peptide display)4,5, t.j. insercja zazwyczaj siedmiu aminokwasów do eksponowanej pętli kapsydu wirusowego, gdzie peptyd w idealnym przypadku pośredniczy w ponownym kierowaniu (re-targeting) do pożądanego typu komórek. Aby osiągnąć maksymalny sukces, obie metody są stosowane w sposób wysokoprzepustowy, w którym protokoły są skalowane w górę w celu uzyskania bibliotek obejmujących około miliona odrębnych wariantów kapsydu. Każdy klon składa się następnie z unikalnej kombinacji licznych wirusów rodzicielskich (podejście przetasowania DNA) lub zawiera charakterystyczny peptyd w tym samym szkielecie wirusowym (podejście prezentacji peptydów). Następnym, końcowym krokiem jest iteracyjna selekcja takiej biblioteki na komórkach docelowych w celu wzbogacenia populacji o poszczególne kapsydy spełniające większość lub idealnie wszystkie wymogi procesu selekcji. Ta ostatnia najlepiej łączy presję pozytywną, taką jak wzrost na określonym, interesującym nas typie komórek, z selekcją negatywną, na przykład eliminacją wszystkich kapsydów reagujących z przeciwciałami anty-AAV. Takie połączenie zwiększa szansę, że syntetyczne kapsydy, które przetrwają selekcję, będą odpowiadać potrzebom danego zastosowania w sposób, który prawdopodobnie nie zostałby znaleziony w żadnym naturalnie występującym izolacie AAV. Tutaj skupiamy się na metodzie przetasowania rodzin DNA jako teoretycznie i eksperymentalnie bardziej wymagającej z tych dwóch technologii. Opisujemy i demonstrujemy wszystkie kluczowe kroki generowania i selekcji przetasowanych bibliotek AAV (Rys. 1), a następnie omawiamy pułapki i krytyczne aspekty protokołów, o których należy wiedzieć, aby odnieść sukces w molekularnej ewolucji AAV.

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Wektory oparte na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) stanowią jedne z najskuteczniejszych i najbardziej obiecujących nośników w terapeutycznym transferze genów u ludzi ze względu na unikalne...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest stworzenie wysoce zróżnicowanej biblioteki syntetycznych kapsydów wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV), z której można wyselekcjonować cząsteczki o pożądanych właściwościach. Osiąga się to poprzez fragmentację, klonowanie i selekcję genów kapsydu AAV za pomocą kontrolowanego trawienia DNazą I, aby umożliwić ich późniejszy ponowny montaż w sekwencje chimeryczne za pomocą dwóch reakcji PCR. W drugim kroku otrzymany produkt PCR jest klonowany z powrotem do konstrukcji AAV zdolnej do replikacji, w celu uzyskania biblioteki plazmidowej zawierającej co najmniej 1 milion różnych genów kapsydu AAV.Następnie ta biblioteka plazmidów jest transfekowana do komórek 2 9 3 T wraz z pomocniczym plazmidem adenowirusowym w celu wytworzenia biblioteki wirusów chimerycznych, które mogą być następnie selekcjonowane na komórkach docelowych lub w organizmach zwierzęcych. Wyniki wykazują pomyślną inżynierię molekularną i ewolucję nowych syntetycznych wektorów A A V w oparciu o zwiększoną lub bardziej specyficzną ekspresję genu reporterowego w hodowlach komórkowych lub u dorosłych myszy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak prezentacja peptydów, jest fakt, że tasowanie rodzin DNA ma potencjał do jednoczesnej zmiany i ulepszenia wielu cech kapsydu AV, od wiązania się z komórkami i transportu wewnątrzkomórkowego, po rozpakowywanie i ekspresję genów w jądrze komórkowym.