Name: Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego aktywności NADPH oksydazy w trzech modelach zapalnych myszy. Technika umożliwia monitorowanie ROS in vivo w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez NIH RO1 AI079253 oraz Departament Spraw Weteranów.

1. Modele zwierzęce
<ol>
 <li>Myszy: Należy wykorzystać myszy p47phox-/- oraz myszy C57BL6/DBA dopasowane pod względem wieku i płci. Należy uzyskać zgodę na przeprowadzenie eksperymentów z Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee).</li>
 <li>Znieczulenie: Do indukcji znieczulenia należy zastosować system ciągłego podawania izofluranu. System waporyzacji (VetEquip) wypełnia się izofluranem (2-3%). Należy potwierdzić pełne znieczulenie myszy, obserwując oddech, ruchy oraz odruch rogówkowy w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne.</li>
 <li>Procedury chirurgiczne: Obszar chirurgiczny (blat) należy przemyć 70% etanolem. Należy założyć sterylne rękawiczki, czysty fartuch chirurgiczny i maskę. Myszy należy przygotować poprzez przycięcie sierści i naprzemienne nakładanie betadyny oraz 70% etanolu w miejscu, w którym zostanie wykonane cięcie. Operację należy przeprowadzić na sterylnej powierzchni, używając sterylnych instrumentów. Po operacji należy monitorować myszy do momentu odzyskania przytomności i swobodnego poruszania się.</li>
 <li>Dotchawicze podanie zymosanu
 <ol>
 <li>Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z opisem w punkcie 1.2.</li>
 <li>Obszar chirurgiczny (szyja) należy zdezynfekować betadyną i 70% etanolem, a następnie odsłonić tchawicę poprzez dyssekcję chirurgiczną.</li>
 <li>Tchawicę należy przebić igłą 27G i wstrzyknąć zymosan (St. Louis, MO) w dawce 1 μg/g, stosując roztwór o stężeniu 0,5 μg/μl (objętość całkowita 50 μl dla myszy o masie 25 g) rozpuszczony w sterylnym PBS.</li>
 <li>Ranę na szyi myszy należy zamknąć sterylnymi szwami jedwabnymi 5-0 w warunkach aseptycznych.</li>
 <li>Obrazowanie należy wykonać po 4 hr i 24 hr.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Ligacja i punkcja kątnicy
 <ol>
 <li>Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z opisem w punkcie 1.2.</li>
 <li>W obszarze chirurgicznym (brzuch) należy przyciąć sierść i zdezynfekować skórę betadyną oraz 70% etanolem.</li>
 <li>Należy wykonać laparotomię pośrodkową i zlokalizować kątnicę.</li>
 <li>Dystalną część odsłoniętej kątnicy (50%) należy podwiązać szwem jedwabnym 4-0, a następnie wykonać punkcję kątnicy dystalnie względem ligacji za pomocą jednego przejścia igły 21G.</li>
 <li>Cięcie należy zamknąć sterylnymi szwami jedwabnymi 4-0.</li>
 <li>Obrazowanie należy wykonać po 4 hr i 24 hr.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Doustne podanie tetrachlorek węgla (CCl4)
 <ol>
 <li>Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z opisem w punkcie 1.2.</li>
 <li>CCl4 (2 μg/g, St. Louis, MO) rozpuszczony w oleju kukurydzianym należy podać poprzez zgłębnik doustny. Procedura podawania CCl4 powinna być przeprowadzona w wyznaczonym obszarze, zgodnie z wytycznymi IBC/EHS.</li>
 <li>Obrazowanie należy wykonać po 4 hr i 24 hr.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Pozyskiwanie obrazu bioluminescencyjnego
<ol>
 <li>Uruchomić system obrazowania IVIS 200 (Xenogen Corporation, Alameda, CA), ustawiając go w trybie luminescencji, i odczekać do ustabilizowania się temperatury matrycy CCD (charge-coupled device).</li>
 <li>Wybrać ustawienia czasu ekspozycji, binningu (medium) oraz przysłony F/Stop (8).</li>
 <li>Umieścić myszy w pozycji grzbietnej w komorze obrazowania na podgrzewanym stole, aby utrzymać normalną temperaturę ciała. Podać znieczulenie zgodnie z opisem w punkcie 1.2 za pomocą maski nosowej, gdy myszy znajdują się w komorze obrazowania IVIS.</li>
 <li>W każdym punkcie czasowym wybranym do obrazowania podać dożylnie drogą zaoczno-orbitarną L-012 (20 μg/g) rozpuszczony w sterylnym PBS (10 μg/μl).</li>
 <li>Przystąpić do rejestracji obrazów od 2 min po wstrzyknięciu L-012. Zazwyczaj stosujemy czas ekspozycji wynoszący 40 sec.</li>
</ol>
3. Analiza danych z wykorzystaniem obszaru zainteresowania (ROI)
<ol>
 <li>Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania Living Image v.4.2 (Xenogen Corporation, Alameda, CA).</li>
 <li>Otwórz obraz i wybierz narzędzia pomiaru obszaru zainteresowania (Region of Interest).</li>
 <li>Wybierz kształt i rozmiar obszaru zainteresowania w obrębie klatki piersiowej i/lub brzucha, po nałożeniu pseudokolorowego obrazu cyfrowego (reprezentującego detekcję fotonów) na zdjęcie fotograficzne myszy.</li>
 <li>Ilościowo określ intensywność sygnału (strumień fotonów) z obszaru zainteresowania.</li>
</ol>
4. Statystyka
<ol>
