Name: Metody in vitro Test klirensu międzybłonkowego, który modeluje wczesne etapy przerzutów raka jajnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj test klirensu międzybłonkowego w modelu przerzutów raka jajnika. Wykorzystuje fluorescencyjną mikroskopię czasową do ilościowej analizy inwazji sferoidów nowotworowych przez warstwę mezotelialną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Nikon Imaging Center w Harvard Medical School, w szczególności Jennifer Waters, Lara Petrak i Wendy Salmon, za szkolenie oraz możliwość korzystania z ich mikroskopów do rejestracji timelapse. Dziękujemy również Rosa Ng i Achim Besser za cenne dyskusje. Praca ta była finansowana z grantu NIH 5695837 (dla M. Iwanickiego) oraz GM064346 (dla JSB), a także z grantu przyznanego przez Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (dla JSB).

1. Tworzenie sferoidów komórek raka jajnika
<ol>
 <li>Komórki raka jajnika wykazujące ekspresję RFP hoduje się w 10% Pożywce Podstawowej (specjalistycznej pożywce do hodowli komórkowej zawierającej mieszaninę 199 i MCDB105 w stosunku 50:50, 10% inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% pen-strep). Aby uzyskać ekspresję RFP w nieoznakowanych komórkach raka jajnika, należy przeprowadzić transfekcję komórek plazmidem zawierającym RFP i wyselekcjonować komórki wykazujące ekspresję RFP. Alternatywnie można zastosować wektory wirusowe do przejściowej ekspresji białek fluorescencyjnych lub przeprowadzić inkubację wstępną komórek z czerwonym fluorescencyjnym barwnikiem do śledzenia komórek (Invitrogen).</li>
 <li>Przed sformowaniem sferoidów raka jajnika konieczne jest przygotowanie 96-dołkowych płytek hodowlanych o okrągłym dnie o niskiej adhezji. W celu przygotowania płytek hodowlanych o niskiej adhezji, do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej Corning dodaje się 30μl roztworu poly-HEMA (6mg polihydroksyetylometakrylanu w 1 ml 95% EtOH). Płytki 96-dołkowe inkubuje się w nieuwilżonym inkubatorze w temperaturze 37°C w celu odparowania etanolu, co pozostawia warstwę poly-HEMA w każdym dołku. Warstwa poly-HEMA zapobiega przywieraniu komórek do dna dołka, zmuszając je do wzrostu w zawiesinie18. [Alternatywnie zamiast naczyń powlekanych poly-HEMA można zastosować płytki hodowlane Ultra-Low Attachment (Corning).]</li>
 <li>Po przygotowaniu płytek hodowlanych o niskiej adhezji, należy poddać komórki raka jajnika trypsynizacji, odwirować komórki w wirówce stołowej (Heraeus) przy 900 RCF przez 3 minuty, odessać nadosad i ponownie zawiesić w 10% Pożywce Podstawowej.</li>
 <li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
 <li>Dostosować stężenie komórek tak, aby w 50μl 10% Pożywki Podstawowej znajdowało się 100 komórek.</li>
 <li>Do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej powlekanej poly-HEMA dodać 50μl jednorodnie zawieszonej, rozcieńczonej zawiesiny komórek.</li>
 <li>Inkubować płytkę 96-dołkową w inkubatorze do hodowli komórkowej w temperaturze 37°C przez 16 godzin (czas ten należy zwiększyć lub zmniejszyć w zależności od czasu potrzebnego danej linii komórkowej na sformowanie wielokomórkowych sferoidów lub zgodnie z pożądanymi warunkami eksperymentalnymi), aby umożliwić komórkom raka jajnika agregację i sformowanie pojedynczego wielokomórkowego sferoidu w każdym dołku. Niektóre komórki nowotworowe mogą ulec apoptozie w tym okresie, dlatego ważne jest wybranie czasu poprzedzającego indukcję apoptozy.</li>
</ol>
2. Tworzenie monowarstwy komórek mezohelialnych
<ol>
 <li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy pokryć dołki szklanej płytki MatTek z 6 dołkami fibronektyną, dodając 2 mL roztworu fibronektyny w PBS o stężeniu 5 μg/mL do każdego dołka i inkubując w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Jakość optyczna szklanego dna w płytkach MatTek umożliwia obrazowanie mikroskopowe o wysokiej rozdzielczości.</li>
 <li>Komórki mezohelialne wykazujące ekspresję GFP hoduje się w 10% Base Medium. Należy utrypsynizować płytkę z komórkami mezohelialnymi, odwirować w wirówce nakładkowej (Heraeus) przy 900 RPM przez 3 minuty, odessać nadsącz i zawiesić komórki ponownie w 10% Base Medium. Komórki mezohelialne użyte w tej procedurze wykazywały ekspresję GFP w momencie ich pozyskania, jednak nieznakowane komórki mezohelialne można uzyskać poprzez transfekcję plazmidem zawierającym cDNA GFP lub wcześniejszą inkubację komórek z zielonym fluorescencyjnym barwnikiem do śledzenia komórek (Invitrogen).</li>
 <li>Po 30-minutowej inkubacji z fibronektyną (krok 2.1), należy przemyć dołki płytki MatTek 2 mL PBS.</li>
 <li>Należy odessać PBS i wysiać 6 x105 komórek mezohelialnych do każdego dołka 6-dołkowej płytki MatTek. Płytkę MatTek należy inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C przez noc, aby umożliwić przyleganie komórek mezohelialnych do płytki i utworzenie monowarstwy.</li>
</ol>
3. Test usuwania komórek mezohelialnych
<ol>
 <li>Użyć pipety, aby zebrać sferoidy raka jajnika z płytki 96-dołkowej powlekanej poly-HEMA.</li>
 <li>Odssać medium z jednego dołka naczynia MatTek 6-dołkowego zawierającego monowarstwę komórek mezohelialnych. Przemyć raz 2mL PBS. Przenieść wszystkie sferoidy z płytki 96-dołkowej do jednego dołka naczynia MatTek (około 3x więcej sferoidów niż tych, które zostaną zobrazowane, aby uwzględnić sferoidy osiadające w części naczynia, której nie można zobrazować).</li>
 <li>Umieścić naczynie MatTek na stole mikroskopu fluorescencyjnego odwróconego z szerokim polem widzenia, zdolnego do obrazowania time-lapse przez co najmniej 8 godzin. Użyć zmotoryzowanego stołu, aby w ramach jednego eksperymentu zobrazować wiele pozycji w naczyniu, w których występują liczne zdarzenia interkalacji sferoidów. Stosujemy odwrócony zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjny do obrazowania time-lapse Nikon Ti-E z zintegrowanym systemem Perfect Focus i optyką DIC o niskim powiększeniu/aperturze numerycznej [20x-0.75 numerical aperture (NA)], halogenowy transiluminator Nikon z kondensorem o długiej odległości roboczej (LWD) 0.52 NA, szybkie filtry wzbudzenia i emisji Nikon (czas przełączania &lt;100 ms; GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), szybkie migawki Smart Shutters Sutter dla ścieżki światła przechodzącego i epifluorescencji, zmotoryzowany stół z enkoderem liniowym Nikon, chłodzoną kamerę CCD Hamamatsu ORCA-AG, niestandardową komorę inkubacyjną mikroskopu z kontrolą temperatury i CO2, oprogramowanie Nikon NIS-Elements AR wersja 3 oraz stół wibroizolacyjny TMC.</li>
