System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Celem niniejszego eksperymentu jest zaprezentowanie, w jaki sposób pierwotny system hodowli komórkowej neuronów może zostać wykorzystany do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej. Osiąga się to poprzez wyizolowanie neuronów z zwojów szyjnych górnych embrionów szczurów rasy RA, a następnie hodowlę neuronów wyizolowanych ze zwojów poddanych dysocjacji, po eliminacji komórek nieneuronalnych. Latentna infekcja HSV jest indukowana z użyciem wirusa EGFP w celu zainfekowania neuronów w obecności inhibitora replikacji litycznej.

Kolejnym krokiem jest indukowanie reaktywacji latentnych kultur zainfekowanych. Na koniec wydajność reaktywacji ocenia się poprzez monitorowanie ekspresji EGFP w czasie. W rezultacie można uzyskać dane pokazujące, w jaki sposób różne szlaki sygnalizacyjne neuronów regulują latencję i reaktywację wirusa opryszczki poprzez zastosowanie inhibitorów chemicznych, interferencji RNA oraz dostarczania genów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona szczegółowe badania interakcji regulujących latencję wirusa opaczonego w neuronach gospodarza na poziomie molekularnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie latencji HSV, takie jak: jakie sygnały działają represyjnie na genom latentny i w jaki sposób na poziomie molekularnym wyzwalana jest reaktywacja? W neuronach metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat latencji HSV-1.

Metodę tę można zastosować również do innych neurotropowych wirusów alfaherpes. Procedurę zademonstrują Marigo Kochi oraz Julian Kim, doktoranci w naszych laboratoriach. Neurony z yczennych zwojów szyjnych (SCG) do niniejszego protokołu izoluje się z płodów szczura w dniu 21. ciąży (E 21), wyjętych z macicy ciężarnej samicy szczura. Pracując pod wyciągiem sekcyjnym, należy uśmiercić każdego płodu, przecinając nożyczkami podstawę szyi tuż nad barkami, oddzielając głowę od tułowia. Aby odsłonić zwoje, należy użyć igieł 23G do przypięcia głowy w trzech miejscach, kładąc ją stroną szyi do góry.

W pierwszej kolejności należy przypiąć rdzeń kręgowy. Po drugie, należy odciągnąć skórę przednią w stronę nosa i ją przypiąć, a po trzecie przypiąć przełyk i tchawicę, odsuwając je od karku. Zlokalizuj SCG, odnajdując miejsce rozwidlenia tętnicy szyjnej.

Tętnica szyjna jest strukturą parzystą. Po obu stronach szyi znajdują się dwa rozwidlenia, zatem w każdym organizmie występują dwa SCG. SCG znajduje się bezpośrednio pod odgałęzieniem.

Oddziel SCG od tętnic, rozciągając rozwidlenie za pomocą obu końców. SCG jest półprzezroczyste i bezbarwne w porównaniu do nieprzezroczystej, żółtawej tkanki tłuszczowej otaczającej rozwidlenie. Umieść zwoje w 12 mililitrach L 15.

Pożywka uzupełniona glukozą w 15 mililitrowej probówce stożkowej na lodzie. Po zebraniu wszystkich SCG z embrionów i ich delikatnym wyciągnięciu, wiruj zwoje przez jedną minutę przy 600 RPM, a następnie usuń nadmiar pożywki Reese.

Zzawiesić zwoje w jednym mililitrze pożywki L 15 zawierającej trypsynę i kolagenazę. Inkubować przez 24 minuty w temperaturze 37 °C.

Mieszaj co osiem minut. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki morskiej, aby inaktywować trypsynę, i wiruj przez jedną minutę. Przy 600 RPM usuń jak najwięcej pożywki z trypsyną i kolagenazą, a następnie przemyj zwoje 10 mililitrami pożywki C, wirując przez jedną minutę przy 600 RPM.

Powtórz to płukanie raz. Usuń medium do płukania i resuspenduj zwoje w 1 mL medium C, aby je rozdzielić, wykonując triturację za pomocą igły 21 G przymocowanej do strzykawki 5 mL przez maksymalnie 15 cykli zasysania i wypychania. Zakończ triturację, używając igły 23 G, aż większość grudek zostanie rozdzielona.

Usuń wszelkie pozostałe skupki komórek, filtrując zdysocjowane neurony przez nylonowy filtr o oczkach 70 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Pobierz 10 µl alikwot przefiltrowanej zawiesiny komórkowej i wymieszaj z barwnikiem trypan blue, aby określić liczbę żywych komórek. Policz liczbę komórek, które aktywnie wykluczają barwnik, używając komory liczniczej (hemocytometru).

Następnie do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek, uprzednio pokrytej kolagenem i lamininą, nanieś 5 000 do 6 000 żywych komórek w 100 µL pożywki C zawierającej 50 ng/mL czynnika wzrostu nerwów (NGF). Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia (dzień pierwszy in vitro lub DIV 1) sprawdź, czy neurony prawidłowo przyległy do podłoża i czy pojawiły się pierwsze wypustki aksonalne.

Zastąp pożywkę C w studzienkach 50 µL pożywki neurobasalnej lub NBM zawierającej NGF, Acho oraz 5-fluorodeoksyurydynę. Wymieniaj pożywkę w jednym rzędzie na raz, aby zapobiec wysychaniu komórek. Inkubuj hodowle w temperaturze 37 °C przez pięć dni.

Monitoruj hodowlę codziennie, aby potwierdzić śmierć komórek nieneuronalnych i wzrost neuronów. Rozpoczynając tę część procedury w szóstym dniu in vitro, sprawdź, czy większość nieneuronalnych komórek podporowych została wyeliminowana. Niezwykle ważne jest, aby w każdym momencie minimalizować zbędne manipulacje fizyczne neuronami.

