Name: Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów przy użyciu genomiki pojedynczego wirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę izolacji pojedynczych wirionów z mieszanych próbek przy użyciu cytometrii przepływowej i amplifikacji MDA. Technika ta umożliwia sekwencjonowanie genomów wirusów bez konieczności ich uprawy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Kenowi Nealsonowi za jego spostrzeżenia i rady przekazane podczas procesu przygotowywania rękopisu.

1. Przygotowanie zawiesin wirusowych
Przed izolacją pojedynczych wirionów za pomocą cytometrii przepływowej należy przygotować niefiksowane zawiesiny wirusowe.
<ol>
	<li>Wyizolować cząsteczki wirusowe zgodnie z wcześniej opracowanymi protokołami, upewniając się, że końcowa zawiesina wirusowa znajduje się w buforze TE (Tris-EDTA, pH 8) przefiltrowanym przez filtr 0,1 μm. Zaleca się stosowanie metod filtracji przepływowej w układzie stycznym (TFF) 6, choć opracowano również inne metody wykorzystujące flokulację chemiczną 7.</li>
	<li>Oznaczyć liczbę cząsteczek wirusowych zgodnie z ustalonymi protokołami, np. z wykorzystaniem epifluorescencji 8-10 lub cytometrii przepływowej 11,12.</li>
	<li>Rozdzielić zawiesinę wirusową do dwóch probówek Eppendorf (zalecana objętość końcowa to 1 000 μl).</li>
</ol>
2. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Aby posortować wirusy za pomocą cytometru przepływowego BD FACSAria II wyposażonego w niestandardowy PMT do rozpraszania przedniego (FSC PMT), należy rozcieńczyć cząstki wirusowe w buforze TE (przefiltrowanym przez filtr 0,1 μm), pH 8,0, do odpowiedniego miana, aby uzyskać szybkość zdarzeń na poziomie 200 events sec-1.</li>
	<li>Należy ustawić progi w celu maksymalizacji stosunku sygnału do szumu; np. dla mieszanej populacji zawierającej cząstki faga T4 i lambda zaleca się następujące wartości: FSC PMT na 1 000 oraz SSC na 200.</li>
	<li>Należy przeanalizować 100 μl próbek „blank”, zawierających odpowiednio: 1) bufor TE przefiltrowany przez filtr 0,1 μm oraz 2) bufor TE przefiltrowany przez filtr 0,1 μm i SybrGreen1 w rozcieńczeniu 1e-4 z roztworu zapasowego (10 000X).</li>
	<li>Należy przeanalizować niewielką alikwotę (zalecane 100 μl) niebarwionej zawiesiny wirusowej w celu oceny tła, a następnie barwioną zawiesinę wirusową (SybrGreen1 w rozcieńczeniu 1e-4 z roztworu zapasowego), analizując łącznie 5 000 zdarzeń dla każdego rodzaju cząstek wirusowych. Służy to sprawdzeniu stężenia i, jeśli to konieczne, dostosowaniu bram sortowania przed właściwym sortowaniem. Zalecamy zastosowanie wąskiej bramy w centrum populacji cząstek wirusowych. Do wyznaczania bram używamy wykresu SYBR Green i FSC PMT.</li>
	<li>Do każdego dołka na szkiełku mikroskopowym z politetrafluoroetylenu (PTFE) (Electron Microscopy Sciences) należy dodać 5 μl 1% agarozy niskotopliwej (LMP) (w buforze TBE) schłodzonej do 37 °C.</li>
	<li>Należy umieścić szkiełko mikroskopowe PTFE w cytometrze przepływowym, aby zbierać posortowane cząstki wirusowe.</li>
	<li>Należy rozpocząć sortowanie cząstek wirusowych zabarwionych SYBR green bezpośrednio na szkiełko PTFE z agarozą LMP. Zalecamy sortowanie 10 lub więcej zdarzeń (cząstek wirusowych) w niektórych dołkach, aby ułatwić ocenę głębokości rozmieszczenia wirusów podczas konfokalnej laserowej skaningowej mikroskopii (CSLM).</li>
	<li>Po zakończeniu sortowania należy wyjąć szkiełko z cytometru przepływowego i dodać do każdego dołka kolejne 5 μl agarozy LMP schłodzonej do 37 °C, aby zatopić cząstkę/cząstki wirusowe.</li>
</ol>
3. Wizualizacja pojedynczych wirionów przy użyciu mikroskopii konfokalnej
Jeśli pożądany jest pojedynczy wirion, niezbędne jest ustalenie, czy każda studzienka zawiera pojedynczy wirus; w tym celu konieczne jest zastosowanie CLSM w celu wizualizacji osadzonych wirionów w 3D, aby zweryfikować, że obecna jest tylko jedna cząsteczka i że wiele wirusów nie jest ułożonych jeden na drugim.
<ol>
	<li>Ustaw laser mikroskopu na długość fali wzbudzenia 488 nm.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie osadzonych cząsteczek wirusa, używając obiektywu 63X o dużej odległości roboczej.</li>
</ol>
4. Amplifikacja całego genomu
<ol>
	<li>Po zidentyfikowaniu studni z pojedynczymi wirusami za pomocą CLSM, przeprowadź amplifikację całego genomu metodą amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) wewnątrz agarozy (in situ).</li>
	<li>Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wprowadzenia zanieczyszczeń DNA, usuń wybrane „kulkie” agarozy z preparasu i umieść je w sterylnej probówce PCR. W tym kroku użyj sterylnej pęsety i/lub żyletki.</li>
	<li>Zlizuj cząstkę wirusa in situ za pomocą ciepła (94 °C) przez 3 min w bloku grzewczym termocyklera.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję MDA zgodnie z zaleceniami producenta (zestaw GenomiPhi HY, GE Healthcare) z następującymi modyfikacjami:
	<ol>
		<li>Zmniejsz objętość próbki i buforów reakcyjnych do 11,25 μl i inkubuj w 30 °C przez maksymalnie 2 hr, aby ograniczyć niespecyficzną amplifikację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść amplifikowany materiał genomowy, przenosząc genomowe DNA (gDNA) do probówki Eppendorf 1,7 ml i dodając 1/10 objętości 3 M octanu sodu (NaOAc) w buforze TBE (tym samym buforze, który został użyty do przygotowania agarozy LMP).</li>
