Name: Genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę Direct PCR do genotypowania próbek roślinnych i zwierzęcych bez oczyszczania DNA. Technika ta pozwala na szybką analizę genetyczną tkanek Arabidopsis, dębu i myszy, oszczędzając czas i zasoby laboratoryjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Za próbki Arabidopsis oraz odpowiednie primery do PCR dziękujemy profesorowi Jaakko Kangasjärvi i jego zespołowi, The Plant Stress Group, Plant Biology, Department of Biosciences na Uniwersytecie w Helsinkach. Eksperymenty z wykorzystaniem metody tradycyjnej zostały przeprowadzone przez panią Airi Lamminmäki.
Próbki myszy transgenicznych zostały dostarczone przez dr Jaanę Vesterinen z Instytutu Biomedycyny/Biochemii Uniwersytetu w Helsinkach.
Harris Uni-Core oraz Harris Cutting Mat są znakami towarowymi firmy Shunderson Communications Inc. Wszystkie pozostałe znaki towarowe są własnością firmy Thermo Fisher Scientific Inc. oraz jej spółek zależnych.

<ol><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li>
<li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li>
<li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li>
<li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+mouse+tails%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li>
<li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li>
<li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory%22">Molecular Cloning: A Laboratory</a>. , 2nd ed, CSH Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Thermo Fisher Scientific, Inc.

Przedstawiona tutaj metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych próbek, co skraca czas pracy i upraszcza proces genotypowania roślin i zwierząt (Rysunek 7). Zaprezentowano również zastosowanie protokołu rozcieńczania w połączeniu z metodą Direct PCR (Rysunek 3). Protokół rozcieńczania jest zalecany w przypadku trudnych próbek (np. starych liści roślin, gatunków roślin zawierających związki interferujące) lub przy długich (lub bogatych w GC) amplikonach. Protokół ten jest szczególnie przydatny podczas rozpoczynania nowego eksperymentu Direct PCR, umożliwiając optymalizację reakcji. Może on służyć jako narzędzie do rozwiązywania sporadycznych problemów, takich jak niska wydajność produktu wynikająca z różnic w materiale tkankowym i/lub zastosowanych starterach. Ponadto, przy przeprowadzaniu wielu reakcji z tej samej próbki, zastosowanie protokołu rozcieńczania gwarantuje, że cała próbka nie zostanie zużyta w jednej reakcji. 
W celu oczyszczania DNA z roślin do analizy PCR przyjętą praktyką było przeprowadzanie lizy komórek, a następnie izolacji DNA przy użyciu różnych komponentów, które potencjalnie mogły zakłócać analizę PCR8. W przypadku roślin szczególnie trudnych, o wysokiej zawartości związków fenolowych, tradycyjnie stosowano dodatek poliwinilopirolidonu w celu usunięcia związków wiążących się z DNA po lizie komórek2,5. Jak tutaj pokazano, tych skomplikowanych i czasochłonnych etapów można uniknąć, stosując zestaw Phire Plant Direct PCR Kit do wykrywania docelowego DNA. Etapy lizy komórek i izolacji DNA można pominąć, wykorzystując czułe techniki dCAPS bezpośrednio z liści rośliny Arabidopsis (Rycina 2). Jak wykazano w niniejszym materiale, protokół rozcieńczania skutecznie niweluje obecność problematycznych komponentów, które mogą zakłócać reakcję PCR (Rycina 3). 
Tradycyjnie warunkiem wstępnym genotypowania zwierząt była izolacja genomicznego DNA z tkanki zwierzęcej za pomocą toksycznego i czasochłonnego procesu, charakteryzującego się długą inkubacją z proteinazą K w celu strawienia skóry i tkanki łącznej, a następnie etapami ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi, wytrącania alkoholem i wirowania6,9,10. Jak wykazano w niniejszej pracy, uproszczenie tego procesu osiągnięto dzięki zastosowaniu zestawu Phire Animal Tissue Direct PCR Kit, co pozwoliło na genotypowanie myszy transgenicznych bez wcześniejszego oczyszczania DNA (Rycina 4). Przykład przedstawiony w tym artykule jest szczególnie wymagający, ponieważ do amplifikacji dwóch fragmentów o znacznej różnicy w wielkości użyto tylko jednego zestawu starterów. Pomimo wrodzonej trudności protokołu, zastosowanie podejścia Direct PCR w połączeniu z prostym protokołem rozcieńczania pozwoliło na uzyskanie wysokich wydajności dwóch produktów PCR (Rycina 4).
Wykrywanie docelowego DNA w oparciu o metodę PCR znajduje wiele zastosowań w badaniach, w tym w analizie genotypu w celu zidentyfikowania roli genów w rozwoju, fizjologii i chorobach. Dzięki tolerancji wyspecjalizowanych polimeraz DNA na inhibitory, protokoły te można zrealizować w minimalnym czasie bez konieczności wcześniejszego oczyszczania DNA.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Phire Plant Direct PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F-130</td><td>200 reakcji (po 50 &amp;mu;l każda)</td></tr><tr><td>Zestaw Phire Animal Tissue Direct PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F-140</td><td>200 reakcji (po 50 &amp;mu;l każda)</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 0,35 mm (różowy)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F-180S/L</td><td>Ilość: 5/25</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 0,50 mm (niebieski)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F-185S/L</td><td>Ilość: 5/25</td></tr><tr><td>Mata do cięcia Harris 6,4 &amp;#215; 7,6 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F-190</td><td>Ilość: 5</td></tr><tr><td>SspI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0771</td><td>100 &amp;mu;l (100 reakcji)</td></tr><tr><td>Termocykler Piko 24-dołkowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TCP0024</td><td></td></tr><tr><td>Płytki PCR Piko 24-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SLP0241</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania produktów PCR GeneJET&lt;br/&gt; Purification Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0701&lt;br/&gt; K0702</td><td>50 preparacji&lt;br/&gt; 250 preparacji</td></tr></tbody></table>

genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania dna

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Metoda bezpośredniej reakcji PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych próbek, co zostało tutaj zademonstrowano dla kilku tkanek roślinnych i zwierzęcych (Rysunek 1). Bezpośrednia reakcja PCR opiera się na specjalnie zmodyfikowanych polimerazach DNA Thermo Scientific Phusion oraz Phire, które zawierają domenę wiążącą dwuniciowy DNA, co nadaje im unikalne właściwości, takie jak wysoka tolerancja na inhibitory.
Detekcja docelowego DNA oparta na metodzie PCR znajduje liczne zastosowania w badaniach roślin, w tym w analizie genotypu roślin oraz weryfikacji transgenów. PCR z tkanek roślinnych tradycyjnie obejmuje wstępny etap izolacji DNA, który może wymagać zastosowania drogich lub toksycznych odczynników. Proces ten jest czasochłonny i zwiększa ryzyko kontaminacji krzyżowej1, 2. Z kolei dzięki zastosowaniu zestawu Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit docelowe DNA można łatwo wykryć bez uprzedniej ekstrakcji DNA. W prezentowanym tutaj modelu analiza pochodnych sekwencji polimorficznych wzmacnianych i ciętych (dCAPS)3,4 jest przeprowadzana bezpośrednio z liści rośliny Arabidopsis. Testy genotypowania dCAPS mogą być wykorzystywane do identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) poprzez trawienie endonukleazą restrykcyjną specyficzną dla allelu SNP3.
Niektóre próbki roślin mogą sprawiać trudności podczas stosowania metod Direct PCR, ponieważ zawierają składniki zakłócające przebieg tej reakcji, takie jak związki fenolowe. W takich przypadkach tradycyjnie wymagany jest dodatkowy etap usuwania tych związków2,5. W niniejszym protokole problem ten rozwiązano poprzez zastosowanie szybkiego i prostego protokołu rozcieńczania, po którym następuje amplifikacja Direct PCR (Rysunek 1). Jako model trudnych w obróbce roślin wykorzystano liście piętnastoletniego dębu, ponieważ próbki te zawierają duże ilości związków fenolowych, w tym tanin.
Transfer genów do organizmów myszy jest powszechnie stosowany w badaniach nad rolą genów w rozwoju, fizjologii i chorobach ludzkich. Wykorzystanie tych zwierząt wymaga przesiewowego badania obecności transgenu, zazwyczaj za pomocą metody PCR. Tradycyjnie wiąże się to z czasochłonnym etapem izolacji DNA, podczas którego DNA do analizy PCR jest oczyszczane z tkanek ucha, ogona lub palców6,7. Jednak dzięki zestawowi Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit genotypowanie myszy transgenicznych może być przeprowadzone bez wcześniejszego oczyszczania DNA. W niniejszym protokole genotypowanie myszy transgenicznej jest realizowane bezpośrednio z tkanek ucha myszy, co zademonstrowano na trudnym przykładzie, w którym do amplifikacji dwóch fragmentów znacznie różniących się wielkością zastosowano tylko jeden zestaw starterów.

