Name: Podstawowy system hodowli neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki pospolitej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Poznaj metodę hodowli neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa HSV-1. Technika obejmuje izolację neuronów z ganglionów szyjnych szczurów, ustanowienie zakażenia latentnego oraz indukcję reaktywacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy recenzentom za ich wnikliwe sugestie, które pomogły ulepszyć niniejszy manuskrypt. Praca ta była wspierana przez granty przyznane MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) oraz IM (AI073898, GM056927) przez NIH. MK otrzymał częściowo wsparcie z grantu szkoleniowego NIH (5T32 AI007180).

<ol><li>Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+duration+of+growth+factor+signaling+through+receptor+tyrosine+kinases+regulates+HSV-1+latency+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons.</a> Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).</li>
<li>Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+MI+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 71-94 (2001).</li>
<li>Letourneau, P. C. Preparation of substrata for in vitro culture of neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetourneau%2C+PC+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 245-254 (2001).</li>
<li>Price, J. P., Brewer, G. J. Serum-free media for neural cell cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrice%2C+JP+%22Protocols+for+Neural+Cell+Culture%22">Protocols for Neural Cell Culture</a>. Fedoroff, S., Richardson, A. , 3rd Ed, Humana Press, Inc. Totowa, N.J. 255-264 (2001).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd Ed, ASM Press. (2008).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. The family Herpesviridae: A brief introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Price, R. W., Rubenstein, R., Khan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+infection+of+isolated+autonomic+neurons+in+culture%3A+viral+replication+and+spread+in+a+neuronal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus infection of isolated autonomic neurons in culture: viral replication and spread in a neuronal network.</a> Arch. Virol. 71, 127-140 (1982).</li>
<li>Tomishima, M. J., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+alpha-herpesvirus+protein+necessary+for+axonal+localization+of+viral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins.</a> J. Cell Biol. 154, 741-752 (2001).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+and+transformed+neuronal+cells+for+studying+pseudorabies+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection.</a> Methods Mol. Biol. 292, 299-316 (2005).</li>
<li>Wang, F., Tang, W., McGraw, H. M., Bennett, J., Enquist, L. W., Friedman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+glycoprotein+E+is+required+for+axonal+localization+of+capsid%2C+tegument%2C+and+membrane+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 glycoprotein E is required for axonal localization of capsid, tegument, and membrane glycoproteins.</a> J. Virol. 79, 13362-13372 (2005).</li>
<li>Benboudjema, L., Mulvey, M., Gao, Y., Pimplikar, S. W., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+us11+gene+product+with+the+cellular+kinesin+light-chain-related+protein+PAT1+results+in+the+redistribution+of+both+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the herpes simplex virus type 1 us11 gene product with the cellular kinesin light-chain-related protein PAT1 results in the redistribution of both polypeptides.</a> J. Virol. 77, 9192-9203 (2003).</li>
<li>Blaho, J., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification and storage.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 14, Unit 14E.1(2005).</li>
<li>Van Zeijl, M., Fairhurst, J., Jones, T. R., Vernon, S. K., Morin, J., LaRocque, J., Feld, B. L., O'Hara, B. L., Bloom, J. D., Johann, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+thiourea+compounds+that+inhibit+herpes+simplex+virus+type+1+DNA+cleavage+and+encapsidation%3A+resistance+maps+to+the+UL6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel class of thiourea compounds that inhibit herpes simplex virus type 1 DNA cleavage and encapsidation: resistance maps to the UL6 gene.</a> J. Virol. 74, 9054-9061 (2000).</li>
<li>Newcomb, W. W., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+herpes+simplex+virus+replication+by+WAY-150138%3A+assembly+of+capsids+depleted+of+the+portal+and+terminase+proteins+involved+in+DNA+encapsidation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of herpes simplex virus replication by WAY-150138: assembly of capsids depleted of the portal and terminase proteins involved in DNA encapsidation.</a> J. Virol. 76, 10084-10088 (2002).</li>
<li>Pesola, J. M., Zhu, J., Knipe, D. M., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+immediate-early+and+early+gene+expression+during+reactivation+from+latency+under+conditions+that+prevent+infectious+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 immediate-early and early gene expression during reactivation from latency under conditions that prevent infectious virus production.</a> J. Virol. 79, 4516-14525 (2005).</li>
