Name: Podstawowy system hodowli neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki pospolitej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Poznaj metodę hodowli neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa HSV-1. Technika obejmuje izolację neuronów z ganglionów szyjnych szczurów, ustanowienie zakażenia latentnego oraz indukcję reaktywacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy recenzentom za ich wnikliwe sugestie, które pomogły ulepszyć niniejszy manuskrypt. Praca ta była wspierana przez granty przyznane MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) oraz IM (AI073898, GM056927) przez NIH. MK otrzymał częściowo wsparcie z grantu szkoleniowego NIH (5T32 AI007180).

<ol><li>Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+duration+of+growth+factor+signaling+through+receptor+tyrosine+kinases+regulates+HSV-1+latency+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons.</a> Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).</li>
<li>Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+MI+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).</li>
<li>Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+PC+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).</li>
<li>Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrice%2C+JP+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+infection+of+isolated+autonomic+neurons+in+culture%3A+viral+replication+and+spread+in+a+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network.</a> Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).</li>
<li>Tomishima, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).</li>
<li>Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+glycoprotein+E+is+required+for+axonal+localization+of+capsid%2C+tegument%2C+and+membrane+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins.</a> J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).</li>
<li>Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+us11+gene+product+with+the+cellular+kinesin+light-chain-related+protein+PAT1+results+in+the+redistribution+of+both+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides.</a> J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).</li>
<li>Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1(2005).</li>
<li>Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+thiourea+compounds+that+inhibit+herpes+simplex+virus+type+1+DNA+cleavage+and+encapsidation%3A+resistance+maps+to+the+UL6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene.</a> J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).</li>
<li>Newcomb, W. W., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+herpes+simplex+virus+replication+by+WAY-150138%3A+assembly+of+capsids+depleted+of+the+portal+and+terminase+proteins+involved+in+DNA+encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation.</a> J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).</li>
<li>Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+immediate-early+and+early+gene+expression+during+reactivation+from+latency+under+conditions+that+prevent+infectious+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production.</a> J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).</li>
<li>Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+promoter+activity+during+latency+establishment%2C+maintenance+and+reactivation+in+primary+dorsal+root+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro.</a> J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).</li>
<li>Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+induce+reactivation+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+a+latency-associated+transcript-+independent+manner+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells.</a> J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).</li>
<li>Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxed+repression+of+herpes+simplex+virus+type+1+genomes+in+murine+trigenminal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons.</a> J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).</li>
<li>Harris, R. A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+latency+in+vitro+by+the+herpes+virus+type+1+mutant+in1918%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918.</a> J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).</li>
<li>Wagner, E. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+investigation+of+herpes+simplex+virus+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental investigation of herpes simplex virus latency.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).</li>
<li>Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+and+functional+comparison+of+the+latency-associated+transcript+promoters+of+herpes+simplex+virus+type+1+strains+KOS+and+McKrae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae.</a> J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).</li>
<li>Stroop, W. G., Banks, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS-63+does+not+cause+acute+or+recurrent+ocular+disease+and+does+not+reactivate+ganglionic+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo.</a> Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).</li>
<li>Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+latent+herpes+simplex+virus+type+1+genome+copy+number+in+individual+neurons+is+virus+strain+specific+and+correlates+with+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation.</a> J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).</li>
<li>Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+molecular+analysis+of+the+avirulent+wild-type+herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS.</a> J. Virol. 58, 203-211 (1986).</li>
<li>Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor-dependence+of+herpes+simplex+virus+latency+in+peripheral+sympathetic+and+sensory+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro.</a> J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).</li>
<li>Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+vestibular+ganglion+neurons+demonstrate+latent+herpes+simplex+type+I+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation.</a> Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).</li>
<li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Ten system hodowli i infekcji pierwotnych neuronów stanowi prostą i skuteczną metodę badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw latencji i reaktywacji HSV-1. System ten wiernie odwzorowuje uznane cechy latencji zdefiniowane zarówno w infekcjach u ludzi, jak i w modelach zwierzęcych. Gdy wirus znajduje się w stanie latencji w hodowlach SCG, nie można wykryć cząstek zakaźnych ani produktów litycznych genów wirusowych. Jedynym wykrywanym produktem genu wirusowego w neuronach z latentną infekcją je...

