Name: Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na mezoporowatych cienkich warstwach krzemionki w celu odkrycia biomarkerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Odkryj metodę wzbogacania białek o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej przy użyciu mezoporowatych cienkich warstw krzemionki. Technika ta umożliwia skuteczną analizę proteomiczną i odkrywanie biomarkerów diagnostycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu Alliance of NanoHealth Pre-center Award (W81XWH-11-2-0168) oraz Texas Center for Cancer Nanomedicine (1U54CA151668-01).

1. Wytwarzanie chipa
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór powlekający do chipa, zaczynając od roztworu prekursora krzemianu hydrolizowanego. Wymieszaj 14 mL tetraetylortokrzemianu (TEOS) z 17 mL etanolu, 6,5 mL wody dejonizowanej i 0,5 mL 6M HCl przy silnym mieszaniu (1200 rpm) przy użyciu mieszadła magnetycznego z podgrzewaniem. Podgrzewaj ten roztwór w temperaturze 80 °C przez 2 godziny, utrzymując stałe mieszanie.</li>
	<li>Przygotuj roztwory polimerów, dodając wybrany kopolimer triblokowy (pluronic F127, L121 i P123) do 10 mL etanolu w temperaturze pokojowej przy silnym mieszaniu. Dopełnij mieszaninę, dodając 7,5 ml roztworu krzemianu (z kroku 1.1) do roztworu kopolimeru triblokowego, a następnie mieszaj intensywnie przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Otrzymano w ten sposób końcowy roztwór powlekający.</li>
	<li>Nanieś 1 mL roztworu powlekającego na 4-calowy wafelek krzemowy metodą spin-coatingu przy prędkości 1500 rpm przez 20 sekund. Następnie podgrzewaj w temperaturze 80 °C przez 12 godzin.</li>
	<li>Podgrzewaj filmy w celu usunięcia organicznego surfaktantu, zwiększając temperaturę w tempie 1 °C na minutę do 425 °C, a następnie wypalaj przez 5 godzin.</li>
	<li>Poddaj powierzchnię chipa z mezoporowatej krzemionki (MPS) obróbce wstępnej za pomocą popiółkowania plazmą tlenową (Plasma Asher - March Plasma System). (Przepływ O2: 80 sccm, moc: 300 W, czas: 10 minut).</li>
	<li>Opcjonalna chemiczna modyfikacja powierzchni: przeprowadź silanizację chipów w 3% roztworze organosilanu w mieszaninie metanol:woda dejonizowana (19:1) przez 72 godziny w temperaturze pokojowej w komorze rękawicowej z N2. Płucz sekwencyjnie metanolem i wodą dejonizowaną. Utwardź chipy w temperaturze 110 °C przez 15 minut w piekarniku z wymuszonym obiegiem powietrza.</li>
</ol>
2. Obróbka wstępna próbek
<ol>
	<li>Do każdej próbki surowicy dodać TFA oraz ACN w taki sposób, aby stężenia końcowe wynosiły 0,01% TFA i 5% ACN. Wymieszać za pomocą wstrząsacza wortexowego.</li>
	<li>Próbki inkubować na wstrząsarce stołowej w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Frakcjonowanie surowicy
<ol>
	<li>Przedwstępnie wypiekać chipy przez noc w piecu w temperaturze 160 °C. Alternatywnie, przechowywać chipy w deskryka-torze do momentu użycia, aby zapobiec nawodnieniu powierzchni przez wodę zawartą w powietrzu otoczenia.</li>
	<li>Użyć sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie cząstki, które mogą znajdować się na powierzchni chipa.</li>
	<li>Przyciąć prefabrykowane, zakupione szkiełka nakrywowe z komorami CultureWell tak, aby zawierały pożądaną liczbę studni. Oczyścić szkiełko nakrywowe 100% etanolem, a następnie umieścić je na powierzchni chipa MPS. Docisnąć szkiełko nakrywowe pęsetą, aby zapewnić całkowite uszczelnienie z chipem.</li>
	<li>Napipetować 10 μL próbki surowicy do każdej studni o średnicy 3 mm. Inkubować przez 30 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odssać surowicę ze studni i usunąć. Napipetować 10 μL wody dejonizowanej do każdej studni, aby wypłukać większe białka. Powtórzyć 4 razy.</li>
	<li>Napipetować 5 μL buforu elucyjnego (0,1% TFA + 50% ACN) do każdej studni z próbką. Pipetować w górę i w dół 30 razy, poruszając końcówką pipety wewnątrz studni, aby wymieszać bufor elucyjny. (Nakładać bufor elucyjny tylko na 1-2 próbki jednocześnie, aby zapobiec zbyt szybkiemu odparowaniu buforu elucyjnego).</li>
	<li>Po wymieszaniu odessać cały bufor elucyjny i umieścić go w probówce do mikrowirówki do czasu przeprowadzenia analizy MALDI-TOF.</li>
	<li>Aby zasymulować złożoność próbki biologicznej i ocenić efekt wzbogacania przy pozyskiwaniu gatunków o niskiej masie cząsteczkowej za pomocą naszego systemu frakcjonowania na chipie, wybrano i przygotowano standardową mieszaninę białek i peptydów składającą się z dwudziestu sześciu różnych gatunków o szerokim zakresie mas cząsteczkowych (900-66 500 Da), pI (4,0-10,2) oraz stężeń (0,5-8 pmol/μl) (patrz lista białek w Tabeli 1).</li>
</ol>
4. Analiza peptydów metodą MALDI-TOF
<ol>
	<li>Nanieś 0,5 μL próbki na płytkę docelową MALDI i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Nanieś 0,5 μL matrycy (kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy (CHCA), 5 g/L) lub nasyconego roztworu kwasu trans-3,5-dimetoksy-4-hydroksycynamonowego (SA) w 50% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA i pozostaw do współkrystalizacji.</li>
	<li>Nanieś 0,5 μL roztworu kalibracyjnego na każdy punkt kalibracyjny i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Włóż płytkę docelową do spektrometru mas MALDI-TOF. Urządzenie powinno być ustawione w trybie reflektora dodatniego z intensywnością lasera 4200 i 3000 impulsów na próbkę. Wybrany zakres masy powinien wynosić od 800 do 5000 Da z masą docelową 2000 Da.</li>
