Name: Inżynieria i ewolucja wektorów terapii genowej syntetycznego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) poprzez tasowanie rodziny DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Poznaj metodę tasowania rodziny DNA do inżynierii wektorów AAV dla terapii genowej. Twórz biblioteki kapsydów z ponad milionem wariantów i selekcjonuj cząsteczki o pożądanych właściwościach w komórkach lub zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają wdzięczność za wyjątkowe wsparcie swojego laboratorium, członków zespołu oraz prowadzonych prac, udzielone przez Cluster of Excellence CellNetworks na Uniwersytecie w Heidelbergu, a także przez fundację Chica and Heinz Schaller (CHS). Z uznaniem odnotowujemy, że molekularna ewolucja AAV poprzez przetasowanie rodzin DNA stała się bardzo aktywną dziedziną od czasu naszej pierwotnej publikacji sprzed trzech lat i w związku z tym przepraszamy wszystkich autorów odpowiednich publikacji, których prac nie można było tutaj przytoczyć ze względu na ograniczenia miejsca.

<ol><li>Grimm, D., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+virus+evolution+to+vector+revolution%3A+use+of+naturally+occurring+serotypes+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+novel+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy.</a> Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+methods+for+gene+transfer+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes.</a> Methods. 28, 146-157 (2002).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
<li>Muller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+peptide+libraries+displayed+on+adeno-associated+virus+to+select+for+targeted+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.</a> Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+viral+vectors+with+modified+tropism%3A+the+adeno-associated+virus+display%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display.</a> Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).</li>
<li>Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22humanized%22+green+fluorescent+protein+cDNA+adapted+for+high-level+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A "humanized" green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells.</a> J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).</li>
<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatality+in+mice+due+to+oversaturation+of+cellular+microRNA%2Fshort+hairpin+RNA+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways.</a> Nature. 441, 537-541 (2006).</li>
<li>Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+hepatocyte+transduction+with+adeno-associated+virus+serotype+8+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice.</a> J. Virol. 79, 214-224 (2005).</li>
<li>Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shuffling+of+adeno-associated+virus+yields+functionally+diverse+viral+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny.</a> Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+selection+of+shuffled+AAV+genomes%3A+a+new+strategy+for+producing+targeted+biological+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles.</a> Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).</li>
<li>Ward, P., Walsh, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+AAV+Cap+sequences+alter+gene+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction.</a> Virology. 386, 237-248 (2009).</li>
<li>Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardium+tropic+adeno-associated+virus+%28AAV%29+evolved+by+DNA+shuffling+and+in+vivo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).</li>
<li>Perabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+engineering+of+a+gene+therapy+vector%3A+directed+evolution+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).</li>
<li>Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adeno-associated+virus+yields+enhanced+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors.</a> Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes%3A+vector+toolkit+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).</li>
<li>Kwon, I., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+gene+delivery+vectors%3A+molecular+engineering+and+evolution+of+adeno-associated+viral+vectors+for+enhanced+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer.</a> Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).</li>
<li>Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+evolution+with+adeno-associated+viral+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High.+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Artificial evolution with adeno-associated viral libraries.</a> Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).</li>
<li>McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+recombinant+adeno-associated+virus+%28scAAV%29+vectors+promote+efficient+transduction+independently+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis.</a> Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

W niniejszym opracowaniu przedstawiliśmy kluczowe kroki eksperymentalne oraz wytyczne dotyczące inżynierii kapsydu AAV za pomocą przetasowania rodzin DNA (DNA family shuffling) oraz ewolucji w komórkach lub w organizmach zwierzęcych. W istocie protokoły te są standaryzowanymi wersjami procedur, które po raz pierwszy opisaliśmy w dziedzinie AAV w 2008 roku3. Chociaż w licznych badaniach uzupełniających przeprowadzonych przez innych autorów zgłoszono wiele modyfikacji np.,10-13, nasze obecne ...

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenoimina (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td>New England Biolabs</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania z żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw z polimerazą Phusion II</td><td>Finnzymes</td><td>F-540S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw z polimerazą HotStar Hifi</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Finnzymes</td><td>F-540S (część zestawu)</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (25 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015 (część zestawu)</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4855.2</td><td></td></tr><tr><td>Sód ampicyliny</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM, 100 &amp;mu;l)</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Iodiksanol (OptiPrep)</td><td>Axis-Shield</td><td>1114739</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>107241</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mega-prep plazmidów</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentryfuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Optima L90K</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirówki Quick-Seal</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroporacji</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulserXcell</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>Vapo Protect</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td>BIOER</td><td>MB-102</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Analizator FACS</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Cytomics FC500 MLP</td><td></td></tr><tr><td>Komórki MegaX DH10B T1R</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td></td></tr><tr><td>Benzonukleaza</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>101695</td><td></td></tr><tr><td>Adenowirus-5</td><td>ATCC</td><td>VR-5</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid pBlueScript II KS(+)</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>212207</td><td></td></tr><tr><td>cap5F (miejsce Pac I na żółto, sekwencje specyficzne dla cap5 pogrubione): GACTCTTAATTAACAGGT&lt;strong&gt;ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC&lt;/strong&gt;</td><td>IDT</td><td>Starter customowy</td><td></td></tr><tr><td>cap5R (miejsce Asc I na zielono, sekwencje specyficzne dla cap5 pogrubione): GTGAGGGCGCGCC&lt;strong&gt;TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC&lt;/strong&gt;</td><td>IDT</td><td>Starter customowy</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (aav) za pomocą tasowania rodzin dna

