Name: Kombinatoryczna synteza i wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek folii polimerowych i nanocząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę kombinatorycznej syntezy biodegradowalnych polianhydrydowych folii i nanocząstek oraz wysokoprzepustowe wykrywanie uwalniania białek. Technika ta przyspiesza projektowanie biomateriałów do celów dostarczania leków i inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe przyznane w ramach nagrody ONR-MURI (NN00014-06-1-1176) oraz przez U.S. Army Medical Research and Materiel Command (Grant nr W81XWH-10-1-0806). Materiał ten powstał w ramach prac wspieranych przez National Science Foundation w ramach grantów nr EEC 0552584 oraz 0851519.

1. Synteza kombinatorycznej biblioteki polimerów (zróżnicowana pod kątem chemii polimerów) – konfigurację robotyczną przedstawiono na Rysunku 1
<ol>
 <li>Rozpuścić każdy monomer w odpowiednim rozpuszczalniku (stężenie = 25 mg/ml) i pobrać każdą z roztworów do szczelnej strzykawki gazowej o pojemności 10cc.</li>
 <li>Przymocować do końców strzykawek kapilary z systemem Luer-lock odporne na rozpuszczalniki.</li>
 <li>Umieścić strzykawki w pompach strzykawkowych (programowalne pompy strzykawkowe New Era) i zablokować je w odpowiedniej pozycji.</li>
 <li>Ustawić siłowniki liniowe (Zaber) w pozycji startowej.</li>
 <li>Za pomocą zacisków do statywu ustawić końce obu kapilar w początkowej fiolce/dołku przeznaczonym do nanoszenia monomerów.</li>
 <li>Uruchomić program LabVIEW, który pompuje zmienne objętości każdego monomeru do każdego dołka, zależnie od pożądanego składu kopolimeru. Jest to realizowane w programie poprzez wydanie polecenia do siłownika osi Z, aby opuścił kapilary do fiolki/dołka, a następnie do każdej pompy, aby dozowała pożądaną objętość. Następnie program nakazuje siłownikowi Z powrót do pozycji domyślnej, a siłownikom X i Y przemieszczenie się do pozycji kolejnej fiolki/dołka. Proces ten jest powtarzany do momentu, aż do każdego dołka zostanie naniesiona pożądana objętość monomeru.</li>
 <li>Po naniesieniu monomerów wielodołkowa lub wielofiolkowa biblioteka monomerów jest przenoszona do wstępnie podgrzanej piecyka próżniowego i inkubowana w próżni przez czas trwania reakcji polimeryzacji kondensacyjnej. W przypadku syntezy CPH:SA reakcję prowadzi się w temperaturze 180 °C i ciśnieniu 0,3 torr przez 1,5 hr, jednak warunki reakcji będą się różnić w zależności od systemu polimerowego.</li>
</ol>
2. Tworzenie kombinatorycznej biblioteki pustych i obciążonych białkiem polimerowych nanocząsteczek oraz filmów – patrz Rysunek 1 w celu zapoznania się z konfiguracją robotyczną
<ol>
 <li>Strzykawka w pierwszej programowalnej pompie strzykawkowej jest napełniana rozpuszczalnikiem (biblioteka blank) lub rozpuszczalnikiem z rozproszonym w nim białkiem (biblioteka z obciążeniem białkowym), podczas gdy strzykawka w drugiej pompie pozostaje pusta. Probówki do otrzymywania nanocząsteczek w sąsiednim uchwycie na próbki są napełniane nie-rozpuszczalnikiem (stosunek rozpuszczalnika do nie-rozpuszczalnika wynosi 1 do 100). Do otrzymywania filmów zamiast probówek w sąsiednim uchwycie na próbki wykorzystuje się pustą płytkę wielodołkową.</li>
 <li>Za pomocą programu LabVIEW rozpuszczalnik jest naniesiony do wszystkich fiolek/dołków z polimerem w bibliotece (stężenie = 20 mg/ml) i inkubowany przez 1-5 min. Można wprowadzić opcjonalny etap sonikacji (30 s przy 40 Hz), aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru.</li>
 <li>Następnie, poprzez uruchomienie oddzielnego programu LabVIEW, próbka jest pobierana do pustej strzykawki i naniesiona do odpowiadającej jej probówki z nie-rozpuszczalnikiem (nanocząsteczki) lub pustego dołka (filmy) w sąsiednim uchwycie na próbki.</li>
 <li>Proces ten jest przeprowadzany dla każdego składu dyskretnej biblioteki polimerów.</li>
 <li>Biblioteka nanocząsteczek lub filmów jest następnie umieszczana w komorze próżniowej w celu usunięcia rozpuszczalnika i nie-rozpuszczalnika (bibliotekę nanocząsteczek można również odzyskać za pomocą filtracji próżniowej).</li>
</ol>