	<li>Przeprowadź taką samą analizę MALDI-TOF w trybie liniowym, zmieniając zakres masy na 900 do 10 000 Da lub 3000 do 70 000 Da oraz masę docelową na 5000 Da.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Surowe widma zostały przetworzone za pomocą oprogramowania ConvertPeakList, a następnie dane wyeksportowano do oprogramowania SpecAlign w celu wstępnego przetwarzania. Wszystkie widma wyrównano metodą korelacji PAFFT, a intensywności znormalizowano względem całkowitego prądu jonowego (TIC) w każdym odpowiadającym im widmie. Wszystkie widma wygładzono oraz odszumiono z zastosowaniem czynników odpowiednio 4 i 0,5. Piki wykryto przy linii bazowej 0,5, oknie masowym 21 i stosunku wysokości 1,5; przed analizą usunięto wartości ujemne.</li>
	<li>Grupowanie hierarchiczne wykonano przy użyciu programu Cluster 3.0 i zwizualizowano w oprogramowaniu MapleTree. Dane MALDI MS (intensywności pików m/z) poddano transformacji logarytmicznej, normalizacji oraz centrowaniu według mediany. Do obliczenia odległości między próbkami wykorzystano korelację Pearsona, a następnie przeprowadzono grupowanie z pełnym wiązaniem (complete linkage clustering).</li>
	<li>Do porównania między grupami (n = 2 grupy) dla każdego wykrytego piku MS przed analizą nienadzorowanego grupowania hierarchicznego zastosowano niezależny test t Studenta. Wartość P równą 0,02 lub niższą uznano za istotną statystycznie w celu wyboru peptydów i białek różnicowo pozyskiwanych z różnych mezoporowatych chipów proteomicznych (duże pory vs. małe pory).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Jak pokazano na Rysunku 1, w niniejszym badaniu wytworzono serię cienkich warstw mezoporowatej krzemionki o różnych nanoteksturach i szczegółowo zbadano ich zastosowanie w selektywnym wychwytywaniu i wzbogacaniu niskocząsteczkowych (LMW) peptydów i białek z ludzkiej surowicy. Rysunek 2a oraz b przedstawiają widma MS nieprzetworzonej próbki surowicy odpowiednio dla peptydów w zakresie od 900 do 10 000 Da oraz białek w zakresie od 3 000 do 70 000 Da. Widma te obrazują tłumienie sygnału w obszarze LMW spowodowane obecnością dobrze jonizujących się, wysoką koncentracją występujących białek o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW), takich jak albumina. Rysunek 2c oraz d przedstawiają widma MS próbki surowicy po frakcjonowaniu za pomocą MPS L121 (rozmiar porów, 6 nm). Większość dużych cząsteczek została usunięta, co doprowadziło do znacznego wzbogacenia składników LMW. W ramach kontroli tę samą próbkę surowicy naniesiono na nieporowatą powierzchnię czystej krzemionki, aby ocenić swoistość warstw MPS w odzyskiwaniu LMWP. Jak widać na Rysunku 2e oraz f, nie odnotowano znaczącego wychwytu peptydów ani białek z nieporowatej krzemionki. Można zatem wywnioskować, że to architektura mezoporowata, a nie powinowactwo powierzchni krzemionki, stanowi główny czynnik wpływający na wzbogacanie LMWP.
Precyzyjnie kontrolowane zmiany wielkości porów można osiągnąć poprzez zastosowanie kopolimerów o różnych długościach bloków hydrofobowych. Wykorzystując zaprojektowaną mieszaninę białek i peptydów, zbadano wpływ wielkości porów na skuteczność odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej (LMW), stosując cienkie warstwy MPS przygotowane z czterech surfaktantów Pluronic (F127, P123, L121 oraz L121 z dodatkiem środka pęczniejącego) o różnych stosunkach objętościowych komponentów hydrofilowych i hydrofobowych, aby utworzyć pory o wielkościach odpowiednio 3,7 nm, 5,2 nm, 7,4 nm i 9,0 nm. Ten zakres wielkości porów pozwolił na odzyskanie różnych zestawów peptydów i białek z tej samej próbki surowicy poprzez wykluczanie wielkościowe i kształtowe (Rycina 3). Widma białek o wysokiej masie cząsteczkowej wykazują punkt odcięcia molekularnego (molecular cut-off) dla każdego typu chipa. Oprócz zależnego od wielkości ubytku białek o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW), frakcjonowanie roztworu wzorcowego na chipie wykazuje różnicowe i selektywne wzbogacenie gatunków LMW powiązane z wielkością porów. Dwukierunkowe grupowanie hierarchiczne przedstawione na Rycynie 3b pokazuje wzorzec wzbogacenia standardów LMW uzyskany za pomocą różnych MSC. Nawet jeśli wszystkie peptydy znajdują się poniżej punktu odcięcia molekularnego chipów, istnieje dodatnia korelacja między wielkością porów a masą cząsteczkową uwięzionych gatunków. MSC z dużymi porami, do 9 nm, preferencyjnie wychwytują większe peptydy, podczas gdy mniejsze peptydy są skuteczniej odzyskiwane przez chipy z mniejszymi porami. Przekształcenie strukturalne układu mezoporowatego przeprowadzono poprzez regulację stężenia polimeru matrycy. Zwiększenie stężenia polimeru matrycy doprowadziło do zmniejszenia krzywizny międzyfazowej między fazami wody, kopolimeru i krzemianu, co w konsekwencji zapoczątkowało powiązaną progresję od struktury sferycznej do cylindrycznej. Pluronic F127, dzięki swojej wysokiej masie cząsteczkowej, posiada wysoki stopień okresowości strukturalnej. Poprzez zwiększenie stężenia F127 w roztworze początkowym można uzyskać różne okresowe nanostruktury cienkich warstw MPS, od nanostruktur 3D do nanostruktur 2D. Trójwymiarowe nanostruktury sześcienne i plastromiodowe heksagonalne, posiadające bardziej pożądane połączenia nanoporów i bardziej dostępną morfologię nanoporów, wykazują lepszą wydajność w selektywnym wzbogacaniu peptydów LMW niż struktura heksagonalna 2D, mimo że mają podobne rozkłady wielkości porów i ten sam punkt odcięcia molekularnego dla frakcjonowania surowicy (Rycina 