Kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek

Niniejszy film opisuje kombinatoryczną syntezę bibliotek biodegradowalnych folii i nanocząstek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek. Najpierw wykorzystano wysokoprzepustowe zautomatyzowane urządzenie do nanoszenia, aby nanieść zróżnicowany pod względem składu zestaw monomerów do kuwet szklanych. Reakcja polikondensacji jest przeprowadzana w temperaturze 180 °C i ciśnieniu 0,3 tor przez 1,5 godziny.

Niniejsze warunki reakcji są specyficzne dla syntezy polimeru polianhydrydowego C-P-H-S-A. Przy użyciu zautomatyzowanego aparatu do osadzania, rozpuszczalnik oraz wszelkie komponenty do enkapsulacji są dozowane do kuwet zawierających bibliotekę polimerów. Można zastosować sonikację, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru i jednorodne rozproszenie dodatkowych komponentów.

Następnie rozpuszczony polimer przenosi się do probówki z nieroztwórnikiem w celu wytworzenia biblioteki nanocząsteczek poprzez nanoprecypitację. Nanocząsteczki odzyskuje się poprzez suszenie próżniowe lub filtrację, a następnie przenosi do zmodyfikowanej płytki 96-dołkowej do uwalniania. Na koniec bibliotekę obciążoną białkiem inkubuje się w warunkach fizjologicznych, a kinetykę uwalniania białka ocenia za pomocą fluorescencyjnej metody detekcji przestrzennej.

W rezultacie można uzyskać dane obrazujące kinetykę uwalniania białka w zależności od właściwości polimeru lub warunków środowiska uwalniania. Główną zaletą tego podejścia w porównaniu z innymi konwencjonalnymi technikami analizującymi jedną próbkę na raz jest możliwość jednoczesnej syntezy wielu próbek. Próbki te mogą być następnie poddane wysokoprzepustowemu przesiewowi w celu zbadania oddziaływań białko-polimer, komórka-polimer lub interakcji polimeru z organizmem gospodarza.

Przyspiesza to racjonalne projektowanie i opracowywanie tych biomateriałów do dostarczania leków oraz inżynierii tkankowej. Procedurę zaprezentuje La Tricia Peterson, stażystka podoktorska z mojego laboratorium. W tej części filmu użyta zostanie aparatura do wysokoprzepływowego osadzania w celu naniesienia biblioteki monomerów o zróżnicowanym składzie po syntezie polimerów.

To urządzenie służy do wytwarzania kombinatorycznej biblioteki pustych lub obciążonych białkiem błon polimerowych lub nanocząsteczek. Zautomatyzowana platforma składa się z dwóch programowalnych pomp strzykawkowych i trzech siłowników liniowych połączonych szeregowo z komputerem. Oprogramowanie LabVIEW jest wykorzystywane do przesyłania poleceń do pomp strzykawkowych i siłowników.

Strzykawki 10 cc szczelne w stosunku do gazów są ładowane do pomp strzykawkowych z podłączonymi metalowymi rurkami kapilarnymi poprzez złącza typu lure lock, które dozują roztwory polimerów do kuwet szklanych. W tym pokazie kwas sukcesynowy (SA) zostanie użyty wraz z 1,6-heksanodiolem (CPH) w celu stworzenia biblioteki nanocząsteczek enkapsulujących albuminę surowicy wołowej Texas Red. Instrukcje zawarte w tym filmie oraz towarzyszącej dokumentacji mogą zostać dostosowane do wytwarzania i testowania szerokiego zakresu bibliotek filmów polimerowych i nanocząsteczek.

Aby zsyntetyzować biblioteki, należy rozpocząć od rozpuszczenia każdego monomeru w chloroformie do końcowego stężenia 25 mg/mL w szklanej fiolce. Następnie każdą z roztworów należy pobrać do strzykawki szczelnej gazowo o pojemności 10 cc, aspirując roztwór przez końcówkę luer lock strzykawki. Należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Następnie przymocuj do końca strzykawki odporną na rozpuszczalniki kapilarę ze stali nierdzewnej z złączem Luer-lock. Zabezpiecz kapilary w zaciskach i przymocuj je do statywu. Następnie umieść końce obu kapilar w otworze startowym.

Do nanoszenia monomeru. Umieść strzykawki w programowalnych pompach strzykawkowych i zablokuj ich pozycję w oprogramowaniu LabVIEW. Ustaw siłowniki liniowe w pozycji startowej w oprogramowaniu.

Uruchom automatyczną depozycję monomerów SA i CPH do kuwet szklanych wzdłuż osi x, y i Z. Aktuatory odpowiednio ustawią rurki kapilarne w każdej kuwecie i wpompują do nich zaprogramowane objętości każdego monomeru, tworząc bibliotekę monomerów o zróżnicowanym składzie. Po przeprowadzeniu depozycji monomerów.

Przenieść bibliotekę monomerów do wstępnie podgrzanego piekarnika próżniowego i inkubować w temperaturze 180 °C i ciśnieniu 0,3 tour przez 1,5 godziny, aby umożliwić polimeryzację kondensacyjną. Po inkubacji proces wytwarzania biblioteki polimerów zostaje zakończony. Następnie przygotowuje się nanocząsteczki polimerowe obciążone białkiem.

W celu przygotowania biblioteki nanocząsteczek z białkiem należy zapoznać się z towarzyszącym protokołem wytwarzania bibliotek polimerowych filmów z obciążeniem białkowym. W tym przypadku do odpowiedniego rozpuszczalnika, który powinien być zdolny do rozpuszczenia biblioteki polimerowej, należy dodać białko – Texas red bovine serum albumin. Tutaj zastosowano chlorek metylenu w stężeniu 2 mg/mL.