	<li>Umieść próbkę(i) w temperaturze 55 °C na 10 min w celu rozpuszczenia agarozy.</li>
	<li>Przenieś probówkę(i) do temperatury 42 °C, aby obniżyć temperaturę przed dodaniem enzymu.</li>
	<li>Dodaj 2 jednostki β-agarazy do każdej probówki i inkubuj przez 2 hr.</li>
	<li>Dodaj do probówki jedną objętość nasyconego buforem roztworu fenolu, wymieszaj energicznie i wiruj przy 3 500 x g przez 15 min. Przenieś nadpływ zawierający DNA do nowej probówki Eppendorf 1,7 ml.</li>
	<li>Dodaj jedną objętość 100% izopropanolu i 1 μl Glycoblue. Wymieszaj dokładnie, odwracając probówkę.</li>
	<li>Wiruj przy 28 000 x g w 4 °C przez 60 min. Odlej izopropanol, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj 150 μl 70% etanolu do każdej probówki. Wiruj przy 28 000 x g w RT przez 10 min. Odlej etanol, wysusz osad DNA na powietrzu i resuspenduj DNA w odpowiedniej objętości buforu TE.</li>
	<li>Zalecamy powtórzenie kroków 4.4-4.9 z następującymi modyfikacjami: przygotuj 3-5 powtórzeń reakcji MDA i skróć inkubację w 30 °C do 1 hr. Połącz próbki po oczyszczeniu i wyprecypituj za pomocą 95-100% etanolu, aby uzyskać pożądaną stężenie.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 podsumowuje proces SVG. Metody te wykorzystują cytometrię przepływową do sortowania cząstek wirusowych na szkiełka mikroskopowe z PTFE zawierające agarozę, aby wyizolować pojedyncze wiriony z mieszanej populacji, a następnie MDA w celu uzyskania ilości gDNA wystarczających do sekwencjonowania.
W ramach dowodu koncepcji bakteriofagi lambda i T4 zostały zmieszane i poddane procesowi SVG 11. Po wychwyceniu wirionów i ich osadzeniu w agarozie, wykorzystano CLSM w celu wizualizacji i potwierdzenia otrzymania pojedynczego wirionu; wyniki przedstawiono na Rysunku 2. Po zidentyfikowaniu studzienek z pojedynczymi wirionami, wybrano je do przeprowadzenia MDA gDNA. Następnie zastosowano multiplex PCR specyficzny dla T4 i lambda, aby zidentyfikować wyizolowany wirion, Rysunek 3. Do sekwencjonowania genomu wybrano wyizolowanego faga lambda.
Sekwencjonowanie genomu przeprowadzono z wykorzystaniem technologii 454-Titanium, a odczyty z sekwencjonowania poddano mapowaniu do referencyjnego w celu określenia stopnia pokrycia uzyskanego za pomocą SVG. Rycina 4 pokazuje, że odzyskano niemal cały genom lambda (z wyjątkiem pierwszych 5 bp).
<img alt="Proces cytometrii przepływowej; schemat; liczenie i analiza komórek poprzez detekcję optyczną i sortowanie." src="/files/ftp_upload/3899/3899fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Metodologia SVG. Zawiesiny wirusowe zawierające mieszaną populację są redukowane do pojedynczych cząstek wirusa za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie sortowane na poszczególne „kuleczki” agarozowe. Wirus jest osadzany w kuleczce agarozowej poprzez nałożenie dodatkowej warstwy agarozy po sortowaniu cytometrycznym. Na koniec przeprowadzana jest amplifikacja całego genomu in situ.
<img alt="Schemat detekcji punktów w mikroskopii; wstawiony wykres przedstawia piki intensywności sygnału (RFU) przy określonych wartościach." src="/files/ftp_upload/3899/3899fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Mikrograf z konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego przedstawiający wyselekcjonowaną cząsteczkę wirusa zatopioną w koraliku agarozowym. A) Rekonstrukcja trójwymiarowa cząsteczki wirusa barwionej Sybr Green I wewnątrz koralika agarozowego. Wstawka: większe powiększenie wyizolowanej cząsteczki wirusa. B) Wykres profilu względnej fluorescencji zabarwionej pojedynczej cząsteczki wirusa wewnątrz koralika agarozowego.
<img alt="Elektroforeza żelu PCR specyficzna dla lambda/T4 pokazująca prążki DNA i marker, porównanie wyników PCR." src="/files/ftp_upload/3899/3899fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Identyfikacja bakteriofagów za pomocą PCR. A) Multiplex PCR z zastosowaniem starterów specyficznych dla T4 i lambda w celu genotypowania, ścieżki: 1. drabinka TrackIt 1 kb plus (Invitrogen), 2. integraza lambda (750 bp), 3. główne białko kapsydu T4 (1,050 bp), 4. mieszanina integrazy lambda i głównego białka kapsydu T4. B) Następcza specyficzna dla lambda reakcja PCR z dodatkowymi loci w celu dalszego potwierdzenia izolacji genomu faga, ścieżki: 1. integraza lambda (750 bp), 2. represor lambda (356 bp), 3. lambda sie (wykluczanie superinfekcji) (456 bp), 4. drabinka TrackIt 1 kb plus (Invitrogen).
<img alt="Analiza danych genomicznych; mapowanie genów, rozkład składu; wykres przebiegu sekwencji." src="/files/ftp_upload/3899/3899fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Atrybuty i pokrycie genomu lambda. A) Wykres zawartości GC, B) Mapa genomu lambda (zaadaptowana z <a href="http://img.jgi.doe.gov" target="_blank">http://img.jgi.doe.gov</a>), oraz C) Mapowanie odczytów SVG do referencyjnego bakteriofaga lambda, oś x to pozycja w genomie, oś y to % pokrycia.