4). Zoptymalizowaliśmy również konjugację organokrzemianu na chipach MPS, wprowadzając popielanie plazmą tlenową w celu wstępnego przygotowania powierzchni chipa. Aby jakościowo zbadać efekt elektrostatyczny na selektywne wzbogacenie na chipie, wykorzystano mieszaninę białek i peptydów. Analiza MS roztworu standardów proteomicznych frakcjonowanych na chipach MPS przygotowanych z L121 i konjugowanych z chemicznymi grupami funkcyjnymi przedstawiona jest na Rycynie 5. Peptydy i białka LMW naładowane dodatnio oraz ujemnie są wychwytywane odpowiednio przez chipy kationowe i anionowe. Ilościowe porównanie wielu chipów MPS w odzyskiwaniu peptydów o dodatnim ładunku netto przedstawiono na Rycynie 5a. Chipy o ładunku ujemnym oraz chipy bez żadnych modyfikacji (pierwotnie z niewielkim ładunkiem ujemnym) wykazują znacznie wyższe wzbogacenie tych peptydów niż chipy modyfikowane APTES (-NH2). I odwrotnie, naładowane dodatnio chipy MPS posiadają wyjątkową zdolność odzyskiwania peptydów o ujemnym ładunku netto, co wykazano na Rycynie 5b. Natomiast α-Endorfina nie wykazuje znaczącej zmiany ze względu na swój punkt izoelektryczny (PI) wynoszący około 6. 
<img alt="Schemat oczyszczania białek: inkubacja surowicy, płukanie i elucja dla chromatografii wykluczania cząsteczkowego." src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zasada frakcjonowania na chipach MPS i wzbogacania LMW. Po naniesieniu próbki na powierzchnię, białka i peptydy LMW zostają uwięzione w porach, podczas gdy większe cząsteczki pozostają na zewnątrz porów i są usuwane podczas etapów płukania. Wzbogacone frakcje są następnie eluowane i analizowane metodą MALDI.
<img alt="Wykres widm spektrometrii mas, względna intensywność vs. m/z, analiza białek, dane eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wzbogacanie peptydów przy użyciu chipów z cienkiej warstwy mezoporowatej krzemionki. Profile MALDI MS zarówno w niskim zakresie mas (900 do 10 000 Da), jak i w wysokim zakresie mas (3000 do 70 000 Da) przed (a,b) i po (c,d) przetwarzaniu surowicy na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki (L121, 6 nm). Odzysk cząsteczek jest znacznie mniejszy w przypadku zastosowania pustych nieporowatych powierzchni krzemionkowych (e,f).
<img alt="Wyniki spektrometrii masowej wykazujące identyfikację białek i analizę mapy ciepła; intensywność względna względem M/z." src="/files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Próg odcięcia cząsteczek i wzbogacanie zależne od wielkości w chipach MPS. (a) Powiększony widok widm MALDI demonstrujący charakterystyczny próg odcięcia cząsteczek dla każdego chipa MPS, korelujący z wielkością porów. (b) Dwukierunkowe hierarchiczne grupowanie cech mieszaniny peptydów pomiędzy różnymi chipami. Intensywność koloru czerwonego lub żółtego wskazuje na względne stężenie peptydów. Większe pory zwiększały odzysk większych peptydów (od 3600 do 8500 Da), natomiast mniejsze peptydy (od 900 do 3500 Da) były preferencyjnie odzyskiwane z chipów o mniejszych porach.
<img alt="Analiza nanocząstek przy użyciu mikroskopii elektronowej oraz wykresy rozkładu wielkości dla polipeptydów." src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Charakterystyka fizyczna cienkich warstw MPS oraz selektywnego odzyskiwania z różnymi nanostrukturami. Dyfraktogramy XRD (a, b, c), TEM (wstawki a, b, c), Pluronic F127 w różnych stężeniach w roztworze prekursora: 4,0×10-3 M (a), 6,0×10-3 M (b) oraz 8,0×10-2 M (c). (d) Wykres słupkowy intensywności detekcji ilustrujący selektywne odzyskiwanie peptydów na trójwymiarowych kubicznych i trójwymiarowych heksagonalnych chipach proteomicznych F127 (odpowiednio Cub i Hex). Różne modyfikacje strukturalne wykazują selektywne wzbogacenie.
<img alt="Wykres słupkowy spektrometrii mas peptydów; względna intensywność analizowanych peptydów dodatnich i ujemnych." src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Odzyskiwanie specyficzne względem ładunku dla chipów o różnych funkcjach powierzchniowych. Wykres słupkowy intensywności MS detekcji selektywnie wychwyconych peptydów na funkcjonalizowanych chipach. W zależności od punktu izoelektrycznego, peptydy są naładowane dodatnio lub ujemnie przy pH 7.0. (a) Peptydy dodatnie ((1) des-Arg1-bradykinina, (2) bradykinina, (3) substancja P-amid, (4) neurotensyna, (5) ACTH(1-17), (6) ACTH(7-38)) są specyficznie wzbogacane na powierzchniach naładowanych ujemnie. (b) Peptydy ujemne ((7) Glu1-fibrinopeptyd B, (8) α-endorfina, (9) ACTH(18-39), (10) insulina, (11) EGF, (12) insulinopodobny GFII) są specyficznie wzbogacane na powierzchniach naładowanych dodatnio. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
<img alt="Widma spektrometrii mas i wykresy korelacji; analiza danych próbek białek w czasie." src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Stabilizacja frakcjonowanej surowicy na chipie. (a) Reprezentatywne profile MALDI peptydów i białek o niskiej masie cząsteczkowej (LMW) elowanych bezpośrednio po frakcjonowaniu surowicy (góra) lub po 3 tygodniach przechowywania na chipie w temperaturze pokojowej (dół). (b) Od góry do dołu: Analiza regresji liniowej średnich intensywności wykrytych pików MS w każdym powtórzeniu w porównaniu do powtórzenia 1 dla świeżo frakcjonowanej surowicy oraz surowicy frakcjonowanej po 3 tygodniach przechowywania na chipach MPS w temperaturze pokojowej. Wskazano równanie, CV oraz współczynnik determinacji (R2). Proszę <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

