Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów przy użyciu genomiki pojedynczego wirusa
May 26th, 2013
Genomika pojedynczego wirusa (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wironów. Zawiesiny wirusów w mieszanym zbiorowisku sortuje się za pomocą cytometrii przepływowej na szkiełko mikroskopowe z dyskretnymi studzienkami zawierającymi agarozę, wychwytując w ten sposób wirion i zmniejszając ścinanie genomu podczas dalszego przetwarzania. Amplifikację całego genomu uzyskuje się za pomocą amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA), w wyniku czego uzyskuje się materiał genomowy odpowiedni do sekwe
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie pojedynczych warianów z konsorcjów mieszanych i sekwencjonowanie uzyskanego materiału genomowego w celu identyfikacji wirusów z różnych środowisk bez konieczności hodowli. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie pojedynczych warianów za pomocą cytometrycznego sortowania przepływu na kulkach aro. Wychwyt pojedynczego jonu jest następnie weryfikowany za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Następnie materiał genomowy jest izolowany z jonów i amplifikowany za pomocą amplifikacji wielokrotnego przemieszczenia lub MDA w celu wygenerowania ilości DNA potrzebnej do sekwencjonowania. Wreszcie, wirusowe DNA jest sekwencjonowane przy użyciu technologii o wysokiej przepustowości w celu wygenerowania nadmiernego pokrycia genomu wirionu, co znacznie pomaga w składaniu genomu i adnotacji. Ostatecznie, techniki bioinformatyczne mające na celu wykorzystanie podejść do podpróbkowania sekwencji w celu zwiększenia wielkości kon pozwalają na analizę izolowanych vonów.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii wirusów, nadając kontekst genomiczny ogromnej puli anotowanych genów planktonu OC, a także umożliwić odkrycie nowych genomów z różnych ekosystemów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć problemy, ponieważ amplifikacja i izolacja pojedynczych jonów przesuwa granice obecnej technologii. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy ocenialiśmy zastosowanie MDA w społecznościach planktonu Vero i zdaliśmy sobie sprawę, że możliwe jest sortowanie pojedynczej cząsteczki i sekwencji wirusa, a tym samym złożenie pełnego genomu wirusa z tych złożonych społeczności Aby sortować wirusy za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w niestandardowe probówki fotopowielacza rozpraszania do przodu lub F-S-C-P-M-T zacznij od rozcieńczenia cząstek wirusa w filtrowanym tris 0,1 mikrona, EDTA dla mieszanego zbioru zawierającego cząstki T 4 i faga lambda ustaw F-S-C-P-M-T na 1000, a SSC na 200, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu.
Po uruchomieniu próbek kontrolnych uruchom około 100 mikrolitrów trwałej zawiesiny wirusa, co daje w sumie 5 000 zdarzeń. Następnie użyj wykresów cyber green i F-S-C-P-M-T, aby umieścić szczelną bramę w środku cząstek wirusa. Teraz dodaj pięć mikrolitrów 1% aros o niskiej temperaturze topnienia w buforze TBE schłodzonym do 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki na szkiełku mikroskopowym A-P-T-F-E, a następnie załaduj szkiełko do cytometru przepływowego, aby wychwycić posortowane cząsteczki wirusa.
Rozpocznij sortowanie, wychwytywanie 10 lub więcej cząstek wirusa w niektórych studzienkach, aby pomóc w wykrywaniu głębokości wirusów podczas konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Po zakończeniu sortowania wyjmij szkiełko z cytometru przepływowego i dodaj do każdej studzienki pięć dodatkowych mikrolitrów aros o niskiej temperaturze topnienia schłodzonego do 37 stopni Celsjusza. Osadzanie cząsteczek wirusa dla pojedynczego wariantu.
Ustaw konfokalny laserowy mikroskop skaningowy na 488 nanometrów. Wzbudzenie następnie zobrazuj osadzone cząstki za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej 63 razy, aby sprawdzić, czy obecna jest tylko jedna cząstka i czy wiele wirusów nie jest ułożonych jeden na drugim. Następnie, po zidentyfikowaniu studzienek z pojedynczymi wirusami, za pomocą żyletki usuń pożądane koraliki agros ze szkiełka i umieść je w sterylnej probówce do PCR.