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach terapii genowej i wirusologii, takich jak sposób uzyskania optymalnego wektora dla danej zastosowania terapeutycznego lub sposób analizy domen kapsydu wirusowego odpowiedzialnych za określone właściwości. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię wielu ludzkich chorób, w tym infekcji patogenami wirusowymi, ponieważ nasza metoda umożliwia ewolucję molekularną wektorów A V, które w sposób specyficzny i skuteczny infekują wirusowe komórki docelowe, takie jak limfocyty T w przypadku HIV lub hepatocyty w przypadku wirusów zapalenia wątroby. Metoda ta może zatem dostarczyć wiedzy na temat biologii A V i może być wykorzystana do ulepszania wektorów AV w terapii genowej.Metodę tę można z łatwością zastosować również do innych rodzin genów o znaczeniu podstawowym lub aplikacyjnym, takich jak geny kodujące fluorescencję, trzy reportery, enzymy komórkowe lub białka uczestniczące w interferencji RNA. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy próbowaliśmy znaleźć odpowiedni wektor do transfuzji genów terapeutycznych do tkanek dorosłych myszy i zdaliśmy sobie sprawę, że wszystkie naturalnie występujące serotypy AV mają wady, takie jak wysoka rozpowszechnienie w populacji ludzkiej i w konsekwencji wysoka częstotliwość odpowiedzi immunologicznej lub słaba wydajność in vivo pomimo efektywnej transdukcji hepatocytów in vitro. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ fragmentacja genu kapsydu AV opartego na DNA oraz niektóre etapy produkcji biblioteki wirusowej są trudne do opanowania, gdyż wymagają doświadczenia i świadomości krytycznych etapów, aby ułatwić rutynowe przygotowanie wystarczających ilości różnych genów kapsydu wirusów towarzyszących adenowirusom.W celu przeprowadzenia tasowania DNA geny te są początkowo subklonowane do wspólnego szkieletu plazmidowego. Aby to osiągnąć, pożądane geny cap są najpierw amplifikowane metodą PCR z powszechnie dostępnych plazmidów AAV przy użyciu starterów cap F i cap R. Następnie geny cap są klonowane do plazmidu zaprojektowanego tak, aby zawierał specyficzne miejsca wiązania starterów oraz miejsca restrykcyjne. W tym przykładzie gen cap jest klonowany do miejsc PAC one oraz SC one, które znajdują się w starterach użytych do amplifikacji cap oraz w plazmidzie biorcy, lecz nie występują w większości AAV. Po przygotowaniu zestawów plazmidów kodujących geny kapsydu AAV rozpoczyna się procedurę tasowania cap metodą PCR, amplifikując wybrane geny cap przy użyciu starterów T3 i T7.Przygotuj 50 µL reakcji PCR zawierającej 200 ng plazmidu cap, każdy starter w końcowym stężeniu 2 µM, 10 µL buforu High Five 5x oraz 1 µL polimerazy High Five. Reakcja ta pozwoli uzyskać około 3 µg produktu PCR, co jest wystarczającą ilością do przeprowadzenia maksymalnie sześciu reakcji shufflingu, w zależności od liczby genów cap włączonych do biblioteki. Rozpocznij od 5 minut w 95 °C, a następnie przeprowadź 40 cykli obejmujących 15 sekund w 94 °C, 30 sekund w 57 °C oraz 3 minuty w 68 °C, kończąc etapem końcowym przez 10 minut w 72 °C.Po oczyszczeniu produktów PCR przeprowadza się kontrolowane trawienie DNA w celu wytworzenia fragmentów genu cap do ponownego montażu w Kyra. Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest uzyskanie odpowiedniego zakresu długości przetrawionych fragmentów DNA genu cap niezbędnych do ponownego montażu w kyras; w tym celu przygotowujemy początkowo duże ilości oczyszczonych genów cap, a następnie przeprowadzamy wiele równoległych reakcji w różnych warunkach. Aby ujednolicić proces trawienia, należy zmieszać różne produkty PCR genu cap do łącznej ilości 4 µg w 54 µL wody, a następnie dodać 6 µL buforu reakcyjnego DS oraz 0,5 µL DNAs one do mieszaniny; ostrożnie wymieszać zawartość probówki trzy razy, krótko odwirować i natychmiast umieścić na bloku grzewczym o temperaturze 25 °C.Inkubuj tę pierwszą reakcję przez jedną minutę. Następnie przygotuj drugą reakcję trawienia, ale inkubuj ją w temperaturze 25 °C przez jedną minutę i 15 sekund. W ten sposób przygotuj wiele równoległych reakcji z czasami inkubacji od jednej do dwóch minut, zmieniając czas inkubacji w odstępach 15 sekund.Zatrzymaj każdą reakcję, dodając 6 µL 25 mM EDTA. Krótko wymieszaj próbkę na wirówce typu vortex i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Wielokrotne reakcje równoległe pozwolą uzyskać pięć próbek białek cap trawionych przez DNAs, jedną dla różnych czasów inkubacji; oczyść fragmenty cap na standardowym żelu 1% AROS.W idealnym przypadku, pomiędzy 100 a 500 pz powinna być widoczna smuga, jak pokazano w tym przykładzie z czasami inkubacji wynoszącymi początkowo jedną minutę, 45 sekund lub dwie minuty. W procesie DNA family shuffling fragmenty cap są najpierw składane w sekwencje pełnej długości za pomocą PCR, w którym zachodzi samopremowanie na podstawie częściowych homologii. Przygotuj 50 µL reakcji z 500 ng oczyszczonych fragmentów, 10 µL 10x buforu do fuzji, 1 µL 10 mM dNTPs, 1,5 µL DMSO oraz 0,5 µL fuzji.Dwie polimerazy inkubuje się przez 30 sekund w temperaturze 98 °C, a następnie przeprowadza 40 cykli obejmujących 10 sekund w 98 °C, 30 sekund w 42 °C i 45 sekund w 72 °C, po czym następuje końcowy etap 10 minut w 72 °C. Następnie przeprowadza się amplifikację zrekonstruowanych genów białek cap w celu późniejszego klonowania za pomocą drugiej reakcji PCR, wykorzystując primery wiążące się z konserwowanymi sekwencjami flankującymi. Na przykład, przy użyciu par SAF i SAR lub CUF i CUR, przygotowuje się reakcję o objętości 50 µL zawierającą 2 µL produktu pierwszej reakcji PCR, każdy primer w stężeniu końcowym 2 µM, 0,5 µL chlorku magnezu, 10 µL buforu 5x high-FI oraz 1 µL polimerazy high-FI.Zaleca się przeprowadzenie od 16 do 24 reakcji PCR, aby zapewnić wystarczająco wysoką wydajność dla późniejszego klonowania. Po połączeniu produktów PCR i oczyszczeniu pełnowymiarowego prążka cap, kolejnym krokiem jest trawienie oczyszczonej puli genów cap za pomocą PAC one i SC one w celu klonowania do plazmidu a a v zdolnego do replikacji. Plazmid biorca zawiera odwrócone powtórzenia końcowe a a v flankujące gen rep AAV two pod kontrolą promotora AAV P five, PAC one i ASC one.Miejsca restrykcyjne poniżej rep umożliwiają klonowanie w ramce odczytania puli przetasowanych cap. Miejsca wiązania starterów LSE wskazane strzałkami są przydatne do sekwencjonowania genu cap; połącz fragmenty cap i odpowiednio przecięty szkielet plazmidu biorcy w stosunku molowym trzy do jednego. Przygotuj master mix o całkowitej objętości 40 µL, wystarczający dla 20 transformacji, z końcowym stężeniem DNA wynoszącym 15 ng/µL.Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C, a następnego dnia przeprowadzić transformację mieszaniny ligacji do szczepu E. coli. Wymieszać 2 µL reakcji ligacji z 30 µL elektrokompetentnych komórek E. coli i przenieść do uprzednio schłodzonych kuwet do elektroporacji na lodzie; przeprowadzić elektroporację przy wartościach 1,8 kV, 200 Ω i 25 µF. Stała czasowa powinna wynosić około 5 ms. Natychmiast dodać 1 mL podgrzanego medium SOC i przenieść do kolby o pojemności 250 ml.20 takich elektroporacji pozwoli uzyskać bibliotekę o różnorodności około 1 × 10⁶ różnych