<ol><li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li>
<li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+early+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li>
<li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li>
<li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+proteomics%3A+written+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li>
<li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics%3A+old%2C+old+fashioned%2C+but+it+still+climbs+up+the+mountains%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li>
<li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przybywa dowodów na to, że region niskiej masy cząsteczkowej proteomu krążenia jest bogatym źródłem biomarkerów diagnostycznych do wczesnego wykrywania chorób. W niniejszej technologii zaprezentowano serię chipów z mezoporowatej krzemionki o różnych rozmiarach porów, strukturach porów i modyfikacjach, służących do selektywnego wzbogacania peptydów i białek o niskiej masie cząsteczkowej. Aby ocenić stabilność białek, chipy MPS inkubowano z ludzką surowicą, suszono po przemyciu i przechowywano przez 3wk w temperaturze pokojowej. Uzyskane wzorce białek/peptydów były porównywalne z wzorcami z surowicy świeżo frakcjonowanej (Rysunek 6a), co potwierdziły wyniki analizy statystycznej przedstawione na Rysunku 6b . Zmienność sygnałów pików mierzona średnim współczynnikiem CV oszacowano na 12,7% dla surowicy surowej i na 14,2% dla próbek frakcjonowanych. Te niewielkie różnice mogły wynikać z wewnętrznej zmienności instrumentu MALDI i sugerują, że wstępne przygotowanie oraz przechowywanie na chipie nie wywołały żadnych istotnych zmian w profilach białek MS. Ten sam eksperyment przeprowadzono na nieporowatym krzemie. Wysuszona surowica odzyskana po przechowywaniu na powierzchni krzemowej została poddana frakcjonowaniu na chipach MPS przed analizą MALDI. Uzyskany słaby profil MS wykazał zaletę stabilizacji zapewnianą przez powierzchnię mezoporowatą. W analogii do wcześniej postulowanych mechanizmów, hipotezujemy, że gatunki LMW uwięzione w nanoporach zostały chronione przed degradacją dzięki wykluczeniu rozmiarowemu proteaz lub przez steryczne hamowanie ich aktywności proteolitycznej w ograniczonej przestrzeni nanoporów. Metoda oparta na chipach MPS może być potężnym narzędziem w badaniach profilowania peptydów i białek LMW w złożonych płynach biologicznych. Chipy MPS są tanie w produkcji i pozwalają na skalowanie produkcji w celu jednoczesnego przetwarzania dużej liczby próbek, co zapewnia korzystne funkcje dla badań przesiewowych i odkrywania biomarkerów.