 <li>Użyj pakietu oprogramowania do analizy statystycznej w celu przeprowadzenia dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Bonferroniego dla poszczególnych punktów czasowych.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Zymosan jest prozapalnym produktem ścian komórkowych drożdży i silnym aktywatorem NADPH oksydazy 3. Wcześniej wykazaliśmy, że intratrachealne podanie zymosanu indukuje silniejszy neutrofilny stan zapalny płuc oraz produkcję cytokin prozapalnych u myszy p47phox-/- w porównaniu do myszy typu dzikiego 1. W niniejszym badaniu naszym celem było porównanie generowania ROS w płucach myszy typu dzikiego oraz myszy p47phox-/- po podaniu zymosanu. 4 h po intratrachealnej administracji zymosanu zaobserwowaliśmy istotny wzrost emisji fotonów w obrębie klatki piersiowej u myszy typu dzikiego w porównaniu do poziomu bazowego, a także wzrost emisji fotonów u myszy typu dzikiego w porównaniu do myszy p47phox-/- po 4 h i 24 h. W przeciwieństwie do tego, sygnały bioluminescencji u myszy p47phox-/- pozostały na poziomach bazowych 4 h po podaniu zymosanu (Rys.1 A-B). Zatem NADPH oksydaza wydaje się być głównym źródłem generowania ROS w płucach po podaniu zymosanu.
Następnie oceniono produkcję ROS w modelu sepsy indukowanej przez CLP. Sepsis jest zagrażającym życiu zespołem związanym z uszkodzeniem narządów końcowych, w tym z ostrym uszkodzeniem płuc (ALI) i zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) 4, 5. Uważa się, że uszkodzenia zapśredniczone przez ROS są istotnym czynnikiem napędzającym wielonarządową niewydolność wywołaną sepsą. Stwierdzono, że w myszach typu dzikiego po CLP poziom ROS był znacząco podwyższony w obrębie klatki piersiowej (4 hr) oraz brzucha (24 hr) w porównaniu z wartością bazową. Natomiast poziomy ROS u myszy p47phox-/- były zbliżone do poziomów bazowych w obu punktach czasowych (Rys. 2 A-C). Wyniki te pokazują, że generowanie ROS w mysim modelu sepsy indukowanej przez CLP jest zależne od oksydazy NADPH.
Na koniec zastosowano obrazowanie bioluminescencyjne do wykrycia produkcji ROS w modelu uszkodzenia wątroby indukowanego CCl4. CCl4 wywołuje martwicę hepatocytów i jest stosowany do modelowania zarówno ostrego uszkodzenia wątroby, jak i włóknienia wątroby 6. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych modeli stanu zapalnego i uszkodzenia, stwierdzono, że produkcja ROS w jamie brzusznej u myszy p47phox-/- była umiarkowanie (około 35%) zwiększona względem wartości bazowej w 4 h po podaniu CCl4. Jednakże skala generowania ROS indukowanego przez CCl4 była znacznie większa u myszy typu dzikiego niż u myszy p47phox-/- (Rys. 3 A-B). Dane te sugerują, że w ostrym uszkodzeniu wątroby indukowanym przez CCl4 zachodzi generowanie ROS zarówno zależne od NADPH oksydazy zawierającej p47phox , jak i niezależne od niej.
<img alt="Obrazowanie bioluminescencyjne, liczba fotonów, odpowiedź na zymosan, analiza WT vs p47phox-/-." src="/files/ftp_upload/3925/3925fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Produkcja ROS w płucach po podaniu zymosanu. A) Reprezentatywne obrazowanie bioluminescencyjne produkcji ROS. Zauważmy, że oprócz klatki piersiowej, luminescencję można wykryć nad brzuchem u myszy typu dzikiego oraz p47phox-/-, a luminescencja brzuszna nie ulega zmianie po podaniu zymosanu. B) Liczba fotonów z klatki piersiowej myszy typu dzikiego i p47phox-/- po pojedynczej intratrachealnej (IT) iniekcji zymosanu. Obrazowanie bioluminescencyjne wykonano w punkcie wyjściowym, po 4 h i po 24 h. Emisję światła z obszaru zainteresowania nad klatką piersiową określono przy użyciu wskazanej skali pseudo-kolorów. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SE, n=6-9 na grupę, *=p&lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby powiększyć rycinę</a>.
<img alt="Schemat obrazowania bioluminescencyjnego z wykresami liczby fotonów, analiza typu dzikiego i p47phox-/-." src="/files/ftp_upload/3925/3925fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Wykrywanie ROS po CLP. A) Reprezentatywne obrazowanie bioluminescencyjne produkcji ROS, B) liczba fotonów z klatki piersiowej oraz C) liczba fotonów z jamy brzusznej myszy typu dzikiego i p47phox-/- w stanie wyjściowym, 4 h i 24 h po CLP. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SE; n=4-5 na grupę, *=p&lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby powiększyć rycinę</a>.
<img alt="Obrazowanie luminescencyjne, wykres słupkowy liczby fotonów; analiza uszkodzenia wątroby, przedziały czasowe, modele mysie." src="/files/ftp_upload/3925/3925fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
 Rysunek 3. Produkcja ROS w jamie brzusznej po uszkodzeniu wątroby indukowanym CCl4. A) Reprezentatywne obrazowanie bioluminescencyjne produkcji ROS oraz B) liczba fotonów w jamie brzusznej myszy typu dzikiego i myszy p47phox-/- w stanie wyjściowym, 4 h i 24 h po doustnym podaniu CCl4. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SE; n=4-5 na grupę, *=p&lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3925/3925fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby powiększyć rysunek</a>.