3. Wysokoprzepustowa kinetyka uwalniania białek
<ol>
 <li>W celu badania kinetyki uwalniania białek o wysokiej przepustowości z biblioteki polimerów, modyfikuje się 96-dołkową płytkę głęboką (2 ml/dołek) z polipropylenu w taki sposób, aby górna 1/3 ścianek dołków w sąsiednich kolumnach (np. A i B, C i D, E i F, G i H) została usunięta, co pozwala na połączenie dołków. Filmy obciążone białkiem muszą zostać wykonane w tej płytce lub nanocząstki muszą zostać do niej przeniesione, aby przeprowadzić badania kinetyki uwalniania o wysokiej przepustowości. Próbki nanocząstek lub filmów obciążonych białkiem należy umieścić tylko w jednym dołku z sąsiadujących kolumn (np. A, C, E i G). Szczegóły przedstawiono na Rysunku 4.</li>
 <li>Po przeniesieniu nanocząstek do 96-dołkowej płytki do uwalniania, pozwala się cząstkom osiąść. Bufor PBS (0,1 mM, pH 7,4) jest powoli dodawany do każdego dołka z próbką (kolumny A, C, E i G), a następnie do każdego sąsiedniego dołka (kolumny B, D, F i H), aż dołki zostaną wypełnione, a bufor będzie swobodnie przepływał między połączonymi dołkami. W przypadku nanocząstek proces ten należy przeprowadzić ze szczególną ostrożnością, aby upewnić się, że cząstki pozostają na dnie dołka z próbką (kolumny A, C, E i G) i nie zostaną przeniesione do sąsiedniego dołka uwalniającego (kolumny B, D, F i H). W niektórych przypadkach wymagane jest wirowanie, aby zlokalizować próbki nanocząstek na dnie dołka z próbką (kolumny A, C, E i G).</li>
 <li>Następnie płytka do uwalniania zostaje zamknięta pokrywką i umieszczona w pożądanej temperaturze (np. 37 °C) pod wpływem mieszania przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
 <li>W określonych odstępach czasu (np. 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 i 30 dni) ilość uwolnionego białka sprzężonego z fluorochromem jest ilościowo określana przy użyciu skanera fluorescencyjnego 9,400 Typhoon Flatbed Fluorescent Scanner (GE Healthcare). Płytkę do uwalniania umieszcza się na powierzchni skanera, skanuje przy użyciu odpowiedniego lasera wzbudzenia i filtrów emisyjnych, a następnie określa intensywność fluorescencji uwolnionego białka w dołkach uwalniających (kolumny B, D, F i H) (Image Quant). Sugeruje się dołączenie do płytki standardów białek o znanych stężeniach w celu obliczenia ilości białka oraz uwzględnienia gaszenia fluorochromu.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Po otrzymaniu biblioteki polimerów przeprowadzono charakterystykę za pomocą 1H NMR, GPC oraz FTIR w celu walidacji tej metody kombinatorycznej1,7,8,11. Masa cząsteczkowa mieści się w zakresie 10 000-20 000 g/mol, indeks polidyspersyjności wynosi od 1,5 do 3,0, a skład chemiczny okazał się prawidłowy i zgodny z konwencjonalnymi metodami syntezy polianhydrydów12-15. Podobnie obrazy SEM bibliotek nanocząsteczek wykazały morfologię powierzchni, rozmiar i rozkład wielkości zbliżone do nanocząsteczek otrzymanych w sposób konwencjonalny2. Kinetykę uwalniania białka z nanocząsteczek lub folii polianhydrydowych przeprowadzono w zmodyfikowanej płytce wielodołkowej, zgodnie z wcześniejszym opisem1. Wyniki wykazały uwalnianie przybliżone do rzędu zerowego, z efektem gwałtownego wyrzutu lub bez niego, w zależności od stopnia załadowania białka i chemii polimeru (Rysunki 2 i 3) 1,12,14,16.
<img alt="Schemat zestawu do dozowania polimerów; kapilary, pompy strzykawkowe, siłowniki liniowe; zastosowanie badawcze." src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Aparat do kombinatorycznego wytwarzania filmów polimerowych i nanocząsteczek.
<img alt="Kumulatywne uwalnianie TRBSA w czasie; wykres analizujący składy polimerowe Poly SA, CPH:SA." src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wysokoprzepustowe uwalnianie Texas Red albuminy surowicy bydlęcej (TRBSA) z biblioteki nanocząstek polimerowych CPH:SA. Chemia polimerów bogatych w SA uwalnia enkapsulowane TRBSA najszybciej, podczas gdy chemia polimerów bogatych w CPH uwalnia je najwolniej. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe i n=4. Przedrukowano za zgodą Petersen et. al.1. Copyright 2010 American Chemical Society. 
 