<table><tbody><tr><td>Tetraetoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131903</td><td>98%</td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science, Inc.</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher</td><td>Nordson March</td><td>AP-600</td><td></td></tr><tr><td>Elipsometr spektroskopowy</td><td>J. A. Woollam Co.</td><td>M-2000DI</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Applied Biosystems</td><td>Voyager-DE-STR</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroksykwas cynamonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td>Matryca dla MALDI-TOF</td></tr><tr><td>trans-3,5-dimetoksy-4-hydroksykwas cynamonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85429</td><td>Matryca dla MALDI-TOF</td></tr><tr><td>Mieszadło z podgrzewaniem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>11-475-30Q</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywkowe szkiełka z komorami CultureWell</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL103350</td><td>śr. 3 mm &amp;#215; głębokość 1 mm, 3-10 &amp;#x03BC;L, sterylne</td></tr><tr><td>Pluronic F 127</td><td>BASF</td><td></td><td>PEO&lt;sub&gt;106&lt;/sub&gt;-PPO&lt;sub&gt;70&lt;/sub&gt;-PEO&lt;sub&gt;106&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Pluronic L121</td><td>BASF</td><td></td><td>PEO&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;-PPO&lt;sub&gt;70&lt;/sub&gt;-PEO&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Pluronic P123</td><td>BASF</td><td></td><td>PEO&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt;-PPO&lt;sub&gt;70&lt;/sub&gt;-PEO&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Właściwości fizykochemiczne i zaprojektowane stężenia (masa cząsteczkowa i punkt izoelektryczny) wybranych standardów peptydowych i białkowych.</td></tr></tbody></table>

wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Identyfikacja krążących biomarkerów wykazuje ogromny potencjał w zastosowaniach nieinwazyjnych w ramach wczesnej diagnostyki i prognostyki, a także w monitorowaniu efektywności terapeutycznej.1-3 Krążący proteom o niskiej masie cząsteczkowej (LMWP), składający się z małych białek uwalnianych z tkanek i komórek lub fragmentów peptydowych pochodzących z proteolitycznej degradacji większych białek, był wiązany ze stanem patologicznym u pacjentów i prawdopodobnie odzwierciedla stan choroby.4,5 Pomimo tych potencjalnych zastosowań klinicznych, wykorzystanie spektrometrii mas (MS) do profilowania LMWP z płynów biologicznych okazało się bardzo trudne ze względu na szeroki zakres dynamiczny stężeń białek i peptydów w surowicy.6 Bez wstępnego przygotowania próbki niektóre z białek o wysokiej zawartości uniemożliwiają wykrycie gatunków o niskiej zawartości w surowicy/osoczu. Obecne podejścia oparte na proteomice, takie jak dwuwymiarowa elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie (2D-PAGE) oraz metody proteomiki typu shotgun, są pracochłonne, charakteryzują się niską przepustowością i oferują ograniczoną przydatność w zastosowaniach klinicznych.7-9 W związku z tym niezbędna jest bardziej efektywna strategia izolacji LMWP z krwi, która umożliwi wysokoprzepustowe badanie próbek klinicznych.
W niniejszej pracy przedstawiamy szybki, wydajny i niezawodny system wielofrakcyjny oparty na chipach z krzemionki mezoporowatej do specyficznego wyodrębniania i wzbogacania LMWP.10,11 Cienkie warstwy krzemionki mezoporowatej (MPS) o regulowanych cechach w skali nano zostały wytworzone przy użyciu metody z matrycą z triblokowego kopolimeru. Stosując różne matryce polimerowe i różne stężenia polimeru w roztworze prekursorowym, określono różne rozkłady wielkości porów, struktury porów, ich łączność oraz właściwości powierzchniowe, a następnie zastosowano je do selektywnego odzyskiwania białek o niskiej masie. Selektywne dzielenie wzbogaconych peptydów na różne podklasy zgodnie z ich właściwościami fizykochemicznymi zwiększy wydajność odzyskiwania i wykrywania gatunków o niskiej zawartości. W połączeniu ze spektrometrią mas i analizą statystyczną wykazaliśmy korelację między charakterystyką nanofazową cienkich warstw krzemionki mezoporowatej a specyficznością i skutecznością pozyskiwania proteomu o niskiej masie. Zaprezentowane tutaj wyniki ujawniają potencjał technologii opartej na nanotechnologii jako potężnej alternatywy dla konwencjonalnych metod pozyskiwania LMWP z złożonych płynów biologicznych. Ze względu na możliwość dostosowania właściwości materiału, potencjał do niskokosztowej produkcji, prostotę i szybkość pobierania próbek oraz znacznie mniejsze wymagania dotyczące ilości próbki do analizy, ta nowa nanotechnologia będzie miała istotny wpływ na dziedzinę badań nad biomarkerami proteomicznymi i kliniczną ocenę proteomiczną.