<ol><li>Segal, B., Han, W., Bushey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+limits+innate+immune+response+in+the+lungs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice.</a> PLoS ONE. 5, e9631(2010).</li>
<li>Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p47phox+mouse+knock-out+model+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease.</a> J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).</li>
<li>Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+induction+of+inflammatory+responses+by+dectin-1+and+Toll-like+receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2.</a> J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).</li>
<li>Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%3A+the+gold+standard+model+for+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis.</a> Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).</li>
<li>Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septic+shock%3B+current+pathogenetic+concepts+from+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Monit%22%5BJournal%5D)">Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective.</a> Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).</li>
<li>Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+carbon+tetrachloride+induced+liver+fibrosis%3A+Histopathological+changes+and+expression+of+CD133+and+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor.</a> BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).</li>
<li>Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+complement-induced+lung+injury+in+mice+with+deficiency+of+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase.</a> J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).</li>
<li>Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthine+oxidase+contributes+to+host+defense+against+Burkholderia+cepacia+in+the+p47%28phox-%2F-%29+mouse+model+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease.</a> Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical-free+biology+of+oxidative+stress.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).</li>
<li>Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Cecal ligation and puncture.</a> Shock. 24, 52-57 Forthcoming.</li>
<li>Wardman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+and+luminescent+probes+for+measurement+of+oxidative+and+nitrosative+species+in+cells+and+tissues%3A+progress%2C+pitfalls%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).</li>
<li>Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+X-linked+chronic+granulomatous+disease%2C+an+inherited+defect+in+phagocyte+superoxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production.</a> Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).</li>
<li>Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).</li>
<li>Daiber, A., Oelze, M., August, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+superoxide+and+peroxynitrite+in+model+systems+and+mitochondria+by+the+luminol+analogue+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012.</a> Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).</li>
<li>Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Pomiar reaktywnych form tlenu (ROS) w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt można przeprowadzić z wykorzystaniem sond fluorescencyjnych i chemiluminescencyjnych. Podczas gdy sondy fluorescencyjne charakteryzują się słabym stosunkiem sygnału do szumu 12, opisana technika obrazowania wykazuje większą czułość w detekcji emisji światła następującej po reakcji chemicznej ROS z substratem L-012 opartym na luminolu. Podobnie jak wszystkie techniki obrazowania bioluminescencyjnego, metodologia ta jest ograniczona prze...