Przedstawiona tutaj metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych tkanek roślinnych i zwierzęcych.

Genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania DNA

Metoda Direct PCR umożliwia amplifikację PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych próbek, co zostało tutaj zademonstrowane dla kilku roślin i ...

Ogólnym celem tego filmu jest zaprezentowanie trzech przykładów amplifikacji PCR bezpośrednio z niewielkich ilości nieoczyszczonych próbek, w tym tkanek roślinnych i zwierzęcych. Bezpośredni PCR można przeprowadzić przy użyciu dwóch alternatywnych protokołów. W protokole bezpośrednim niewielka ilość nieoczyszczonej próbki jest dodawana bezpośrednio do reakcji PCR, natomiast protokół rozcieńczania wymaga krótkiego etapu preinkubacji przed PCR w celu uwolnienia DNA z materiału próbki.W pierwszym przykładzie genotypowanie rzodkiewnika zostanie przeprowadzone z wykorzystaniem protokołu bezpośredniego. Do docelowego DNA wprowadza się specyficzną dla allelu sekwencję rozpoznawania enzymu restrykcyjnego, a następnie identyfikuje się specyficzne dla allelu polimorfizmy pojedynczego nukleotydu po trawieniu endonukleazą restrykcyjną. Następnie zastosowany zostanie protokół rozcieńczeń, aby najpierw namnożyć specyficzne fragmenty DNA z 15-letnich liści dębu, a następnie przeprowadzić genotypowanie myszy transgenicznych bezpośrednio z tkanki ucha myszy.We wszystkich trzech przykładach amplifikacja DNA zostaje przeprowadzona bez żadnych etapów oczyszczania próbki przed PCR, przy zastosowaniu metody bezpośredniego PCR. Główną zaletą bezpośredniego PCR w stosunku do metod tradycyjnych jest brak konieczności przeprowadzania ekstrakcji lub oczyszczania DNA. Przekłada się to na oszczędność czasu oraz kosztów.Analizę genotypową metodą dCAPS (derived cleaved amplified polymorphic sequence) należy rozpocząć od przygotowania reakcji PCR o objętości 20 lub 50 µL, wykorzystując zestaw do bezpośredniego PCR z roślin zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie, używając wycinaka Harris Uni unicorn i maty do cięcia, należy wyciąć fragment liścia rośliny Arabidopsis o średnicy 0,50 mm, mocno trzymając wycinak. Należy wcisnąć krawędź tnącą w tkankę i przesuwać wycinak ruchem obrotowym w przód i w tył.Naciśnij tłok, aby wyrzucić krążek przebijający do mieszaniny reakcyjnej PCR. Upewnij się, że próbka wpada do roztworu PCR i nie przykleja się do ścianek. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej w protokole bezpośrednim, kluczowe jest zastosowanie prawidłowej metody czyszczenia narzędzia do pobierania próbek.Przed każdym badaniem próbki należy oczyścić krawędź tnącą wycinaka, zanurzając go w 2% roztworze podchlorynu sodu. Kilka razy naciśnij tłok w górę i w dół, a następnie przetrzyj krawędź tnącą czystym ręcznikiem papierowym. Matę do wycinania należy również przepłukać pomiędzy próbkami.Następnie, używając termocyklera Pico 24 oraz płytki do PCR, przeprowadź reakcje PCR zgodnie z warunkami cykli opisanymi w tekście towarzyszącym temu filmowi. Po zakończeniu PCR odwirować materiał roślinny. Przenieś 5 µL supernatantu do nowej probówki do mikrocentryfugi, dodając wcześniej 4 µL wody. Dodaj 1 µL endonukleazy restrykcyjnej SSP1, delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj, aby zebrać zawartość na dnie probówki.Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie dezaktywuj enzym restrykcyjny, inkubując go w temperaturze 65 °C przez 20 minut. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym dodaj do reakcji 2,5 µL 5x buforu do ładowania.Przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym, aby przeanalizować otrzymane fragmenty, nakładając 10 µl otrzymanej mieszaniny do dołka w żelu. Aby rozpocząć, wytnij wycinek o średnicy dwóch milimetrów z liścia dębu. Umieść próbkę w 20 µl buforu rozcieńczającego dołączonego do zestawu plant direct PCR.Oczyść krawędź tnącą oraz matę do nakłuwania i cięcia w sposób opisany wcześniej, a następnie rozgnieć próbkę liścia za pomocą końcówki do pipety 100 µL, krótko dociskając ją do ścianki probówki. Krótko wiruj próbki w mikrocentryfudze, aż odczynniki opadną na dno probówek. Nadnadkład można wykorzystać bezpośrednio w reakcji PCR lub rozcieńczyć w sterylnej wodzie w stosunku 1:10 lub 1:100.W zależności od rodzaju próbki, należy użyć od 0,5 µl do 1 µl supernatantu lub rozcieńczenia jako matrycy dla 20 µl reakcji