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Identyfikacja krążących biomarkerów stwarza ogromny potencjał dla nieinwazyjnych metod wczesnej diagnostyki i prognozowania, a także dla...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie technologii opartej na cienkiej warstwie mezoporowatego krzemionki do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie wykonanie chipów z cienką warstwą mezoporowatego krzemionki i poddanie ich wstępnej obróbce metodą popielania plazmą tlenową. Drugim krokiem jest przeprowadzenie prostego przygotowania surowicy, a następnie wzbogacenie białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy poprzez frakcjonowanie na chipie.Po elucji białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z chipa, cząsteczki są profilowane przy użyciu spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą i analizą czasu przelotu (MALDI-TOF). Ostatnim krokiem jest wykorzystanie specjalistycznego oprogramowania do przeprowadzenia analizy danych. W rezultacie widma mas oraz wyniki analizy statystycznej ujawniają specyficzność i skuteczność pozyskiwania proteomu o niskiej masie cząsteczkowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi technologiami, takimi jak elektroforeza 2D i Western blot, jest wysoka zdolność do wzbogacania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej i niskiej zawartości w surowicy, wysoka przepustowość i efektywność czasowa, zmniejszenie wymagań co do ilości próbki surowicy oraz niski koszt. Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest kontrola morfologii sieci nanoporów, takiej jak rozkład wielkości porów, ich kształt oraz połączenia między nimi. Cechy te determinują bowiem czułość i swoistość profilowania docelowych sygnatur krwi.Aby zapewnić powtarzalność, dążymy do dokładnej kontroli stosunku molowego materiału wyjściowego i rygorystycznego przestrzegania instrukcji przygotowania roztworu do powlekania chipa. Należy rozpocząć od przygotowania roztworu prekursora krzemianu hydrolizowanego. W warunkach intensywnego mieszania połączyć 14 ml teos z 17 ml etanolu o stężeniu 200 proof, 6,5 ml wody dejonizowanej oraz 0,5 ml 6 M kwasu solnego.Kontynuuj intensywne mieszanie i podgrzewaj otrzymany roztwór w temperaturze 80 °C przez dwie godziny. Następnie przygotuj roztwór kopolimeru triblokowego, dodając wybrany roztwór polimeru do 10 ml etanolu w temperaturze pokojowej przy energicznym mieszaniu. W tej demonstracji zastosowano onic F1 27.Dopełnij mieszaninę, dodając roztwór krzemianu do tego triblokowego kopolimeru, a następnie mieszaj intensywnie przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Nanieś jeden mililitr otrzymanego roztworu powłoki na czterocalowy wafelek krzemowy za pomocą spin coatingu przy prędkości 1 500 RPM przez 20 sekund. Następnie podgrzewaj wafelek w temperaturze 80 °C przez 12 godzin.Następnie zwiększaj temperaturę o jeden stopień Celsjusza na minutę, aż do osiągnięcia 425 °C, a następnie wypalaj w tej temperaturze przez pięć godzin. Kolejnie poddaj powierzchnię otrzymanego chipa z krzemionki mezoporowatej (MPS) wstępnej obróbce za pomocą popielania plazmą tlenową. Następnie zmierz grubość filmu oraz porowatość, używając oksymetru.W międzyczasie do każdej próbki surowicy należy dodać kwas trifluorooctowy do stężenia końcowego 0,01% oraz acetonitryl do stężenia końcowego 5%. Następnie próbki te należy mieszać na wstrząsarku wierzchowej w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po uprzednim wypalaniu płytek przez noc w piekarniku w temperaturze 160°C. Za pomocą sprężonego powietrza należy usunąć wszelkie cząsteczki, które mogą znajdować się na powierzchni płytki. Szkiełko nakrywkę należy oczyścić 100% etanolem i umieścić na powierzchni płytki NPS, tworząc dołki na próbki.Docisnąć szkiełko nakrywką za pomocą pęsety, aby zapewnić szczelne przyleganie do chipa. Następnie do każdego otworu nanieść pipetą 10 µL próbki surowicy. Inkubować przez 30 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej, aby umożliwić białkom o niskiej masie cząsteczkowej wniknięcie w pory. Po inkubacji odessać surowicę z otworów i usunąć.Następnie pipetą nanieś 10 µL wody dejonizowanej do każdej studzienki, aby wypłukać większe białka. Powtórz to płukanie czterokrotnie, pracując jednocześnie tylko z jedną lub dwiema studzienkami. Aby zapobiec odparowaniu, szybko dodaj 5 µL buforu elucyjnego do każdej próbki.Wykonać 30-krotne pipetowanie w górę i w dół, poruszając końcówką pipety w studzience w celu wymieszania zawartości. Po wymieszaniu odessać cały bufor elucyjny i przenieść go do probówki do mikrocentryfugi do momentu rozpoczęcia analizy spektrometrią mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą i analizatorem czasu przelotu (MALDI-TOF). Nanieść 0,5 µL próbki na płytkę docelową MALDI i pozostawić do wyschnięcia, następnie nanieść 0,5 µL matrycy w 50% acetonitrylu zawierającym 0,1% TFA i pozwolić na współkrystalizację. Następnie nanieść 0,5 µL roztworu kalibracyjnego na pole kalibracyjne. Po wyschnięciu umieścić płytkę docelową w spektrometrze mas MALDI-TOF.Urządzenie należy przełączyć w tryb reflektora dodatniego (positive reflector mode) przy intensywności lasera 4 i 203 000 strzałach na próbkę. Najpierw należy przeprowadzić analizę w wybranym zakresie mas od 800 do 5 000 Daltonów z masą docelową 2000 Daltonów. Następnie należy wykonać tę samą analizę MALDI-TOF w trybie liniowym, zmieniając zakres mas na 900 do 10 000 Daltonów lub 3000 do 70 000 Daltonów przy masie docelowej 5 000 Daltonów.Po procesie analizy multi top przetwórz surowe widma za pomocą oprogramowania convert peak list, a następnie wyeksportuj je do programu specal. W celu wstępnego przetwarzania w oprogramowaniu Align dopasuj wszystkie widma, korzystając z wyrównywania pików metodą szybkiej transformaty Fouriera lub korelacji P-A-F-F-T, i znormalizuj intensywności do całkowitego prądu jonowego. Przeprowadź detekcję pików przy zastosowaniu stosunku wysokości równym dwóm oraz 0.3% okna masy.Przed analizą należy skorygować linię bazową i usunąć wartości ujemne. Import plików T 2D do widoku markerów jest pierwszym krokiem nadzorowanego przetwarzania danych MALDI dla różnych grup. Rozpocznij od uruchomienia oprogramowania marker view, a następnie zaimportuj pliki T 2D.Wybierz folder zawierający pliki T 2D i ustaw parametry przetwarzania widm. Następnie otwórz tabelę próbek. Zaznacz próbki z tej samej grupy i przypisz im etykietę grupy.Znormalizuj próbki, korzystając z sum całkowitych pól. Następnie otwórz okno opcji. Przypisz unikalny kolor i symbol dla każdej grupy.Następnie wykonano analizę głównych składowych (PCA) oraz test t dla próbek aktywnych danych, które zostały podzielone na różne grupy na podstawie wyników PC1 i PC2. Potencjalne biomarkery wyznaczono na podstawie wykresów ładunków PC, które prezentują podsumowanie profilu intensywności wybranych biomarkerów po kliknięciu w profile wykresów dla wybranych pików. Punkty o większych wartościach pozwalają na rozróżnienie poszczególnych grup.Po porównaniu grup za pomocą testu T, posortuj tabelę według rosnących wartości P, aby zidentyfikować piki pozwalające rozróżnić poszczególne grupy. Przedstawione tutaj są widma MS próbki surowicy dla peptydów w zakresie od 900 do 10 000 Daltonów oraz dla białek w zakresie od 3000 do 70 000 Daltonów. Widma nieprzetworzonych próbek ilustrują tłumienie sygnału w obszarze niskich mas cząsteczkowych wynikające z obecności dobrze jonizowanych, wysoce obfitych białek o wysokiej masie cząsteczkowej, takich jak albuminy. Po frakcjonowaniu za pomocą cienkich warstw MPS większość dużych cząsteczek została usunięta, co doprowadziło do znacznego wzbogacenia komponentów o niskiej masie cząsteczkowej. W ramach kontroli ta sama próbka surowicy została naniesiona na nieporowatą powierzchnię z czystej krzemionki.Aby ocenić specyficzność cienkich warstw MPS w odzyskiwaniu proteomu o niskiej masie cząsteczkowej, sprawdzono, czy zachodzi znaczące wychwytywanie peptydów lub białek z nieporawatej krzemionki. Stwierdzono, że nie następuje ono, co pozwala wywnioskować, że to mezoporowata architektura, a nie powinowactwo powierzchni krzemionki, stanowi dominujący czynnik w wzbogacaniu LMWP. Precyzyjnie kontrolowane zmiany wielkości porów można osiągnąć poprzez zastosowanie kopolimerów o różnych długościach bloków hydrofobowych.Wpływ wielkości porów na skuteczność odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej (LMW) zbadano z wykorzystaniem cienkich warstw MPS przygotowanych z czterech surfaktantów onicznych o różnych stosunkach objętościowych komponentów hydrofobowych i hydrofilowych. Przedstawiono powiększony widok widm MALDI, który obrazuje charakterystyczny próg odcięcia molekularnego każdego chipa MPS korelujący z wielkością porów. Zakres wielkości porów doprowadził do odzyskania różnych zestawów peptydów i białek z tej samej próbki surowicy poprzez wykluczanie wielkościowe i kształtowe.Można to również zaobserwować w dwukierunkowym hierarchicznym grupowaniu cech mieszaniny peptydów pomiędzy różnymi chipami. Intensywność koloru czerwonego lub żółtego wskazuje na względne stężenie peptydów. Większe pory zwiększały wydajność odzyskiwania większych peptydów, podczas gdy mniejsze peptydy były odzyskiwane preferencyjnie z chipów o mniejszych porach.Różne okresowe nanostruktury cienkich warstw MPS tworzone przy użyciu trójblokowych kopolimerów o wysokiej masie cząsteczkowej, takich jak onic F1 27 z podobnymi rozkładami wielkości porów, można uzyskać poprzez dostrojenie składu polimeru w roztworze prekursora. Trójwymiarowe nanostruktury sześcianowe i heksagonalne w kształcie plastra miodu charakteryzują się korzystniejszą łącznością nanoporów oraz bardziej dostępną morfologią nanoporów. W rezultacie wykazują one wyższą skuteczność w selektywnym wzbogacaniu peptydów LMW niż struktura heksagonalna 2D.Jest to prawdą, mimo że wykazują one podobny rozkład wielkości porów i ten sam próg odcięcia molekularnego dla frakcjonowania surowicy. Konjugacja Organy lane na chipach MPS została usprawniona poprzez wprowadzenie popiółkowania plazmą tlenową w celu wstępnego przygotowania powierzchni chipa. Rycina ta przedstawia specyficzną dla ładunku wydajność odzyskiwania dla chipów o różnych funkcjach powierzchniowych za pomocą wykresu słupkowego intensywności MS detekcji selektywnie wychwyconych peptydów na funkcjonalizowanych chipach.W zależności od swojego punktu izoelektrycznego, peptydy przy pH 7,0 są naładowane dodatnio lub ujemnie, poza usunięciem białek o wysokiej masie cząsteczkowej. Wyniki wykazują, że konstrukcja strukturalna i funkcjonalizacja chemiczna NPS dodatkowo zwiększyły specyficzność wzbogacania peptydów. Dzięki temu opracowaniu.Przewidujemy, że technika ta utoruje drogę badaczom z dziedziny proteomiki do poszukiwania nowych biomarkerów służących do wczesnej diagnostyki lub oceny terapeutycznej w obrębie płynów ustrojowych w modelach ludzkich i zwierzęcych. W konsekwencji przyczyni się to do usprawnienia spersonalizowanego leczenia głównych jednostek chorobowych.