Wymiana pożywki musi być przeprowadzona bardzo delikatnie i powoli, w przeciwnym razie powstały stres mechaniczny może wpłynąć na żywotność neuronów. Do obecnej pożywki w każdej studzience należy dodać acyklowir lub CV do stężenia końcowego 100 µM. CV należy dodawać powoli i delikatnie, aby siła mechaniczna nie wpłynęła negatywnie na komórki w dniu następnym.

W siódmym dniu in vitro (DIV 7) zainfekuj kultury SCG rekombinowanym wirusem HSV-1 wykazującym ekspresję reportera EGF połączonego z wirusowym białkiem litycznym US 11, przy wielokrotności zakażenia (MOI) od 1 do 2. Dodaj rozcieńczonego wirusa bezpośrednio do istniejącego medium w dołku. Uwzględnij kontrolę pozornej infekcji oraz infekcję lityczną.

Kontrola pozytywna w pożywce bez CV. Pozostawić infekcję na dwie do trzech godzin w temperaturze 37°C. Następnie zastąpić pożywkę do infekcji świeżą pożywką NBM zawierającą NGF oraz CV. Niezwykle ważne jest zachowanie szczególnej ostrożności podczas wymiany pożywki do infekcji. Przechylić płytkę w swoją stronę i powoli usunąć pożywkę z dna studzienki.

Następnie skieruj końcówkę pipety w stronę ścianki dołka, a nie na jego dno, i pozwól, aby pożywka powoli spłynęła na komórki. Wymieniaj pożywkę w jednym rzędzie na raz, aby zapobiec wysychaniu komórek. Przenieś hodowle z powrotem do inkubatora, obchodząc się z nimi jak najdelikatniej, aby nie upośledzić ich zdolności do podtrzymywania latencji HSV one.

Kultury należy utrzymywać przez sześć dni w temperaturze 37°C, w czasie którego wirus przejdzie w stan latencji. W tym okresie należy używać mikroskopu fluorescencyjnego do monitorowania ekspresji us 11 EGFP jako wskaźnika replikacji litycznej.

Zgodnie z oczekiwaniami, w kontroli z infekcją pozorowaną nie powinna wystąpić ekspresja GFP. S 11 EGFP powinno być wykrywalne wyłącznie w próbkach zainfekowanych. Dołki kontroli pozytywnej bez zastosowania CV wskazują na pomyślną infekcję pierwotną i produktywną replikację lityczną.

Aby ocenić reaktywację w 14. dniu in vitro (DIV 14), ostrożnie zastąp medium zawierające CV świeżym medium bez CV, postępując jak poprzednio. Skieruj końcówkę pipety w stronę ścianki studzienki, a nie na jej dno, i pozwól medium łagodnie spłynąć na komórki, jeśli jest to odpowiednie. Uwzględnij zmienne farmakologiczne lub biologiczne, takie jak LY 2 9 0 0 4 w stężeniu 20 micromolar.

W kulturach z latentną infekcją traktowanych A CV nie powinna być wykryta ekspresja GFP. Przenieść komórki z powrotem do temperatury 37°C na okres od pięciu do sześciu dni. Monitorować żywe kultury za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu wykrycia neuronów przechodzących reaktywację.

Częstotliwość reaktywacji oblicza się poprzez zliczenie liczby studzienek zawierających neurony wykazujące ekspresję EGFP i wyrażenie tej wartości jako proporcję całkowitej liczby badanych studzienek. Rysunek ten przedstawia przykład, w którym do późnych kultur SCG po infekcji zastosowano statynę wyzwalającą, znaną indukcję reaktywacji. Reaktywację monitorowano i oceniano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej każdego dnia po podaniu leku przez okres pięciu dni.

Przy zastosowaniu TSA reaktywacja osiąga 50% wartości maksymalnej w ciągu dwóch dni, a do piątego dnia osiąga 60% poziomu bazowego lub spontanicznej reaktywacji reprezentowanej przez DMSO. Kontrole leczone w tym eksperymencie wynoszą około 10% i zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 5 do 20% przy użyciu tego systemu in vitro. Późno zainfekowane hodowle SCG były również traktowane LY 2 9 0 0 4.

Kultury reaktywowane znanym induktorem reaktywacji przy użyciu LY porównano z kulturami traktowanymi inhibitorem syntezy viralnego DNA, kwasem fosfoacetylowym (PAA), oraz obiema związkami jednocześnie, jak pokazano tutaj. Ekspresja US 11 EGFP jest upośledzona przez PAA w kulturach indukowanych do reaktywacji za pomocą LY 2 9 4 0 0 2, co wskazuje, że ekspresja US 11 EGFP zależy od replikacji viralnego DNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ścisłe przestrzeganie zasad aseptyki oraz jak najdelikatniejsze obchodzenie się z kulturą CG, aby uniknąć zwiększonej spontanicznej reaktywacji wywołanej stresem lub ruchami mechanicznymi. Po zastosowaniu tej procedury w celu ustanowienia latentnych infekcji HSV 1 w hodowlach neuronów można przeprowadzić inne metody, takie jak knockdown shRNA oraz ekspresja ektopiczna genu typu dzikiego i genów zmutowanych, aby scharakteryzować funkcje neuronalne regulujące latencję i reaktywację HSV 1.

Należy pamiętać, że HSV-1 jest patogenem ludzkim, który wymaga zachowania środków ostrożności zgodnie z poziomem bezpieczeństwa BSL-2. Przed przeprowadzeniem tej procedury należy zapoznać się z zasadami pracy w warunkach BSL-2. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zakładać kultury SCG w celu ustanowienia utajonych infekcji HSV-1 oraz jak skutecznie indukować reaktywację w neuronach.