<li>Arthur, J. L., Scarpini, C. G., Connor, V., Lachmann, R. H., Tolkovsky, A. M., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+promoter+activity+during+latency+establishment%2C+maintenance+and+reactivation+in+primary+dorsal+root+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 promoter activity during latency establishment, maintenance and reactivation in primary dorsal root neurons in vitro.</a> J. Virol. 75, 3885-3895 (2001).</li>
<li>Danaher, R. J., Jacob, R. J., Steiner, M. R., Allen, W. R., Hill, J. M., Miller, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+induce+reactivation+of+herpes+simplex+virus+type+1+in+a+latency-associated+transcript-+independent+manner+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors induce reactivation of herpes simplex virus type 1 in a latency-associated transcript- independent manner in neuronal cells.</a> J. Neurovirol. 11, 306-317 (2005).</li>
<li>Terry-Allison, T., Smith, C. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxed+repression+of+herpes+simplex+virus+type+1+genomes+in+murine+trigenminal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Relaxed repression of herpes simplex virus type 1 genomes in murine trigenminal neurons.</a> J. Virol. 71, 12394-12405 (2007).</li>
<li>Harris, R. A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+latency+in+vitro+by+the+herpes+virus+type+1+mutant+in1918%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Establishment of latency in vitro by the herpes virus type 1 mutant in1918.</a> J. Gen. Virol. 72, 907-913 (1991).</li>
<li>Wagner, E. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+investigation+of+herpes+simplex+virus+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Experimental investigation of herpes simplex virus latency.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 419-443 (1997).</li>
<li>Strelow, L. I., Laycock, K. A., Jun, P. Y., Rader, K. A., Brady, R. H., Miller, J. K., Pepose, J. S., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+and+functional+comparison+of+the+latency-associated+transcript+promoters+of+herpes+simplex+virus+type+1+strains+KOS+and+McKrae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A structural and functional comparison of the latency-associated transcript promoters of herpes simplex virus type 1 strains KOS and McKrae.</a> J. Gen Virol. 75, 2475-2480 (1994).</li>
<li>Stroop, W. G., Banks, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS-63+does+not+cause+acute+or+recurrent+ocular+disease+and+does+not+reactivate+ganglionic+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 strain KOS-63 does not cause acute or recurrent ocular disease and does not reactivate ganglionic latency in vivo.</a> Acta Neuropathol. 87, 14-22 (1994).</li>
<li>Sawtell, N. M., Poon, D. K., Tansky, C. S., Thompson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+latent+herpes+simplex+virus+type+1+genome+copy+number+in+individual+neurons+is+virus+strain+specific+and+correlates+with+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The latent herpes simplex virus type 1 genome copy number in individual neurons is virus strain specific and correlates with reactivation.</a> J. Virol. 72, 5343-5350 (1998).</li>
<li>Thompson, R. L., Cook, M. L., Devi-Rao, G., Wagner, E. K., Stevens, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+molecular+analysis+of+the+avirulent+wild-type+herpes+simplex+virus+type+1+strain+KOS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional and molecular analysis of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOS.</a> J. Virol. 58, 203-211 (1986).</li>
<li>Wilcox, C. L., Smith, R. L., Freed, C. R., Johnson, E. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor-dependence+of+herpes+simplex+virus+latency+in+peripheral+sympathetic+and+sensory+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor-dependence of herpes simplex virus latency in peripheral sympathetic and sensory neurons in vitro.</a> J. Neurosci. 10, 1268-1275 (1990).</li>
<li>Roehm, P. C., Camarena, V., Gardner, J. B., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+vestibular+ganglion+neurons+demonstrate+latent+herpes+simplex+type+I+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Cultured vestibular ganglion neurons demonstrate latent herpes simplex type I reactivation.</a> Laryngoscope. 121, 2268-2275 (2011).</li>
<li>Kuhn, M. A., Nayak, S., Camarena, V., Gardner, J., Wilson, A., Mohr, I., Chao, M. V., Roehm, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+model+of+facial+palsy+resulting+from+reactivation+of+latent+herpes+simplex+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">A cell culture model of facial palsy resulting from reactivation of latent herpes simplex virus type 1.</a> Otology & Neurotology. , Forthcoming (2012).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Ten system hodowli i infekcji pierwotnych neuronów stanowi prostą i skuteczną metodę badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw latencji i reaktywacji HSV-1. System ten wiernie odwzorowuje uznane cechy latencji zdefiniowane zarówno w infekcjach u ludzi, jak i w modelach zwierzęcych. Gdy wirus znajduje się w stanie latencji w hodowlach SCG, nie można wykryć cząstek zakaźnych ani produktów litycznych genów wirusowych. Jedynym wykrywanym produktem genu wirusowego w neuronach z latentną infekcją je...

