Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest stworzenie wysoce zróżnicowanej biblioteki syntetycznych kapsydów wirusów adeno-zależnych (AAV), z której można wyselekcjonować cząsteczki o pożądanej właściwości. Osiąga się to poprzez wstępną fragmentację, klonowanie i selekcję genów kapsydu AAV za pomocą kontrolowanego trawienia DNAzą I, aby umożliwić ich późniejszy ponowny montaż w sekwencje chimeryczne za pomocą dwóch reakcji PCR. W drugim kroku otrzymany produkt PCR jest ponownie klonowany do konstrukcji AAV zdolnej do replikacji, w celu uzyskania biblioteki plazmidowej obejmującej co najmniej 1 milion różnych genów kapsydu AAV.

Następnie tę bibliotekę plazmidów transfekuje się do komórek 2 9 3 T wraz z plazmidem pomocniczym adenowirusowym w celu wytworzenia biblioteki wirusów chimerycznych, którą można następnie selekcjonować na komórkach docelowych lub w organizmach zwierzęcych. Wyniki wykazują sukces inżynierii molekularnej i ewolucji nowych syntetycznych wektorów A A V w oparciu o zwiększoną lub bardziej specyficzną ekspresję genu reporterowego w hodowlach komórkowych lub u dorosłych myszy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak prezentacja peptydów, jest fakt, że tasowanie rodzin DNA daje możliwość jednoczesnej zmiany i poprawy wielu cech kapsydu AV – od wiązania komórkowego i transportu wewnątrzkomórkowego, po rozpakowanie i ekspresję genów w jądrze komórkowym.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach terapii genowej i wirusologii, takich jak sposób uzyskania idealnego wektora dla danej aplikacji terapeutycznej lub sposób analizy domen kapsydu wirusowego odpowiedzialnych za określoną właściwość. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię wielu ludzkich chorób, w tym infekcji patogenami wirusowymi, ponieważ nasza metoda umożliwia ewolucję molekularną wektorów A V, które w sposób specyficzny i silny infekują wirusowe komórki docelowe, takie jak limfocyty T w przypadku HIV lub hepatocyty w przypadku wirusów zapalenia wątroby. Metoda ta może również dostarczyć wiedzy na temat biologii A V i może być wykorzystana do ulepszania wektorów AV w terapii genowej.

Metodę tę można z łatwością zastosować również do innych rodzin genów o znaczeniu podstawowym lub aplikacyjnym, takich jak geny kodujące fluorescencję zależną od dawki, trzy reportery, enzymy komórkowe lub białka zaangażowane w interferencję RNA. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy próbowaliśmy znaleźć odpowiedni wektor do transfuzji genów terapeutycznych do tkanek dorosłych myszy i zauważyliśmy, że wszystkie naturalnie występujące serotypy AV mają wady, takie jak wysoka rozpowszechnienie w populacji ludzkiej i w konsekwencji wysoka częstotliwość wykorzystywania odporności lub słaba wydajność in vivo mimo efektywnej transdukcji hepatocytów in vitro. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ fragmentacja genu kapsydu AV opartego na DNA oraz niektóre etapy produkcji biblioteki wirusowej są trudne do opanowania, gdyż wymagają doświadczenia i świadomości krytycznych etapów, aby ułatwić rutynowe przygotowanie wystarczających ilości różnych genów kapsydu wirusa towarzyszącego adenowirusom.

W celu przeprowadzenia tasowania DNA geny te są początkowo subklonowane do wspólnego szkieletu plazmidowego. Aby to osiągnąć, pożądane geny cap są najpierw amplifikowane metodą PCR z powszechnie dostępnych plazmidów AAV przy użyciu starterów cap F i cap R. Następnie geny cap są klonowane do plazmidu zaprojektowanego tak, aby zawierał specyficzne miejsca wiązania starterów oraz miejsca restrykcyjne. W tym przykładzie gen cap jest klonowany w miejsca PAC one i SC one, które występują w starterach użytych do amplifikacji cap oraz w plazmidzie biorcy, ale nie występują w większości AAV. Po utworzeniu zestawów plazmidów kodujących geny kapsydu AAV rozpoczyna się procedurę tasowania cap metodą PCR, amplifikując wybrane geny cap przy użyciu starterów T three i T seven.

