Name: Procesy etykietowania katalizowane proteazą i kwasem z wykorzystaniem 18wody wzbogaconej w O (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metody etykietowania izotopowego białek z wykorzystaniem wody wzbogaconej 18O poprzez procesy katalizowane proteazą i kwasem. Techniki te umożliwiają ilościową i jakościową analizę proteomiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH/NIDCR 1R01DE019796.

Przedstawione przepływy pracy LeO umożliwiają stabilne znakowanie izotopowe trawionych białek oraz syntetycznych peptydów. Te eksperymenty w funkcji czasu (Rysunek 1) mają zastosowanie w badaniach proteomiki porównawczej i ilościowej, a także w badaniach nad proteazami. Każdy przepływ pracy składa się z dwóch etapów doświadczalnych (Rysunek 2): A) pobierania próbek w określonych odstępach czasu z odpowiedniej reakcji kodowanej stabilnym izotopem 18O (rozszczepienie peptydów katalizowane przez proteazę; reakcja wymiany tlenu karboksylowego katalizowana przez proteazę; reakcja wymiany tlenu karboksylowego katalizowana przez kwas) oraz B) analizy za pomocą spektrometrii mas i graficznej reprezentacji kinetyki wbudowy 18O.
A. Eksperymenty z przebiegiem czasowym
I. PALeO-TimeCourse: Oznaczanie miejsc cięcia proteolitycznego za pomocą etykietowania katalizowanego przez proteazy
<ol>
 <li>(Opcjonalnie) Mostki disiarczkowe białek (10 μM) i peptydów (250 μM) redukuje się za pomocą DTT (stężenie końcowe 2,5 mM) w 25 mM NH4HCO3 (obie substancje świeżo przygotowane) poprzez inkubację przez 30 min w 50 °C.</li>
 <li>(Opcjonalnie) Wolne cysteiny alkiluje się jodoacetamidem (stężenie końcowe 10 mM) w 25 mM NH4HCO3 poprzez inkubację przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
 <li>W zależności od analizowanej proteazy, roztwory białek/peptydów muszą zostać oczyszczone w celu usunięcia pozostałości buforu i czynnika alkilującego. Do oczyszczania peptydów należy użyć kolumn wirowych PepClean C-18 (Thermo), a do wymiany buforów w próbkach białek koncentratorów odśrodkowych Vivaspin (Sartorius).</li>
 <li>Peptydy/białka należy ponownie rozpuścić lub poddać wymianie w 20 μl buforu reakcyjnego do proteazy (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5.5; trypsyna: 25 mM NH4HCO3, pH 8.0) zawierającego 1:1 (v/v) końcowo H218O (95%, Sigma Isotec).</li>
 <li>Przed dodaniem proteazy należy pobrać próbkę dla punktu czasowego zero: zmieszać 0,5 μl mieszaniny reakcyjnej i 0,5 μl matrycy z kwasu alfa-cyjno-4-hydroksycynamowego (10 mg/ml w 50% acetonitrylu, 0,1% TFA). Nanieść próbkę na płytkę docelową MALDI Opti-TOF 384 (AB SCIEX) i pozostawić krople rozpuszczalnika w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia (około 5 min).</li>
 <li>Rozdzielić roztwór reakcyjny na dwie alykwoaty. Pierwszy alykwoat inkubuje się z odpowiednią proteazą (ECE-1: 75 nM; trypsyna: 0,04 nM) w temperaturze pokojowej lub w temperaturze zalecanej dla danego enzymu. Drugi alykwoat inkubuje się bez proteazy, co służy jako próbka kontrolna. Pierwszy alykwoat stanowi standardową próbkę dla znakowania 18O katalizowanego przez proteazę i może być wykorzystany do identyfikacji peptydów i białek, wykrywania aktywności proteolitycznej oraz monitorowania reakcji cięcia proteolitycznego. Drugi alykwoat służy do wykazania, że inkorporacja 18O jest indukowana przez proteazę; w związku z tym w tej próbce nie oczekuje się ani znakowania, ani cięcia.</li>
 <li>Monitorować przebieg reakcji, pobierając alykwoaty reakcyjne i nanosząc je zgodnie z opisem w kroku 5 w odpowiednich odstępach czasu. Opisane powyżej warunki reakcji są stosowane do monitorowania reakcji proteolitycznej do czterech dni (ok. 24 punktów naniesienia). Pobieranie próbek należy rozpocząć co 5 min do 30 min, następnie nanosić co 30 min do 2 h, potem co 1 h do 8 h i co 8 h do 4 dni. Produkty cięcia powinny pojawić się w ciągu pierwszych 12 h, a substrat powinien zostać całkowicie zhydrolizowany po 24 h. Przedłużony czas inkubacji reakcji pozwala na zdefiniowanie stabilnych produktów reakcji, które są odrębne od produktów pośrednich, podlegających dalszemu przetwarzaniu. W zależności od pytania badawczego i danych par enzym-substrat, czasy nanoszenia i temperatura inkubacji muszą być modyfikowane, aby zapewnić optymalne próbkowanie reakcji.</li>
