Wytrącanie powinowactwa aktywnych czynników GEF białka Rho z wykorzystaniem białka Rho z mutacją z tagiem GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie aktywacji RO specyficznych czynników wymiany G-D-P-G-T-P lub gafów w hodowlach komórkowych poprzez wykorzystanie mutantu białka fuzyjnego RO A GST, który wykazuje wysokie powinowactwo do aktywowanych gs. Osiąga się to najpierw poprzez produkcję mutantu białka row z tagiem GST w bakteriach. Następnie przeprowadza się oczyszczanie białka GST row A sprzężonego z kuleczkami.

Następnie, za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, ocenia się czystość i stężenie białka GST RO A. Na koniec przygotowuje się lizat komórkowy i przeprowadza analizę precypitacji GEF z użyciem białka GST RO A. W rezultacie, dzięki analizie western blot precypitowanych białek z zastosowaniem swoistego przeciwciała anty-GF oraz kwantyfikacji metodą densytometrii, można uzyskać wyniki wykazujące zwiększoną precypitację aktywowanego GS w komórkach poddanych działaniu preparatu.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na szereg interesujących pytań w dziedzinie surowego GTPS, takich jak sposób regulacji wielu czynników wymiany G-D-P-G-T-P w sposób specyficzny dla sygnału oraz sposób koordynacji ich aktywności. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać początkowe trudności, ponieważ białko GST RO G 17 A jest stosunkowo niestabilne i może ulegać degradacji podczas przygotowania. Ważne jest również, aby przeprowadzić test precypitacji GF szybko i konsekwentnie. Procedurę tę zaprezentuje Pfizer Vahid, student studiów magisterskich z mojego laboratorium, w celu transformacji e coli.

Szybko dodaj 1 µL DNA PX row A G 17 A o stężeniu od 25 do 50 ng/µL do 1/4 objętości kompetentnych komórek DH5α w kąpieli lodowej. Delikatnie potrząśnij probówką, aby wymieszać zawartość, i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Przeprowadź szok termiczny komórek w temperaturze 42 °C przez 45 sekund, a następnie ponownie umieść je na lodzie na dwie minuty.

Dodaj 900 µL medium SOC i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Za pomocą zgiętej sterylnej pipety Pasteura roznieś od 50 do 100 µL przekształconych bakterii na wcześniej przygotowaną płytkę z agarem LB i persyną. Inkubuj płytkę w pozycji prawidłowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez pięć minut, a następnie odwróć ją i inkubuj przez noc.

Wybierz dobrze odizolowaną kolonię transformowanych bakterii i użyj jej do zaszczepienia 50 mililitrów LB z ampicyliną. Hoduj przez noc w temperaturze 37 °C przy mieszaniu. Po osiągnięciu przez kulturę pełnej gęstości rozcieńcz ją 450 mililitrami LB z ampicyliną i hoduj przez kolejne 30 minut. W temperaturze 37 °C indukuj produkcję białka row w bakteriach, dodając 500 mikrolitrów 100 milimolarnym IPTG do 500 mililitrów kultury.

Obniż temperaturę do 22–24 °C i inkubuj przez około 16 godzin. Wirowanie hodowli należy przeprowadzić z prędkością 3 600 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Osady zamrozić na co najmniej jedną godzinę, a najlepiej na noc, w temperaturze -80 °C.

Po przygotowaniu 200 mililitrów buforu do lizy zgodnie z opisem w protokole pisemnym, należy przygotować bufor do lizy plus, uzupełniając 10 mililitrów o 1 mM DTT, 1 mM PMSF oraz jedną tabletkę inhibitora proteaz, pracując w lodzie. Do osadów Thor należy dodać 10 mililitrów buforu do lizy plus i dokładnie resuspender poprzez pipetowanie oraz mieszanie w wstrząsarze typu vortex. Zawiesinę należy sonykować w lodzie przez jedną minutę przy ustawieniu cztery z 50% impulsem.

Odwiruj lizat po sonikacji z prędkością od 15 000 do 20 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przenieś oczyszczony sonikat do sterylnej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml. Przygotuj kulki z glutationem, delikatnie mieszając zawiesinę 75% i przenosząc 335 µL do probówki 15 ml za pomocą końcówki o szerokim otworze. Dodaj 10 ml zimnego PBS i odwiruj z prędkością 500 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

Odciąć supernatant. Dodać 1 mL buforu do lizy plus do kulek i ponownie wirować. Ponownie odciąć supernatant i dodać bufor do lizy.