 <li>Sferoidy komórek raka jajnika osiądą na dnie naczynia i przyłączą się do monowarstwy komórek mezohelialnych. Rejestrować obrazy GFP, RFP i fazokontrastowe z ponad 20 interakcji sferoid/monowarstwa, co 10 minut, przez 8 godzin.</li>
 <li>Ekspresujące RFP sferoidy komórek raka jajnika będą naciekać do ekspresującej GFP monowarstwy komórek mezohelialnych, tworząc w niej otwory. Po 8 godzinach zmierzyć wielkość otworów, obrysowując czarne obszary na obrazach GFP za pomocą oprogramowania Elements (lub innego odpowiedniego oprogramowania, np. Image J). Znormalizować wielkość otworu do początkowej wielkości sferoidu, dzieląc wielkość otworu po 8 godzinach przez wielkość sferoidu na odpowiadającym mu obrazie RFP w czasie zero. W tym przykładzie wielkość otworu mierzono tylko raz, ale można ją mierzyć wielokrotnie w ciągu ośmiogodzinnego eksperymentu, aby lepiej zrozumieć dynamikę interkalacji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
W tym przykładzie porównaliśmy zdolność do usuwania komórek mezotelialnych przez sferoidy raka jajnika OVCA433 o osłabionej ekspresji taliny-1 w stosunku do kontrolnych sferoidów OVCA433. Sferoidy OVCA433 z każdej grupy dodano do naczynia MatTek zawierającego monowarstwy komórek mezotelialnych ZT. Sześć sferoidów z każdej grupy obrazowano co 10 minut przez osiem godzin (Rycina 4, Film 3, Film 4). Pomiarowi poddano otwory powstałe w monowarstwie w wyniku rozprzestrzeniania się sferoidów, a następnie wyciągnięto średnią z sześciu pozycji z każdej grupy. Rycina 4 pokazuje, że średnia powierzchnia oczyszczenia stworzona przez sferoidy z wyciszeniem taliny 1 była znacznie mniejsza niż średnia powierzchnia stworzona przez sferoidy kontrolne, co sugeruje, że talina jest niezbędna do usuwania komórek mezotelialnych przez sferoidy raka jajnika OVCA433.
<img alt="Schemat inwazji komórek raka jajnika; monowarstwa komórek mezohelialnych, proces migracji komórek." src="/files/ftp_upload/3888/3888fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przerzuty raka jajnika. Pierwotne guzy jajnika rozwijają się albo z nabłonka powierzchniowego jajnika, albo z jajowodów. Komórki lub skupiska nowotworowe oddzielają się od guza pierwotnego i gromadzą w jamie otrzewnej. Komórki nowotworowe mogą następnie agregować, tworząc wielokomórkowe sferoidy. Sferoidy przyłączają się następnie do monowarstw komórek mezohelialnych wyścielających jamę otrzewną. Komórki mezohelialne są wypierane spod przyłączonego sferoidu raka jajnika, co umożliwia sferoidom dostęp do znajdującej się poniżej błony podstawnej.
Film 1. Przerzuty raka jajnika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_1_Lower_Quality.mp4">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
<img alt="Schemat histologiczny prawidłowego otrzewnej w porównaniu do przerzutów raka jajnika; strzałki wskazują komórki mezohelialne." src="/files/ftp_upload/3888/3888fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Komórki mezohelialne wyścielają powierzchnię ludzkiej tkanki otrzewnej i są wypierane spod implantów komórek raka jajnika.
<img alt="Interakcja sferoidów komórek raka jajnika z monowarstwami komórek mezohelialnych, schemat doświadczenia." src="/files/ftp_upload/3888/3888fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Test usuwania mezotelium. Sferoidy raka jajnika są tworzone poprzez inkubację 100 komórek raka jajnika wykazujących ekspresję RFP na dołek w 96-dołkowej okrągłodنnej płytce hodowlanej powlekanej poly-HEMA w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Poly-HEMA zapobiega przywieraniu komórek do płytki hodowlanej, co pozwala im pozostać w zawiesinie i przylegać do siebie, tworząc jeden skupisko na dołek. Monowarstwy komórek mezohelialnych przygotowuje się poprzez wysianie 6x105 komórek mezohelialnych na dołek w 6-dołkowej płytce MatTek powlekanej fibronektyną i inkubację płytki w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Następnie sferoidy są przenoszone do płytki MatTek z monowarstwą mezohelialną, a obie populacje komórek są obrazowane co 10 minut przez 8 godzin przy użyciu zautomatyzowanego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania w szerokim polu Nikon Ti-E w trybie time-lapse oraz oprogramowania Elements.
Film 2. Test oczyszczania mezotelialnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_2_lower_quality.mp4">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
<img alt="Analiza usuwania komórek mezotelialnych; sferoidy raka jajnika vs. komórki mezotelialne; wyniki na wykresie pudełkowym." src="/files/ftp_upload/3888/3888fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Osłabienie ekspresji taliny 1 w sferoidach OVCA433 zmniejsza zdolność do usuwania komórek mezotelialnych. Sferoidy OVCA433 (kolor czerwony) z osłabioną i bez osłabionej ekspresją taliny 1 poddano adhezji i inwazji do monowarstwy mezotelialnej ZT (kolor zielony). Obie populacje komórek obrazowano co 10 minut przez 8 godzin przy użyciu zmotorizowanego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Ti-E Widefield w trybie time-lapse oraz oprogramowania elements. Wykres pokazuje, że osłabienie ekspresji taliny 1 znacząco zmniejsza usuwanie komórek mezotelialnych (wykres kwantylowy z zielonymi słupkami oznaczającymi średnie).
Film 3. Kontrolne sferoidy OVCA433 (czerwone) naciekające monowarstwę mezotelialną (zieloną). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_3.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
Film 4. Osłabienie ekspresji taliny 1 w sferoidach OVCA433 (czerwony) zmniejsza zdolność oczyszczania mezohelialnego (zielony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3888/Movie_4.mov">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.