 <li>Po naniesieniu ostatniego punktu czasowego reakcji lub w przerwach między wydłużonymi interwałami nanoszenia, płytka docelowa MALDI zostaje poddana analizie MALDI-TOF/TOF MS/MS zgodnie z poniższym opisem (Sekcja B).</li>
</ol>
II. PALeO-TimeCourse: znakowanie końców proteolitycznych po trawieniu
<ol>
 <li>(Opcjonalnie) Mostki dwusiarczkowe białek (10 μM) i peptydów (250 μM) redukuje się za pomocą DTT (stężenie końcowe 2,5 mM) w 25 mM NH4HCO3 (oba roztwory świeżo przygotowane) poprzez inkubację przez 30 min w 50 °C.</li>
 <li>(Opcjonalnie) Wolne cysteiny alkiluje się jodoacetamidem (stężenie końcowe 10 mM) w 25 mM NH4HCO3 poprzez inkubację przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
 <li>W zależności od wybranej proteazy, roztwory białek/peptydów należy oczyścić w celu usunięcia pozostałości buforu i czynnika alkilującego. Do oczyszczania peptydów należy użyć kolumienek wirówkowych PepClean C-18, a do wymiany buforu białek koncentratorów wirówkowych Vivaspin.</li>
 <li>Oczyszczone produkty peptydowe/białka należy ponownie rozpuścić/wymienić w 20 μl buforu do reakcji proteazy (np. trypsyna: 25 mM NH4HCO3, pH 8,0) i poddać całkowitemu trawieniu wybraną proteazą (np. trypsyna: 0,04 nM; 37 °C; 12 hr).</li>
 <li>Produkty cięcia oczyszcza się za pomocą kolumienek wirówkowych PepClean C-18. Krok ten wyeliminuje resztkową aktywność proteazy.</li>
 <li>Oczyszczone produkty peptydowe należy ponownie rozpuścić/wymienić w 20 μl buforu do reakcji proteazy (trypsyna: 25 mM NH4HCO3, pH 8,0) zawierającego końcowe H218O w stosunku 1:1 (v/v).</li>
 <li>Przed dodaniem enzymu należy pobrać próbkę dla punktu czasowego zero: zmieszać 0,5 μl mieszaniny reakcyjnej i 0,5 μl macierzy kwasu alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowego (10 mg/ml w 50% acetonitrylu, 0,1% TFA). Próbkę nanosi się na płytkę docelową MALDI i pozostawia krople rozpuszczalnika w temperaturze pokojowej do wyschnięcia (około 5 min).</li>
 <li>Roztwór reakcyjny dzieli się na dwie aliquoty. Pierwszą aliquotę inkubuje się z wybraną proteazą (np. trypsyna: 0,04 nM) w temperaturze pokojowej lub w temperaturze zalecanej dla danego enzymu. Drugą aliquotę inkubuje się bez proteazy, co służy jako kontrola. Pierwsza aliquota stanowi standardową próbkę dla znakowania 18O po trawieniu katalizowanego przez proteazę i może być wykorzystana do ilościowego oznaczania peptydów i białek. Druga aliquota służy do wykazania, że wbudowanie 18O jest katalizowane przez proteazę; w związku z tym w tej próbce nie spodziewamy się znakowania.</li>
 <li>Przebieg reakcji monitoruje się poprzez pobieranie aliquot reakcyjnych i nanoszenie ich zgodnie z opisem w kroku 7 w odpowiednich odstępach czasu. Na przykład, w celu monitorowania reakcji wymiany tlenu karboksylowego katalizowanej przez trypsynę, nanosiliśmy próbki początkowo co 5 min przez 30 min, a następnie co 15 min.</li>
 <li>Po naniesieniu próbki dla ostatniego punktu czasowego lub pomiędzy wydłużonymi odstępami nanoszenia, płytkę docelową MALDI poddaje się analizie MALDI-TOF/TOF MS/MS zgodnie z opisem poniżej (Sekcja B).</li>
</ol>
III. ALeO-TimeCourse: Etap znakowania grup karboksylowych katalizowany kwasem
<ol>
 <li>Inkubować poszczególne peptydy (50 nM) z wodą wzbogaconą w 18O w stosunku 1:1 (v/v) w obecności lub w nieobecności (kontrola) 0,1% (v/v) końcowego stężenia kwasu trifluorooctowego (objętość całkowita 30 μl).</li>
 <li>Pobierać próbki produktów reakcji codziennie przez 48 dni, nakładając 0,5 μl aliquotu mieszaniny wraz z 0,5 μl matrycy z kwasu alfa-cyjanop-4-hydroksycynnamowego (10 mg/ml w 50% acetonitrylu, 0,1% TFA) bezpośrednio na płytkę docelową MALDI.</li>
 <li>W przerwach między nakładaniem próbek oraz po nakładaniu próbki z ostatniego punktu czasowego reakcji, przekazać płytkę docelową MALDI do analizy MALDI-TOF/TOF MS/MS zgodnie z opisem w sekcji B.</li>
</ol>
B. Pozyskiwanie i analiza danych MALDI-TOF/TOF MS/MS
<ol>
 <li>Widma masowe są rejestrowane przy użyciu analizatora 4800 MALDI TOF/TOF (AB SCIEX).</li>
 <li>Przed analizą instrument jest kalibrowany za pomocą mieszaniny standardów peptydowych (Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments) z maksymalną dopuszczalną tolerancją błędu pomiaru masy ± 50 ppm i minimalną liczbą sześciu dopasowanych pików.</li>