Przygotować 50 µL reakcji PCR zawierającej 200 ng plazmidu cap, każdy primer w końcowym stężeniu 2 µM, 10 µL buforu High Five 5x oraz 1 µL polimerazy High Five. Reakcja ta pozwoli na uzyskanie około 3 µg produktu PCR, co wystarcza do przeprowadzenia do sześciu reakcji shufflingu, w zależności od liczby genów cap włączonych do biblioteki. Rozpocząć od 5 minut w 95 °C, a następnie przeprowadzić 40 cykli: 15 sekund w 94 °C, 30 sekund w 57 °C oraz 3 minuty w 68 °C, kończąc etapem końcowym trwającym 10 minut w 72 °C.

Po oczyszczeniu produktów PCR stosuje się kontrolowane trawienie DNA w celu utworzenia fragmentów genu cap do ponownego montażu w Kyra. Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest uzyskanie odpowiedniego zakresu długości trawionych fragmentów DNA genu cap niezbędnych do montażu w kyras; w tym celu przygotowujemy początkowo nadmiarowe ilości oczyszczonych genów cap, a następnie przeprowadzamy wiele równoległych reakcji w różnych warunkach. Aby przygotować jednorodne trawienie, wymieszać różne produkty PCR genu cap do uzyskania całkowitej ilości 4 µg w 54 µL wody, a następnie dodać 6 µL buforu reakcyjnego DS oraz 0,5 µL DNAs one do reakcji. Ostrożnie odwirować probówkę trzy razy i natychmiast umieścić ją w bloku grzejnym ustawionym na 25 °C.

Inkubuj tę pierwszą reakcję przez jedną minutę. Następnie przygotuj drugą reakcję trawienia, ale inkubuj ją w temperaturze 25 °C przez jedną minutę i 15 sekund. W ten sposób przygotuj wiele równoległych reakcji z czasami inkubacji od jednej do dwóch minut, zmieniając czas inkubacji w odstępach 15 sekund.

Zatrzymaj każdą reakcję, dodając 6 µL 25 mM EDTA. Krótko wymieszaj zawartość probówki w wirówce typu vortex i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Wielokrotne reakcje równoległe pozwolą uzyskać pięć próbek caps digested z DNAs, jedną dla różnych czasów inkubacji; oczyść fragmenty cap na standardowym żelu 1% AROS.

W idealnym przypadku, pomiędzy 100 a 500 parami zasad powinien być widoczny rozmaz (smear), jak pokazano w tym przykładzie dla czasów inkubacji wynoszących początkowo jedną minutę, 45 sekund lub dwie minuty. W procesie tasowania rodzin DNA fragmenty nakrywek są najpierw składane w sekwencje o pełnej długości za pomocą reakcji PCR, w której ulegają one samopotęgowaniu w oparciu o częściowe homologie. Przygotować reakcję o objętości 50 µL zawierającą 500 ng oczyszczonych fragmentów, 10 µL 10 x buforu do fuzji, 1 µL 10 mM dNTPs, 1,5 µL DMSO oraz 0,5 µL polimerazy do fuzji.

Dwie polimerazy inkubuje się przez 30 sekund w temperaturze 98 °C, a następnie przeprowadza 40 cykli obejmujących 10 sekund w 98 °C, 30 sekund w 42 °C oraz 45 sekund w 72 °C, po czym następuje końcowy etap 10 minut w 72 °C. Następnie, w celu późniejszego klonowania, amplifikuje się zrekonstruowane geny kapsydu za pomocą drugiej reakcji PCR, stosując primery wiążące się z konserwowanymi sekwencjami flankującymi. Na przykład, dla zestawów SAF i SAR lub CUF i CUR, przygotowuje się reakcję o objętości 50 µL zawierającą 2 µL produktu pierwszej reakcji PCR, każdy primer w stężeniu końcowym 2 µM, 0,5 µL chlorku magnezu, 10 µL buforu 5x high-FI oraz 1 µL polimerazy high-FI.