<table><tbody><tr><td>L-012</td><td>Wako Chemicals USA, Inc.</td><td>120-04891</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>tetrachlorek węgla</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>289116</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy nadph w różnych modelach zwierzęcych

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

Oksydaza NADPH jest kluczowym enzymem pośredniczącym w przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybiczej obronie organizmu. Oprócz roli w przeciwdrobnoustrojowej obronie gospodarza, oksydaza NADPH pełni istotne funkcje sygnalizacyjne modulujące odpowiedź zapalną 1. W związku z tym opracowanie metody pomiaru kinetyki generowania ROS pochodzących z oksydazy NADPH w czasie rzeczywistym powinno stanowić wartościowe narzędzie badawcze do zrozumienia mechanizmów istotnych dla obrony organizmu, stanu zapalnego oraz uszkodzeń tkanek.
Przewlekła ziarniniakoza (CGD) jest dziedziczną chorobą oksydazy NADPH, charakteryzującą się ciężkimi infekcjami i nadmiernym stanem zapalnym. Aktywacja oksydazy NADPH w fagocytach wymaga translokacji jej subunit cytozolowych (p47phox, p67phox oraz p40phox) i Rac do związanego z błoną flawocytochromu (składającego się z heterodimeru gp91phox i p22phox). Mutacje powodujące utratę funkcji w dowolnym z tych komponentów oksydazy NADPH prowadzą do rozwoju CGD. Podobnie jak u pacjentów z CGD, myszy z niedoborem gp91phox oraz myszy z niedoborem p47phox wykazują defektywną aktywność oksydazy NADPH w fagocytach i upośledzoną odporność organizmu 2, 13. Poza fagocytami, które zawierają opisane wyżej komponenty oksydazy NADPH, różne inne typy komórek wykazują ekspresję różnych izoform oksydazy NADPH.
W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę ilościowego oznaczania produkcji ROS u żywych myszy oraz określania udziałuy NADPH oksydazy w generowaniu ROS w modelach stanu zapalnego i uszkodzeń. Metoda ta opiera się na reakcji ROS z L-012 (analogiem luminolu), w wyniku której emitowana jest luminescencja rejestrowana przez urządzenie o ładunku sprzężonym (CCD). W pierwotnym opisie sondy L-012 wykazano, że chemiluminescencja zależna od L-012 była całkowicie zniesiona przez dysmutazę ponadtlenkową, co wskazuje, że głównym wykrywanym w tej reakcji ROS był anion ponadtlenkowy 14. Późniejsze badania wykazały, że L-012 może wykrywać inne wolne rodniki, w tym reaktywne formy azotu 15, 16. Kielland et al. 16 wykazali, że miejscowe zastosowanie myristonianu forbolu, silnego aktywatora NADPH oksydazy, prowadzi do zależnej od NADPH oksydazy generacji ROS, którą można było wykryć u myszy przy użyciu luminescencyjnej sondy L-012. W tym modelu wykazali oni, że luminescencja zależna od L-012 była zniesiona u myszy z niedoborem p47phox.
Porównaliśmy generowanie ROS u myszy typu dzikiego oraz u myszy z niedoboremy oksydazy NADPH p47phox-/- 2 w następujących trzech modelach: 1) podaniu intratrachealnym zymosanu, pro zapalnego produktu pochodzącego ze ścian komórkowych grzybów, który może aktywować oksydazę NADPH; 2) podwiązaniu i perforacji kątnicy (CLP), modelu sepsy wewnątrzbrzusznej z wtórnym ostrym zapaleniem i uszkodzeniem płuc; oraz 3) podaniu doustnym tetrachlorku węgla (CCl4), modelu uszkodzenia wątroby zależnego od ROS. Modele te zostały wybrane specjalnie w celu oceny generowania ROS zależnego od oksydazy NADPH odpowiednio w kontekście stanu zapalnego o charakterze nieinfekcyjnym, sepsy polimikrobowej oraz uszkodzenia narządów indukowanego toksynami. Porównanie bioluminescencji u myszy typu dzikiego z myszami p47phox-/- pozwala nam określić specyfny wkład ROS generowanych przez oksydazę NADPH zawierającą p47phox w sygnał bioluminescencyjny w tych modelach.
Wyniki obrazowania bioluminescencyjnego, które wykazały zwiększone poziomy ROS u myszy typu dzikiego w porównaniu z myszami p47phox-/-, wskazały, że oksydaza NADPH jest głównym źródłem generowania ROS w odpowiedzi na bodźce zapalne. Metoda ta zapewnia małoinwazyjne podejście do monitorowania generowania ROS w czasie rzeczywistym podczas stanu zapalnego in vivo.

Oksydaza NADPH jest głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w fagocytach. Ze względu na efemeryczną naturę ROS, pomiar i monitorowanie poziomu ROS u żywych zwierząt jest trudne. Opisano mało inwazyjną metodę seryjnego oznaczania ilościowego ROS u żywych myszy.