<img alt="Badanie uwalniania polimeru; wykres skumulowanej frakcji masy w funkcji czasu dla stosunków CPTEG:CPH." src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wysokoprzepustowe uwalnianie Texas Red bovine serum albumin (TRBSA) z biblioteki filmów polimerowych CPTEG:CPH. Chemia polimerów bogata w CPTEG uwalnia enkapsulowane TRBSA najszybciej, natomiast chemia polimerów bogata w CPH uwalnia je najwolniej. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe i n=3.
<img alt="Schemat modyfikacji polimeru; porównanie powierzchni przed i po nałożeniu filmu polimerowego." src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Obraz przedstawiający dwa sąsiadujące dołki „przed” i „po” modyfikacji w 96-dołkowej polipropylenowej płytce głębokiej. Obraz „po” modyfikacji po prawej stronie przedstawia również dodanie filmu polimerowego (dno lewego dołka) z uwalnianą pomiędzy dwoma dołkami do roztworu buforowego enkapsulowaną cząsteczką fluorescencyjną. Uwolniona cząsteczka fluorescencyjna jest następnie wykrywana w prawym dołku.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial%2Fhigh-throughput+methods+for+the+determination+of+polyanhydride+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior.</a> J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).</li>
<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Znajomość niezbędnych warunków syntezy oraz temperatur przejścia szklistego (Tgs) syntetyzowanych polimerów jest kluczowa dla wytwarzania biblioteki. Jeśli Tgs znajdują się poniżej temperatury pokojowej, etap wytwarzania nanocząstek może wymagać przeprowadzenia w środowisku o kontrolowanej temperaturze, niższej niż Tg polimerów. Ponadto należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że cały sprzęt mający kontakt z wysokimi temperaturami i rozpuszczalnikami jest przystosowany do pracy w taki...

<table><tbody><tr><td>Zmotoryzowany stół XYZ: 3x T-LSM050A, zakres ruchu 50 mm na oś</td><td>Zaber Technologies</td><td>T-XYZ-LSM050A-KT04</td><td></td></tr><tr><td>Jednopompowy dozownik strzykawkowy NE-1000</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Szklane probówki hodowlane wielokrotnego użytku Pyrex* Vista* bez kołnierza</td><td>Corning</td><td>07-250-125</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety szklane</td><td>Scientific Strategies</td><td>G102</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>776671-35</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki gazoszczelne SGE, Luer Loc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>509507</td><td></td></tr><tr><td>Płytki głębokich dołków U96 1.3 ml &amp;amp; 2.0 ml</td><td>Thermo Scientific: Nunc</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>Maty do zamykania dołków</td><td>Thermo Scientific: Nunc</td><td>276000</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-79</td><td></td></tr><tr><td>Krążki filtracyjne Whatman Grade 50 90 mm</td><td>Whatman</td><td>1450-090</td><td></td></tr></tbody></table>

kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polianhydrydy to klasa biomateriałów o doskonałej biokompatybilności i właściwościach umożliwiających dostarczanie leków. Choć były one szeroko badane przy użyciu konwencjonalnych technik syntezy polegających na analizie jednej próbki na raz, opracowano nowsze podejście wysokoprzepustowe, które umożliwia syntezę i testowanie dużych bibliotek polianhydrydów.1Ułatwi to bardziej efektywny proces optymalizacji i projektowania tych biomateriałów do zastosowań w dostarczaniu leków i szczepionek. Metoda opisana w niniejszej pracy dotyczy kombinatorycznej syntezy bibliotek biodegradowalnych folii i nanocząstek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustowej detekcji uwalniania białek z tych bibliotek. W tej metodzie sterowanej robotycznie (Rysunek 1), siłowniki liniowe oraz pompy strzykawkowe są sterowane przez system LabVIEW, co umożliwia realizację zautomatyzowanego protokołu bez konieczności ręcznej obsługi, eliminując tym samym błędy użytkownika. Ponadto metoda ta pozwala na szybkie wytwarzanie bibliotek polimerów w skali mikro, co zmniejsza wielkość partii, prowadząc jednocześnie do stworzenia wielowariantowych systemów polimerowych. Takie kombinatoryczne podejście do syntezy polimerów ułatwia otrzymanie do 15 różnych polimerów w czasie równoważnym czasowi potrzebnemu na konwencjonalną syntezę jednego polimeru. Dodatkowo, po rozpuszczeniu biblioteki polimerów w rozpuszczalniku i wytrąceniu w nie-rozpuszczalniku (w przypadku nanocząsteczek) lub poprzez suszenie próżniowe (w przypadku filmów), kombinatoryczną bibliotekę polimerów można uformować w puste lub obciążone białkiem geometrie, w tym filmy lub nanocząsteczki. Po wprowadzeniu białka sprzężonego z fluorochromem do bibliotek polimerowych, kinetykę uwalniania białka można ocenić w sposób wysokoprzepustowy przy użyciu metody detekcji opartej na fluorescencji (Rycina 2 i 3) zgodnie z wcześniejszym opisem1Ta platforma kombinatoryczna została zwalidowana za pomocą konwencjonalnych metod2 a biblioteki folii i nanocząsteczek polianhydrydów zostały scharakteryzowane za pomocą 1H NMR oraz FTIR. Biblioteki zostały przesianie pod kątem kinetyki uwalniania białek, stabilności i antygeniczności; in vitro toksyczność komórkowa, produkcja cytokin, ekspresja markerów powierzchniowych, adhezja, proliferacja i różnicowanie; oraz in vivo biodystrybucja i mukoordhezja1-11Opracowana w niniejszej pracy metoda kombinatoryczna umożliwia wysokoprzepustową syntezę polimerów oraz wytwarzanie bibliotek nanopartykuł i filmów obciążonych białkami, które z kolei mogą zostać poddane przesiewowi. in vitro i in vivo w celu optymalizacji właściwości biomateriału.

Niniejsza metoda opisuje kombinatoryczną syntezę bibliotek biodegradowalnych filmów i nanocząsteczek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek.

Kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek

Polianhydrydy stanowią klasę biomateriałów o doskonałej biokompatybilności i właściwościach umożliwiających dostarczanie leków. Choć były one przedmiotem szerokich badań z...