Zaleca się przeprowadzenie od 16 do 24 reakcji PCR, aby zapewnić wystarczająco wysoką wydajność dla późniejszego klonowania. Po połączeniu produktów PCR i oczyszczeniu pełnowymiarowego prążka kapsydu, następnym krokiem jest trawienie oczyszczonej puli genów kapsydu enzymami PAC one i SC one w celu klonowania do plazmidy AAV zdolnej do replikacji. Plazmida biorca zawiera odwrócone powtórzenia końcowe AAV flankujące gen rep AAV two pod kontrolą promotora AAV P five, PAC one oraz SC one.

Miejsca restrykcyjne poniżej sekwencji rep umożliwiają klonowanie w odpowiedniej ramce odczytu puli przetasowanych genów cap. Miejsca wiązania starterów LSE zaznaczone strzałkami są przydatne do sekwencjonowania genu cap; połącz fragmenty cap i odpowiednio pocięty szkielet plazmidu biorcy w stosunku molowym 3:1. Przygotuj master mix o całkowitej objętości 40 µL, wystarczający na 20 transformacji, z końcowym stężeniem DNA wynoszącym 15 ng/µL.

Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C. Następnego dnia przeprowadzić transformację mieszaniny ligacji do komórek E. coli. Wymieszać 2 µL reakcji ligacji z 30 µL elektrokompetentnych komórek E. coli i przenieść do uprzednio schłodzonych kuwet do elektroporacji. Przeprowadzić elektroporację na lodzie przy parametrach 1,8 kV, 200 Ω i 25 µF. Stała czasowa powinna wynosić około 5 ms. Natychmiast dodać 1 mL uprzednio ogrzanego pożywki SOC i przenieść do kolby o pojemności 250 ml.

Przeprowadzenie 20 takich elektroporacji pozwoli na uzyskanie biblioteki o różnorodności wynoszącej około 1 × 10⁶ różnych klonów. Do połączonych transformacji należy dodać taką samą objętość uprzednio ogrzanej pożywki SOC, a następnie inkubować przy 37 °C i 180 RPM przez jedną godzinę. Następnie 40 ml połączonych transformacji należy przenieść do 800 ml pożywki LB z ampicyliną i inkubować przez kolejne 16 godzin w tych samych warunkach; następnie plazmidowe DNA biblioteki jest oczyszczane przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu.

Produkcję biblioteki wirusowej rozpoczyna się od transfekcji komórek HEC 2 9 3 T biblioteką a a v. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej komórki HEC 2 9 3 T na 10 szalkach o wymiarach 15 cm² i hoduj je przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Dla każdej transfekcji przygotuj dwie następujące mieszaniny odczynników w dwóch oddzielnych probówkach. Poniższe ilości podano na 10 płytek w pierwszej probówce.

Wymieszać 7,9 milliliters chlorku sodu oraz DNA, a następnie dodać wodę do uzyskania całkowitej objętości 15,8 milliliters. Do drugiej probówki dodać 3,52 milliliters polietylenopoliaminy, 7,9 milliliters chlorku sodu oraz 4,38 milliliters wody. Połączyć obie mieszaniny, wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie równomiernie rozdzielić roztwór do każdej szalki z komórkami 2 9 3 T. Inkubować w temperaturze 37 degrees Celsius.

Po 48 godzinach można zebrać bibliotekę wirusową. Zdrapać komórki do medium, połączyć komórki ze wszystkich szalek w jednej probówce i wirować przy 1200 RPM przez 15 minut. Osad komórkowy resuspendować w sześciu mililitrach buforu do lizy, a następnie poddać pięciu cyklom zamrażania i rozmrażania; po pięciu cyklach zamrażania i rozmrażania inkubować z Ben Nase przez jedną godzinę w 37 stopniach Celsjusza.

Następnie odwiruj szczątki komórkowe przy 3 750 RPM przez 20 minut. Przygotuj gradient do oczyszczania wirusa, używając pipety Pasteura do dodania pięciu mililitrów zawiesiny wirusa do probówki wirówkowej Beckman Quicks seal, a następnie po 1,5 mililitra roztworów idal o stężeniach 15%, 25% i 40%. Uzupełnij gradient buforem lizującym i wiruj w ultrawirówce przy 50 000 K przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu ultrawirowania wyjmij probówkę z rotora i przemyj jej zewnętrzną powierzchnię 70% etanolem. Wbij igłę w górną część probówki w celu wentylacji, a następnie za pomocą drugiej igły pobierz 1,2 mililitra frakcji 40% IOL. Należy uważać, aby nie pobrać materiału z frakcji 25%, ponieważ zawiera ona puste pęcherzyki.