<ol><li>Raghunathan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+amplification+from+a+single+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA amplification from a single bacterium.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).</li>
<li>Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomic+sequencing+using+Multiple+Displacement+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).</li>
<li>Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+single+microbial+cells+from+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).</li>
<li>Edwards, R. A., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral metagenomics.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).</li>
<li>Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of viruses in the environment.</a> Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).</li>
<li>Williamson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition%3A+metagenomic+characterization+of+viruses+within+aquatic+microbial+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456(2008).</li>
<li>John, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+concentration+of+ocean+viruses+by+chemical+flocculation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).</li>
<li>Noble, R., Fuhrman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li>
<li>Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+viruses+in+marine+waters%3A+assessment+by+epifluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).</li>
<li>Hennes, K. P., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+counts+of+viruses+in+natural+waters+and+laboratory+cultures+by+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol.+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy.</a> Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).</li>
<li>Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+marine+viruses+in+culture+and+natural+samples+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).</li>
<li>Brussaard, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+bacteriophages+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enumeration of bacteriophages using flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).</li>
<li>Allen, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Virus+Genomics%3A+A+New+Tool+for+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery.</a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+cloning+using+phi+29+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przy stosowaniu podejść SVG należy wziąć pod uwagę szereg istotnych czynników. Genotypowanie, przeprowadzone podczas eksperymentu dowodzącego koncepcji 13, nie jest właściwą opcją dla izolatów środowiskowych lub nieznanych, ponieważ nie istnieją starannie zachowane primery wspólne dla wszystkich grup wirusów. Ponadto podczas amplifikacji z wykorzystaniem reakcji MDA często zgłasza się syntezę DNA tła lub nieswoistą amplifikację 14. Nieswoistą amplifikację przypisuje się kontaminacji DNA pochodzącej ...