Niniejszy film opisuje kombinatoryczną syntezę bibliotek biodegradowalnych folii i nanocząstek polianhydrydowych oraz wysokoprzepustową detekcję uwalniania białek z tych bibliotek. Najpierw wykorzystano wysokoprzepustowe zautomatyzowane urządzenie do nanoszenia, aby nanieść zróżnicowany pod względem składu zestaw monomerów do kuwet szklanych. Reakcja polikondensacji jest przeprowadzana w temperaturze 180 °C i ciśnieniu 0,3 tor przez 1,5 godziny.Niniejsze warunki reakcji są specyficzne dla syntezy polimeru polianhydrydowego C-P-H-S-A. Przy użyciu zautomatyzowanego aparatu do osadzania, rozpuszczalnik oraz wszelkie komponenty do enkapsulacji są dozowane do kuwet zawierających bibliotekę polimerów. Można zastosować sonikację, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru i jednorodne rozproszenie dodatkowych komponentów.Następnie rozpuszczony polimer przenosi się do probówki z nieroztwórnikiem w celu wytworzenia biblioteki nanocząsteczek poprzez nanoprecypitację. Nanocząsteczki odzyskuje się poprzez suszenie próżniowe lub filtrację, a następnie przenosi do zmodyfikowanej płytki 96-dołkowej do uwalniania. Na koniec bibliotekę obciążoną białkiem inkubuje się w warunkach fizjologicznych, a kinetykę uwalniania białka ocenia za pomocą fluorescencyjnej metody detekcji przestrzennej.W rezultacie można uzyskać dane obrazujące kinetykę uwalniania białka w zależności od właściwości polimeru lub warunków środowiska uwalniania. Główną zaletą tego podejścia w porównaniu z innymi konwencjonalnymi technikami analizującymi jedną próbkę na raz jest możliwość jednoczesnej syntezy wielu próbek. Próbki te mogą być następnie poddane wysokoprzepustowemu przesiewowi w celu zbadania oddziaływań białko-polimer, komórka-polimer lub interakcji polimeru z organizmem gospodarza.Przyspiesza to racjonalne projektowanie i opracowywanie tych biomateriałów do dostarczania leków oraz inżynierii tkankowej. Procedurę zaprezentuje La Tricia Peterson, stażystka podoktorska z mojego laboratorium. W tej części filmu użyta zostanie aparatura do wysokoprzepływowego osadzania w celu naniesienia biblioteki monomerów o zróżnicowanym składzie po syntezie polimerów.To urządzenie służy do wytwarzania kombinatorycznej biblioteki pustych lub obciążonych białkiem błon polimerowych lub nanocząsteczek. Zautomatyzowana platforma składa się z dwóch programowalnych pomp strzykawkowych i trzech siłowników liniowych połączonych szeregowo z komputerem. Oprogramowanie LabVIEW jest wykorzystywane do przesyłania poleceń do pomp strzykawkowych i siłowników.Strzykawki 10 cc szczelne w stosunku do gazów są ładowane do pomp strzykawkowych z podłączonymi metalowymi rurkami kapilarnymi poprzez złącza typu lure lock, które dozują roztwory polimerów do kuwet szklanych. W tym pokazie kwas sukcesynowy (SA) zostanie użyty wraz z 1,6-heksanodiolem (CPH) w celu stworzenia biblioteki nanocząsteczek enkapsulujących albuminę surowicy wołowej Texas Red. Instrukcje zawarte w tym filmie oraz towarzyszącej dokumentacji mogą zostać dostosowane do wytwarzania i testowania szerokiego zakresu bibliotek filmów polimerowych i nanocząsteczek.Aby zsyntetyzować biblioteki, należy rozpocząć od rozpuszczenia każdego monomeru w chloroformie do końcowego stężenia 25 mg/mL w szklanej fiolce. Następnie każdą z roztworów należy pobrać do strzykawki szczelnej gazowo o pojemności 10 cc, aspirując roztwór przez końcówkę luer lock strzykawki. Należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Następnie przymocuj do końca strzykawki odporną na rozpuszczalniki kapilarę ze stali nierdzewnej z złączem Luer-lock. Zabezpiecz kapilary w zaciskach i przymocuj je do statywu. Następnie umieść końce obu kapilar w otworze startowym.Do nanoszenia monomeru. Umieść strzykawki w programowalnych pompach strzykawkowych i zablokuj ich pozycję w oprogramowaniu LabVIEW. Ustaw siłowniki liniowe w pozycji startowej w oprogramowaniu.Uruchom automatyczną depozycję monomerów SA i CPH do kuwet szklanych wzdłuż osi x, y i Z. Aktuatory odpowiednio ustawią rurki kapilarne w każdej kuwecie i wpompują do nich zaprogramowane objętości każdego monomeru, tworząc bibliotekę monomerów o zróżnicowanym składzie. Po przeprowadzeniu depozycji monomerów.Przenieść bibliotekę monomerów do wstępnie podgrzanego piekarnika próżniowego i inkubować w temperaturze 180 °C i ciśnieniu 0,3 tour przez 1,5 godziny, aby umożliwić polimeryzację kondensacyjną. Po inkubacji proces wytwarzania biblioteki polimerów zostaje zakończony. Następnie przygotowuje się nanocząsteczki polimerowe obciążone białkiem.W celu przygotowania biblioteki nanocząsteczek z białkiem należy zapoznać się z towarzyszącym protokołem wytwarzania bibliotek polimerowych filmów z obciążeniem białkowym. W tym przypadku do odpowiedniego rozpuszczalnika, który powinien być zdolny do rozpuszczenia biblioteki polimerowej, należy