Napełnij strzykawkę 10 cc rozpuszczalnikiem zawierającym Texas Red BSA i umieść ją w pierwszej pompie strzykawkowej. Następnie umieść czystą, pustą strzykawkę 2 cc w drugiej pompie strzykawkowej, a probówki zawierające 15 ml nierozpuszczalnika, w tym przypadku pentanu, umieść w uchwycie na probówki sąsiadującym z platformą na fiolki. Następnie w oprogramowaniu lab view uruchom zautomatyzowany proces osadzania rozpuszczalnika, wybierając odpowiedni program.

Po uruchomieniu programu rozpuszczalnik jest dozowany do kuwet zawierających bibliotekę polimerów, co pozwala uzyskać stężenie polimeru wynoszące 20 mg/ml. Po dozowaniu całego rozpuszczalnika należy odczekać od jednej do pięciu minut, aby polimer się rozpuścił. Następnie można przeprowadzić opcjonalną syndykację, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru i jednorodne rozproszenie białek.

Następnie uruchom program przenoszenia próbek w programie LabVIEW. Każda próbka rozpuszczonego polimeru z biblioteki jest następnie pobierana do pustej strzykawki i dozowana do odpowiadającej jej probówki z nienasyconym rozpuszczalnikiem w uchwycie na próbki. Po przeniesieniu wszystkich próbek odzyskaj nanocząstki obciążone białkiem, umieszczając bibliotekę nanocząstek w komorze próżniowej przy próżni 10 mm Hg lub stosując filtrację próżniową aż do usunięcia rozpuszczalnika.

Aby zbadać uwalnianie enkapsulowanej BSA, należy rozpocząć od głębokiej płytki 96-dołkowej z polipropylenu, zmodyfikowanej poprzez usunięcie górnej połowy cala ścianek każdego drugiego sąsiadującego słupka w płytce. Usunięcie górnej części każdego dołka pomiędzy słupkami A i B, C i D, E i F oraz G i H umożliwia przepływ cieczy między każdą parą sąsiadujących dołków po napełnieniu ich do pełnej objętości przenoszenia. Wprowadzić standardy Texas red BSA o stężeniu od 1000 do 10 µg/mL do głębokiej płytki 96-dołkowej.

Będą one wykorzystywane do obliczania ilości białka oraz do uwzględnienia gaszenia fluorochromu. Należy zrekonstytuować pożądaną masę nanocząstek w buforze PBS, a następnie poddać je sonikacji w celu równomiernego rozproszenia cząstek. Następnie przenieść bibliotekę nanocząstek do głębokiej płytki 96-dołkowej i odczekać, aż próbki opadną na dno dołków. W kolejnym kroku, używając pipety, powoli wypełnić wszystkie sąsiednie dołki buforem PBS do poziomu około jednej czwartej cala od górnej krawędzi dołka.

W sąsiednich studniach powinno znajdować się wystarczająco dużo buforu, aby zapewnić swobodny przepływ między nimi. Następnie szczelnie zamknąć płytkę uwalniającą pokrywką i inkubować w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu. W trakcie trwania eksperymentu, w określonych odstępach czasu, należy skanować płytkę za pomocą płaskiego skanera fluorescencyjnego Typhoon 9 400, stosując odpowiednie filtry wzbudzenia, lasera i emisji.

Po skanowaniu należy użyć oprogramowania do kwantyfikacji obrazu, aby określić ilość uwolnionego białka koniugowanego z fluorochromem w każdym cyklu uwalniania. W celu wyznaczenia kinetyki uwalniania białka w zależności od chemii polimeru, Texas Red BSA zamknięto w bibliotece nanocząstek polimerowych syntetyzowanych z monomerów SA i CPH zgodnie z opisem w tym filmie. Nanocząstki z załadowanym białkiem inkubowano w temperaturze 37 °C przez miesiąc, podczas którego w odstępach czasowych wykonywano skany fluorescencyjne w celu kwantyfikacji uwalniania białka.

Jak pokazano tutaj, ta metoda wysokoprzepustowa do badania hydratacji została wykorzystana do określenia kinetyki uwalniania Texas Red BSA z biblioteki nanopartykuł polianhydrydowych A-C-P-H-S-A. Zaobserwowano trendy zależne od chemii, z coraz szybszymi stopniami uwalniania w przypadku chemii filmów Sarich. Podobne wyniki uzyskano, stosując standardowe testy ilościowego oznaczania białek.

W oddzielnym eksperymencie oceniono uwalnianie Texas Red BSA z bibliotek filmów polianhydrydowych CPT CPH, jak pokazano tutaj; zaobserwowano kinetykę uwalniania bliską rzędowi zerowemu, przy czym filmy bogate w cpeg uwalniały białko najszybciej, co wskazuje na potencjalne zastosowania w medycynie jako biodegradowalne urządzenia do dostarczania leków. Wyniki te wskazują, że pożądany profil uwalniania leku terapeutycznego lub antygenu szczepionkowego można kontrolować poprzez zmianę chemii polimeru. Na podstawie tej procedury opracowano inne metody kombinatoryczne do badania takich obszarów jak stabilność białek, toksyczność komórkowa, aktywacja komórkowa oraz biodystrybucja InVivo.

Kwestie te są istotne dla racjonalnego projektowania biomateriałów do dostarczania leków oraz inżynierii tkankowej. Pamiętaj o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej i przestrzeganiu zasad bezpiecznej pracy w laboratorium przez cały czas trwania niniejszego protokołu.