<table><tbody><tr><td>bufor TE 1X</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>fenol nasycony buforem</td><td>Invitrogen</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>zestaw GenomiPhi HY</td><td>GE Healthcare</td><td>25-6600-22</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>15 mg/ml</td></tr><tr><td>agaroza LMP</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>szkiełko przedmiotowe PTFE</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63430-04</td><td>24 dołki, średnica 4 mm</td></tr><tr><td>SybrGreen</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10 000X</td></tr><tr><td>&amp;#946;-agaraza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0392S</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „single virus genomics”

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Amplifikacja całego genomu oraz sekwencjonowanie pojedynczych komórek mikrobowych umożliwiają charakterystykę genomiczną bez konieczności hodowli 1-3. Wirusy, które są wszechobecne i stanowią najliczniejsze organizmy na naszej planecie 4 oraz są istotne w każdym środowisku 5, nie zostały jeszcze poznane za pomocą podobnych metod. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji i charakterystyki genomów pojedynczych wirionów, zwaną „genomiką pojedynczych wirusów” (Single Virus Genomics, SVG). SVG wykorzystuje cytometrię przepływową do izolacji poszczególnych wirusów oraz amplifikację całego genomu w celu uzyskania genomowego DNA (gDNA) o wysokiej masie cząsteczkowej, który może być wykorzystany w kolejnych reakcjach sekwencjonowania.

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się materiał genomiczny odpowiedni do sekwencjonowania.