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

Oksydaza NADPH jest kluczowym enzymem pośredniczącym w przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybiczej odpowiedzi obronnej gospodarza. Oprócz roli w przeciwmikrobowej obronie gospodarza, NADPH...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapewnienie małoinwazyjnego podejścia do monitorowania w czasie rzeczywistym generowania reaktywnych form tlenu (ROS) pochodzących z oksydazy N-A-D-P-H w trzech różnych zapalnych modelach mysich. Pierwszy model polega na podaniu dokanałowym Xan, w którym prozapalna cząsteczka Xan jest wstrzykiwana do tchawicy znieczulonych myszy. Xan jest produktem pochodzącym ze ścian komórkowych grzybów, który może aktywować oksydazę N-A-D-P-H.Drugim modelem jest ligacja i punkcja kątnicy, czyli CLP. W tym przypadku otwiera się jamę brzuszną myszy, a kątnicę podwiązuje się jedwabną nicią, po czym nakłuwa się ją igłą w celu wywołania sepsy wewnątrzbrzusznej oraz wtórnego ostrego stanu zapalnego i uszkodzenia płuc. Trzecim modelem jest podanie tetrachlorku węgla poprzez zgłębnik doustny.Tetrachlorek węgla wywołuje martwicę hepatocytów i może być stosowany do modelowania zarówno ostrego uszkodzenia wątroby, jak i włóknienia wątroby. Obrazowanie bioluminescencyjne jest przeprowadzane na myszach modelowych w celu oceny produkcji ROS. Wynikowe dane wskazują, że oksydaza N-A-D-P-H jest głównym źródłem generowania ROS w odpowiedzi na bodźce zapalne.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, na przykład sondą Florence, jest to, że metoda ta zapewnia małoinwazyjne podejście do monitorowania w czasie rzeczywistym generowania RS podczas stanu zapalnego in vivo. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące stanu zapalnego i urazów w przebiegu odpowiedzi obronnej, takie jak rola RS w zapaleniu i uszkodzeniu płuc. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy zaczęliśmy badać rolę reaktywnych form tlenu w odpowiedzi obronnej gospodarza, co przedstawiono na trzech modelach zwierzęcych generowania ROS pokazanych w tym filmie.Użyj myszy P 47 Fox null oraz myszy C 57 BL six DBA o tym samym wieku i płci. Uzyskaj zgodę na eksperymenty z instytucjonalnej komisji ds. opieki i użytkowania zwierząt w ramach przygotowań do intratrachealnej administracji xin. Zsterylizuj platformę chirurgiczną 70% ethanol i przykryj ją sterylną podkładką.Procedurę chirurgiczną należy przeprowadzić w czystym fartuchu operacyjnym, rękawiczkach i maseczce, używając sterylnych narzędzi do znieczulenia. Napełnić parowar systemu do ciągłego podawania izofluranu roztworem izofluranu o stężeniu od 2 do 3% i włączyć urządzenie. Następnie, po dwóch do trzech minutach, umieścić myszy w komorze anestezjologicznej i potwierdzić pełne znieczulenie zwierząt, wykonując ucisk palca u nogi oraz obserwując oddech i ruchy.Częstość oddechów powinna zmniejszyć się o około 50%. Następnie, używając strzyżarki, należy ogolić miejsce nacięcia na przedniej części szyi myszy. Umieść mysz na platformie operacyjnej w pozycji grzbietowej i załóż stożek nosowy w celu utrzymania znieczulenia. Trzykrotnie na zmianę aplikuj Betadynę oraz 70% ethanol na szyję.Następnie, używając prostych ostrych nożyczek, wykonaj nacięcie skóry w okolicy przedniej części szyi na około 0.5 centymetrów. Następnie, za pomocą zakrzywionej pęsety, rozchyl mięśnie wokół tchawicy, aby odsłonić ją w celu podania Xan drogą wewnątrztchawiczą. Użyj strzykawki z igłą o rozmiarze 27 G, aby nakłuć tchawicę w części środkowej, pomiędzy pierścieniami chrzęstnymi.Następnie skieruj igłę do przodu i powoli wstrzyknij 1 µg na gram masy ciała Xan. Po zabiegu zamknij nacięcie pięcioma sterylnymi szwami z nylonu. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej wyłożonej płaskim papierem, a połowę klatki regeneracyjnej ustaw na podkładce grzewczej.Monitoruj myszy, aż się obudzą i zaczną swobodnie się poruszać. Aby przeprowadzić drugą ligację i nakłucie, ogol brzuch znieczulonej myszy trymerem i umieść zwierzę na platformie chirurgicznej w pozycji grzbietnej. Następnie zdezynfekuj pole operacyjne Betadyną oraz 70% ethanol.Podobnie jak poprzednio, przy użyciu skalpela wykonaj nacięcie skóry o długości 1,5 centymetra w linii środkowej brzucha, a następnie użyj nożyczek. Przetnij otrzewną i otwórz jamę brzuszną za pomocą rozwieraka; zlokalizuj i odsłoń kątnicę, która znajduje się po lewej stronie jamy brzusznej. Używając pęsety nieurazowej, dokonaj eksterioryzacji.Następnie należy podwiązać dystalną 50% część odsłoniętego kątnicy za pomocą czterech szwów jedwabnych. Używając igły 21G, należy nakłuć kątnicę dystalnie w stosunku do miejsca podwiązania. Wprowadzić kątnicę z powrotem do jamy brzusznej.Do zamknięcia ściany brzucha należy użyć czterech sterylnych szwów nylonowych. Następnie nacięcie zamyka się za pomocą pięciu sterylnych szwów nylonowych. Podskórnie podaje się 0,5 milliliters soli fizjologicznej z 2,5 micrograms buprenorfiny, a następnie przeprowadza obserwację pooperacyjną zgodnie z wcześniejszą procedurą.Podanie tetrachlorku węgla drogą doustną stanowi model uszkodzenia wątroby zależnego od reaktywnych form tlenu. Aby podać tetrachlorek węgla za pomocą zgłębnika, należy utrzymać znieczuloną mysz w chwycie za kark, trzymając głowę w osi pionowej względem przełyku. Następnie należy wprowadzić końcówkę igły do karmienia i podawania leków o rozmiarze 22G zawierającej tetrachlorek węgla za siekacze, kierując ją w stronę tylnej części gardła i w dół przełyku, a następnie nacisnąć tłok, aby podać tetrachlorek węgla. Należy monitorować zwierzę do czasu wybudzenia. Obrazy bioluminescencyjne powinny zostać pozyskane przed indukcją produkcji ROS oraz odpowiednio 4 i 20 godzin po jej wywołaniu.Aby to zrobić, należy uruchomić oprogramowanie Live Image 4.2. Następnie należy zainicjować system obrazowania IVIS 200. Kliknij Initialize i ustaw system w tryb luminescencji.Należy odczekać, aż temperatura urządzenia sprzężonego ładunkowo zostanie ustabilizowana, co zostanie zasygnalizowane na ekranie w oprogramowaniu. Ustawić czas ekspozycji na 40 seconds. Następnie ustawić binning na medium oraz przysłonę na one eighth.Umieść znieczuczoną mysz w komorze obrazowania z platformą o kontrolowanej temperaturze, ustawiając ją w pozycji grzbietowej. Na dwie minuty przed każdym wykonaniem obrazu załóż stożek nosowy w celu podania znieczulenia, tak jak wcześniej. Użyj strzykawki o pojemności 1 mL z igłą 27G, aby podać dożylnie 50 µL pochodnej luminalnej L 0 1 2.Wykonaj iniekcję zaoczodołową. Na koniec wykonaj