<table><tbody><tr><td>70&amp;mu;filtr nylonowy (sito do komórek)</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1x roztwór Hanksa&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;) </td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>bez CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; oraz MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>1x podłoże Minimum Essential Media (MEM) </td><td>Invitrogen</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>5-fluoro-2-&amp;rsquo;-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>przygotować roztwór stokowy o stężeniu 20 mM w 1x MEM; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>płytki TC z 96 płaskimi dołkami</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>acyklowir </td><td>Calbiochem</td><td>114798</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 31 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Afidikolina </td><td>Calbiochem</td><td>178273</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Suplement B-27 </td><td>Invitrogen</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>przygotować roztwór stokowy o stężeniu 10 mg/ml w HBSS&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td>przygotuj 40% roztwór zapasowy w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; sterylizować przez filtr &amp;i przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>L-glutamina </td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Laminina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1 mg/ml w H2O&lt;sub&gt;2O&lt;/sub&gt;; szybkie zamrażanie 20 &amp;#x03BC;alikwoty &amp;przechowywać w temperaturze -80°C&amp;#x00B0;C; rozcieńczyć do 2 &amp;#x03BC;g/ml stężenie robocze w sterylnym H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;z pożywki L-15 </td><td>Invitrogen</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów </td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT.5017</td><td>przygotować 50 &amp;#x03BC;roztwór stokowy o stężeniu g/ml w HBSS&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;; przechowywać w temperaturze -80°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>pożywka Neurobasal </td><td>Invitrogen</td><td>12348</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosfonooctowy (PAA) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6909</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 75 mg/ml w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Hydrobromek poli-D-lizyny </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Kolagen z ogonów szczura </td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>Stężenie różni się w zależności od partii produktu; przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C i rozcieńczyć do stężenia roboczego 0,66 mg/ml w sterylnej H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Trichostatyna A </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>przygotować roztwór stokowy 1 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Trypsyna 2,5% </td><td>Invitrogen</td><td>15090-04</td><td></td></tr></tbody></table>

system hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) wywołuje dożywotną infekcję latentną w neuronach obwodowych. Ten latentny rezerwuar jest źródłem nawracających zdarzeń reaktywacji, które zapewniają transmisję wirusa i przyczyniają się do rozwoju choroby klinicznej. Obecne leki przeciwwirusowe nie wpływają na rezerwuar latentny, a szczepionki nie istnieją. Podczas gdy molekularne szczegóły replikacji litycznej są dobrze opisane, mechanizmy kontrolujące latencję w neuronach pozostają nieznane. Nasza obecna wiedza na temat latencji pochodzi z badań in vivo z wykorzystaniem modeli małych zwierząt, które były niezbędne do określenia wymagań genetycznych wirusa oraz roli odpowiedzi immunologicznych. Niemniej jednak w żywych zwierzętach nie jest możliwe odróżnienie specyficznych efektów wpływających na relację wirusa z neuronem od bardziej ogólnych konsekwencji infekcji pośredniczonych przez komórki odpornościowe lub nie-neuronalne komórki wspierające. Ponadto eksperymenty na zwierzętach są kosztowne, czasochłonne i ograniczone pod kątem dostępnych opcji manipulowania procesami gospodarza. Aby pokonać te ograniczenia, niezbędny jest system oparty wyłącznie na neuronach, który odtwarzałby charakterystykę latencji i reaktywacji in vivo, oferując jednocześnie zalety hodowli tkankowej w zakresie homogeniczności i dostępności.
Przedstawiamy tutaj model in vitro z wykorzystaniem hodowli pierwotnych neuronów sympatycznych z górnych zwojów szyjnych szczura (SCG) (Ryc. 1) do badania latencji i reaktywacji HSV-1, który spełnia większość, jeśli nie wszystkie, pożądane kryteria. Po usunięciu komórek nieneuronalnych, niemal jednorodne hodowle neuronów TrkA+ są zakażane HSV-1 w obecności acyklowiru (ACV) w celu zahamowania replikacji litycznej. Po usunięciu ACV efektywnie ustanawiane są nieproduktywne infekcje HSV-1, które wiernie wykazują uznane cechy latencji. Co istotne, lityczne mRNA, białka i wirusy zakaźne stają się niewykrywalne, nawet w przypadku braku selekcji, natomiast ekspresja transkryptu związanego z latencją (LAT) utrzymuje się w jądrach neuronów. Genomy wirusowe są utrzymywane w średniej liczbie 25 kopii na neuron i mogą zostać indukowane do replikacji produktywnej poprzez zakłócenie sygnalizacji PI3-Kinazy / Akt lub proste odstawienie czynnika wzrostu nerwów1. Rekombinowany HSV-1 kodujący EGFP połączone z wirusowym białkiem litycznym Us11 zapewnia funkcjonalny marker replikacji wynikającej z reaktywacji w czasie rzeczywistym, który można łatwo skwantyfikować. Oprócz zabiegów chemicznych, w systemie tym można z powodzeniem zastosować metodologie genetyczne, takie jak interferencja RNA lub dostarczanie genów za pomocą wektorów lentiwirusowych, co umożliwia badania mechanistyczne, które są bardzo trudne, jeśli nie niemożliwe, do przeprowadzenia na zwierzętach. Podsumowując, system latencji / reaktywacji HSV-1 oparty na SCG stanowi potężne i niezbędne narzędzie do odkrycia molekularnych mechanizmów kontrolujących latencję i reaktywację HSV-1 w neuronach – odnośnej długotrwałej zagadki w wirusologii, której rozwiązanie może dostarczyć nowych spostrzeżeń w opracowywaniu nowych terapii celujących w latentny rezerwuar herpeswirusa.