 <li>Widma MS (zakres mas 400 - 4,000 m/z) są rejestrowane w trzech powtórzeniach w trybie jonów dodatnich z regulowaną intensywnością lasera (3,400 - 3,800; krok 50), przy dopuszczalnym zakresie intensywności piku bazowego 2,000 - 45,000. Dla podwidm rejestrowane są pojedyncze strzały, łącznie 400 strzałów/widmo; warunki zatrzymania wchodzą w życie po zarejestrowaniu 800 podwidm (zatwierdzonych lub odrzuconych) lub po zatwierdzeniu 400 podwidm zgodnie z kryteriami akceptacji. W przypadku próbek o niskiej zawartości analitów lub w obecności złożonego tła biologicznego dolna granica zakresu detekcji MS powinna zostać podniesiona do 800 m/z. Dodatkowo może być konieczne usunięcie soli i innych związków zakłócających za pomocą etapu oczyszczania próbek opisanego wcześniej lub poprzez rozdział LC.</li>
 <li>Pliki danych MS (pliki .t2d) są eksportowane z oprogramowania do akwizycji danych 4000 Series Explorer i importowane do wewnętrznego laboratoryjnego systemu informatycznego, który wykorzystuje oprogramowanie MASCOT Distiller (Matrix Science) do przetwarzania widm i detekcji pików. Obwiednie izotopowe są dekonwolucjonowane, a stosunki wbudowania 18O automatycznie wyznaczane przy użyciu algorytmu podobnego do opisanego przez Mason et al.12 i zaadaptowanego przez nasz zespół9. Alternatywnie do dekonwolucji danych typu 18O15,16 można wykorzystać narzędzia programistyczne takie jak ZoomQuant13 i Viper14 oraz komercyjne pakiety oprogramowania, takie jak BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) i Mascot Distiller Quantitation Toolbox (Matrix Science). Stosunki wbudowania 18O są wyrażone jako względne wkłady poszczególnych form izotopowych peptydów (t.j. peptydów zawierających 16O, 18O1 lub 18O2) do całej obwiedni izotopowej.</li>
 <li>Dla każdego eksperymentu TimeCourse masy cząsteczkowe ([M+H]+) wszystkich wykrytych form peptydowych są wyodrębniane z powiązanych plików danych MS, a wartości są grupowane w koszyki (bins) o szerokości masy 100 ppm.</li>
 <li>Ustalono, że do wypełnienia koszyka wymagane są co najmniej trzy wartości [M+H]+. W przypadku znanych substratów przefiltrowana lista koszyków jest porównywana z listą produktów cięcia proteolitycznego przewidzianych na podstawie sekwencji peptydowej substratu przy użyciu narzędzia ExPASy FindPept17 (<a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a>) i dopuszczalnej tolerancji błędu masy 200 ppm.</li>
 <li>Widma MS/MS są rejestrowane dla wszystkich wartości mas produktów cięcia przewidzianych przez narzędzie FindPept oraz dla wartości koszyków, z którymi powiązane jest wbudowanie 18O. Dane MS/MS są rejestrowane na analizatorze 4800 MALDI TOF/TOF w trybie jonów dodatnich z reflektorem 1kV, przy stałej intensywności lasera 4200 i wyłączonym gazie CID. Dla każdego podwidma rejestrowanych jest 50 strzałów w układzie losowym, do maksymalnie 40 podwidm na plamkę (co daje łącznie 2,000 strzałów/plamka).</li>
 <li>Pliki danych MS/MS (pliki .t2d) są eksportowane z oprogramowania do akwizycji danych 4000 Series Explorer i importowane do wewnętrznego laboratoryjnego systemu informatycznego, gdzie detekowane są piki, a listy pików MS/MS są przypisywane do odpowiadających im zgrupowanych danych MS.</li>
 <li>W celu identyfikacji peptydów listy pików MS/MS są przeszukiwane w bazie danych SwissProt przy użyciu wyszukiwarki MASCOT z następującymi parametrami: brak specyficzności enzymu, tolerancja masy jonu prekursorowego 150 ppm i jonu fragmentacyjnego 0,2 Da.</li>
 <li>Identyfikacje peptydów mogą być dodatkowo walidowane za pomocą oprogramowania Data Explorer (AB SCIEX) poprzez potwierdzenie charakterystycznych wzorów wbudowania 18O w jonach fragmentacyjnych serii y, zgodnie z opisem Shevchenko et al.18.</li>
</ol>
C. Przygotowanie wykresów czasowych widm oraz wbudowania 18O
Wykresy czasowo-spektralne: pliki danych MS (.t2d) dla każdego punktu czasowego reakcji są eksportowane z oprogramowania Data Explorer jako pliki ASCII za pomocą makra, a następnie importowane do programu do analizy danych i grafiki (np. Origin firmy OriginLab) i przedstawiane w formie wykresów kaskadowych (Rycina 3).
Wykresy wbudowywania 18O: Dla każdego zgrupowanego produktu rozszczepienia peptydów wyznaczono wzglهny wkład poszczególnych gatunków izotopowych peptydów (16O, 18O1 lub 18O2) dla wszystkich punktów czasowych reakcji i narysowano je w funkcji czasu (Rysunek 4).