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Amplifikacja całego genomu i sekwencjonowanie pojedynczych komórek drobnoustrojów umożliwiają charakteryzację genomiczną bez konieczności hodowli 1-3. Wirusy, które ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja pojedynczych wirionów z mieszanego konsorcjum oraz sekwencjonowanie uzyskanego materiału genomicznego w celu identyfikacji wirusów z różnych środowisk bez konieczności ich hodowli. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację pojedynczych wirionów przy użyciu sortowania cytometrycznego na kulezkach agarozowych. Przechwycenie pojedynczego wirionu jest następnie weryfikowane za pomocą mikroskopii konfokalnej.Następnie materiał genomiczny jest izolowany z wirionów i amplifikowany metodą wielokrotnej amplifikacji z przemieszczeniem (MDA), aby uzyskać ilość DNA niezbędną do sekwencjonowania. W końcowej fazie DNA wirusa jest sekwencjonowane przy użyciu technologii wysokoprzepustowych w celu uzyskania nadmiarowego pokrycia genomu wirionu, co znacząco wspomaga montaż i adnotację genomu. Ostatecznie techniki bioinformatyczne oparte na metodach próbkowania podzbiorów sekwencji w celu zwiększenia rozmiaru kontigów umożliwiają analizę wyizolowanych wirionów.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii wirusów, nadając kontekst genomowy ogromnej puli nieopisanych genów wirioplanktonu, a także umożliwić odkrywanie nowych genomów z różnorodnych ekosystemów. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ amplifikacja i izolacja pojedynczych wirionów przesuwa granice obecnych możliwości technologicznych. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas oceny zastosowania MDA w badaniach społeczności wirioplanktonu, kiedy zauważyliśmy, że możliwe jest wyselekcjonowanie pojedynczej cząstki wirusa, a następnie jej sekwencjonowanie i zmontowanie pełnego genomu wirusa z tych złożonych zbiorowisk. Do sortowania wirusów należy użyć cytometru przepływowego wyposażonego w niestandardowe fotopowielacze rozproszenia przedniego (FSCPMT). Należy rozpocząć od rozcieńczenia cząstek wirusowych w buforze Tris-EDTA filtrowanym przez membranę o porach 0,1 µm. W przypadku mieszanego zespołu zawierającego cząstki faga T4 oraz faga lambda, należy ustawić FSCPMT na 1000, a SSC na 200, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu.Po analizie próbek kontrolnych, przeprowadź pomiar około 100 µL zabarwionej zawiesiny wirusowej aż do uzyskania łącznie 5 000 zdarzeń. Następnie, korzystając z wykresów sybr green one oraz FSCPMT, wyznacz wąską bramkę w centrum populacji cząsteczek wirusowych. Do każdego okienka na szkiełku mikroskopowym z P-T-F-E dodaj pięć µL 1% agarozy niskotopliwej w buforze TBE schłodzonej do 37 °C, a następnie umieść szkiełko w cytometrze przepływowym w celu wychwycenia posortowanych cząsteczek wirusowych.Rozpocząć sortowanie, przechwytując 10 lub więcej zdarzeń cząstek wirusowych w niektórych studzienkach, aby ułatwić wykrycie głębokości położenia wirusów podczas konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej. Po zakończeniu sortowania wyjąć preparat z cytometru przepływowego i dodać pięć kolejnych mikrolitrów agarozy o niskiej temperaturze topnienia, schłodzonej do 37 °C, do każdej studzienki zawierającej cząstki wirusowe. W przypadku pojedynczych wirionów ustawić konfokalny skaningowy mikroskop laserowy na wzbudzenie przy 488 nm. Następnie obrazować zatopione cząstki, używając obiektywu 63 x o długiej ogniskowej, aby zweryfikować, czy obecna jest tylko pojedyncza cząstka i czy wiele wirusów nie jest ułożonych jeden na drugim. Po zidentyfikowaniu studzienek z pojedynczymi wirusami, za pomocą żyletki usunąć wybrane kule agarozy z preparatu i umieścić je w sterylnej probówce do PCR.Umieść probówkę w bloku grzewczym termocyklera ustawionym na 94 °C przez trzy minuty, aby przeprowadzić lizę cząstki wirusowej in-situ. Następnie po wykonaniu zmodyfikowanej procedury MDA przenieś genomowe DNA do probówek Eppendorf o pojemności 1,7 ml i dodaj 1/10 objętości 3 M octanu sodu w buforze TBE w celu oczyszczenia namnożonego materiału genomowego. Przechowuj próbki w temperaturze 55 °C przez 10 minut, aby rozpuścić agarozę, a następnie przenieś probówki do temperatury 42 °C w celu obniżenia temperatury przed dodaniem enzymu. Teraz dodaj dwie jednostki Beta-agarazy do każdej probówki i inkubuj probówki przez dwie godziny.Następnie do każdej probówki dodaj jedną objętość buforowanego, nasyconego roztworu fenolu. Wymieszaj intensywnie i wiruj probówki przez 15 minut przy 3 500 ×g w temperaturze pokojowej. Przenieś nadlodzie zawierające DNA do nowej probówki Eppendorfa o pojemności 1,7 ml. Następnie do probówek dodaj jedną objętość 100% izopropanolu oraz jeden µL glyco-blue i odwróć probówki, aby wymieszać zawartość. Po ponownym wirowaniu probówek, tym razem przez 60 minut przy 28 000 ×g i 4 °C, odlej izopropanol, uważając, aby nie naruszyć osadu, i dodaj 150 µL 70% etanolu do każdej probówki. Wiruj probówki przez 10 minut przy 28 000 ×g w temperaturze pokojowej. Odlej etanol, wysusz osad DNA na powietrzu i resuspenduj DNA w odpowiedniej objętości buforu Tris-EDTA. Ta trójwymiarowa rekonstrukcja cząsteczki wirusa barwionej sybr green I wewnątrz kuleczki agarozy pokazuje, w jaki sposób konfokalna mikroskopia laserowa może być wykorzystana do wizualizacji i potwierdzenia, że w każdej studzience uzyskano pojedynczy wirion po jego przechwyceniu i zatopieniu w agarozie; wstawka przedstawia większe powiększenie wyizolowanej cząsteczki wirusa.Tutaj przedstawiono wykres profilu względnej fluorescencji barwionej pojedynczej cząsteczki wirusa wewnątrz kuleczki agarozowej. Ta końcowa seria rycin pokazuje, że dla tego reprezentatywnego wirusa odzyskano niemal cały genom Lambda, z wyjątkiem pierwszych pięciu par zasad. Tutaj przedstawiono wykres GC dla zidentyfikowanego genomu pojedynczego wirusa. Ta rycina przedstawia mapę genomu lambda. Na koniec pokazano mapowanie genomu pojedynczego wirusa dla reprezentatywnego, wyizolowanego i namnożonego bakteriofaga lambda. Oś X przedstawia pozycję w genomie. Oś Y przedstawia procent pokrycia.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie technik sterylnych oraz poświęcenie czasu na zapewnienie uniknięcia kontaminacji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody w celu oceny taksonomii wyizolowanych wirionów przed sekwencjonowaniem całego genomu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować pojedyncze wiriony przy użyciu fluorescencyjnego sortowania komórek, mikroskopii konfokalnej oraz amplifikacji całego genomu.