dodać białko – Texas red bovine serum albumin. Tutaj zastosowano chlorek metylenu w stężeniu 2 mg/mL.Napełnij strzykawkę 10 cc rozpuszczalnikiem zawierającym Texas Red BSA i umieść ją w pierwszej pompie strzykawkowej. Następnie umieść czystą, pustą strzykawkę 2 cc w drugiej pompie strzykawkowej, a probówki zawierające 15 ml nierozpuszczalnika, w tym przypadku pentanu, umieść w uchwycie na probówki sąsiadującym z platformą na fiolki. Następnie w oprogramowaniu lab view uruchom zautomatyzowany proces osadzania rozpuszczalnika, wybierając odpowiedni program.Po uruchomieniu programu rozpuszczalnik jest dozowany do kuwet zawierających bibliotekę polimerów, co pozwala uzyskać stężenie polimeru wynoszące 20 mg/ml. Po dozowaniu całego rozpuszczalnika należy odczekać od jednej do pięciu minut, aby polimer się rozpuścił. Następnie można przeprowadzić opcjonalną syndykację, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru i jednorodne rozproszenie białek.Następnie uruchom program przenoszenia próbek w programie LabVIEW. Każda próbka rozpuszczonego polimeru z biblioteki jest następnie pobierana do pustej strzykawki i dozowana do odpowiadającej jej probówki z nienasyconym rozpuszczalnikiem w uchwycie na próbki. Po przeniesieniu wszystkich próbek odzyskaj nanocząstki obciążone białkiem, umieszczając bibliotekę nanocząstek w komorze próżniowej przy próżni 10 mm Hg lub stosując filtrację próżniową aż do usunięcia rozpuszczalnika.Aby zbadać uwalnianie enkapsulowanej BSA, należy rozpocząć od głębokiej płytki 96-dołkowej z polipropylenu, zmodyfikowanej poprzez usunięcie górnej połowy cala ścianek każdego drugiego sąsiadującego słupka w płytce. Usunięcie górnej części każdego dołka pomiędzy słupkami A i B, C i D, E i F oraz G i H umożliwia przepływ cieczy między każdą parą sąsiadujących dołków po napełnieniu ich do pełnej objętości przenoszenia. Wprowadzić standardy Texas red BSA o stężeniu od 1000 do 10 µg/mL do głębokiej płytki 96-dołkowej.Będą one wykorzystywane do obliczania ilości białka oraz do uwzględnienia gaszenia fluorochromu. Należy zrekonstytuować pożądaną masę nanocząstek w buforze PBS, a następnie poddać je sonikacji w celu równomiernego rozproszenia cząstek. Następnie przenieść bibliotekę nanocząstek do głębokiej płytki 96-dołkowej i odczekać, aż próbki opadną na dno dołków. W kolejnym kroku, używając pipety, powoli wypełnić wszystkie sąsiednie dołki buforem PBS do poziomu około jednej czwartej cala od górnej krawędzi dołka.W sąsiednich studniach powinno znajdować się wystarczająco dużo buforu, aby zapewnić swobodny przepływ między nimi. Następnie szczelnie zamknąć płytkę uwalniającą pokrywką i inkubować w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu. W trakcie trwania eksperymentu, w określonych odstępach czasu, należy skanować płytkę za pomocą płaskiego skanera fluorescencyjnego Typhoon 9 400, stosując odpowiednie filtry wzbudzenia, lasera i emisji.Po skanowaniu należy użyć oprogramowania do kwantyfikacji obrazu, aby określić ilość uwolnionego białka koniugowanego z fluorochromem w każdym cyklu uwalniania. W celu wyznaczenia kinetyki uwalniania białka w zależności od chemii polimeru, Texas Red BSA zamknięto w bibliotece nanocząstek polimerowych syntetyzowanych z monomerów SA i CPH zgodnie z opisem w tym filmie. Nanocząstki z załadowanym białkiem inkubowano w temperaturze 37 °C przez miesiąc, podczas którego w odstępach czasowych wykonywano skany fluorescencyjne w celu kwantyfikacji uwalniania białka.Jak pokazano tutaj, ta metoda wysokoprzepustowa do badania hydratacji została wykorzystana do określenia kinetyki uwalniania Texas Red BSA z biblioteki nanopartykuł polianhydrydowych A-C-P-H-S-A. Zaobserwowano trendy zależne od chemii, z coraz szybszymi stopniami uwalniania w przypadku chemii filmów Sarich. Podobne wyniki uzyskano, stosując standardowe testy ilościowego oznaczania białek.W oddzielnym eksperymencie oceniono uwalnianie Texas Red BSA z bibliotek filmów polianhydrydowych CPT CPH, jak pokazano tutaj; zaobserwowano kinetykę uwalniania bliską rzędowi zerowemu, przy czym filmy bogate w cpeg uwalniały białko najszybciej, co wskazuje na potencjalne zastosowania w medycynie jako biodegradowalne urządzenia do dostarczania leków. Wyniki te wskazują, że pożądany profil uwalniania leku terapeutycznego lub antygenu szczepionkowego można kontrolować poprzez zmianę chemii polimeru. Na podstawie tej procedury opracowano inne metody kombinatoryczne do badania takich obszarów jak stabilność białek, toksyczność komórkowa, aktywacja komórkowa oraz biodystrybucja InVivo.Kwestie te są istotne dla racjonalnego projektowania biomateriałów do dostarczania leków oraz inżynierii tkankowej. Pamiętaj o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej i przestrzeganiu zasad bezpiecznej pracy w laboratorium przez cały czas trwania niniejszego protokołu.