<ol><li>Bender, M., Kemp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-18+Studies+of+the+Mechanism+of+the+alpha-Chymotrypsin-catalyzed+Hydrolysis+of+Esters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters.</a> Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).</li>
<li>Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pepsin-catalyzed+exchange+of+oxygen+atoms+between+water+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).</li>
<li>Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanisms+of+action+of+proteolytic+enzymes+using+heavy+oxygen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange.</a> European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).</li>
<li>Fenselau, C., Yao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O2-labeling+in+quantitative+proteomic+strategies%3A+a+status+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).</li>
<li>Miyagi, M., Rao, K. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+18O-labeling+strategies+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics.</a> Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).</li>
<li>Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18O+stable+isotope+labeling+in+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct.+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">18O stable isotope labeling in MS-based proteomics.</a> Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).</li>
<li>Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+proteolytic+18O+labeling%3A+endoprotease-catalyzed+16O-to-18O+exchange+of+truncated+peptide+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates.</a> Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).</li>
<li>Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+strategy+for+detecting+and+characterizing+endogenous+proteinase+activities+in+complex+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.</a> Proteomics. 8, 435-445 (2008).</li>
<li>Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+endothelin-converting+enzyme-1%3A+a+regulator+of+beta-arrestin-dependent+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).</li>
<li>Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+cleavage+site-specificity+of+the+Plasmodium+falciparum+cysteine+proteases+falcipain-2+and+falcipain-3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.</a> PLoS ONE. 4, e5156(2009).</li>
<li>Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+automatically+interpreting+mass+spectra+of+18O-labeled+isotopic+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).</li>
<li>Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+%22ZoomQuant%26quot%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li>
<li>Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li>
<li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+computing+%2818%29O%2F%2816%29O+ratios+of+differentially+stable-isotope+labeled+peptides+in+the+context+of+postdigestion+%2818%29O+exchange%2Flabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling.</a> Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).</li>
<li>Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+proteolytic+processes+in+human+cancer+microenvironments+by+microdialysis+and+activity-based+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.</a> Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+%27de+novo%27+peptide+sequencing+by+a+combination+of+nanoelectrospray%2C+isotopic+labeling+and+a+quadrupole%2Ftime-of-flight+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).</li>
<li>Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li>
<li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li>
<li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Dzięki połączeniu znakowania izotopami stabilnymi i wysokorozdzielczej spektrometrii mas w ujęciu czasowym, metoda PALeO-TimeCourse umożliwia dynamiczną analizę powstawania produktów peptydowych. Test ten może być wykorzystany do generowania peptydów znakowanych izotopami stabilnymi na potrzeby ilościowych i jakościowych badań proteomiki oraz do oceny kinetyki powstawania peptydów proteotypowych. Co więcej, PALeO-TimeCourse została zaprojektowana do oceny szlaków proteolitycznych w specyficznych, fizjologicznie istotnych...