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Wektory oparte na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) stanowią jedne z najskuteczniejszych i najbardziej obiecujących nośników dla terapeutycznego transferu genów u ludzi dzięki unikalnemu połączeniu korzystnych właściwości1. Należą do nich apatogenność wirusów dzikich oraz wysoce zaawansowane metodologie produkcji rekombinowanych wektorów o wysokim mianie, wysokiej czystości i jakości klinicznej2. Kolejną szczególną zaletą systemu AAV w porównaniu z innymi wirusami jest dostępność bogatego zbioru naturalnie występujących serotypów, które różnią się kluczowymi właściwościami, a jednocześnie mogą być łatwo przekształcane w wektory przy użyciu wspólnego protokołu1,2. Co więcej, szereg grup, w tym nasza, opracowało ostatnio strategie wykorzystania tych naturalnych wirusów jako matryc do tworzenia wektorów syntetycznych, które albo łączą cechy wielu serotypów wyjściowych, albo ulepszają właściwości pojedynczego izolatu. Odpowiednie technologie służące do osiągnięcia tych celów to albo przetasowanie rodzin DNA (DNA family shuffling)3, t.j. fragmentacja różnych genów kapsydu AAV, a następnie ich ponowne złożenie w oparciu o częściowe homologie (zazwyczaj &gt;80% dla większości serotypów AAV), albo prezentacja peptydów (peptide display)4,5, t.j. insercja zazwyczaj siedmiu aminokwasów do eksponowanej pętli kapsydu wirusowego, gdzie peptyd w idealnym przypadku pośredniczy w ponownym kierowaniu (re-targeting) do pożądanego typu komórek. Aby osiągnąć maksymalny sukces, obie metody są stosowane w sposób wysokoprzepustowy, w którym protokoły są skalowane w górę w celu uzyskania bibliotek obejmujących około miliona odrębnych wariantów kapsydu. Każdy klon składa się następnie z unikalnej kombinacji licznych wirusów rodzicielskich (podejście przetasowania DNA) lub zawiera charakterystyczny peptyd w tym samym szkielecie wirusowym (podejście prezentacji peptydów). Następnym, końcowym krokiem jest iteracyjna selekcja takiej biblioteki na komórkach docelowych w celu wzbogacenia populacji o poszczególne kapsydy spełniające większość lub idealnie wszystkie wymogi procesu selekcji. Ta ostatnia najlepiej łączy presję pozytywną, taką jak wzrost na określonym, interesującym nas typie komórek, z selekcją negatywną, na przykład eliminacją wszystkich kapsydów reagujących z przeciwciałami anty-AAV. Takie połączenie zwiększa szansę, że syntetyczne kapsydy, które przetrwają selekcję, będą odpowiadać potrzebom danego zastosowania w sposób, który prawdopodobnie nie zostałby znaleziony w żadnym naturalnie występującym izolacie AAV. Tutaj skupiamy się na metodzie przetasowania rodzin DNA jako teoretycznie i eksperymentalnie bardziej wymagającej z tych dwóch technologii. Opisujemy i demonstrujemy wszystkie kluczowe kroki generowania i selekcji przetasowanych bibliotek AAV (Rys. 1), a następnie omawiamy pułapki i krytyczne aspekty protokołów, o których należy wiedzieć, aby odnieść sukces w molekularnej ewolucji AAV.

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Wektory oparte na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) stanowią jedne z najskuteczniejszych i najbardziej obiecujących nośników w terapeutycznym transferze genów u ludzi ze względu na unikalne...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest stworzenie wysoce zróżnicowanej biblioteki syntetycznych kapsydów wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV), z której można wyselekcjonować cząsteczki o pożądanych właściwościach. Osiąga się to poprzez fragmentację, klonowanie i selekcję genów kapsydu AAV za pomocą kontrolowanego trawienia DNazą I, aby umożliwić ich późniejszy ponowny montaż w sekwencje chimeryczne za pomocą dwóch reakcji PCR. W drugim kroku otrzymany produkt PCR jest klonowany z powrotem do konstrukcji AAV zdolnej do replikacji, w celu uzyskania biblioteki plazmidowej zawierającej co najmniej 1 milion różnych genów kapsydu AAV.Następnie ta biblioteka plazmidów jest transfekowana do komórek 2 9 3 T wraz z pomocniczym plazmidem adenowirusowym w celu wytworzenia biblioteki wirusów chimerycznych, które mogą być następnie selekcjonowane na komórkach docelowych lub w organizmach zwierzęcych. Wyniki wykazują pomyślną inżynierię molekularną i ewolucję nowych syntetycznych wektorów A A V w oparciu o zwiększoną lub bardziej specyficzną ekspresję genu reporterowego w hodowlach komórkowych lub u dorosłych myszy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, taki

engineering-evolution-synthetic-adeno-associated-virus-aav-gene

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej adeno-stowarzyszonego wirusa (AAV) poprzez mieszanie rodzin DNA

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

AAV generowanie biblioteki wyświetlania peptydów i późniejsza walidacja poprzez kodowanie kreskowe kandydatów o nowych właściwościach do tworzenia AAV nowej generacji.

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Poznaj metodę tasowania rodziny DNA do inżynierii wektorów AAV dla terapii genowej. Twórz biblioteki kapsydów z ponad milionem wariantów i selekcjonuj cząsteczki o pożądanych właściwościach w komórkach lub zwierzętach.

Inżynieria i ewolucja wektorów terapii genowej syntetycznego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) poprzez tasowanie rodziny DNA (Wideo) | JoVE Journal

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Przeglądaj więcej filmów