<table><tbody><tr><td>70&amp;mu;filtr nylonowy (sito do komórek)</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>1x roztwór Hanksa&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;) </td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>bez CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; oraz MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>1x podłoże Minimum Essential Media (MEM) </td><td>Invitrogen</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>5-fluoro-2-&amp;rsquo;-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>przygotować roztwór stokowy o stężeniu 20 mM w 1x MEM; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>płytki TC z 96 płaskimi dołkami</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>acyklowir </td><td>Calbiochem</td><td>114798</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 31 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Afidikolina </td><td>Calbiochem</td><td>178273</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 10 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Suplement B-27 </td><td>Invitrogen</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>przygotować roztwór stokowy o stężeniu 10 mg/ml w HBSS&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td>przygotuj 40% roztwór zapasowy w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; sterylizować przez filtr &amp;i przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>L-glutamina </td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Laminina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1 mg/ml w H2O&lt;sub&gt;2O&lt;/sub&gt;; szybkie zamrażanie 20 &amp;#x03BC;alikwoty &amp;przechowywać w temperaturze -80°C&amp;#x00B0;C; rozcieńczyć do 2 &amp;#x03BC;g/ml stężenie robocze w sterylnym H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;z pożywki L-15 </td><td>Invitrogen</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów </td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT.5017</td><td>przygotować 50 &amp;#x03BC;roztwór stokowy o stężeniu g/ml w HBSS&lt;sub&gt;-/-&lt;/sub&gt;; przechowywać w temperaturze -80°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>pożywka Neurobasal </td><td>Invitrogen</td><td>12348</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosfonooctowy (PAA) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6909</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 75 mg/ml w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Hydrobromek poli-D-lizyny </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td>przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml w H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Kolagen z ogonów szczura </td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>Stężenie różni się w zależności od partii produktu; przechowywać w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C i rozcieńczyć do stężenia roboczego 0,66 mg/ml w sterylnej H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Trichostatyna A </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>przygotować roztwór stokowy 1 mM w DMSO; przechowywać w temperaturze -20°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Trypsyna 2,5% </td><td>Invitrogen</td><td>15090-04</td><td></td></tr></tbody></table>

system hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) wywołuje dożywotną infekcję latentną w neuronach obwodowych. Ten latentny rezerwuar jest źródłem nawracających zdarzeń reaktywacji, które zapewniają transmisję wirusa i przyczyniają się do rozwoju choroby klinicznej. Obecne leki przeciwwirusowe nie wpływają na rezerwuar latentny, a szczepionki nie istnieją. Podczas gdy molekularne szczegóły replikacji litycznej są dobrze opisane, mechanizmy kontrolujące latencję w neuronach pozostają nieznane. Nasza obecna wiedza na temat latencji pochodzi z badań in vivo z wykorzystaniem modeli małych zwierząt, które były niezbędne do określenia wymagań genetycznych wirusa oraz roli odpowiedzi immunologicznych. Niemniej jednak w żywych zwierzętach nie jest możliwe odróżnienie specyficznych efektów wpływających na relację wirusa z neuronem od bardziej ogólnych konsekwencji infekcji pośredniczonych przez komórki odpornościowe lub nie-neuronalne komórki wspierające. Ponadto eksperymenty na zwierzętach są kosztowne, czasochłonne i ograniczone pod kątem dostępnych opcji manipulowania procesami gospodarza. Aby pokonać te ograniczenia, niezbędny jest system oparty wyłącznie na neuronach, który odtwarzałby charakterystykę latencji i reaktywacji in vivo, oferując jednocześnie zalety hodowli tkankowej w zakresie homogeniczności i dostępności.
Przedstawiamy tutaj model in vitro z wykorzystaniem hodowli pierwotnych neuronów sympatycznych z górnych zwojów szyjnych szczura (SCG) (Ryc. 1) do badania latencji i reaktywacji HSV-1, który spełnia większość, jeśli nie wszystkie, pożądane kryteria. Po usunięciu komórek nieneuronalnych, niemal jednorodne hodowle neuronów TrkA+ są zakażane HSV-1 w obecności acyklowiru (ACV) w celu zahamowania replikacji litycznej. Po usunięciu ACV efektywnie ustanawiane są nieproduktywne infekcje HSV-1, które wiernie wykazują uznane cechy latencji. Co istotne, lityczne mRNA, białka i wirusy zakaźne stają się niewykrywalne, nawet w przypadku braku selekcji, natomiast ekspresja transkryptu związanego z latencją (LAT) utrzymuje się w jądrach neuronów. Genomy wirusowe są utrzymywane w średniej liczbie 25 kopii na neuron i mogą zostać indukowane do replikacji produktywnej poprzez zakłócenie sygnalizacji PI3-Kinazy / Akt lub proste odstawienie czynnika wzrostu nerwów1. Rekombinowany HSV-1 kodujący EGFP połączone z wirusowym białkiem litycznym Us11 zapewnia funkcjonalny marker replikacji wynikającej z reaktywacji w czasie rzeczywistym, który można łatwo skwantyfikować. Oprócz zabiegów chemicznych, w systemie tym można z powodzeniem zastosować metodologie genetyczne, takie jak interferencja RNA lub dostarczanie genów za pomocą wektorów lentiwirusowych, co umożliwia badania mechanistyczne, które są bardzo trudne, jeśli nie niemożliwe, do przeprowadzenia na zwierzętach. Podsumowując, system latencji / reaktywacji HSV-1 oparty na SCG stanowi potężne i niezbędne narzędzie do odkrycia molekularnych mechanizmów kontrolujących latencję i reaktywację HSV-1 w neuronach – odnośnej długotrwałej zagadki w wirusologii, której rozwiązanie może dostarczyć nowych spostrzeżeń w opracowywaniu nowych terapii celujących w latentny rezerwuar herpeswirusa.

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Wirus opryszczki typu 1 (HSV-1) wywołuje dożywotną infekcję latentną w neuronach obwodowych. Ten latentny rezerwuar jest źródłem nawracających...