<table><tbody><tr><td>Kolumny do oczyszczania PepClean C-18</td><td>Thermo</td><td>89870</td><td></td></tr><tr><td>Płyta docelowa Opti-TOF 384 MALDI</td><td>AB SCIEX</td><td>1016629</td><td></td></tr><tr><td>4800 MALDI TOF/TOF</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Materiały</td></tr><tr><td>Alfa-cyano-4-hydroksycyjanowa kwas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990-1G-F</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3294-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Acros</td><td>16568-0050</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Endotelina konwertaza-1 (ECE-1)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1784-ZN</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna Gold</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Woda-&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;O, 97 atom % &lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329878-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw standardów masy do kalibracji instrumentów AB SCIEX TOF/TOF</td><td>AB SCIEX</td><td>4333604</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Odczynniki</td></tr></tbody></table>

procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18o

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Izotopy stabilne są niezbędnymi narzędziami w biologicznej spektrometrii mas. Historycznie izotopy stabilne 18O były szeroko wykorzystywane do badania mechanizmów katalitycznych enzymów proteolitycznych1-3. Wraz z pojawieniem się proteomiki opartej na spektrometrii mas, katalityczne włączanie atomów 18O z wody wzbogaconej izotopowo stało się popularną metodą ilościowego porównywania poziomów ekspresji białek (przegląd w pracach Fenselau i Yao4, Miyagi i Rao5 oraz Ye et al.6). Znakowanie 18O stanowi prostą i niskokosztową alternatywę dla technik znakowania chemicznego (np. iTRAQ, ICAT) i metabolicznego (np. SILAC)7. W zależności od zastosowanej proteazy, znakowanie 18O może prowadzić do wbudowania do dwóch atomów 18O w grupie karboksylowej końca C produktu cięcia3. Reakcję znakowania można podzielić na dwa niezależne procesy: rozszczepienie wiązania peptydowego oraz reakcję wymiany tlenu karboksylowego8. W naszej adaptacji enzymatycznego znakowania 18O o nazwie PALeO (protease-assisted labeling employing 18O-enriched water), wykorzystaliśmy wodę wzbogaconą w 18O w stopniu 50% w celu uzyskania charakterystycznych sygnatur izotopowych. W połączeniu z wysokorozdzielczą tandemową spektrometrią mas MALDI-TOF/TOF MS/MS (desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana macierzą z pomiarem czasu przelotu), charakterystyczne obwiednie izotopowe mogą być użyte do identyfikacji produktów cięcia z wysokim poziomem specyficzności. Wcześniej wykorzystaliśmy metodologię PALeO do wykrywania i charakterystyki endogennych proteaz9 oraz monitorowania reakcji proteolitycznych10-11. Ponieważ PALeO koduje samą istotę reakcji cięcia proteolitycznego, układ eksperymentalny jest prosty, a etapy biochemicznego wzbogacania produktów cięcia mogą zostać pominięte. Metodę PALeO można łatwo rozszerzyć o (i) eksperymenty kinetyczne monitorujące dynamikę reakcji cięcia proteolitycznego oraz (ii) analizę proteolizy w złożonych próbkach biologicznych odzwierciedlających warunki fizjologiczne. Eksperymenty PALeO-TimeCourse pomagają w identyfikacji etapów limitujących szybkość procesu oraz produktów pośrednich w złożonych reakcjach szlaków proteolitycznych. Ponadto reakcja PALeO pozwala nam zidentyfikować enzymy proteolityczne, takie jak serynowa proteaza trypsyna, która jest zdolna do ponownego wiązania swoich produktów cięcia i katalizowania wbudowania drugiego atomu 18O. Takie enzymy umożliwiające „podwójne znakowanie” mogą być wykorzystywane do znakowania 18O po trawieniu, w którym peptydy są znakowane wyłącznie poprzez reakcję wymiany tlenu karboksylowego. Nasza trzecia strategia rozszerza znakowanie z użyciem wody wzbogaconej w 18O poza enzymy, wykorzystując niskie pH do wprowadzania sygnatur izotopów stabilnych 18O do peptydów.

Wykorzystaliśmy schemat PALeO-TimeCourse do dynamicznego monitorowania wbudowywania stabilnych izotopów 18O w produkty cięcia peptydów generowane przez enzymy proteolityczne. Przedstawione podejście jest wszechstronnym narzędziem do porównawczych badań ścieżek przetwarzania proteolitycznego dla różnych kombinacji substratu i proteazy. Poprzez wielokrotne pobieranie próbek z reakcji proteolitycznych w jej trakcie, eksperyment PALeO-TimeCourse dostarcza rozdzielonych w czasie migawek obfitości substratu i produk...