<ol><li>Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).</li>
<li>Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRies%2C+LG+%22SEER+Cancer+Statistics+Review%2C+1975-2005%22">SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005</a>. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005">http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005</a> (2007).</li>
<li>Burleson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).</li>
<li>Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electron+Microscopic+Study+of+the+Invasion+of+Ascites+Tumor+Cells+into+the+Abdominal+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall.</a> Cancer Res. 25, 490-497 (1965).</li>
<li>Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+explants+of+peritoneum+and+endometrium%3A+a+novel+model+of+the+early+endometriosis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion.</a> Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).</li>
<li>Zhang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+growth+patterns+of+human+peritoneal+mesothelial+cells%3A+comparison+between+advanced+epithelial+ovarian+cancer+and+non-ovarian+cancer+sources%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Soc.+Gynecol.+Investig%22%5BJournal%5D)">Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources.</a> J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).</li>
<li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Line+of+Intra-abdominal+Metastatic+Attack%3A+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).</li>
<li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix.+An+in+vitro+model+system+for+studying+tumor+cell+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion.</a> Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).</li>
<li>Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+novel+3D+culture+model+to+elucidate+the+role+of+mesothelial+cells%2C+fibroblasts+and+extra-cellular+matrices+on+adhesion+and+invasion+of+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum.</a> Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).</li>
<li>Ksiazek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+peritoneal+mesothelial+cells+promote+ovarian+cancer+cell+adhesion%3A+the+role+of+oxidative+stress-induced+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin.</a> Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).</li>
<li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).</li>
<li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+and+its+receptors+partly+mediate+adhesion+of+ovarian+cancer+cells+to+peritoneal+mesothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro.</a> Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).</li>
<li>Heyman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+vitronectin+stimulates+migration+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells.</a> Cell. Biol. Int. 34, 493-502 Forthcoming.</li>
<li>Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+and+beta1+integrin+mediate+ovarian+carcinoma+cell+adhesion+to+peritoneal+mesothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells.</a> Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).</li>
<li>Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+human+ovarian+adenocarcinoma+IGROV1+cells+to+endothelial+cells+is+partly+mediated+by+the+alphav+integrins-vitronectin+adhesive+system+and+induces+an+alteration+of+endothelial+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity.</a> Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).</li>
<li>Leroy-Dudal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmigration+of+human+ovarian+adenocarcinoma+cells+through+endothelial+extracellular+matrix+involves+alphav+integrins+and+the+participation+of+MMP2%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2.</a> Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).</li>
<li>Iwanicki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).</li>
<li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+shape+in+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li>
<li>Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+human+ovarian+surface+epithelial+cells%3A+a+potential+model+for+ovarian+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).</li>
<li>Roberts, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+molecular+and+cellular+events+during+neoplastic+progression%3A+a+mouse+syngeneic+ovarian+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model.</a> Neoplasia. 7, 944-956 (2005).</li>
<li>Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+assay+system+for+transendothelial+tumor+cell+invasion%3A+significance+of+E-selectin+and+alpha+3+integrin+in+the+transendothelial+invasion+by+HT1080+fibrosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).</li>
<li>Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+studying+heterotypic+cell-cell+interactions+and+tissue+specimen+cultures+under+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments.</a> Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).</li>
<li>Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-extravasation+model+--+selection+of+highly+motile+and+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).</li>
<li>Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+I+contributes+to+the+generation+of+resting+cortical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension.</a> Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).</li>
<li>Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+migration+of+colon+carcinoma+cells+requires+expression+of+E-selectin+by+endothelial+cells+and+activation+of+stress-activated+protein+kinase-2+%28SAPK2%2Fp38%29+in+the+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).</li>
<li>Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+and+micromechanics+of+tumor+cell+chemotactic+protrusion%2C+locomotion%2C+and+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation.</a> Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj „Test oczyszczania mezotelialnego” (Mesothelial Clearance Assay) wykorzystuje mikroskopię poklatkową do monitorowania interakcji między wielokomórkowymi sferoidami raka jajnika a monowarstwami komórek mezotelialnych z dużą szczegółowością przestrzenną i czasową. Wcześniej kilka grup badawczych8-14 stosowało testy punktu końcowego, aby wykazać, że komórki raka jajnika przywierają do monowarstw komórek mezotelialnych i naciekają je. Niniejszy test jest wyjątkowy, ponieważ wykorzystuje komórki...