Umieść probówkę w bloku grzewczym termocyklera ustawionego na 94 stopnie Celsjusza na trzy minuty, aby usunąć cząsteczkę wirusa na miejscu. Następnie, po wykonaniu zmodyfikowanego MDA, przenieś genomowe DNA do 1,7 mililitrowych probówek einor i dodaj jedną dziesiątą objętość trzymolowego octanu sodu w buforze TBE Aby oczyścić amplifikowany materiał genomowy, umieść próbki w temperaturze 55 stopni Celsjusza na 10 minut, aby rozpuścić aros, a następnie przesuń probówki do 42 stopni Celsjusza, aby obniżyć temperaturę przed dodaniem enzymu. Teraz dodaj dwie jednostki beta aase do każdej probówki i inkubuj probówki przez dwie godziny.
Następnie dodaj jedną objętość nasyconego buforem roztworu fenolu do każdej probówki. Wymieszaj energicznie i odwiruj probówki przez 15 minut w temperaturze 3 500 razy G.At temperaturze pokojowej, przenieś DNA zawierające SUPERNATANTY do nowej 1,7 mililitrowej probówki einor. Następnie dodaj jedną objętość 100% izopropanolu i jeden mikrolitr błękitu glikologicznego do probówek i odwróć probówki do wymieszania po ponownym odwirowaniu probówek.
Tym razem przez 60 minut w temperaturze 28 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Zdekantuj izopropanol, uważając, aby nie naruszyć granulatu i dodaj 150 mikrolitrów 70% etanolu do każdej tuby. Kręć rurki przez 10 minut 28 000 razy.
G w temperaturze pokojowej. Zdekantować etanol na powietrzu do sucha, osad DNA i ponownie zawiesić DNA w odpowiedniej objętości buforu tris EDTA. Ta trójwymiarowa rekonstrukcja cybernetycznie zielonej, jednej barwionej cząsteczki wirusa w prędkości agro pokazuje, w jaki sposób konfokalna mikroskopia laserowa może być wykorzystana do wizualizacji i potwierdzenia, że pojedynczy wirion jest uzyskiwany w każdym dołku po schwytaniu i osadzeniu w aros, wstawka pokazuje większe powiększenie izolowanej cząsteczki wirusa.
Tutaj pokazano wykres profilu względnej fluorescencji wybarwionej pojedynczej cząsteczki wirusa w koraliku aros. Ta ostatnia seria rycin pokazuje, w jaki sposób prawie cały genom Lambda, z wyjątkiem pierwszych pięciu par zasad, został odzyskany dla tego reprezentatywnego wirusa. Poniżej znajduje się wykres GC dla pojedynczego wirusa.
Zidentyfikowany genom jest pokazany. Ten rysunek przedstawia mapę genomu lambda. Na koniec pokazano mapowanie pojedynczego genomu wirusa dla reprezentatywnej izolowanej i amplifikowanej bakterii o fagu lambda.
Oś X pokazuje pozycję genomu. Oś Y pokazuje procentowe pokrycie. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby użyć sterylnej techniki i poświęcić trochę czasu, aby uniknąć zanieczyszczenia.
Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody w celu oceny taksonomii izolowanych warianów przed sekwencjonowaniem całego genomu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak izolować pojedyncze odmiany za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, mikroskopii konfokalnej i amplifikacji całego genomu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Single Virus Genomics (SVG) to metoda zaprojektowana w celu izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów z mieszanych zawiesin wirusowych. Technika ta wykorzystuje cytometrię przepływową do sortowania i wielokrotne amplifikację przemieszczenia (MDA) do amplifikacji całych genomów, ułatwiając następnie sekwencjonowanie.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Wirologia
- Genomika
- Mikrobiologia
Tło
- Izolowanie pojedynczych wirionów umożliwia badanie genomów wirusów bez konieczności hodowli.
- Cytometria przepływowa jest wykorzystywana do sortowania wirionów na kulkach agarozy.