combinatorial-synthesis-high-throughput-protein-release-from-polymer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kombinacyjna synteza oraz wysokowydajne uwalnianie białka z polimerowych warstw i bibliotek nanocząstek

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Przedstawiamy podejście mikrofluidyczne do ekspresji macierzy białkowych. Urządzenie składa się z tysięcy komór reakcyjnych sterowanych za pomocą mikromechanicznych zaworów. Urządzenie mikrofluidyczne jest połączone z biblioteką genów naniesioną w formie mikromacierzy. Geny te są następnie transkrybowane i translacyjne bezpośrednio na chipie, co pozwala na otrzymanie macierzy białkowej gotowej do zastosowań eksperymentalnych.

Generator wysokoprzepustowej ekspresji białek z wykorzystaniem platformy mikroprzepływowej

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Prosta, solidna i skalowalna technika funkcjonalizacji i samodzielnego montażu makroskopowych warstw nanocząstek-ligandów na podłożach bez szablonów jest opisana w tym protokole.

Technika funkcjonalizacji i samoorganizacji makroskopowych warstw monowarstwowych nanocząstek-ligand na podłożach bez szablonów

Raportujemy protokoły "polimeryzacji" różnych typów nanocząsteczek metalowych w kapsułkach polimerowych w długie łańcuchy "homo-" i "kopolimerów".

Wykorzystanie nanocząstek metali pokrytych blokiem polistyrenu (kwas akrylowy) jako monomerów do ich homo- i kopolimeryzacji

Polimeryzacja wytrącająca bez mieszania zapewnia szybkie, powtarzalne podejście do prototypowania syntezy wrażliwych na bodźce mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych) o wąskim rozkładzie rozmiarów. W tej syntezie protokołu demonstruje się charakterystykę rozpraszania światła i śledzenie fluorescencji pojedynczych cząstek tych mikrożeli w mikroskopii szerokokątnej.

Kontrolowana synteza i śledzenie fluorescencji wysoce jednorodnych mikrożeli poli(N-izopropyloakrylamidowych)

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Nanożele są doskonałą i wszechstronną platformą nanocząsteczek do dostarczania leków biologicznych. Reagujące na bodźce polimerowe nanożele na bazie glikolu poli(etylenowego), zdolne do kapsułkowania ładunków opartych na białkach, zsyntetyzowano przy użyciu jednoetapowej strategii sieciowania ko-nanopolimeryzacji w warunkach wodnych. Przedstawiono tutaj optymalne wytwarzanie i charakterystykę tych nowych nanocząstek.

Synteza nanożeli reagujących na bodźce przy użyciu wodnego jednoetapowego sieciowania i konanopolimeryzacji

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do osadzania bezkomórkowych reakcji syntezy białek w makroskalowych matrycach hydrożelowych bez potrzeby stosowania zewnętrznej fazy płynnej.

Metody osadzania bezkomórkowych reakcji syntezy białek w hydrożelach w makroskali

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Poznaj metodę kombinatorycznej syntezy biodegradowalnych polianhydrydowych folii i nanocząstek oraz wysokoprzepustowe wykrywanie uwalniania białek. Technika ta przyspiesza projektowanie biomateriałów do celów dostarczania leków i inżynierii tkankowej.

Kombinatoryczna synteza oraz wysokoprzepustowe uwalnianie białek z bibliotek błon polimerowych i nanocząstek

Przeglądaj więcej filmów