<table><tbody><tr><td>Komórki raka jajnika OVCA433</td><td></td><td></td><td>Dar od dr. Dennisa Slamona</td></tr><tr><td>Komórki mezotelialne ZT</td><td></td><td></td><td>Dar od dr. Tan Ince</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>19950</td><td></td></tr><tr><td>MCDB105</td><td>Cell Applications Inc.</td><td>117-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS-inaktywowana ciepłem</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Polyhydroksyetylometakrylan (poly-HEMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>192066-25G</td><td>W celu przygotowania roztworu poly-HEMA rozpuścić 6mg proszku poly-HEMA w 1ml 95% EtOH</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111ACS200</td><td>Rozcieńczyć do 95% w dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Dygestorium do hodowli komórkowych</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-300</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do płytek z poly-HEMA</td><td>Labline Instruments</td><td>Imperial III 305</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Heraeus Instruments</td><td>75003429/01</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa szalka z szklanym dnem</td><td>MatTek Corp.</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-1MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Odwrócony zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjny do obrazowania time-lapse Ti-E z zintegrowanym systemem Perfect Focus</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>20X-0.75 apertura numeryczna</td></tr><tr><td>Transiluminator halogenowy</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Kondensor z dużą odległością roboczą 0.52 NA</td></tr><tr><td>Filtry wzbudzenia i emisji</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td>GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50</td></tr><tr><td>Ścieżka światła transmitowanego i epifluorescencyjnego</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Smart Shutters</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik z enkoderem liniowym</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chłodzona kamera CCD</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>ORCA-AG</td><td></td></tr><tr><td>Komora inkubacyjna mikroskopu z kontrolą temperatury i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wykonana na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS-Elements</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Wersja 3</td></tr></tbody></table>