obrazowanie i przeanalizuj uzyskane obrazy zgodnie z opisem. W następnej części filmu przeanalizuj zgromadzone dane przy użyciu oprogramowania Living Image w wersji 4.2.Otwórz obraz i kliknij ROI tools w palecie narzędzi. Następnie w menu ROI tools wybierz ROI shape i kliknij koło na liście rozwijanej. Wybierz liczbę obszarów ROI, które zostaną dodane do obrazu.Dostosuj położenie ROI nad klatką piersiową i/lub brzuchem w menu narzędzi ROI, aby określić natężenie sygnału lub strumień fotonów z obszaru zainteresowania. Kliknij przycisk pomiaru, aby otworzyć tabelę pomiarów ROI, która wyświetla dane dla wszystkich ROI utworzonych na obrazach. Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeprowadzić dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Bonferroniego w poszczególnych punktach czasowych w celu porównania generowania ROS w płucach osobników typu dzikiego oraz osobników z niedoborem NADPH oksydazy.Myszy P 47 z nokautem genu Fox po wyzwaniu Xan. Xan podawano zgodnie z opisem w tym filmie w punkcie wyjściowym, po 4 oraz 24 godzinach. Wykonano obrazowanie myszy zgodnie z przedstawioną tutaj procedurą.Odnotowano istotny wzrost emisji fotonów nad klatką piersiową u myszy typu dzikiego, ale nie u myszy P 47. Fox sno po czterech i 24 godzinach w porównaniu z wartością wyjściową. Sugeruje to, że oksydaza N-A-D-P-H jest głównym źródłem generowania ROS w płucach po podaniu XUS Sand.Następnie oceniono produkcję ROS w modelu sepsy indukowanej CLP. Sepsa jest zagrażającym życiu zespołem powiązanym z uszkodzeniem narządów końcowych, w tym z ostrym uszkodzeniem płuc i zespołem ostrej niewydolności oddechowej. Uszkodzenia pośredniczone przez ROS są uważane za istotny czynnik napędzający wielonarządową niewydolność indukowaną sepsą.Jak pokazano na tym wykresie, w myszach typu dzikiego poziom ROS był istotnie zwiększony w obszarze klatki piersiowej cztery godziny po CLP oraz w obszarze brzucha 24 godziny po CLP. Jednakże poziomy ROS u myszy z nokautem genu P 47 Fox były zbliżone do poziomów bazowych w obu punktach czasowych. Wyniki te wskazują, że generowanie ROS w mysim modelu sepsy indukowanej CLP jest zależne odyksydazy N-A-D-P-H.Na koniec wykorzystano obrazowanie bioluminescencyjne do wykrycia produkcji ROS w modelu uszkodzenia wątroby wywołanego tetrachlorkiem węgla. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych modeli zapalenia i uszkodzenia, produkcja ROS w jamie brzusznej u myszy P 47 Fox null była umiarkowanie zwiększona o około 35% względem poziomu podstawowego cztery godziny po podaniu tetrachlorku węgla. Jednakże skala generowania ROS wywołanego tetrachlorkiem węgla była znacząco większa u myszy typu dzikiego niż u myszy P 47 Fox null.Dane te sugerują, że w ostrym uszkodzeniu wątroby indukowanym chlorkiem karbonu zachodzi generowanie ROS zarówno w sposób zależny od oksydazy NADPH zawierającej P47phox, jak i niezależny od niej. Wyniki obrazowania bioluminescencyjnego, które wykazały zwiększony poziom ROS u myszy typu dzikiego w porównaniu do myszy z nokautem P47phox, wskazały, że oksydaza NADPH jest głównym źródłem generowania ROS w odpowiedzi na bodziec zapalny.Metoda ta zapewnia małoinwazyjne podejście do monitorowania w czasie rzeczywistym generowania RS podczas stanu zapalnego in vivo.

