Kombinatoryczna synteza i wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek folii polimerowych i nanocząstek

Ten film opisuje kombinatoryczną syntezę biodegradowalnych warstw bezwodnika poli bezwodnika i bibliotek nanocząstek oraz wysokowydajne wykrywanie uwalniania białek z tych bibliotek. Po pierwsze, wysokowydajne, zautomatyzowane aparaty do osadzania wykorzystywane do osadzania zróżnicowanej pod względem składu gamy monomerów w szklanych kuwetach. Reakcję polikondensacji przeprowadza się w temperaturze 180 stopni Celsjusza i 0,3 tora przez 1,5 godziny.

Te warunki reakcji są specyficzne dla syntezy polimerów polibezwodnika C-P-H-S-A. Za pomocą zautomatyzowanego aparatu do osadzania, rozpuszczalnik i wszelkie składniki do kapsułkowania są umieszczane w kuwetach zawierających bibliotekę polimerów. Sonikacja może być stosowana w celu zapewnienia całkowitego rozpuszczenia polimeru i równomiernego rozproszenia dodatkowych składników.

Następnie rozpuszczony polimer przenosi się do probówki z bezrozpuszczalnikiem w celu wytworzenia biblioteki nanocząstek przez nanowytrącanie. Nanocząstki są odzyskiwane przez suszenie próżniowe lub filtrację, a następnie przenoszone na zmodyfikowaną płytkę o 96 dołkach. Na koniec biblioteka załadowana białkiem jest inkubowana w warunkach fizjologicznych, a kinetyka uwalniania białek jest oceniana przy użyciu metody wykrywania przestrzeni fluorescencyjnej.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują kinetykę uwalniania białek w funkcji właściwości polimeru lub warunków środowiska uwalniania. Główną zaletą tego podejścia w porównaniu z innymi konwencjonalnymi technikami jednej próbki na raz jest to, że jesteśmy w stanie syntetyzować wiele próbek jednocześnie. Próbki te można następnie przesiewać z dużą przepustowością pod kątem interakcji białkowo-polimerowych, polimerowych lub polimerowych gospodarzy.

To z kolei przyspiesza racjonalne projektowanie i rozwój tych biomateriałów do dostarczania leków i inżynierii tkankowej. Procedurę zademonstruje La Tricia Peterson, pooperacyjna z mojego laboratorium. W tej części filmu aparat do osadzania przepływowego Hyatt jest używany do deponowania biblioteki monomerów o zmiennym składzie po syntezie polimerów.

Aparatura ta jest wykorzystywana do wytwarzania kombinatorycznej biblioteki pustych lub załadowanych białkiem folii polimerowych lub nanocząstek. Zautomatyzowana platforma składa się z dwóch programowalnych pomp strzykawkowych i trzech siłowników liniowych połączonych szeregowo z komputerem na komputerze. Oprogramowanie LabVIEW służy do kierowania poleceń do pomp strzykawkowych i siłowników.

Strzykawki o pojemności 10 ml są ładowane do pomp strzykawkowych za pomocą metalowych rurek kapilarnych połączonych za pomocą złączek blokujących przynętę, które dozują roztwory polimerów do szklanych kuwet. W tej demonstracji kwas seikowy lub SA zostanie użyty z jednym sześcioma sześcioma Biss para oxy heane lub CPH w celu stworzenia biblioteki nanocząstek otaczających albuminę surowicy Texas Red Boan. Instrukcje zawarte w tym filmie i towarzyszących mu dokumentach można dostosować do wytwarzania i testowania szerokiej gamy bibliotek folii polimerowych i nanocząstek.

Aby zsyntetyzować biblioteki, zacznij od rozpuszczenia każdego monomeru i chloroformu w końcowym stężeniu 25 miligramów na mililitr w szklanej fiolce. Następnie załaduj każdy roztwór do szczelnej strzykawki o pojemności 10 cm3, zasysając roztwór przez końcówkę strzykawki z blokadą przynęty. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza.

Następnie przymocuj odporną na rozpuszczalniki rurkę kapilarną ze stali nierdzewnej z blokadą przynęty do końca strzykawki. Zabezpiecz rurki kapilarne w clamps, przymocuj do stojaka pierścieniowego. Następnie umieść końce obu rurek kapilarnych w początkowym vete.

Do osadzania monomerów. Umieść strzykawki na programowalnych pompach strzykawkowych i zablokuj je na miejscu w oprogramowaniu widoku laboratoryjnego. Ustaw siłowniki liniowe w pozycji wyjściowej w oprogramowaniu.

Zainicjuj automatyczne osadzanie monomerów SA i CPH w szklanych kuwetach na osiach x, y i z. Siłowniki prawidłowo umieszczą rurki kapilarne w każdym Q, weterynarz i wpompują do nich zaprogramowane objętości każdego monomeru, tworząc bibliotekę monomerów o zróżnicowanym składzie. Po osadzaniu monomeru.

Przenieś bibliotekę monomerów do nagrzanego pieca próżniowego i inkubuj w temperaturze 180 stopni Celsjusza i 0,3 obwodu przez 1,5 godziny, aby umożliwić polimeryzację kondensacyjną. Po inkubacji zakończono wytwarzanie biblioteki polimerów. Następnie generowane są nanocząstki polimerowe obciążone białkiem.

Zapoznaj się z dołączonym protokołem wytwarzania biblioteki folii polimerowych ładowanych białkiem w celu wytworzenia biblioteki nanocząstek załadowanych białkiem. Dodać białko w tym przypadku, albuminę surowicy bydła rasy czerwonej z Teksasu do odpowiedniego rozpuszczalnika, który powinien być w stanie rozpuścić bibliotekę polimerów. Tutaj stosuje się chlorek metylenu w stężeniu dwóch miligramów na mililitr.

Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml rozpuszczalnikiem Texas Red BSA zawierającym rozpuszczalnik i umieścić ją w pierwszej pompce strzykawkowej. Następnie umieść czystą, pustą strzykawkę o pojemności dwóch cm3 w drugiej pompie strzykawkowej, umieść probówki zawierające 15 mililitrów bezrozpuszczalnika, w tym przypadku, pentanu w uchwycie probówki przylegającym do platformy fiolki. Następnie w laboratorium oprogramowanie View zainicjuj zautomatyzowany proces osadzania rozpuszczalnika, wybierając program.

Po zainicjowaniu programu rozpuszczalnik jest umieszczany w kuwetach zawierających bibliotekę polimerów, co daje stężenie polimeru na poziomie 20 miligramów na mililitr. Gdy cały rozpuszczalnik zostanie osadzony, pozwól mu rozpuścić polimer przez jedną do pięciu minut. Następnie należy przeprowadzić opcjonalną syndykację, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru i równomierne rozproszenie białek.

Następnie zainicjuj program transferu próbki w widoku laboratorium. Każda rozpuszczona próbka polimeru w bibliotece jest następnie pobierana do pustej strzykawki i dozowana do odpowiedniej probówki z bezrozpuszczalnikiem w uchwycie próbki. Po przeniesieniu każdej próbki odzyskaj nanocząstki załadowane białkiem, umieszczając bibliotekę nanocząstek w komorze próżniowej na 10 milimetrach próżni rtęci lub stosując filtrację próżniową do momentu usunięcia rozpuszczalnika.

Aby zbadać uwalnianie zamkniętego BSA, zacznij od głębokiej płyty polipropylenowej ze spawem 96, która została zmodyfikowana poprzez usunięcie górnego pół cala każdej ściany studzienki z każdej innej przylegającej kolumny w płycie. Usunięcie górnej części każdej studzienki między kolumnami A i B, C oraz DENF i GNH pozwala na przepływ cieczy między każdą parą przylegających studzienek po napełnieniu do pełnego transferu objętościowego. Czerwone standardy BSA z Teksasu w zakresie od 1000 do 10 mikrogramów na mililitr do głębokiej płytki 96-dołkowej.

Zostaną one wykorzystane do obliczenia ilości białka, a także będą uwzględniać wygaszanie fluorochromu, odtworzenie pożądanej masy nanocząstek w buforze PBS, a następnie sonikację w celu równomiernego rozproszenia cząstek. Następnie przenieś bibliotekę nanocząstek do głębokiej płytki 96-dołkowej i poczekaj, aż próbki osiądą na dnie płytki studzienki. Następnie za pomocą pipetera powoli napełnij wszystkie sąsiednie studzienki buforem PBS do jednej czwartej cala od górnej części studzienki.

W sąsiednich studniach powinna być wystarczająca ilość bufora, aby mógł swobodnie przepływać między studniami. Następnie uszczelnij płytkę zwalniającą pokrywką i umieść ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod mieszaniem. Na czas trwania eksperymentu w przyrostowych punktach czasowych użyj płaskiego skanera fluorescencyjnego 9 400 Typhoon, aby zeskanować płytkę przy użyciu odpowiednich filtrów wzbudzenia, lasera i emisji.

Po zeskanowaniu użyj oprogramowania do pomiaru ilości obrazu, aby określić ilościowo ilość uwolnionego białka sprzężonego z fluorochromem w każdym uwolnieniu. Cóż, Texas Red BSA został zamknięty w bibliotece nanocząstek polimerowych zsyntetyzowanych z monomerów SA i CPH, jak opisano w tym filmie, w celu określenia kinetyki uwalniania białek w funkcji chemii polimerów. Nanocząstki załadowane białkiem inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden miesiąc, podczas którego uzyskano skany fluorescencyjne w przyrostowych punktach czasowych w celu ilościowego określenia uwalniania białka.

Jak pokazano tutaj, ta metoda przepustowości wodnej została wykorzystana do określenia kinetyki uwalniania Texas Red BSA z biblioteki nanocząstek bezwodnika polibezwodnika A-C-P-H-S-A. Zaobserwowano trendy zależne od chemii wraz ze wzrostem szybkości uwalniania z substancji chemicznych filmu Sarich. Podobne wyniki uzyskano przy użyciu standardowych testów ilościowych białek.

W osobnym eksperymencie oceniono uwalnianie Texas Red BSA z bibliotek filmów CPT CPH z polibezwodnika CPT, jak pokazano tutaj: kinetykę uwalniania bliskiego zeru zaobserwowano przy tym, że warstwy bogate w cpeg najszybciej uwalniają białko z potencjalnymi zastosowaniami w medycynie jako biodegradowalne urządzenia do dostarczania leków. Wyniki te wskazują, że pożądany profil uwalniania leku terapeutycznego lub antygenu szczepionkowego może być kontrolowany poprzez zmianę składu chemicznego polimeru. Po tej procedurze opracowano inne metody kombinatoryczne w celu zbadania takich obszarów, jak stabilność białek, toksyczność komórkowa, aktywacja komórkowa i biodystrybucja InVivo.

Aspekty te są ważne dla racjonalnego projektowania biomateriałów do dostarczania leków i inżynierii tkankowej. Nie zapomnij nosić odpowiednich środków ochrony osobistej i ćwiczyć bezpiecznych procedur laboratoryjnych podczas całego tego protokołu.