PCR. Reakcje należy przygotować zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Po przygotowaniu reakcji należy użyć termocyklera PICO 24 oraz płytki PCR, aby przeprowadzić reakcje PCR zgodnie z warunkami cyklicznymi opisanymi w tekście.Po PCR do reakcji dodaj 5 µL buforu do nakładania 5x, a następnie przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym, wykorzystując 15 µL otrzymanej mieszaniny. Rozpocznij protokół rozcieńczania do genotypowania myszy transgenicznych, umieszczając wybić o średnicy 2 mm z tkanki ucha myszy w 20 µL buforu do rozcieńczania zawierającego 0,5 µL dodatku uwalniającego DNA dostarczonego wraz z tkanką zwierzęcą. Zgodnie z zestawem do bezpośredniego PCR inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie inkubuj przez dwie minuty w temperaturze 98 °C.Po odwirowaniu próbek, należy użyć 1 µL supernatantu jako matrycy dla 20 µL reakcji PCR. Supernatant, który nie zostanie użyty natychmiast, można przenieść do nowej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C. W ostatnim kroku wykorzystuje się 24-dołkowy termocykler oraz płytkę PCR do przeprowadzenia reakcji PCR zgodnie z warunkami cyklu wymienionymi w pisanej procedurze. Po wykonaniu PCR do reakcji należy dodać 5 µL 5x buforu do ładowania, a następnie przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym, nakładając 15 µL otrzymanej mieszaniny w technice dCAPS. Miejsce restrykcyjne w obrębie analizowanego SNP zostaje wprowadzone lub zniesione przy użyciu startera PCR z jednym lub wieloma niedopasowaniami względem docelowego DNA.W tym przykładzie produkty PCR o długości 160 par zasad, zawierające interesującą nas pozycję SNP (allelem g lub a) w genomie Arabidopsis, zostały namnożone z wycinków liści rośliny przy użyciu zestawu Fire Plant Direct PCR. Forward primer zawierał jeden niedopasowany nukleotyd na końcu 3', co stworzyło specyficzną miejsce restrykcyjne SspI w docelowym DNA, które występowało w allelu A, ale nie w drugim allelu SNP. Nieoczyszczone produkty PCR poddano trawieniu enzymem restrykcyjnym SspI, a uzyskane fragmenty przeanalizowano na żelu agarozowym; ścieżki g i a odpowiadają allelom SNP dla każdej próbki.Na tym obrazie po lewej stronie znajdują się nienaruszone produkty PCR, a po prawej fragmenty po trawieniu. W przypadku trudnego materiału roślinnego, takiego jak liść dębu, konieczne jest zastosowanie protokołów rozcieńczania ze względu na wysoką koncentrację związków fenolowych, zgodnie z opisanym tutaj protokołem rozcieńczania. Fragment chloroplastowego DNA o długości 297 par zasad został namnożony przy użyciu trzyetapowego protokołu.Próbki liści dębu o różnych rozcieńczeniach przedstawiono wraz z kontrolami pozytywną i negatywną. Zastosowano zestaw do bezpośredniego PCR z tkanki zwierzęcej w celu amplifikacji dwóch fragmentów o znacznej różnicy w wielkości przy użyciu tylko jednego zestawu starterów, co pozwoliło na uzyskanie obfitej ilości obu produktów o prawidłowej wielkości: 1500 par zasad dla myszy transgenicznych oraz 200 par zasad dla myszy typu dzikiego. Słabsze górne pasmo w przypadku myszy heterozygotycznych wynika z konkurencji obu matryc o ten sam starter.Wyniki genotypowania są jednak jednoznaczne. Przebadano również stabilność próbek przygotowanych zgodnie z protokołem rozcieńczania. Wyniki wykazują, że rozcieńczone próbki poddane wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania oraz próbki przechowywane w temperaturze -20°C przez co najmniej rok były porównywalne z próbkami wykorzystanymi bezpośrednio do PCR. Aby dalej zweryfikować skuteczność tej procedury, z tkanek ucha myszy zamplifikowano cztery amplikony, stosując protokół rozcieńczania z zestawu Fire Animal Tissue Direct PCR.W ramach porównania DNA oczyszczono najpierw przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA, a te same fragmenty powielono za pomocą polimerazy DNA tac hot start zgodnie z zaleceniami producenta; jedynie przy zastosowaniu zestawu do bezpośredniego PCR z tkanek zwierzęcych pomyślnie powielono wszystkie cztery amplikony. Bezpośredni PCR jest szczególnie przydatny w badaniach genotypowania wymagających amplifikacji bardzo wielu próbek. Pominięcie etapu oczyszczania DNA może znacząco skrócić czas potrzebny na przeprowadzenie eksperymentu. Technika ta zapewnia dodatkowe korzyści poprzez zmniejszenie ryzyka kontaminacji oraz oszczędność cennego materiału próbek.