Dodatkowo, aby przygotować 50% zawiesinę, połącz 2 × 50 µL zrównoważonej zawiesiny kulek z przygotowanym supernatorem. Inkubuj w rotatorze w temperaturze 4 °C przez 45 minut. Przygotuj HBS plus, uzupełniając 100 mL buforu HBS o 5 mM chlorku magnezu oraz 1 mM DTT. Odwiruj supernatant i kulki przy 500 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

Odrzuć supernatant i przemyj kulki dwukrotnie 10 mililitrami buforu do lizy plus oraz dwukrotnie 10 mililitrami HBS plus. Po ostatnim przemyciu przygotuj 50% zawiesinę, resuspendując kulki w HBS plus uzupełnionym o inhibitor proteaz. Rozcieńcz 10 mikrolitrów końcowego preparatu z kulkami, używając dwukrotności objętości buforu do próbek LAM ly zawierającego beta-merkaptoetanol.

Następnie przygotuj trzy próbki wzorca BSA, mieszając odpowiednio 10 µL, 5 µL oraz 2,5 µL roztworu stockowego BSA o stężeniu 2 mg/mL z 10 µL buforu Laemmli.

Gotuj próbki przez pięć minut, następnie krótko odwiruj i rozdziel je wraz z markerem masy cząsteczkowej na 10% żelu poliakrylamidowym SDS; po barwieniu i odbarwieniu żelu oszacuj ilość GST row A G 17 A, używając standardów BSA jako referencji. Przenieś równą objętość kulek zawierających około 10 do 15 µg białka do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Aby przygotować się do testu pull down GF, hoduj komórki przeznaczone do badania do osiągnięcia konfluencji w naczyniach o średnicy 10 cm i poddaj je deprywacji surowiczej przez co najmniej trzy godziny przed przeprowadzeniem testu.

Tuż przed rozpoczęciem analizy. Przygotować bufor do lizy z dodatkiem inhibitorów proteaz, pracując w lodzie. Usunąć pożywkę z płytek i przemyć je lodowatym roztworem HBS.

Usunąć cały HBS i dodać 700 µL buforu do lizy plus do każdej płytki. Rozprowadzić płyn, aby pokryć całą powierzchnię płytek.

Następnie zeskrob i zbierz lizaty do ponumerowanych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Wiruj przy 15 000 ×g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zachowaj nadsącz do analizy; jeśli liczba komórek w każdej płytce była taka sama, pobierz 30 µL z każdego nadsączu i zmieszaj z 30 µL dwukrotnie stężonego buforu do próbek redukujących.

Następnie zagotować i odstawić na lód. Pozostałe supernatranty dodać do alikwotów kulek GST row a G 17 A i inkubować w rotatorze przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Wirować kulki z prędkością 6 800 ×g przez 10 sekund w temperaturze 4 °C.

Odlej supernatant i przemyj kuleczki trzy razy buforem do lizy. Używając strzykawki o pojemności 1 CC z igłą o średnicy 30 G, całkowicie usuń ostatni płukanie i dodaj 20 µL dwukrotnie stężonego buforu do próbek lizacyjnych redukujących. Gotuj próbki przez pięć minut, odwiruj w celu osadzenia kuleczków, a następnie przeprowadź elektroforezę całkowitych lizatów komórkowych oraz próbek białek z precipytatu na żelu SDS-PAGE o procentowym stężeniu odpowiednim dla wielkości badanego GF.

Na koniec wykonaj western blotting w celu wykrycia odpowiedniego GFA w udanym teście GF. Przedstawiono tutaj wykrywanie aktywacji czynnika wymiany GFH one. Wiersz A G 17 A białko wychwytuje część GFH one z lizatów komórek kontrolnych, co sugeruje, że GFH one wykazuje aktywność podstawową.

Ilość wytrąconego białka wzrosła jednak w komórkach traktowanych zapalną cytokiną czynnikiem martwicy nowotworu alfa, co jest zgodne z tezą, że TNF alfa aktywuje G FH one. Co istotne, całkowity lizat komórkowy wykazuje podobne ilości gfh one w próbce kontrolnej i traktowanej, co sugeruje, że zabieg nie zmienił poziomu G FH one i że ilość materiału wyjściowego użytego w analizie była równa. Podczas adaptacji tej procedury ważne jest, aby utrzymywać białko GSE RO G 17 A oraz lizaty komórkowe w temperaturze 0°C (na lodzie).

Należy przeprowadzać analizę GF szybko i w sposób spójny oraz stosować odpowiednie kontrole pozytywne, które umożliwią unieważnienie wyników i rozwiązywanie problemów.