Kapsydy AAV. Poszczególne klony z oryginalnej biblioteki plazmidów są analizowane pod kątem funkcjonalności i różnorodności poprzez wykorzystanie ich do produkcji rekombinantów. Następnie komórki hodowlane lub zwierzęta są zakażane różnymi ilościami oczyszczonego wirusa z wektorów AAV wykazujących ekspresję genu reporterowego, a następnie określa się wydajność transdukcji.

Przedstawione tutaj wyniki mikroskopii fluorescencyjnej pochodzą z trzech ludzkich linii komórkowych zainfekowanych pięcioma różnymi rekombinowanymi wektorami AAV wykazującymi ekspresję YFP, stworzonymi z przetasowanych genów cap. Alternatywną metodą analizy wydajności transdukcji jest pomiar ekspresji fluorescencyjnego genu reporterowego za pomocą cytometrii przepływowej (FACS). Rycina ta przedstawia typowy wynik dla czterech typów komórek: ludzkich komórek nerek, ludzkich komórek szyjki macicy, mysich fibroblastów oraz ludzkich limfocytów T, zainfekowanych 18 różnymi rekombinowanymi wektorami AAV wykazującymi ekspresję YFP, stworzonymi z genów cap losowo wybranych z oryginalnej biblioteki.

Ekspresję YFP zakodowano kolorystycznie w celu ułatwienia wizualizacji. Przedstawione obrazy ukazują procenty komórek transdukowanych, gdzie kolor czarny oznacza 0%, a biały najwyższą wartość zmierzoną dla każdego klonu typu komórkowego; czerwony klon B2 jest przykładem klonu o niskiej ogólnej skuteczności, co jest spodziewane w przypadku niepoddanych selekcji kapsydów. Bibliotekę wirusową można następnie przesiewać w celu wyłonienia pojedynczych cząsteczek wykazujących większość lub wszystkie pożądane właściwości w danej linii komórkowej lub w organizmach zwierzęcych w procesie selekcji.

W hodowlach komórkowych komórki są najpierw koinfekowane różnymi alikwotami biblioteki oraz wirusem ENO five w celu wsparcia wzrostu a a v, następnie komórki są zbierane, a namnożone a a v jest ekstrahowane i wykorzystywane do ponownej infekcji nowych komórek. Wyznaczenie optymalnych stosunków adenowirusów a a v do koinfekcji komórek jest istotne, a dobrym miernikiem skutecznej infekcji arius jest wystąpienie efektów cytopatycznych trzy dni po inokulacji wirusem, objawiające się zaokrąglaniem i odrywaniem komórek; na tej rycinie panel w lewym górnym rogu przedstawia komórki nieinfekowane, podczas gdy pozostałe panele pokazują komórki zainfekowane wskazanymi ilościami cząstek adenowirusa na komórkę. Innym użytecznym wskaźnikiem infekcji i namnażania a a v jest detekcja białek kapsydu metodą western blotting z użyciem przeciwciała B one, które rozpoznaje wysoce konserwowany epitop kapsydu a a v.

Lewa plama przedstawia komórki coinfekowane różnymi objętościami w mikrolitrach biblioteki a a V oraz wirusa pomocniczego ENO. Dwie pierwsze ścieżki są dobrymi przykładami warunków dających ledwie wykrywalną ekspresję białka a a v, co wskazuje na wystarczającą, ale nie nadmierną infekcję i amplifikację a a v, a tym samym pożądaną silną korelację genotypu z fenotypem. W związku z tym do reinfekcji świeżych komórek wykorzystano 0,11 lub 10 mikrolitrów tych supernatantów.

Wyniki analizy western blot przedstawiono w komórkach po prawej stronie. W LA c przeprowadzono infekcję samym v jako kontrolę negatywną. Kluczowe jest również monitorowanie różnorodności biblioteki podczas powtarzanych rund infekcji za pomocą sekwencjonowania DNA.