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Wirus opryszczki typu 1 (HSV-1) wywołuje dożywotną infekcję latentną w neuronach obwodowych. Ten latentny rezerwuar jest źródłem nawracających...

Celem niniejszego eksperymentu jest zademonstrowanie, w jaki sposób pierwotny układ kultur neuronów może zostać wykorzystany do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki prostego. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wyizolowanie neuronów z zwojów szyjnych górnych embrionów szczurów rasy RA, a następnie hodowlę neuronów wyizolowanych z dysocjowanych zwojów po usunięciu komórek nieneuronalnych. Latentna infekcja HSV jest ustanawiana przy użyciu wirusa EGFP do zakażenia neuronów w obecności inhibitora replikacji litycznej.Kolejnym krokiem jest indukowanie reaktywacji latentnych zakażonych kultur. Na koniec wydajność reaktywacji ocenia się poprzez monitorowanie ekspresji EGFP w czasie. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, w jaki sposób różne szlaki sygnałowe neuronów regulują latencję i reaktywację wirusa herpes simplex, z wykorzystaniem inhibitorów chemicznych, interferencji RNA oraz dostarczania genów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona szczegółowe badania oddziaływań regulujących latencję wirusa prostego opuszki w neuronach gospodarza na poziomie molekularnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w d

a-primary-neuron-culture-system-for-study-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System kultury neuronów pierwotnych do badania oporności i reaktywacji wirusa opryszczki pospolitej

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Większość badań nad opryszczkowym zapaleniem rogówki wykorzystuje model infekcji pierwotnej. Jednakże infekcja pierwotna HSV-1 zazwyczaj nie prowadzi do rozwoju choroby u ludzi. W niniejszej pracy opisujemy model nawrotowy opryszczkowej choroby rogówki, który dokładniej naśladuje przebieg choroby u ludzi.

Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Źródło: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017)W niniejszym filmie przedstawiono zakażanie komórek ssaków w fazie stacjonarnej wirusem HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), a następnie replikację genomu wirusowego przy użyciu aparatu replikacyjnego gospodarza i wirusa. Syntetyczny analog nukleozydu zostaje wbudowany w nowo syntetyzowane wirusowe DNA w celu oznakowania replikujących się genomów,...

Znakowanie replikujących się genomów HSV-1 analogiem nukleozydowym

Obrazowanie żywych komórek zakażeń wirusem opryszczki umożliwia analizę dynamicznych zdarzeń transportu kierowanego i rozprzestrzeniania się międzykomórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodologie, które wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa eksprymujące fluorescencyjne białka fuzyjne, aby ułatwić wizualizację zespołów wirusowych podczas infekcji neuronów pierwotnych.

Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

W neurobiologii i neurowirusologii kluczowe jest posiadanie niezawodnego, powtarzalnego systemu in vitro, który służy jako model translacyjny dla tego, co dzieje się in vivo w ludzkich neuronach. Protokół ten opisuje, jak hodować i różnicować ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y w żywotne neurony do wykorzystania w zastosowaniach in vitro.

Różnicowanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Poznaj metodę hodowli neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa HSV-1. Technika obejmuje izolację neuronów z ganglionów szyjnych szczurów, ustanowienie zakażenia latentnego oraz indukcję reaktywacji.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Przeglądaj więcej filmów