Hodowla i zastosowania trójwymiarowych modeli komórek nabłonkowych otrzymywanych w bioreaktorze z rotującą ścianką (Rotating Wall Vessel)

Niniejszy niekonwencjonalny protokół przedstawia prosty i niezawodny system hodowli ludzkich komórek nabłonka w organotypowych modelach 3D, które odtwarzają ludzką tkankę in vivo. Najpierw komórki nabłonka hoduje się do uzyskania konfluencyjnej warstwy w kolbie do hodowli tkanek, a następnie zbiera i łączy z mikronośnikami w bioreaktorze STLV. Rotacja STLV na platformie pozwala na stworzenie środowiska stałego swobodnego spadku o niskim ścinaniu cieczy, co umożliwia przyleganie i wzrost komórek na kuleczkach oraz formowanie agregatów komórkowych po 96 godzinach i w przybliżeniu każdego kolejnego dnia.

Uzupełniaj pożywkę w SDLV, aby zrekompensować metabolizm komórkowy po utworzeniu agregatów; raz w tygodniu wykonuj obrazy próbek za pomocą mikroskopii świetlnej w celu monitorowania postępów rozwoju po całkowitym sformowaniu agregatów i zróżnicowaniu komórkowym. Przesiej agregaty do dalszych analiz eksperymentalnych i testów. Ostatecznie system ten może generować organotypowe modele in vivo dla wielu badań naukowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna hodowla komórkowa, jest fakt, że komórki nabłonkowe różnicują się i polaryzują w agregaty przypominające tkankę, wykazując tym samym morfologię i funkcje zbliżone do autentycznej tkanki ludzkiej. Ten system modelowy 3D pozwala na głębsze zrozumienie biologii komórek nabłonkowych, interakcji między gospodarzem a patogenem oraz złożonych zależności między typami komórek, które mogą zostać wprowadzone do systemu. Dr Andrea Radkey.

Postdoc z mojego laboratorium zaprezentuje teraz procedurę detoksykacji wolnoobrotowego bioreaktora z naczyniami bocznymi. Przykryj otwarte porty zaślepkami luer. Napełnij STLV 95% etanolem i inkubuj w celu równowagi przez 24 godziny.

Usunąć etanol, a następnie napełnić sterylną wodą destylowaną i inkubować przez 24 godziny. Korzystając z narzędzi dostarczonych przez producenta, poluzować wszystkie śruby i wyjąć centralny korek z STLV. Umieścić je w worku do sterylizacji i autoklawować w temperaturze 110 °C przez 20 minut. Złożyć ponownie STLV i powtórzyć proces detoksykacji, aby zapewnić sterylność.

Następnie dokręć śruby STLV. Do każdego portu przymocuj wcześniej wysterylizowany zawór jednokierunkowy. Teraz wyjmij tłoki z 10 mililitrowej i 5 mililitrowej strzykawki typu lure lock i połóż tłoki na opakowaniach.

Aby zachować sterylność, przykręć strzykawki do kurka odcinającego. Następnie dolewaj DPBS do strzykawki 10 ml, aż STLV zostanie wypełnione, a strzykawka 5 ml zacznie się napełniać. Po tym czasie włóż sterylne tłoki do każdej ze strzykawek i usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza z bioreaktora, naprzemiennie przesuwając tłoki strzykawek.

Zamknąć kurki i przymocować STLV do obrotowej platformy pionowej. Wirować przez co najmniej 24 godziny, aby sprawdzić szczelność w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Dodać 15 ml DPBS do 250 mg kulek cytodex microcar, a po ochłodzeniu poddać autoklawowaniu.

Wypłucz DPBS trzykrotnie, używając pożywki hodowlanej do komórek nabłonkowych. Zakręć probówką, aby resuspenderć kuleczki. Następnie resuspenderć kuleczki w 15 mililitrach pożywki hodowlanej.

Najpierw hoduje się 1 × 10⁷ komórek nabłonkowych w monowarstwach w kolbach do hodowli tkankowych. Następnie komórki zbiera się, przelicza i ocenia ich żywotność za pomocą barwienia wykluczającego trypanem niebieskim, po czym dodaje się je do przygotowanych kulek.

Przepłucz probówkę stożkową, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały przeniesione. Następnie usuń DPBS oraz strzykawki z STLV. Usuń również korek z centralnego portu, używając pipety serologicznej 10 ml.

Przenieś zawiesinę kulek z komórkami nabłonkowymi do STLV. Jednorazowo wypłucz probówkę stożkową, aby przenieść wszystkie komórki i kulki. Następnie załóż z powrotem korek portu centralnego.

Następnie wyjmij tłoki z strzykawki 5 ml oraz strzykawki 10 ml i pozostaw tłoki w opakowaniach. Aby zachować sterylność, zakręć otwory strzykawek za pomocą otwartych kurków. Napełnij STLV pożywką.

Wymień tłoki i zamknij kurek. Następnie inkubuj nowo zaszczepioną kulturę STLV w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut bez rotacji. Po wyjęciu STLV z inkubatora otwórz kurek.

Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą tłoków i zamknij kurek odcinający. Następnie ustaw STLV na obrót ciągły z prędkością 20 RPM w inkubatorze. Po 96 do 120 godzinach wymień medium, wyjmując strzykawki i otwierając oba kurki odcinające STLV, aby umożliwić osiadanie kulek i komórek.

Po osadzeniu komórek, odlać około 75% pożywki przez port boczny za pomocą strzykawek w celu przeprowadzenia protokołu dokarmiania. Ponownie uzupełniać pożywkę w zależności od potrzeb, opierając się na metabolizmie komórkowym. Należy również monitorować wzrost i żywotność agregatów co pięć do siedmiu dni.

Aby uniknąć rozrywania agregatów, należy użyć końcówki do pipety 1000 µL, odciętej około dwóch centymetrów od wierzchołka i wysterylizowanej. Ostrożnie pobrać 200 µL agregatów z otworu centralnego i podzielić na dwie probówki 1,5 mL. Jedną porcję należy wykorzystać do monitorowania żywotności komórek. Po oddzieleniu komórek od kulek, żywotność należy ocenić za pomocą testu wykluczania trypan blue.

Barwienie do obrazowania agregatów komórkowych. Dodać od 0,5 do 1 ml pożywki do drugiej alikwoty agregatów o objętości 1,5 ml i przenieść do małej szalki Petriego, używając końcówki do pipety 1000 µL z odciętym wierzchołkiem. Obrazować agregaty.

W przypadku niektórych modeli komórek nabłonkowych, przy użyciu odwróconego mikroskopu świetlnego, konieczne jest przeniesienie agregatów do jednorazowego naczynia w celu zwiększenia napowietrzania hodowli na około tydzień przed zbiorem agregatów. Do analizy należy wyjąć strzykawki z STLV i odlać około 50% medium przez port boczny. Następnie należy usunąć centralny korek i ostrożnie przelać całą zawartość z portu centralnego do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów.

Przepłucz STLV dwukrotnie pięcioma mililitrami pożywki i połącz płukanki z zebranymi agregatami. Następnie przenieś agregaty z 50 mililitrowej probówki stożkowej do urządzenia Harv. Po jednym tygodniu ostrożnie zbierz agregaty do potencjalnych formatów testów, analiz i pomiarów; zróżnicowane ludzkie agregaty nabłonkowe były hodowane w systemie bioreaktora STLV.

Obrazy SEM i TEM zostały pozyskane z ludzkich komórek pochwy hodowanych w STLV przez 39 dni. Należy zauważyć, że agregaty 3D wykazują cechy ultrastrukturalne podobne do tkanek: mikrofałdy, w wgłębienia, wewnątrzkomórkowe pęcherzyki wydzielnicze oraz mikrokosmki na powierzchni apikalnej; obrazy konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej 3D komórek pochwy wskazują na ekspresję mucyny oraz markerów specyficznych dla komórek nabłonkowych i różnicowania końcowego. Fizjologicznie istotne fenotypy stanowią również doskonałą platformę do oceny toksyczności związków.

Test MTT, powszechnie stosowany w celu pomiaru żywotności, metabolizmu lub proliferacji komórek, może być wykorzystywany do oceny toksyczności różnych substancji chemicznych i związków. Alternatywnie, toksyczność po traktowaniu związkami testowymi można zmierzyć za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu. W tym przykładzie, po traktowaniu NONOXINOL nine, agregaty pochwowe wykazały odpowiedź toksyczną podobną do modeli eksplantów szyjki macicy, lecz odmienny profil w porównaniu do monowarstw.

Agregaty 3D są funkcjonalnie responsywne, na przykład po stymulacji cząsteczkami pochodzenia mikrobiologicznego, które są rozpoznawane przez receptory Toll-podobne. Agregaty reagują poprzez wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym białka IL6 oraz ekspresję transkrypcyjną receptora progesteronu. W komórkach pochwy można również zaobserwować receptor reagujący na stymulację hormonalną.

Agregaty 3D nie tylko wykazują zdolność do reagowania na cząsteczki patogenów i hormonów, ale są również w stanie funkcjonalnie wspierać infekcję wirusem prostego opryszczki typu 2. Obraz z mikroskopii konfokalnej 3D agregatów pochwowych zainfekowanych HSV 2 potwierdza przebieg infekcji. Właściwości fizyczne i funkcjonalne poszczególnych komórek w obrębie agregatów można również określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, na przykład przeprowadzając analizę cytometryczną w celu pomiaru ekspresji powierzchniowej Muc1 na poszczególnych komórkach pochwy.

Trójwymiarowe agregaty pochwy wykazywały niższy procent mucyny 1 na swojej powierzchni w porównaniu do monowarstw po ich rozwoju. Technika ta umożliwiła badaczom z zakresu biologii tkanek i chorób zakaźnych badanie struktury oraz odpowiedzi fizjologicznych na bodźce. Dzięki zastosowaniu tych modeli organotypowych lepiej odwzorowujemy biologię człowieka.