test oczyszczania mezotelialnego in vitro modelujący wczesne etapy przerzutowania raka jajnika

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Rak jajnika jest piątą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów w Stanach Zjednoczonych1. Pomimo pozytywnej początkowej odpowiedzi na leczenie, od 70 do 90 procent kobiet z rakiem jajnika rozwija nowe przerzuty, a nawrót choroby jest często śmiertelny2. Niezbędne jest zatem zrozumienie mechanizmu powstawania przerzutów wtórnych w celu opracowania lepszych metod leczenia raka jajnika w stadium pośrednim i zaawansowanym. Przerzut raka jajnika następuje, gdy komórki złośliwe odrywają się od miejsca guza pierwotnego i rozprzestrzeniają w jamie otrzewnej. Rozprzestrzenione komórki mogą tworzyć wielokomórkowe skupiska, czyli sferoidy, które albo pozostają niesprzężone, albo implantują się w narządach w obrębie jamy otrzewnej3 (Rysunek 1, Film 1). 
Wszystkie organy w jamnie otrzewnej są wyścielone pojedynczą, ciągłą warstwą komórek mezohelialnych4-6 (Rysunek 2). Jednakże, jak wykazano w badaniach mikrografii elektronowych wyciętych fragmentów tkanki guza u ludzi3,5-7 (Rysunek 2), pod guzami otrzewnymi komórki mezohelialne nie występują. Sugeruje to, że komórki mezohelialne są usuwane spod masy guza w wyniku nieznanego procesu.
Wcześniejsze eksperymenty in vitro wykazały, że pierwotne komórki raka jajnika przywierają wydajniej do macierzy zewnątrzkomórkowej niż do komórek mezotelialnych8, a nowsze badania wykazały, że pierwotne komórki mezotelialne otrzewnej w rzeczywistości stanowią barierę dla adhezji i inwazji komórek raka jajnika (w porównaniu do adhezji i inwazji na podłożach niepokrytych komórkami mezotelialnymi)9,10. Sugeruje to, że komórki mezotelialne działają jako bariera przeciwko przerzutom raka jajnika. Mechanizmy komórkowe i molekularne, dzięki którym komórki raka jajnika przełamują tę barierę i usuwają mezoteliów, pozostawały do niedawna nieznane.
W niniejszym opisie przedstawiamy metodologię testu in vitro, który modeluje interakcję między sferoidami komórek raka jajnika a komórkami mezotelialnymi in vivo (Rycina 3, Film 2). Nasz protokół został opracowany na podstawie wcześniej opisanych metod analizy interakcji komórek nowotworu jajnika z monowarstwami mezotelialnymi8-16 i został po raz pierwszy przedstawiony w raporcie wykazującym, że komórki nowotworu jajnika wykorzystują zależną od integryn aktywację miozyny oraz siłę trakcyjną, aby promować usuwanie komórek mezotelialnych spod sferoidu nowotworowego17. Model ten wykorzystuje fluorescencyjną mikroskopię poklatkową do monitorowania dwóch populacji komórek w czasie rzeczywistym, dostarczając informacji przestrzennych i czasowych na temat zachodzącej interakcji. Komórki raka jajnika wykazują ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), natomiast komórki mezotelialne wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Sferoidy komórek raka jajnika wykazujące ekspresję RFP przyczepiają się do monowarstwy komórek mezotelialnych wykazujących ekspresję GFP. Sferoidy rozprzestrzeniają się, naciekają i spychają komórki mezotelialne, tworząc otwór w monowarstwie. Otwór ten jest widoczny jako przestrzeń negatywna (czarna) na obrazie GFP. Powierzchnię otworu można następnie zmierzyć, aby ilościowo przeanalizować różnice w aktywności usuwania komórek pomiędzy populacjami kontrolnymi a eksperymentalnymi komórek raka jajnika i/lub komórek mezotelialnych. Test ten wymaga jedynie niewielkiej liczby komórek raka jajnika (100 komórek na sferoid × 20–30 sferoidów na warunek), dzięki czemu możliwe jest przeprowadzenie go z wykorzystaniem cennych próbek pierwotnych komórek nowotworowych. Co więcej, test ten można łatwo zaadaptować do wysokoprzepustowych przesiewów.