Na tym schemacie przedstawiono porównania sekwencji białek klonów AAV z biblioteki opartej na AAV 2, 8 i 9 przed i po selekcji; sekwencje powyżej czerwonej linii reprezentują rodzice AAV. Fioletowe strzałki wskazują zdarzenia rekombinacji homologicznej. Czerwona strzałka oznacza crossing-over między AAV 2 a AAV 9, odnotowany we wszystkich wyselekcjonowanych klonach. W przypadku selekcji in vivo, bibliotekę AAV wstrzykuje się zwierzętom, a następnie sekwencje odzyskuje się z komórek lub tkanek docelowych za pomocą PCR, po czym są one ponownie klonowane i pakowane do nowej rundy infekcji.

Przedstawiono tutaj przykład uratowania pomyślnie zainfekowanych klonów AAV z wątrób myszych tydzień po obwodowej infuzji biblioteki. Ścieżka pierwsza pokazuje oczekiwany prążek o wielkości 2,2 kilobazy, natomiast ścieżka druga to kontrola bez matrycy; wielkości prążków markera DNA na ścieżce M podano w kilobazach. Niezależnie od procedury selekcji, wzbogacone warianty kapsydu muszą zostać ostatecznie zwalidowane w odpowiednich systemach.

Przedstawiono tutaj przykład lepszej wydajności wzbogaconej chimery AAV w hodowlach komórkowych. Ciemniejsze kolory wskazują na wyższą zakaźność w przeliczeniu na liczbę cząsteczek, a zatem klonu. AAV-DJ wykazuje wyższą skuteczność niż zbiór ośmiu naturalnych typów dzikich AAV w szerokim zakresie linii komórkowych.

Na koniec przedstawiono analizę wybranego klonu AAV KYMERA w wątrobie myszy. AAV DN został wyselekcjonowany na komórkach hepatoma, a następnie wykorzystany do produkcji rekombinowanych wektorów wykazujących ekspresję lucyferazy, co zaprezentowano na reprezentatywnych myszach (trzy na grupę) tydzień po obwodowej infuzji równych dawek tego wektora lub kontroli opartej na dzikim typie AAV8, jednym z najsilniejszych znanych naturalnych izolatów w wątrobie myszy. Należy zauważyć, że choć klon AAV DN daje nieco niższą ogólną ekspresję w wątrobie, jest on bardziej specyficzny dla tego organu, ponieważ wykazuje znacznie mniejszą ekspresję pozatarczycową w tkankach pozawątrobowych po skorygowaniu poziomów ekspresji w wątrobie za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Technikę tę, przy prawidłowym przeprowadzeniu, można zrealizować w ciągu jednego tygodnia, zaczynając od amplifikacji genów kapsydu AV, a kończąc na utworzeniu biblioteki wirusowej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że przedstawiony tutaj protokół został opracowany na podstawie naszych doświadczeń w selekcji naturalnych serotypów AV i jest wysoce prawdopodobne, że niektóre z warunków będą wymagały dostosowania i optymalizacji przez innych użytkowników tworzących własne biblioteki niestandardowe. Poza tą procedurą, w celu wygenerowania bibliotek o wysokiej różnorodności lub dalszej poprawy właściwości kapsydów stworzonych i wzbogaconych za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling), można zastosować inne metody, takie jak ukierunkowana ekspozycja peptydów z wykorzystaniem systemu AGENESIS lub randomizacja oparta na technice PCR.

Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie wirusowej dostawy genów do eksploracji strategii terapeutycznych w chorobach i związanych z nimi komórkach docelowych, w których konwencjonalne typy AAV dawały niesatysfakcjonujące wyniki, takich jak zakażenia HIV i limfocyty T, a także do badania wektorowego transferu genów do ludzkich komórek macierzystych i innych trudnych do zainfekowania komórek w hodowli. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak projektować i ewoluować wysoce zróżnicowane biblioteki syntetycznych wektorów wirusów adeno-zależnych, wykorzystując kombinację fragmentacji i ponownego składania genów, a także w jaki sposób przeprowadzać selekcję tych bibliotek w komórkach hodowlanych lub u zwierząt, aby wzbogacić poszczególne kapsydy o pożądane specyficzne właściwości do zastosowań jako wektory transferu genów. Należy pamiętać, że praca z adenowirusami może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zachować wiele środków ostrożności.