Procedury znakowania izotopami stabilnymi z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O (procedury LeO) są wszechstronnymi narzędziami w ilościowych i jakościowych badaniach proteomicznych. W procedurach wspomaganych proteazami (PALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez proteolityczne rozszczepienie oraz reakcje wymiany tlenu karboksylowego katalizowane przez proteazy. W procedurze katalizowanej kwasowo (ALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez wymianę tlenu karboksylowego przy niskim pH.

Procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O

Stabilne izotopy są niezbędnymi narzędziami w biologicznej spektrometrii mas. Historycznie stabilne izotopy 18O były szeroko wykorzystywane do badania katalizy...

Niniejsza prezentacja przedstawia przepływy pracy dla stabilnego znakowania izotopowego hydrolizatów białek oraz peptydów syntetycznych z wykorzystaniem wody wzbogaconej w tlen 18; najpierw w eksperymencie z przebiegiem czasowym paleo katalizowanym przez proteazę, gdzie substrat i proteazę inkubuje się w obecności 50% wody wzbogaconej w tlen 18 w celu wbudowania atomów tlenu 18, a następnie w przypadku proteazy zdolnej do podwójnego znakowania, powtarza się inkubację produktów rozszczepienia po trawieniu z badaną proteazą w obecności 50% wody wzbogaconej w tlen 18.Przebieg pracy EO realizuje katalityczną w kwasie inkorporację atomów tlenu 18 do grup funkcyjnych w określonych odstępach czasu. Nakładanie alikwotów mieszanin reakcyjnych z matrycą na docelowe płytki w czasie pozyskiwania danych z spektrometrii mas pozwala na generowanie wykresów czasowych widm reakcji rozszczepiania peptydów, a także wykresów inkorporacji tlenu 18; poszczególne gatunki peptydów będące znakowanymi produktami rozszczepiania są wybierane do identyfikacji sekwencji w oparciu o MS/MS. W ostatecznym rozrachunku przepływy pracy te oferują wszechstronne narzędzia do ilościowych i jakościowych badań proteomicznych.Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad proteazami, takie jak identyfikacja szybkości, etapów limitujących oraz produktów pośrednich reakcji w złożonych szlakach proteolitycznych. Sygnatury proteolityczne zidentyfikowane w przebiegu czasowym paleo dostarczają istotnych informacji na temat swoistości substratowej. Ponadto, timer danych wykorzystuje również informacje kinetyczne.Postdoc z mojego laboratorium zademonstruje teraz tę procedurę. Przebieg analizy paleotime course monitoruje dynamikę reakcji rozszczepiania proteolitycznego w oparciu o katalizowaną przez proteazy inkorporację tlenu 18. Do 20 µL reakcji dodaj peptydy z próbki do buforu reakcyjnego proteazy zawierającego wodę wzbogaconą w tlen 18. Wymieszaj 0,5 µL mieszaniny reakcyjnej z 0,5 µL matrycy, nanieś kropelkę na płytkę docelową MALDI Opti-3 84 i pozostaw krople rozpuszczalnika w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia. W międzyczasie rozdziel mieszaninę reakcyjną do dwóch probówek.Kontrola i próbka do probówki z próbką. Dodać badaną proteazę i inkubować w zalecanej temperaturze reakcji enzymatycznej. Dodać w określonych punktach czasowych.Pobrać alikwot 0.5 µL, zmieszać go z 0.5 µL matrycy i nanieść na płytkę wielocelową. Następnie przeanalizować dynamikę reakcji za pomocą analizy MALDI-TOF MS, zgodnie z opisem w dalszej części tego schematu znakowania po trawieniu. Proteazy, takie jak trypsyna, katalizują reakcję wymiany tlenu w grupie karboksylowej w celu wbudowania O18. Po przeprowadzeniu trawienia białek bez znakowania O18, przepuścić produkty cięcia przez kolumkę spinową PepClean C18, aby usunąć resztkową aktywność proteaz.Następnie resuspenduj próbki w 20 µL buforu do reakcji z trypsyną zawierającego wodę wzbogaconą w tlen 18. Pobierz alikwot o objętości 0,5 µL i zmieszaj z równą objętością matrycy. Następnie nanieś próbkę na płytkę docelową Opti Off 3 84 MALDI i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.Następnie podziel roztwór reakcyjny na probówki kontrolne i próbkowe. Do probówek próbkowych dodaj trypsynę i inkubuj w temperaturze 37 °C. W celu monitorowania przebiegu reakcji pobierz alikwot o objętości 0,5 µl.Wymieszać z 0,5 µL matrycy i nanieść na płytkę MALDI. Dynamikę tej reakcji wymiany tlenu karboksylowego analizować za pomocą analizy MALDI-TOF MS. Procedura IEO w funkcji czasu opiera się na katalizowanych kwasem reakcjach wymiany tlenu karboksylowego w grupach bocznych i terminalnych peptydów kwasowych.Najpierw inkubuj 50 nanomolar poszczególnych peptydów w wodzie wzbogaconej w tlen 18 w stosunku jeden do jednego, w obecności lub w nieobecności 0,1% kwasu trichlorooctowego. Codziennie przez 48 dni pobieraj 0,5 mikrolitra aliquotów reakcji i nakładaj je bezpośrednio wraz z macierzą na płytkę docelową MALDI. Regularnie poddawaj płytkę docelową MALDI analizie MALDI TOF MS/MS. Sekcja ta jest szczegółowo opisana w towarzyszącym manuskrypcie.W pierwszej kolejności należy uzyskać widma MS w trzech powtórzeniach w trybie jonów dodatnich. Po skalibrowaniu multipolu i skonfigurowaniu akwizycji MS, należy wykonać pojedyncze