Opisany tutaj test oczyszczania mezotelium wykorzystuje komórki znakowane fluorescencyjnie oraz mikroskopię wideo poklatkową do wizualizacji i ilościowego pomiaru interakcji między wielokomórkowymi sferoidami raka jajnika a monowarstwami komórek mezoteliów. Test ten modeluje wczesne etapy przerzutowania raka jajnika.

Test oczyszczania mezotelialnego in vitro modelujący wczesne etapy przerzutowania raka jajnika

Rak jajnika jest piątą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów w Stanach Zjednoczonych1. Pomimo pozytywnej początkowej odpowiedzi na terapię, od 70 do 90 ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie zdolności wielokomórkowych sferoidów raka jajnika do naciekania単warstwy mezoteliów. Jest to osiągane najpierw poprzez inkubację komórek raka jajnika wykazujących ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego w płytkach hodowlanych o niskiej adhezji w celu utworzenia wielokomórkowych sferoidów. Kolejnym krokiem jest wysianie komórek mezoteliów wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego na szklane płytki hodowlane powlekane fibronektyną w celu utworzenia monowarstw.Ostatnim krokiem jest przeniesienie sfer raka jajnika z płytek o niskim stopniu adhezji na płytki zawierające monowarstwy mezohelialne. W końcowej fazie wykorzystuje się fluorescencyjną mikroskopię w trybie time-lapse w celu ilościowego określenia względnej zdolności kontrolnych i eksperymentalnych sfer raka jajnika do tworzenia ubytków w monowarstwie mezohelialnej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi testami punktowymi jest wykorzystanie kombinacji komórek znakowanych fluorescencyjnie i mikroskopii wideo time-lapse do monitorowania dynamiki oczyszczania środkowej części w czasie. Przed utworzeniem fenotypu raka jajnika konieczne jest przygotowanie niskoprzychylnych płytek hodowlanych z 96 dołkami o okrągłym dnie. Aby przygotować te płytki hodowlane, należy dodać 30 µL roztworu poly hema do każdego dołka płytki hodowlanej z 96 dołkami.Inkubuj płytki 96-dołkowe w nieuwilgotnionej inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 24 do 48 godzin, aby odparować etanol, pozostawiając na dnie każdego dołka warstwę poly HEMA. Warstwa poly HEMA zapobiega przywieraniu komórek do dna dołka, co zmusza komórki do wzrostu w zawiesinie. Ekspresyjne w białku fluorescencyjnym czerwonym komórki raka jajnika wykorzystane w tym eksperymencie są hodowane w podłożu bazowym 10%, specjalistycznym podłożu do hodowli komórkowych, po przygotowaniu płytek do hodowli o niskiej adhezji.Trypsynizację komórek raka jajnika na płytce przeprowadza się poprzez najpierw przemycie płytki roztworem PBS, a następnie dodanie 1 mL trypsyny i inkubowanie płytki w temperaturze 37 °C przez 4-5 minut. Po dodaniu pożywki podstawowej z 10% FBS w celu zneutralizowania trypsyny, zawiesinę komórkową przenosi się do 15 mL stożkowej probówki z polipropylenu. Komórki pelletuje się w wirówce laboratoryjnej przy 900 RCF przez 3 minuty, odsysa nadsącz i resuspenduje komórki w pożywce podstawowej z 10% FBS.Po policzeniu komórek za pomocą komory liczydłowej (hemocytometru), dostosuj stężenie komórek do 100 komórek na 50 µL 10% podłoża podstawowego. Do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej poly-HEMA dodaj 50 µL jednorodnie zawieszonej, rozcieńczonej zawiesiny komórkowej. Inkubuj płytkę 96-dołkową w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, aby umożliwić skupienie się komórek raka jajnika i utworzenie pojedynczego wielokomórkowego sferoidu w każdym dołku. Aby rozpocząć tę procedurę, pokryj dołki szklanej płytki MatTek o 6 dołkach fibonektyną. Do każdego dołka płytki dodaj 2 mL roztworu fibonektyny w PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Komórki mezoteliów wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, przeznaczone do tworzenia monowarstwy komórek mezoteliów, hodowane są w pożywce podstawowej z dodatkiem 10%. Potraktuj płytkę z komórkami mezoteliów trypsyną, a następnie odwiruj zawiesinę w wirówce laboratoryjnej przy 900 RPM przez trzy minuty. Odessaj nadsącz i resuspenduj komórki w pożywce podstawowej z dodatkiem 10%, dostosowując stężenie do pożądanej wartości za pomocą pożywki podstawowej z dodatkiem 10%. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji fibonektyny w płytce MatTek, przemyj studzienki 2 mL PBS, odessaj PBS i wysiej 6 × 10⁵ komórek mezoteliów na każdą studzienkę w sześciostudzienkowej płytce MatTek.Inkubuj płytkę MatTek w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić przywieranie komórek mezohelialnych do płytki i utworzenie monowarstwy. Aby rozpocząć ten test, użyj pipety do pobrania PHE raka jajnika z 96-dołkowej płytki powlekanej poly-HEMA, odessij medium z jednego dołka 6-dołkowej płytki MatTek zawierającej monowarstwę komórek mezohelialnych, wypłucz raz 2 mL PBS, a następnie dodaj całe PHE z płytki 96-dołkowej do jednego dołka płytki MatTek. Jest to około trzykrotna liczba steroidów, które zostaną zobrazowane, aby uwzględnić PHE osadzające się w części płytki, której nie można zobrazować.Ponieważ chcemy obrazować tylko jeden steroid w jednym polu widzenia, należy unikać ich agregacji. Delikatnie kołysz naczyniem z jednej strony na drugą, aby równomiernie rozprowadzić steroidy po monowarstwie przed ich przytwierdzeniem. Umieść naczynie Mat Tech na stole odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w szerokim polu.Zdolność do wykonywania obrazowania poklatkowego przez okres co najmniej ośmiu godzin. Należy użyć zmotoryzowanego stolika, aby obrazować wiele pozycji w naczyniu podczas wielokrotnych zdarzeń kolokalizacji OID. W pojedynczym eksperymencie komórka raka jajnika PHE osiądzie na dnie naczynia i przyłączy się do komórki mezoteliopodobnej.Monowarstwa gromadzi obrazy GFP-RFP i fazowe z interakcji ponad 20 sferoid monowarstwowych co 10 minut przez osiem godzin. W teście oczyszczania komórek mezotelialnych komórki raka jajnika PHE wykazujące ekspresję RFP będą naciekać monowarstwę komórek mezotelialnych wykazujących ekspresję GFP, tworząc w niej otwory. Wielkości otworów mierzy się poprzez obrysowanie czarnych obszarów na obrazach GFP przy użyciu oprogramowania Element lub innego odpowiedniego oprogramowania, takiego jak Image J. Następnie wielkość otworu normalizuje się do początkowej wielkości sferoidu, dzieląc wielkość otworu po ośmiu godzinach przez wielkość sferoidu na odpowiadającym mu obrazie RFP w czasie zero. Test oczyszczania komórek mezotelialnych może być wykorzystany do porównania zdolności inwazyjnej sferoidów komórek raka jajnika, które zostały zmodyfikowane genetycznie w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych, za pomocą których sferoidy komórek raka jajnika usuwają komórki mezotelialne.Warstwa jednowarstwowa komórek mezoteliów w tym przykładzie, zdolność oczyszczania MEZOTELIALNYM komórek raka jajnika OVCA 4 33. Porównano sferoidy (OIDs) OVCA 4 33, w których wyciszono ekspresję Talonu 1, z kontrolnymi sferoidami OVCA 4 33. Mierzono otwory powstałe w monowarstwie wskutek rozprzestrzeniania się PHE, a następnie wyciągnięto średnią z sześciu pozycji z każdej grupy.Jak pokazano na tym wykresie, średnia powierzchnia oczyszczenia powstała w wyniku wyciszenia genu Talon 1 w sferoidach była znacznie mniejsza niż średnia powierzchnia powstała w sferoidach kontrolnych, co sugeruje, że Talon jest niezbędny do oczyszczania mezotelium przez komórki raka jajnika OVCA 4 33. Ten film poklatkowy przedstawia kontrolny czerwony sferoid OVCA 4 33 naciekający zieloną warstwę mezotelium. Kolejny film poklatkowy przedstawia czerwony sferoid OVCA 4 33 z osłabioną ekspresją Talon 1 naciekający zieloną warstwę mezotelium.W porównaniu z poprzednim filmem widać wyraźnie, że osłabienie ekspresji Talon one w sferoidach zmniejsza zdolność oczyszczania przez komórki mezotelialne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat monitorowania interakcji między rakiem jajnika, sferoidami wielokomórkowymi a monowarstwami komórek mezotelialnych w czasie, z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse.

in-vitro-mesothelial-clearance-assay-that-models-early-steps-ovarian

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

In vitro test likwidacji mezoteliomatów, który modeluje wczesne etapy przerzutów raka jajnika

Opisujemy metodologie tworzenia heterotypowych trójwymiarowych modeli in vitro, składających się z fibroblastów jajnika oraz prawidłowych komórek nabłonkowych powierzchni jajnika lub komórek nabłonkowych raka jajnika. Omówiono zastosowanie tych modeli do badania oddziaływań stroma-nabłonek, które zachodzą podczas rozwoju raka jajnika.