Celem niniejszego eksperymentu jest zademonstrowanie, w jaki sposób pierwotny układ kultur neuronów może zostać wykorzystany do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki prostego. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wyizolowanie neuronów z zwojów szyjnych górnych embrionów szczurów rasy RA, a następnie hodowlę neuronów wyizolowanych z dysocjowanych zwojów po usunięciu komórek nieneuronalnych. Latentna infekcja HSV jest ustanawiana przy użyciu wirusa EGFP do zakażenia neuronów w obecności inhibitora replikacji litycznej.Kolejnym krokiem jest indukowanie reaktywacji latentnych zakażonych kultur. Na koniec wydajność reaktywacji ocenia się poprzez monitorowanie ekspresji EGFP w czasie. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, w jaki sposób różne szlaki sygnałowe neuronów regulują latencję i reaktywację wirusa herpes simplex, z wykorzystaniem inhibitorów chemicznych, interferencji RNA oraz dostarczania genów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ona szczegółowe badania oddziaływań regulujących latencję wirusa prostego opuszki w neuronach gospodarza na poziomie molekularnym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie latencji wirusa prostego opuszki, takie jak: jakie sygnały odpowiadają za represję genomu latentnego oraz w jaki sposób na poziomie molekularnym wyzwalana jest reaktywacja? W neuronach metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat latencji HSV1.Metodę tę można zastosować również do innych neurotropowych wirusów alfaherpes. Procedurę zaprezentują Marigo Kochi i Julian Kim, oboje doktoranci w naszych laboratoriach. Neurony z yczennych zwojów szyjnych (SCG) do niniejszego protokołu izoluje się z embrionów szczura w 21. dniu rozwoju (E 21), które zostały wyjęte z macicy ciężarnej samicy szczura. Pracując pod dygestorium sekcyjnym, należy uśmiercić każdego embriona, kierując nożyczki w podstawę szyi, tuż nad barkami, i oddzielając głowę od tułowia. Aby odsłonić zwoje, należy użyć igieł o rozmiarze 23 G do przypięcia głowy w trzech miejscach, ustawiając ją stroną szyi do góry.W pierwszej kolejności przymocuj rdzeń kręgowy za pomocą szpilek. Po drugie, odciągnij skórę przednią nad nos i przymocuj ją szpilką, a po trzecie przymocuj przełyk i tchawicę, odsuwając je od karku. Zlokalizuj SCG, odnajdując miejsce rozwidlenia tętnicy szyjnej.Tętnica szyjna jest strukturą parzystą. Po obu stronach szyi znajdują się dwie rozwidlenia, zatem dwie s CGS na osobę. SCG znajduje się bezpośrednio pod rozgałęzieniem.Oddziel SCG od tętnic, rozciągając rozwidlenie za pomocą obu końców. SCG jest półprzezroczyste i bezbarwne w porównaniu do nieprzeźroczystej, żółtawej tkanki tłuszczowej otaczającej rozwidlenie. Umieść zwoje w 12 mililitrach L 15.Pożywka uzupełniona glukozą w 15-mililitrowej probówce stożkowej na lodzie. Po zebraniu wszystkich SCG z embrionów i delikatnym wyciągnięciu zwojów, odwiruj je przez jedną minutę przy 600 RPM, a następnie usuń nadmiar pożywki.Zzawiesić zwoje w 1 ml pożywki L 15 zawierającej trypsynę i kolagenazę. Inkubować przez 24 minuty w temperaturze 37 °C.Mieszać co osiem minut. Następnie dodać 10 mililitrów pożywki morskiej, aby zneutralizować trypsynę, i wirować przez jedną minutę. Przy 600 RPM usunąć jak największą ilość pożywki z trypsyną i kolagenazą, a następnie przemyć zwoje 10 mililitrami pożywki C, wirować przez jedną minutę przy 600 RPM.Powtórz to płukanie raz. Usuń medium płuczące i resuspenduj zwoje w 1 ml medium C, aby przeprowadzić dysocjację poprzez tytrację, używając igły 21 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 5 ml, wykonując maksymalnie 15 cykli zasykania i wypychania. Zakończ tytrację przy użyciu igły 23 G, aż większość grudek zostanie rozdzielona.Usuń wszelkie pozostałe skupiska komórek, filtrując dysocjowane neurony przez nylonowy filtr o rozmiarze 70 micron do probówki stożkowej o pojemności 50 milliliter. Pobierz 10 microliter aliquot zawiesiny komórkowej po filtracji i zmieszaj z triam blue w celu oznaczenia liczby żywych komórek. Policz liczbę komórek aktywnie wykluczających barwnik, używając hemo cytometer.Następnie do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek, uprzednio pokrytej kolagenem i lamininą, przenieś od 5 000 do 6 000 żywych komórek w 100 µL pożywki C zawierającej 50 ng/mL czynnika wzrostu nerwów. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia, w pierwszym dniu in vitro (DIV 1), sprawdź poprawność przytwierdzenia neuronów oraz wzrost niektórych projekcji aksonalnych.Zastąp medium C w dołkach 50 µL medium podstawowego dla neuronów (neuro basal medium) lub NBM zawierającego NGF Acho oraz 5-fluorodoksyurydynę. Wymieniaj medium w jednym rzędzie na raz, aby zapobiec wysychaniu komórek. Inkubuj hodowle w temperaturze 37 °C przez pięć dni.Monitoruj kulturę codziennie, aby potwierdzić śmierć komórek nieneuronalnych oraz wzrost neuronów. Aby rozpocząć tę część procedury w szóstym dniu in vitro, sprawdź, czy większość nieneuronalnych komórek wspierających została wyeliminowana. Niezmiernie ważne jest, aby w każdym momencie minimalizować niepotrzebne manipulacje fizyczne neuronami.Wymiana pożywki musi być przeprowadzona bardzo delikatnie i powoli, aby uniknąć stresu mechanicznego, który mógłby wpłynąć na żywotność neuronów. Do istniejącej pożywki w każdej studzience należy dodać acyklowir lub CV do końcowego stężenia 100 micromolar. CV należy dodawać powoli i delikatnie, aby siły mechaniczne nie wpłynęły negatywnie na komórki w dniu następnym.W siódmym dniu in vitro (DIV 7) zainfekuj kultury SCG rekombinowanym wirusem HSV-1, który wykazuje ekspresję reportera EGF połączonego z wirusowym białkiem litycznym US 11, przy wielokrotności zakażenia (MOI) od 1 do 2. Dodaj rozcieńczony wirus bezpośrednio do istniejącej pożywki w studzience. Uwzględnij kontrolę z pozorną infekcją oraz infekcję lityczną.Kontrola pozytywna w pożywce bez CV. Pozostawić infekcję na dwie do trzech godzin w temperaturze 37°C. Następnie zastąpić pożywkę do infekcji świeżą pożywką NBM zawierającą NGF oraz CV. Kluczowe jest zachowanie ogromnej ostrożności podczas wymiany pożywki do infekcji. Przechylić płytkę w swoją stronę i powoli usunąć pożywkę z dna dołka.Następnie skieruj końcówkę pipety w stronę ścianki dołka, a nie jego dna, i pozwól, aby pożywka łagodnie spłynęła na komórki. Wymieniaj pożywkę w jednym rzędzie naraz, aby zapobiec wysychaniu komórek. Przenieś kultury z powrotem do inkubatora, obchodząc się z nimi jak najdelikatniej, aby nie naruszyć ich zdolności do podtrzymywania latencji HSV 1.Kultury należy utrzymywać przez sześć dni w temperaturze 37°C, w czasie którego wirus wejdzie w stan latencji. W tym okresie należy używać mikroskopu fluorescencyjnego do monitorowania ekspresji us 11 EGFP jako wskaźnika replikacji litycznej.Zgodnie z oczekiwaniami, w kontroli z pozorowaną infekcją nie powinno wystąpić ekspresji GFP. S 11 EGFP powinno być wykryte wyłącznie w próbkach zainfekowanych. Studzienki kontroli pozytywnej bez zastosowania CV wskazują na przebieg udanej pierwotnej infekcji oraz produktywną replikację lityczną.Aby ocenić reaktywację w 14. dniu in vitro (DIV 14), ostrożnie zastąp medium zawierające CV świeżym medium bez CV, postępując jak poprzednio. Skieruj końcówkę pipety w stronę ścianki studni, a nie dna, i pozwól medium delikatnie spłynąć na komórki, jeśli jest to stosowne. Uwzględnij zmienne farmakologiczne lub biologiczne, takie jak LY 2 9 0 0 4 w stężeniu 20 µM.W kulturach z utajoną infekcją traktowanych A CV nie powinna być wykryta ekspresja GFP. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez okres od pięciu do sześciu dni. Monitoruj żywe kultury za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu wykrycia neuronów ulegających reaktywacji.Częstotliwość reaktywacji oblicza się poprzez zliczenie liczby studni zawierających neurony pozytywne pod kątem EGFP i wyrażenie tej wartości jako proporcji do całkowitej liczby studni z próbkami. Rysunek ten przedstawia przykład, w którym do późnych kultur zakażonych SCG zastosowano trigger statin, znany induktor reaktywacji. Reaktywację monitorowano i oceniano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej codziennie po podaniu leku przez okres pięciu dni.W przypadku TSA reaktywacja osiąga 50% wartości maksymalnej w ciągu dwóch dni, a do piątego dnia reaktywacja osiąga 60% poziomu bazowego lub spontanicznego, reprezentowanego przez DMSO. W tym eksperymencie w leczonych kulturach kontrolnych wartość ta wynosi około 10%, a w tym systemie in vitro zazwyczaj mieści się w przedziale od 5 do 20%. Później w zakażonych kulturach SCG zastosowano również LY 2 9 0 0 4.Porównano kultury z indukowaną reaktywacją za pomocą znanego induktora reaktywacji LY z kulturami traktowanymi inhibitorem syntezy viralnego DNA, kwasem fosfonooctowym (PAA), oraz obiema związkami jednocześnie, jak pokazano tutaj. Ekspresja US 11 EGFP jest upośledzona przez PAA w kulturach indukowanych do reaktywacji za pomocą LY 2 9 4 0 0 2, co wskazuje, że ekspresja US 11 EGFP zależy od replikacji viralnego DNA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ścisłe przestrzeganie zasad aseptyki oraz jak najdelikatniejsze obchodzenie się z kulturą CG, aby uniknąć zwiększonej spontanicznej reaktywacji wywołanej stresem lub ruchami mechanicznymi. Po zastosowaniu tej procedury w celu ustanowienia utajonych infekcji HSV one w hodowlach neuronów, można przeprowadzić inne metody, takie jak wyciszanie za pomocą shRNA oraz ekspresja ektopowa genu typu dzikiego i mutantów z utratą funkcji, aby scharakteryzować funkcje neuronalne regulujące latencję i reaktywację HSV one.Należy pamiętać, że HSV-1 jest patogenem ludzkim, który wymaga zachowania środków ostrożności zgodnych z poziomem bezpieczeństwa BSL-2. Przed przystąpieniem do tej procedury należy zapoznać się z zasadami pracy w warunkach BSL-2. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak tworzyć kultury SCG w celu ustanowienia latentnych infekcji HSV-1 oraz jak skutecznie indukować reaktywację w neuronach.

