Procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w ¹⁸O

Niniejsza prezentacja przedstawia przepływy pracy dla stabilnego znakowania izotopowego hydrolizatów białek oraz peptydów syntetycznych z wykorzystaniem wody wzbogaconej w tlen 18; najpierw w eksperymencie z przebiegiem czasowym paleo katalizowanym przez proteazę, gdzie substrat i proteazę inkubuje się w obecności 50% wody wzbogaconej w tlen 18 w celu wbudowania atomów tlenu 18, a następnie w przypadku proteazy zdolnej do podwójnego znakowania, powtarza się inkubację produktów rozszczepienia po trawieniu z badaną proteazą w obecności 50% wody wzbogaconej w tlen 18.

Przebieg pracy EO realizuje katalityczną w kwasie inkorporację atomów tlenu 18 do grup funkcyjnych w określonych odstępach czasu. Nakładanie alikwotów mieszanin reakcyjnych z matrycą na docelowe płytki w czasie pozyskiwania danych z spektrometrii mas pozwala na generowanie wykresów czasowych widm reakcji rozszczepiania peptydów, a także wykresów inkorporacji tlenu 18; poszczególne gatunki peptydów będące znakowanymi produktami rozszczepiania są wybierane do identyfikacji sekwencji w oparciu o MS/MS. W ostatecznym rozrachunku przepływy pracy te oferują wszechstronne narzędzia do ilościowych i jakościowych badań proteomicznych.

Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad proteazami, takie jak identyfikacja szybkości, etapów limitujących oraz produktów pośrednich reakcji w złożonych szlakach proteolitycznych. Sygnatury proteolityczne zidentyfikowane w przebiegu czasowym paleo dostarczają istotnych informacji na temat swoistości substratowej. Ponadto, timer danych wykorzystuje również informacje kinetyczne.

Postdoc z mojego laboratorium zademonstruje teraz tę procedurę. Przebieg analizy paleotime course monitoruje dynamikę reakcji rozszczepiania proteolitycznego w oparciu o katalizowaną przez proteazy inkorporację tlenu 18. Do 20 µL reakcji dodaj peptydy z próbki do buforu reakcyjnego proteazy zawierającego wodę wzbogaconą w tlen 18. Wymieszaj 0,5 µL mieszaniny reakcyjnej z 0,5 µL matrycy, nanieś kropelkę na płytkę docelową MALDI Opti-3 84 i pozostaw krople rozpuszczalnika w temperaturze pokojowej do całkowitego wyschnięcia. W międzyczasie rozdziel mieszaninę reakcyjną do dwóch probówek.

Kontrola i próbka do probówki z próbką. Dodać badaną proteazę i inkubować w zalecanej temperaturze reakcji enzymatycznej. Dodać w określonych punktach czasowych.

Pobrać alikwot 0.5 µL, zmieszać go z 0.5 µL matrycy i nanieść na płytkę wielocelową. Następnie przeanalizować dynamikę reakcji za pomocą analizy MALDI-TOF MS, zgodnie z opisem w dalszej części tego schematu znakowania po trawieniu. Proteazy, takie jak trypsyna, katalizują reakcję wymiany tlenu w grupie karboksylowej w celu wbudowania O18. Po przeprowadzeniu trawienia białek bez znakowania O18, przepuścić produkty cięcia przez kolumkę spinową PepClean C18, aby usunąć resztkową aktywność proteaz.

Następnie resuspenduj próbki w 20 µL buforu do reakcji z trypsyną zawierającego wodę wzbogaconą w tlen 18. Pobierz alikwot o objętości 0,5 µL i zmieszaj z równą objętością matrycy. Następnie nanieś próbkę na płytkę docelową Opti Off 3 84 MALDI i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Następnie podziel roztwór reakcyjny na probówki kontrolne i próbkowe. Do probówek próbkowych dodaj trypsynę i inkubuj w temperaturze 37 °C. W celu monitorowania przebiegu reakcji pobierz alikwot o objętości 0,5 µl.

Wymieszać z 0,5 µL matrycy i nanieść na płytkę MALDI. Dynamikę tej reakcji wymiany tlenu karboksylowego analizować za pomocą analizy MALDI-TOF MS. Procedura IEO w funkcji czasu opiera się na katalizowanych kwasem reakcjach wymiany tlenu karboksylowego w grupach bocznych i terminalnych peptydów kwasowych.

Najpierw inkubuj 50 nanomolar poszczególnych peptydów w wodzie wzbogaconej w tlen 18 w stosunku jeden do jednego, w obecności lub w nieobecności 0,1% kwasu trichlorooctowego. Codziennie przez 48 dni pobieraj 0,5 mikrolitra aliquotów reakcji i nakładaj je bezpośrednio wraz z macierzą na płytkę docelową MALDI. Regularnie poddawaj płytkę docelową MALDI analizie MALDI TOF MS/MS. Sekcja ta jest szczegółowo opisana w towarzyszącym manuskrypcie.

W pierwszej kolejności należy uzyskać widma MS w trzech powtórzeniach w trybie jonów dodatnich. Po skalibrowaniu multipolu i skonfigurowaniu akwizycji MS, należy wykonać pojedyncze pomiary dla widm cząstkowych. Następnie należy wyeksportować pliki danych MS z oprogramowania do akwizycji danych Explorer z serii 4 000.