Heterotypowe trójwymiarowe modelowanie in vitro oddziaływań stropowo-nabłonkowych podczas inicjacji i progresji raka jajnika

W tym filmie demonstrujemy rozwój trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej. Ta kultura organotypowa może pomóc w badaniu adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie przerzutów raka jajnika w błonie śluzowej jamy otrzewnej: metoda tworzenia modelu 3D wyściółki otrzewnej in vitro

Ten film opisuje technikę ilościowego pomiaru interakcji sferoid raka jajnika z komórkami międzybłonka, przy użyciu komórek znakowanych fluorescencyjnie i mikroskopii poklatkowej. Ten test in vitro modeluje interakcję między sferoidami komórek raka jajnika z przerzutami a komórkami międzybłonka wyściełającymi jamę otrzewnej in vivo.

Test klirensu międzybłonkowego: technika in vitro do ilościowego określania zdolności infekcji sferoid raka jajnika do monowarstw komórek międzybłonka

Inwazja komórek raka jajnika w błonie międzybłonkowej otrzewnej jest procesem dynamicznym w czasie. Wykorzystując analizator w czasie rzeczywistym, zdolność inwazyjną komórek raka jajnika w modelu kohodowli komórek sferoidalnych i międzybłonka można określić ilościowo w dłuższych okresach czasu, zapewniając wgląd w czynniki regulujące proces przerzutowy.

Ocena przyczepu sferoidalnego raka jajnika i inwazji komórek międzybłonka w czasie rzeczywistym

Przedstawiamy protokół, który implementuje zarówno podejścia in vivo, jak i ex vivo do badania kolonizacji tkanki tłuszczowej otrzewnowej przez raka jajnika, szczególnie sieci komórkowej. Ponadto przedstawiamy protokół ilościowego i analitycznego oznaczania struktur komórek odpornościowych w sieci znanych jako plamki mleczne, które sprzyjają przerzutom tkanki tłuszczowej otrzewnej.

Metody in vivo i ex vivo do badania przerzutowej kolonizacji raka jajnika struktur mlecznej w tkance tłuszczowej otrzewnej

Przerzuty raka jajnika charakteryzują się licznymi rozlanymi zmianami wewnątrzotrzewnowymi, tak że dokładne wizualne określenie obciążenia guzem jest trudne.  W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego oznaczania obciążenia guzem przerzutowym in situ i ex vivo przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) i obrazowania optycznego.

Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Tutaj prezentujemy protokół do budowy trójwymiarowego modelu in vitro wyściółki jamy otrzewnej, składającego się z pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka i fibroblastów pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową, jako narzędzie do badania adhezji, inwazji i proliferacji komórek raka jajnika.

Modelowanie wczesnych etapów rozsiewu raka jajnika w organotypowym posiewie ludzkiej jamy otrzewnowej

Aby wyjaśnić wieloetapowy proces rozprzestrzeniania się raka jajnika w otrzewnej, obecne badanie przedstawia mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej poprzez ortotopową inokulację tymi komórkami nowotworowymi.<br...

Mysi eksperymentalny model pierwotnego rozwoju guza i przerzutów do otrzewnej za pomocą ortotopowej inokulacji komórkami raka jajnika

Aby zbadać progresję guza jajnika w fizjologicznie istotnym modelu, wielokomórkowe sferoidy zostały wyhodowane w mikrourządzeniu pod symulowanym przepływem płynu. Ten dynamiczny model 3D emuluje środowisko wewnątrzotrzewnowe z komponentami komórkowymi i mechanicznymi, w których dochodzi do przerzutów raka jajnika.

Modelowanie wielokomórkowego zachowania sferoidalnego raka jajnika w dynamicznym mikrourządzeniu otrzewnowej 3D

Ten protokół opisuje ustanowienie trójwymiarowego (3D) modelu ex vivo interakcji komórka rakowa - sieć komórkowa. Model ten stanowi platformę do wyjaśnienia mechanizmów pronowotworowych w niszy tkanki tłuszczowej oraz do testowania nowych terapii.

Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Poznaj test klirensu międzybłonkowego w modelu przerzutów raka jajnika. Wykorzystuje fluorescencyjną mikroskopię czasową do ilościowej analizy inwazji sferoidów nowotworowych przez warstwę mezotelialną.

Test oczyszczania mezotelialnego in vitro modelujący wczesne etapy przerzutowania raka jajnika

Przeglądaj więcej filmów