klonów. Do połączonych transformat dodać jedną objętość uprzednio ogrzanej pożywki SOC, a następnie inkubować przy 37 °C i 180 RPM przez jedną godzinę. Następnie 40 ml połączonych transformat dodać do 800 ml pożywki lb z ampicyliną i inkubować przez kolejne 16 godzin w tych samych warunkach, po czym plazmidowy DNA biblioteki oczyścić za pomocą dostępnego komercyjnie zestawu.Produkcja biblioteki wirusowej rozpoczyna się od transfekcji komórek HEC 2 9 3 T biblioteką a a v; aby rozpocząć tę procedurę, wysiej komórki HEC 2 9 3 T na 10 15 centymetrowych szalek kwadratowych i hoduj je przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Dla każdej transfekcji przygotuj dwie następujące mieszaniny odczynników w dwóch oddzielnych probówkach. Poniższe ilości podano w przeliczeniu na 10 płytek w pierwszej probówce.Wymieszać 7,9 ml chlorku sodu i DNA, a następnie dodać wodę do uzyskania całkowitej objętości 15,8 ml. Do drugiej probówki dodać 3,52 ml polietylenoaminy, 7,9 ml chlorku sodu oraz 4,38 ml wody. Połączyć obie mieszaniny, wymieszać w wortexie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie równomiernie rozdzielić roztwór do każdej szalki z komórkami 2 9 3 T. Inkubować w temperaturze 37 °C.Po 48 godzinach można zebrać bibliotekę wirusową. Zeskrob komórki do medium, połącz komórki ze wszystkich naczyń w jednej probówce i wiruj przy 1200 RPM przez 15 minut. Resuspenduj osad komórkowy w sześciu mililitrach buforu do lizy, a następnie poddaj pięciu cyklom zamrażania i rozmrażania. Po pięciu cyklach zamrażania i rozmrażania inkubuj z Ben Nase przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie odwiruj szczątki komórkowe przy 3 750 RPM przez 20 minut. Przygotuj gradient do oczyszczania wirusa, używając pipety Pasteura do dodania pięciu mililitrów zawiesiny wirusa do probówki wirówkowej Beckman Quicks seal, a następnie dodaj po 1,5 mililitra roztworów jodka w stężeniach 15%, 25% i 40%. Uzupełnij gradient buforem lizującym i wiruj w ultrawirówce przy 50 000 K przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po zakończeniu ultrawirowania wyjmij probówkę z rotora i przemyj jej zewnętrzną powierzchnię 70% etanolem. Wbij igłę w górną część probówki w celu zapewnienia wentylacji, a następnie za pomocą drugiej igły pobierz 1,2 mililitra frakcji 40% IOL. Należy uważać, aby nie pobierać materiału z frakcji 25%, ponieważ jest ona pusta.Kapsydy AAV. Poszczególne klony z oryginalnej biblioteki plazmidów są analizowane pod kątem funkcjonalności i różnorodności poprzez wykorzystanie ich do produkcji rekombinowanych wektorów AAV wykazujących ekspresję genu reporterowego. Następnie zainfekowane są hodowle komórkowe lub zwierzęta różnymi ilościami oczyszczonego wirusa i wyznaczana jest wydajność transdukcji.Przedstawiono tutaj wyniki mikroskopii fluorescencyjnej dla trzech ludzkich linii komórkowych zainfekowanych pięcioma różnymi rekombinowanymi wektorami AAV wykazującymi ekspresję YFP, stworzonymi z przetasowanych genów cap. Alternatywną metodą analizy wydajności transdukcji jest pomiar ekspresji fluorescencyjnego genu reporterowego za pomocą cytometrii przepływowej (FACS). Rysunek ten przedstawia typowy wynik dla czterech typów komórek: ludzkich komórek nerkowych, ludzkich komórek szyjki macicy, mysich fibroblastów oraz ludzkich limfocytów T, zainfekowanych 18 różnymi rekombinowanymi wektorami AAV wykazującymi ekspresję YFP, stworzonymi z genów cap losowo wybranych z oryginalnej biblioteki.Ekspresję YFP zakodowano kolorystycznie w celu ułatwienia wizualizacji. Przedstawione