Następnie zaimportuj dane do wewnętrznego systemu informacyjnego wykorzystującego oprogramowanie Mascot Distiller do przetwarzania widm i detekcji pików. Przeprowadź dekonwolucję obwiedni izotopowych i automatycznie wyznacz współczynniki wbudowania tlenu 18; przyjmij współczynniki wbudowania tlenu 18 jako względne wkłady poszczególnych gatunków izotopowych peptydów do całej obwiedni izotopowej. Przefiltruj listę binów i wyznacz co najmniej trzy wartości w przedziale masy 100 ppm dla każdego eksperymentu z przebiegiem czasowym.

Wyodrębnij masy cząsteczkowe dla wszystkich wykrytych gatunków peptydów z powiązanych plików danych MS. Następnie, korzystając z programu X pacey, znajdź zbiór peptydów przy dopuszczalnej tolerancji błędu masy 200 PPM. Porównaj listę binów z danymi produktów cięcia proteolitycznego przewidzianymi na podstawie sekwencji peptydu substratowego.

Przejdź do pozyskiwania widm msms dla wszystkich wartości mas produktów rozszczepienia przewidzianych przez narzędzie find pep oraz dla wartości bin z przypisaną inkorporacją tlenu 18. Zbierz dane MSMS obejmujące 50 strzałów w zrandomizowanym wzorcu na każde podwidmo, przy maksymalnie 40 podwidmach na punkt, a następnie wyeksportuj pliki msms. Następnie wyeksportuj pliki danych MSMS do systemu analizy w celu detekcji pików oraz uzyskania list pików MSMS powiązanych z odpowiadającymi im danymi bend MS w celu identyfikacji peptydów.

Ustaw następujące parametry wyszukiwania w wyszukiwarce Mascot: brak specyficzności enzymatycznej, tolerancja masy jonu prekursorowego 150 PPM oraz tolerancja masy jonu fragmentacyjnego 0,2 Daltona. Przeszukaj listy M-S-M-S-P w bazie danych Swiss Pro. Identyfikacje peptydów można dodatkowo zweryfikować za pomocą oprogramowania data explorer, potwierdzając charakterystyczne wzorce wbudowania tlenu 18 w jonach fragmentacyjnych na wykresach czasowych widm.

Wyeksportuj pliki danych MS dla każdego punktu czasowego reakcji z oprogramowania data explorer w formacie plików ASCI za pomocą makra. Następnie zaimportuj pliki do programu do analizy danych i tworzenia grafiki i przedstaw je w formie wykresów kaskadowych (waterfall plots), aby stworzyć wykresy wbudowania tlenu 18 dla każdego zgięcia. Z produktów rozszczepienia peptydów wyodrębnij względne wkłady poszczególnych izotopowych form peptydów we wszystkich punktach czasowych reakcji, a następnie nanieś je na wykres w funkcji czasu.

Wykresy czasowo-widmowe, takie jak ten, obrazują dynamikę reakcji cięcia proteolitycznego. Niniejszy eksperyment analizuje cięcie bioaktywnego peptydu endo i C przez enzym konwertujący śródbłonka 1. Układ kaskadowy (tzw. waterfall plot) przedstawia widma MS z eksperymentów przebiegu czasowego, co pozwala na jednoczesne monitorowanie degradacji substratu oraz powstawania produktów pośrednich i końcowych.

Produkty rozszczepienia są identyfikowane za pomocą MSMS oraz charakterystycznych sygnatur wbudowania tlenu 18 w ich obwiedniach izotopowych. Ten mechanizm reakcji trypsyny wskazuje, że proteazy seryjne pośredniczą w wbudowaniu do dwóch atomów tlenu 18 do produktów rozszczepienia peptydów. W schemacie znakowania opartym na proteazach, reakcja rozszczepienia wiązania peptydowego skutkuje 50% stosunkiem wbudowania pojedynczego tlenu 18 dla nowo powstałych produktów rozszczepienia peptydów; proteazy takie jak trypsyna, które ponownie wiążą produkty reakcji, katalizują dalej wbudowanie drugiego atomu tlenu 18 poprzez reakcję wymiany tlenu karboksylowego.

W stanie równowagi znacznik tlenu 18 rozkłada się w stosunku jeden do dwóch do jednego w produktach nieoznakowanych, pojedynczo oznakowanych i podwójnie oznakowanych. W schemacie znakowania końców proteolitycznych przed trawieniem nie dochodzi do rozszczepienia wiązań peptydowych. Zamiast tego wbudowanie do dwóch atomów tlenu 18 opiera się wyłącznie na reakcji wymiany tlenu karboksylowego.

W związku z tym włączenie tlenu 18 zachodzi tylko w przypadku proteaz, które ponownie wiążą produkty rozszczepienia swoich peptydów. Labelowanie tlenem 18 katalizowane kwasem prowadzi do włączenia dwóch atomów tlenu 18 na grupę karboksylową. W trakcie tego eksperymentu wielokrotne przesunięcia masy o dwie daltony w obwiedni izotopowej angiotensyny I mogą zostać zmapowane poprzez pobór atomów tlenu 18.

Dzięki połączeniu znakowania OPE z wysokorozdzielczą spektrometrią mas w sposób rozdzielczo czasowym, metoda paleo time course umożliwia dynamiczną analizę powstawania produktów peptydowych. Analiza ta może być wykorzystana do generowania stabilizowanych peptydów znakowanych topicznie na potrzeby ilościowych i jakościowych badań proteomicznych, a także do oceny kinetyki powstawania peptydów Protopic.

Analiza przebiegu czasowego Paleo została zaprojektowana w celu oceny szlaków proteolitycznych w warunkach istotnych fizjologicznie. Technika ta utorowała drogę do naszych ostatnich badań nad procesami litycznymi w mikrośrodowiskach nowotworowych człowieka.