bioluminescence-imaging-nadph-oxidase-activity-different-animal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Bioluminescencyjne obrazowanie aktywności NADPH oksydazy w różnych modelach zwierzęcych

Gua Sha, tradycyjne chińskie terapeutyczne skrobanie skóry, powoduje podskórne wynaczynienie krwi z mikrokrążenia. Przedstawiamy protokół obrazowania bioluminescencyjnego transgenicznych myszy HO-1-luciferase, aby wykazać, że Gua Sha zwiększa ekspresję hemooksygenazy-1 (HO-1) w wielu narządach.

Obrazowanie bioluminescencyjne nadekspresji hejmoooksygenazy-1 podczas procedury Gua Sha

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i...

Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Źródło: Valentine, M. E. i in., Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa oraz testowanie tłumienia zjadliwości w prostym modelu infekcji myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje zastosowanie podejścia obrazowania opartego na bioluminescencji do monitorowania zakażenia bakteryjnego w modelu żywej myszy. Sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne i rentgenowskie umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym oraz anatomiczną lokalizację infekcji rozprzestrzeniającej...

Obrazowanie w czasie rzeczywistym infekcji bakteryjnej w modelu myszy z użyciem bioluminescencji

Źródło: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia metodę obrazowania bioluminescencyjnego in vivo genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych wstrzykniętych do mózgu myszy. Proces obejmuje wstrzyknięcie lucyferyny, przygotowanie obrazowania i wykrywanie sygnałów bioluminescencyjnych z przeszczepionych komórek w miejscu...

Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego aktywności NADPH oksydazy w trzech modelach zapalnych myszy. Technika umożliwia monitorowanie ROS in vivo w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

Przeglądaj więcej filmów