genotyping-of-plant-and-animal-samples-without-prior-dna-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Genotypizacja próbek roślinnych i zwierzęcych bez wstępnej ekstrakcji DNA

Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Ten artykuł opisuje ekstrakcję DNA z klipsa do ogona danio pręgowanego. Protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę analizy genotypów danio pręgowanego.

Ekstrakcja DNA z klipsa ogonowego: metoda stosowana w genotypowaniu danio pręgowanego

Opisujemy procedury znakowania i genotypowania nowonarodzonych myszy oraz generowania z nich pierwotnych kultur neuronalnych. Genotypowanie jest szybkie, wydajne i niezawodne oraz pozwala na automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Jest to szczególnie przydatne w przypadku myszy ze śmiertelnością noworodków i ich hodowli, które wymagają wcześniejszego zakończenia genotypowania.

Szybkie genotypowanie zwierząt, a następnie tworzenie pierwotnych kultur neuronów mózgowych

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Opisana tutaj jest metoda ekstrakcji, oczyszczania i kontroli jakości genomowego DNA z obligatoryjnego biotroficznego patogenu grzybowego, mączniaka prawdziwego, do użycia w długotrwałym sekwencjonowaniu genomu.

Oczyszczanie genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mączniaka prawdziwego do sekwencjonowania z długim odczytem

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.

Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej

Niniejszy protokół opisuje użycie technologii kodów kreskowych DNA do uwierzytelniania materiałów leczniczych pochodzenia roślinnego, oraz rośliny leczniczej Angelica sinensis (Oliv.) Jako przykład wskazano Diels.

Zastosowanie barkodowania DNA do identyfikacji roślin leczniczych

Poznaj metodę Direct PCR do genotypowania próbek roślinnych i zwierzęcych bez oczyszczania DNA. Technika ta pozwala na szybką analizę genetyczną tkanek Arabidopsis, dębu i myszy, oszczędzając czas i zasoby laboratoryjne.

Genotypowanie próbek roślinnych i zwierzęcych bez uprzedniego oczyszczania DNA

Przeglądaj więcej filmów