Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja pojedynczych wirionów z mieszanego konsorcjum oraz sekwencjonowanie uzyskanego materiału genomicznego w celu identyfikacji wirusów z różnych środowisk bez konieczności ich hodowli. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację pojedynczych wirionów przy użyciu sortowania cytometrycznego na kulezkach agarozowych. Przechwycenie pojedynczego wirionu jest następnie weryfikowane za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Następnie materiał genomiczny jest izolowany z wirionów i amplifikowany metodą wielokrotnej amplifikacji z przemieszczeniem (MDA), aby uzyskać ilość DNA niezbędną do sekwencjonowania. W końcowej fazie DNA wirusa jest sekwencjonowane przy użyciu technologii wysokoprzepustowych w celu uzyskania nadmiarowego pokrycia genomu wirionu, co znacząco wspomaga montaż i adnotację genomu. Ostatecznie techniki bioinformatyczne oparte na metodach próbkowania podzbiorów sekwencji w celu zwiększenia rozmiaru kontigów umożliwiają analizę wyizolowanych wirionów.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii wirusów, nadając kontekst genomowy ogromnej puli nieopisanych genów wirioplanktonu, a także umożliwić odkrywanie nowych genomów z różnorodnych ekosystemów. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ amplifikacja i izolacja pojedynczych wirionów przesuwa granice obecnych możliwości technologicznych. Pomysł na tę metodę pojawił się podczas oceny zastosowania MDA w badaniach społeczności wirioplanktonu, kiedy zauważyliśmy, że możliwe jest wyselekcjonowanie pojedynczej cząstki wirusa, a następnie jej sekwencjonowanie i zmontowanie pełnego genomu wirusa z tych złożonych zbiorowisk. Do sortowania wirusów należy użyć cytometru przepływowego wyposażonego w niestandardowe fotopowielacze rozproszenia przedniego (FSCPMT). Należy rozpocząć od rozcieńczenia cząstek wirusowych w buforze Tris-EDTA filtrowanym przez membranę o porach 0,1 µm. W przypadku mieszanego zespołu zawierającego cząstki faga T4 oraz faga lambda, należy ustawić FSCPMT na 1000, a SSC na 200, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu.

Po analizie próbek kontrolnych, przeprowadź pomiar około 100 µL zabarwionej zawiesiny wirusowej aż do uzyskania łącznie 5 000 zdarzeń. Następnie, korzystając z wykresów sybr green one oraz FSCPMT, wyznacz wąską bramkę w centrum populacji cząsteczek wirusowych. Do każdego okienka na szkiełku mikroskopowym z P-T-F-E dodaj pięć µL 1% agarozy niskotopliwej w buforze TBE schłodzonej do 37 °C, a następnie umieść szkiełko w cytometrze przepływowym w celu wychwycenia posortowanych cząsteczek wirusowych.

Rozpocząć sortowanie, przechwytując 10 lub więcej zdarzeń cząstek wirusowych w niektórych studzienkach, aby ułatwić wykrycie głębokości położenia wirusów podczas konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej. Po zakończeniu sortowania wyjąć preparat z cytometru przepływowego i dodać pięć kolejnych mikrolitrów agarozy o niskiej temperaturze topnienia, schłodzonej do 37 °C, do każdej studzienki zawierającej cząstki wirusowe. W przypadku pojedynczych wirionów ustawić konfokalny skaningowy mikroskop laserowy na wzbudzenie przy 488 nm. Następnie obrazować zatopione cząstki, używając obiektywu 63 x o długiej ogniskowej, aby zweryfikować, czy obecna jest tylko pojedyncza cząstka i czy wiele wirusów nie jest ułożonych jeden na drugim. Po zidentyfikowaniu studzienek z pojedynczymi wirusami, za pomocą żyletki usunąć wybrane kule agarozy z preparatu i umieścić je w sterylnej probówce do PCR.

Umieść probówkę w bloku grzewczym termocyklera ustawionym na 94 °C przez trzy minuty, aby przeprowadzić lizę cząstki wirusowej in-situ. Następnie po wykonaniu zmodyfikowanej procedury MDA przenieś genomowe DNA do probówek Eppendorf o pojemności 1,7 ml i dodaj 1/10 objętości 3 M octanu sodu w buforze TBE w celu oczyszczenia namnożonego materiału genomowego. Przechowuj próbki w temperaturze 55 °C przez 10 minut, aby rozpuścić agarozę, a następnie przenieś probówki do temperatury 42 °C w celu obniżenia temperatury przed dodaniem enzymu. Teraz dodaj dwie jednostki Beta-agarazy do każdej probówki i inkubuj probówki przez dwie godziny.

Następnie do każdej probówki dodaj jedną objętość buforowanego, nasyconego roztworu fenolu. Wymieszaj intensywnie i wiruj probówki przez 15 minut przy 3 500 ×g w temperaturze pokojowej. Przenieś nadlodzie zawierające DNA do nowej probówki Eppendorfa o pojemności 1,7 ml. Następnie do probówek dodaj jedną objętość 100% izopropanolu oraz jeden µL glyco-blue i odwróć probówki, aby wymieszać zawartość. Po ponownym wirowaniu probówek, tym razem przez 60 minut przy 28 000 ×g i 4 °C, odlej izopropanol, uważając, aby nie naruszyć osadu, i dodaj 150 µL 70% etanolu do każdej probówki. Wiruj probówki przez 10 minut przy 28 000 ×g w temperaturze pokojowej. Odlej etanol, wysusz osad DNA na powietrzu i resuspenduj DNA w odpowiedniej objętości buforu Tris-EDTA. Ta trójwymiarowa rekonstrukcja cząsteczki wirusa barwionej sybr green I wewnątrz kuleczki agarozy pokazuje, w jaki sposób konfokalna mikroskopia laserowa może być wykorzystana do wizualizacji i potwierdzenia, że w każdej studzience uzyskano pojedynczy wirion po jego przechwyceniu i zatopieniu w agarozie; wstawka przedstawia większe powiększenie wyizolowanej cząsteczki wirusa.

Tutaj przedstawiono wykres profilu względnej fluorescencji barwionej pojedynczej cząsteczki wirusa wewnątrz kuleczki agarozowej. Ta końcowa seria rycin pokazuje, że dla tego reprezentatywnego wirusa odzyskano niemal cały genom Lambda, z wyjątkiem pierwszych pięciu par zasad. Tutaj przedstawiono wykres GC dla zidentyfikowanego genomu pojedynczego wirusa. Ta rycina przedstawia mapę genomu lambda. Na koniec pokazano mapowanie genomu pojedynczego wirusa dla reprezentatywnego, wyizolowanego i namnożonego bakteriofaga lambda. Oś X przedstawia pozycję w genomie. Oś Y przedstawia procent pokrycia.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie technik sterylnych oraz poświęcenie czasu na zapewnienie uniknięcia kontaminacji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody w celu oceny taksonomii wyizolowanych wirionów przed sekwencjonowaniem całego genomu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować pojedyncze wiriony przy użyciu fluorescencyjnego sortowania komórek, mikroskopii konfokalnej oraz amplifikacji całego genomu.