wartości to procenty przetransdukowanych komórek, gdzie kolor czarny oznacza 0%, a biały najwyższą zmierzoną wartość dla każdego klonu typu komórkowego. Kolor czerwony w przypadku klonu B2 obrazuje klon o niskiej ogólnej skuteczności, co jest spodziewane w przypadku niezmodyfikowanych kapsydów. Następnie bibliotekę wirusową można przesiewać w poszukiwaniu pojedynczych cząsteczek wykazujących większość lub wszystkie pożądane właściwości w danej linii komórkowej lub w organizmach zwierzęcych w celu przeprowadzenia selekcji.W hodowlach komórkowych komórki są najpierw coinfekowane różnymi alikwotami biblioteki oraz wirusem ENO five w celu wsparcia wzrostu a a v, następnie komórki są zbierane, a namnożony a a v jest ekstrahowany i wykorzystywany do reinfekcji nowych komórek. Wyznaczenie optymalnych stosunków adenowirusów a a v dla coinfekcji komórek jest istotne, a dobrą miarą skutecznej infekcji arius jest wystąpienie efektów cytopatycznych trzy dni po inokulacji wirusem, objawiających się zaokrągleniem i odklejaniem się komórek; na tej rycinie lewy górny panel przedstawia komórki niezinfekowane, natomiast pozostałe panele pokazują komórki zainfekowane wskazanymi ilościami adenowirusa w przeliczeniu na cząstki na komórkę. Innym przydatnym odczytem w przypadku infekcji i amplifikacji a a v jest detekcja białek kapsydu za pomocą western blottingu z użyciem przeciwciała B one, które rozpoznaje wysoce konserwowany epitop kapsydu a a v.Lewy blot przedstawia komórki coinfekowane różnymi objętościami w mikrolitrach biblioteki a a V oraz wirusa pomocniczego ENO. Pierwsze dwie ścieżki stanowią dobre przykłady warunków, w których ekspresja białka a a v jest ledwo wykrywalna, co wskazuje na wystarczającą, ale nie nadmierną infekcję i amplifikację a a v, a tym samym na pożądane ścisłe powiązanie genotypu z fenotypem. W związku z tym do reinfekcji świeżych komórek wykorzystano 0,11 lub 10 mikrolitrów tych supernatantów.Wyniki analizy western blot przedstawiono w komórkach po prawej stronie. W LA c przeprowadzono zakażenie samym v jako kontrolę negatywną. Kluczowe jest również monitorowanie różnorodności biblioteki podczas powtarzanych rund zakażeń za pomocą sekwencjonowania DNA.Ten schemat przedstawia porównanie sekwencji białek klonów AAV z biblioteki opartej na AAV 2, 8 i 9 przed i po selekcji; sekwencje powyżej czerwonej linii reprezentują rodzicielskie AAV. Fioletowe strzałki wskazują zdarzenia rekombinacji homologicznej. Czerwona strzałka oznacza crossing-over między AAV 2 a AAV 9, zaobserwowany u wszystkich wybranych klonów. W przypadku selekcji w organizmach zwierzęcych, bibliotekę AAV wprowadza się do zwierząt, a następnie odzyskuje z komórek lub tkanek docelowych za pomocą PCR, po czym ponownie klonuje i pakuje do kolejnej rundy infekcji.Przedstawiono tutaj przykład odzyskania pomyślnie zainfekowanych klonów AAV z wątrób myszy tydzień po obwodowej infuzji biblioteki. Ścieżka pierwsza pokazuje oczekiwany prążek o wielkości 2,2 kilobazy, natomiast ścieżka druga to kontrola bez matrycy; wielkości prążków markera DNA na ścieżce M podano w kilobazach. Niezależnie od procedury selekcji, wzbogacone warianty kapsydu muszą zostać ostatecznie zwalidowane w odpowiednich systemach.Tutaj przedstawiono przykład wyższej wydajności wzbogaconej chymerzy AAV w hodowlach komórkowych. Ciemniejsze kolory wskazują na wyższą zakaźność w przeliczeniu na liczbę cząsteczek, a zatem klona. AAV-DJ wykazuje lepsze parametry niż zbiór ośmiu naturalnych typów dzikich AAV w szerokim zakresie linii komórkowych.Na