pomiary dla widm cząstkowych. Następnie należy wyeksportować pliki danych MS z oprogramowania do akwizycji danych Explorer z serii 4 000.Następnie zaimportuj dane do wewnętrznego systemu informacyjnego wykorzystującego oprogramowanie Mascot Distiller do przetwarzania widm i detekcji pików. Przeprowadź dekonwolucję obwiedni izotopowych i automatycznie wyznacz współczynniki wbudowania tlenu 18; przyjmij współczynniki wbudowania tlenu 18 jako względne wkłady poszczególnych gatunków izotopowych peptydów do całej obwiedni izotopowej. Przefiltruj listę binów i wyznacz co najmniej trzy wartości w przedziale masy 100 ppm dla każdego eksperymentu z przebiegiem czasowym.Wyodrębnij masy cząsteczkowe dla wszystkich wykrytych gatunków peptydów z powiązanych plików danych MS. Następnie, korzystając z programu X pacey, znajdź zbiór peptydów przy dopuszczalnej tolerancji błędu masy 200 PPM. Porównaj listę binów z danymi produktów cięcia proteolitycznego przewidzianymi na podstawie sekwencji peptydu substratowego.Przejdź do pozyskiwania widm msms dla wszystkich wartości mas produktów rozszczepienia przewidzianych przez narzędzie find pep oraz dla wartości bin z przypisaną inkorporacją tlenu 18. Zbierz dane MSMS obejmujące 50 strzałów w zrandomizowanym wzorcu na każde podwidmo, przy maksymalnie 40 podwidmach na punkt, a następnie wyeksportuj pliki msms. Następnie wyeksportuj pliki danych MSMS do systemu analizy w celu detekcji pików oraz uzyskania list pików MSMS powiązanych z odpowiadającymi im danymi bend MS w celu identyfikacji peptydów.Ustaw następujące parametry wyszukiwania w wyszukiwarce Mascot: brak specyficzności enzymatycznej, tolerancja masy jonu prekursorowego 150 PPM oraz tolerancja masy jonu fragmentacyjnego 0,2 Daltona. Przeszukaj listy M-S-M-S-P w bazie danych Swiss Pro. Identyfikacje peptydów można dodatkowo zweryfikować za pomocą oprogramowania data explorer, potwierdzając charakterystyczne wzorce wbudowania tlenu 18 w jonach fragmentacyjnych na wykresach czasowych widm.Wyeksportuj pliki danych MS dla każdego punktu czasowego reakcji z oprogramowania data explorer w formacie plików ASCI za pomocą makra. Następnie zaimportuj pliki do programu do analizy danych i tworzenia grafiki i przedstaw je w formie wykresów kaskadowych (waterfall plots), aby stworzyć wykresy wbudowania tlenu 18 dla każdego zgięcia. Z produktów rozszczepienia peptydów wyodrębnij względne wkłady poszczególnych izotopowych form peptydów we wszystkich punktach czasowych reakcji, a następnie nanieś je na wykres w funkcji czasu.Wykresy czasowo-widmowe, takie jak ten, obrazują dynamikę reakcji cięcia proteolitycznego. Niniejszy eksperyment analizuje cięcie bioaktywnego peptydu endo i C przez enzym konwertujący śródbłonka 1. Układ kaskadowy (tzw. waterfall plot) przedstawia widma MS z eksperymentów przebiegu czasowego, co pozwala na jednoczesne monitorowanie degradacji substratu oraz powstawania produktów pośrednich i końcowych.Produkty rozszczepienia są identyfikowane za pomocą MSMS oraz charakterystycznych sygnatur wbudowania tlenu 18 w ich obwiedniach izotopowych. Ten mechanizm reakcji trypsyny wskazuje, że proteazy seryjne pośredniczą w wbudowaniu do dwóch atomów tlenu 18 do produktów rozszczepienia peptydów. W schemacie znakowania opartym na proteazach, reakcja rozszczepienia wiązania peptydowego skutkuje 50% stosunkiem wbudowania pojedynczego tlenu 18 dla nowo powstałych produktów rozszczepienia peptydów; proteazy takie jak trypsyna, które ponownie wiążą produkty reakcji, katalizują dalej wbudowanie drugiego atomu tlenu 18 poprzez reakcję wymiany tlenu karboksylowego.W stanie równowagi znacznik tlenu 18 rozkłada się w stosunku jeden do dwóch do jednego w produktach nieoznakowanych, pojedynczo oznakowanych i podwójnie oznakowanych. W schemacie znakowania końców proteolitycznych przed trawieniem nie dochodzi do rozszczepienia wiązań peptydowych. Zamiast tego wbudowanie do dwóch atomów tlenu 18 opiera się wyłącznie na reakcji wymiany tlenu karboksylowego.W związku z tym włączenie tlenu 18 zachodzi tylko w przypadku proteaz, które ponownie wiążą produkty rozszczepienia swoich peptydów. Labelowanie tlenem 18 katalizowane kwasem prowadzi do włączenia dwóch atomów tlenu 18 na grupę karboksylową. W trakcie tego eksperymentu wielokrotne przesunięcia masy o dwie daltony w obwiedni izotopowej angiotensyny I mogą zostać zmapowane poprzez pobór atomów tlenu 18.Dzięki połączeniu znakowania OPE z wysokorozdzielczą spektrometrią mas w sposób rozdzielczo czasowym, metoda paleo time course umożliwia dynamiczną analizę powstawania produktów peptydowych. Analiza ta może być wykorzystana do generowania stabilizowanych peptydów znakowanych topicznie na potrzeby ilościowych i jakościowych badań proteomicznych, a także do oceny kinetyki powstawania peptydów Protopic.Analiza przebiegu czasowego Paleo została zaprojektowana w celu oceny szlaków proteolitycznych w warunkach istotnych fizjologicznie. Technika ta utorowała drogę do naszych ostatnich badań nad procesami litycznymi w mikrośrodowiskach nowotworowych człowieka.