a-primary-neuron-culture-system-for-study-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System kultury neuronów pierwotnych do badania oporności i reaktywacji wirusa opryszczki pospolitej

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Większość badań nad opryszczkowym zapaleniem rogówki wykorzystuje model infekcji pierwotnej. Jednakże infekcja pierwotna HSV-1 zazwyczaj nie prowadzi do rozwoju choroby u ludzi. W niniejszej pracy opisujemy model nawrotowy opryszczkowej choroby rogówki, który dokładniej naśladuje przebieg choroby u ludzi.

Nawracające opłykowe zapalenie stromy rogówki u myszy jako model do badania ludzkiego HSK

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Obrazowanie żywych komórek zakażeń wirusem opryszczki umożliwia analizę dynamicznych zdarzeń transportu kierowanego i rozprzestrzeniania się międzykomórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodologie, które wykorzystują rekombinowane szczepy wirusa eksprymujące fluorescencyjne białka fuzyjne, aby ułatwić wizualizację zespołów wirusowych podczas infekcji neuronów pierwotnych.

Obrazowanie żywych komórek transportu i rozprzestrzeniania się wirusa alfaopryszczki

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Skóra jest jednym z celów ludzkiego patogenu wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1). Aby zbadać drogę inwazji HSV-1 do tkanki, ustaliliśmy model infekcji ex vivo mysich arkuszy naskórka, które reprezentują najbardziej zewnętrzną warstwę skóry.

Ex vivo Zakażenie mysiego naskórka wirusem opryszczki pospolitej typu 1

W neurobiologii i neurowirusologii kluczowe jest posiadanie niezawodnego, powtarzalnego systemu in vitro, który służy jako model translacyjny dla tego, co dzieje się in vivo w ludzkich neuronach. Protokół ten opisuje, jak hodować i różnicować ludzkie komórki nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y w żywotne neurony do wykorzystania w zastosowaniach in vitro.

Różnicowanie ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Plaquing to rutynowa metoda używana do ilościowego oznaczania żywych wirusów w populacji. Chociaż plaqueing jest często nauczany w różnych programach nauczania mikrobiologii z bakteriami i bakteriofagami, plaqueing wirusów ssaków jest bardziej złożony i czasochłonny. Protokół ten opisuje procedury, które działają niezawodnie w przypadku regularnej pracy z wirusami opryszczki pospolitej.

Plaquing wirusów opryszczki pospolitej

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Poznaj metodę hodowli neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa HSV-1. Technika obejmuje izolację neuronów z ganglionów szyjnych szczurów, ustanowienie zakażenia latentnego oraz indukcję reaktywacji.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Przeglądaj więcej filmów