- Mikroskopia konfokalna potwierdza pojedyncze wiriony.
- Wysoko przepustowe technologie sekwencjonowania są zastosowane do analizy genomowej.
Cel badania
- Izolować pojedyncze wiriony z mieszanych konsorcjów.
- Sekwencyjnie materiał genomowy dla identyfikacji wirusów.
- Zoptymalizować montaż i adnotacje genomu poprzez bioinformatykę.
Stosowane metody
- Sortowanie cytometryczne wirusowych zawiesin.
- Izolowanie materiału genomowego z uchwyconych wirionów.
- Wielokrotne amplifikacje przemieszczenia (MDA) do amplifikacji DNA.
- Wysoko przepustowe sekwencjonowanie dla kompleksowego zakresu genomowego.
Główne wyniki
- Sukces w izolacji pojedynczych wirionów z mieszanych próbek.
- Generowanie wystarczającej ilości DNA do sekwencjonowania poprzez MDA.
- Wysoko zakresowe sekwencjonowanie pomaga w montażu genomu.
- Zastosowanie technik bioinformatycznych do analizy danych.
Wnioski
- SVG jest skuteczny w badaniu genomów wirusowych w różnych środowiskach.
- Metoda zmniejsza ścinanie genomu podczas przetwarzania.
- Bioinformatyka poprawia analizę izolowanych wirionów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single Virus Genomics (SVG) enables cultivation-free genomic characterization of individual virions, addressing a critical gap in viral ecology and discovery pipelines. By isolating and amplifying single viral genomes from complex mixtures, SVG supports target de-risking and predictive confidence in early-stage antiviral and phage therapy research. This method enhances portfolio relevance by providing high-resolution genomic data from unculturable viruses, informing mechanistic studies and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral hypotheses by providing genomic context to individual virions from mixed environmental samples.
- Operational Value: Supports biological de-risking through cultivation-free isolation, reducing false negatives in target identification.
- Predictive Value: Generates high-coverage sequencing data that aids in genome assembly and annotation, improving confidence in viral target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, high-molecular-weight genomic DNA via MDA, enabling reliable downstream sequencing and comparative analysis.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through flow cytometry-based sorting and confocal validation, ensuring reproducible single-virion capture.
- Scalability: Allows processing of thousands of events via flow cytometry, supporting high-throughput screening of viral diversity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viral genome data to preclinical validation by enabling sequence-based taxonomy and functional inference.
- Biomarker Alignment: Supports identification of viral genomic signatures that may correlate with pathogenic potential or host interaction profiles.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in viral target selection through direct genomic evidence.
Pipeline & Workflow Integration
SVG fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and target validation prior to lead identification and preclinical evaluation. Its output—amplified, sequencable viral DNA—directly enables genomic screening and comparative analytics workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating single virons for genomic interrogation, clarifying viral diversity and functional potential in complex communities.
- Screening: Enables assay standardization through flow sorting and MDA amplification, providing reproducible inputs for sequencing-based screening platforms.
- Analytics: Generates quantitative genomic outputs (coverage, GC content, genome maps) that allow cross-condition comparison and variant calling.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing genome-resolved data that can inform biomarker development and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for viral genome characterization across diverse ecosystems, reducing reliance on cultivation-dependent methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in viral target validation by delivering cultivation-free, genome-resolved data from single particles.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through validated single-virion capture via flow cytometry and confocal microscopy.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of viral targets, reducing investment in non-viable or poorly characterized candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering high-confidence genomic data that informs advancement decisions in antiviral and phage-derived therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, confocal microscopy, and molecular biology for single-particle handling and amplification.
- Dependent on access to flow cytometers with custom scatter detection and high-throughput sequencing infrastructure.
- Necessitates standardized protocols for sample preparation, contamination control, and bioinformatic analysis across teams.
- Must account for variability in viral size, density, and staining efficiency when adapting to diverse viral systems or environmental samples.
- Practical limitations include amplification bias and stochastic sampling effects inherent to single-cell/single-virion MDA approaches.