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Procesy oznaczania katalizowanych przez proteazę i kwas za pomocą wody wzbogaconej o 18O

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

DNA i białka są specjalnie znakowane sekwencyjnie grupami reporterowymi o powinowactwie lub fluorescencyjnym za pomocą metylotransferaz DNA lub białek oraz analogów syntetycznych kofaktorów. W zależności od specyficzności kofaktora enzymów, do jedno- lub dwuetapowego znakowania stosuje się azyrydynę lub podwójnie aktywowane analogi kofaktorów.

Specyficzne sekwencyjnie znakowanie kwasów nukleinowych i białek za pomocą metylotransferaz i analogów kofaktorów

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Tutaj prezentujemy protokół do oceny jednorodności etykietowania dla każdego gatunku białka w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Kwantyfikacja jednorodności znakowania w całym proteomie na poziomie pojedynczej cząsteczki

Użycie tiolowanego uracylu do wrażliwego i specyficznego oczyszczania nowo przepisanego RNA z drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Niezwykle szybkie i swoiste znakowanie metaboliczne RNA in vivo za pomocą 4-tiouracylu (Ers4tU)

Utlenianie tiolu białka ma znaczące implikacje w normalnych warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Opisujemy szczegóły ilościowej metody proteomiki redoks, która wykorzystuje wychwytywanie wspomagane żywicą, znakowanie izobaryczne i spektrometrię mas, umożliwiając specyficzną dla miejsca identyfikację i kwantyfikację odwracalnie utlenionych reszt cysteiny białek.

Wychwytywanie wspomagane żywicą w połączeniu z izobarycznym tandemowym etykietowaniem masy w celu multipleksowanej kwantyfikacji utleniania tiolu białek

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

Poznaj metody etykietowania izotopowego białek z wykorzystaniem wody wzbogaconej 18O poprzez procesy katalizowane proteazą i kwasem. Techniki te umożliwiają ilościową i jakościową analizę proteomiczną.

Procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w ¹⁸O

Przeglądaj więcej filmów