low-molecular-weight-protein-enrichment-on-mesoporous-silica-thin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach krzemionki mezoporowanej w celu odkrycia biomarkerów

Ten film opisuje SEC-MALS, który wykorzystuje możliwości chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) i wielokątowego rozpraszania światła (MALS). W SEC-MALS SEC-MALS SEC rozdziela białka lub kompleksy białkowe na podstawie ich wielkości, a detektor MALS określa średnią masę cząsteczkową, mierząc intensywność światła rozproszonego przez cząsteczkę pod różnymi kątami.

Chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła dla oligomerów białkowych

Opisano podejście do badań przesiewowych materiałów w celu opracowania mikromacierzy domieszkowanych białkiem pochodzącym zol-żel przy użyciu nowej metody produkcji druku pinów. Metodologia ta została zademonstrowana poprzez opracowanie mikromacierzy acetylocholinoesterazy i multikinaz, które są wykorzystywane do opłacalnych badań przesiewowych małych cząsteczek.

Podejście do badań przesiewowych materiałów z przewodnikiem w celu opracowania ilościowych mikromacierzy białkowych pochodzących zol-żel

Kilka patologicznych biomarkerów nie może być łatwo wykrytych przez obecne techniki ze względu na ich niskie stężenie w płynach biologicznych, obecność enzymów rozkładających i duże ilości białek o dużej masie cząsteczkowej. Chemicznie funkcjonalizowane nanocząstki hydrożelu mogą zbierać, konserwować i koncentrować białka o niskiej liczebności, umożliwiając wykrywanie wcześniej niewykrywalnych biomarkerów.

Nanocząsteczki hydrożelu pobierane z osocza lub moczu w celu wykrycia białek o niskiej liczebności

Przedstawiono procedurę przygotowania porowatych hybrydowych mediów separacyjnych składających się z makroporowatego monolitu polimerowego wewnętrznie pokrytego mikroporowatym polimerem koordynacyjnym o dużej powierzchni.

Otrzymywanie wysokoporowatych koordynacyjnych powłok polimerowych na makroporowatych monolitach polimerowych w celu zwiększonego wzbogacenia fosfopeptydów

Ten protokół opisuje procedurę wzbogacania białek ECM z tkanek lub guzów oraz deglikozylacji i trawienia preparatów wzbogaconych w ECM na peptydy w celu analizy ich składu białkowego za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek i trawienie do peptydów do analizy spektrometrii mas

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Tutaj prezentujemy protokół syntezy bioinspirowanych materiałów krzemionkowych i immobilizacji enzymów w nich. Krzemionka jest syntetyzowana przez połączenie krzemianu sodu i "dodatku" aminowego, które neutralizują się w kontrolowanym tempie. Właściwości i funkcję materiału można zmienić poprzez immobilizację enzymatyczną in situ lub postsyntetyczne elucję kwasową zamkniętych dodatków.

Otrzymywanie krzemionki funkcjonalnej metodą inspirowaną biologicznie

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Ten protokół opisuje połączenie chromatografii wykluczającej rozmiar z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) dla absolutnej charakterystyki białek i kompleksów w roztworze. SEC-MALS określa masę cząsteczkową i wielkość czystych białek, natywnych oligomerów, heterokompleksów i zmodyfikowanych białek, takich jak glikoproteiny.

Charakterystyka białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości sprzężonej z wielokątowym rozpraszaniem światła (SEC-MALS)

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół prezentujący optycznie przezroczyste i płaskie podłoże do usprawnionego wychwytywania i analizy cząstek zanieczyszczających w wodzie pitnej. Przedstawiono tutaj Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP): elastyczny rurociąg do wychwytywania, kwantyfikacji i identyfikacji cząstek w ciekłych mediach.

Multimodalna analiza mikroplastiku w wodzie pitnej przy użyciu rurociągu do analizy nanomembran krzemowych

Odkryj metodę wzbogacania białek o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej przy użyciu mezoporowatych cienkich warstw krzemionki. Technika ta umożliwia skuteczną analizę proteomiczną i odkrywanie biomarkerów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Przeglądaj więcej filmów