koniec przedstawiono analizę wybranego klonu AAV KYMERA w wątrobie myszy. AAV DN wyselekcjonowano na komórkach hepatoma i następnie wykorzystano do produkcji rekombinowanych wektorów wyrażających lucyferazę, co pokazano na reprezentatywnych myszach (trzy na grupę) tydzień po obwodowej infuzji równych dawek tego wektora lub kontroli opartej na dzikim typie AAV8, jednym z najsilniejszych znanych naturalnych izolatów w wątrobie myszy. Należy zauważyć, że choć klon AAV DN daje nieco niższą całkowitą ekspresję w wątrobie, jest on bardziej specyficzny dla tego organu, ponieważ wykazuje znacznie mniejszą ekspresję poza celem w tkankach niehepatycznych po dostosowaniu poziomów ekspresji w wątrobie za pomocą oprogramowania do obrazowania.Przy prawidłowym wykonaniu technika ta może zostać zrealizowana w ciągu jednego tygodnia, począwszy od amplifikacji genów kapsydu AV, a kończąc na uzyskaniu biblioteki wirusowej. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że przedstawiony tutaj protokół został opracowany na podstawie naszych doświadczeń z selekcją naturalnych serotypów AV i jest wysoce prawdopodobne, że niektóre warunki będą wymagały dostosowania i precyzyjnego dostrojenia przez innych użytkowników tworzących własne biblioteki customowe. Poza tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak prezentacja peptydów z ukierunkowaną mutagenezą przy użyciu AGENESIS lub randomizacja oparta na PCR, aby wygenerować biblioteki o wysokiej różnorodności lub podjąć próbę dalszej poprawy właściwości kapsydów, które zostały stworzone i wzbogacone za pomocą DNA family shuffling po ich opracowaniu.Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie wirusowej dostawy genów do eksplorowania strategii terapeutycznych w chorobach i powiązanych komórkach docelowych, w których konwencjonalne typy AAV dawały niezadowalające wyniki, takich jak zakażenie HIV i limfocyty T, a także do badania wektorowego transferu genów do ludzkich komórek macierzystych i innych trudnych do zainfekowania komórek w hodowli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak projektować i ewoluować wysoce zróżnicowane biblioteki syntetycznych wektorów wirusów towarzyszących adenowirusom, wykorzystując kombinację fragmentacji i ponownego składania genów, a także jak przeprowadzać selekcję tych bibliotek w komórkach hodowlanych lub u zwierząt w celu wzbogacenia poszczególnych kapsydów o pożądane, specyficzne właściwości do zastosowania jako wektory transferu genów. Należy pamiętać, że praca z adenowirusami może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy podjąć wiele środków ostrożności.

engineering-evolution-synthetic-adeno-associated-virus-aav-gene

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej adeno-stowarzyszonego wirusa (AAV) poprzez mieszanie rodzin DNA

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

AAV generowanie biblioteki wyświetlania peptydów i późniejsza walidacja poprzez kodowanie kreskowe kandydatów o nowych właściwościach do tworzenia AAV nowej generacji.

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Poznaj metodę tasowania rodziny DNA do inżynierii wektorów AAV dla terapii genowej. Twórz biblioteki kapsydów z ponad milionem wariantów i selekcjonuj cząsteczki o pożądanych właściwościach w komórkach lub zwierzętach.

Inżynieria i ewolucja wektorów terapii genowej syntetycznego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) poprzez tasowanie rodziny DNA (Wideo) | JoVE Journal

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Przeglądaj więcej filmów