isolation-genome-analysis-single-virions-using-single-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem „Genomiki Pojedynczych Wirusów”

Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.

Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów

Opisano prosty, wydajny i niezawodny sposób synchronizacji dostarczania wielu komponentów wirusowych do komórek roślinnych za pomocą przejściowej ekspresji pośredniczonej przez Agrobacterium. Podejście to umożliwia badanie replikacji i enkapsydacji, a następnie ponowne składanie komponentów niewirusowych in vitro w pozbawione genomu optyczne „duchy” wirusowe (viral ghosts), odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Prosta i niezawodna metoda in vivo oraz in vitro do badania składania wirusów

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Praca z zakaźnymi wirusami Ebola jest ograniczona do laboratoriów o 4 poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Tetrarazystroniczne cząstki wirusopodobne zawierające replikację i transkrypcję (trVLP) reprezentują system modelowania cyklu życia, który pozwala nam bezpiecznie modelować wiele cykli zakaźnych w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2, opierając się wyłącznie na składnikach wirusa Ebola.

Modelowanie cyklu życiowego wirusa Ebola w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 z cząstkami wirusopodobnymi zawierającymi minigenomy tetracistroniczne

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Przedstawiamy elastyczny protokół generowania wysokiej jakości metagenomów o rozmiarze wirusa (viromów) z próbek ludzkiego kału. Pierwotnie opracowany do wiromiki gleby, tutaj ten protokół został z powodzeniem zastosowany do próbek kału, umożliwiając solidną charakterystykę wirusosfery ludzkiego jelit.

Metagenomika frakcji wirusa DNA dla próbek ludzkiego kału

Poznaj metodę izolacji pojedynczych wirionów z mieszanych próbek przy użyciu cytometrii przepływowej i amplifikacji MDA. Technika ta umożliwia sekwencjonowanie genomów wirusów bez konieczności ich uprawy.

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Przeglądaj więcej filmów