Name: Wytrącanie powinowactwa aktywnych Rho-GEF przy użyciu zmutowanego białka Rho znakowanego GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj metodę wytrącania aktywnych Rho-GEF z lizatów komórek nabłonkowych przy użyciu zmutowanego białka GST-RhoA(G17A). Technika ta umożliwia badanie aktywacji czynników wymiany nukleotydów w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (CIHR) (MOP-97774) oraz Kanadyjską Radę Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC, grant nr: 480619). KS jest laureatem nagrody KRESCENT New Investigator Award (nagrody przyznawanej wspólnie przez Kidney Foundation of Canada, Canadian Nephrology Society oraz Canadian Institute of Health Research) oraz Early Researcher Award przyznanej przez Ministerstwo Badań i Innowacji Ontario. FW korzysta ze wsparcia stypendium Li Ka Shing.

1. Transformacja E. coli konstruktem pGEX-RhoA(G17A)
<ol>
 <li>Przygotować agar LB, rozpuszczając 2,5 g LB i 1,5 g agaru w 100 ml dH2O. Autoklawować i schłodzić do około 50-55 °C, co w praktyce oznacza temperaturę, w której kolbę można wygodnie trzymać w dłoni.</li>
 <li>Przygotować roztwór zapasowy ampicyliny (Amp), rozpuszczając 50 mg/ ml w dH2O. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy i zamrozić niewykorzystane alikwoty. Do agaru LB z punktu 1.1 dodać 100 μl roztworu zapasowego Amp (stężenie końcowe 50 μg/ml). Wymieszać przez delikatne obracanie i wlać do 10 cm szalek do bakterii (15-20 ml/szalka). Pozostawić do stężenia (15-30 min.), a niewykorzystane szalki przechowywać odwrócone w temperaturze 4 °C przez 2-3 tygodnie.</li>
 <li>Aby przeprowadzić transformację E. Coli, szybko rozmrozić alikwot kompetentnych komórek DH5α w kąpieli lodowej. Dodać 1 μl DNA pGEXRhoA(G17A) rozcieńczonego do 25-50 ng/μl. Wymieszać poprzez lekkie stuknięcie probówki i inkubować na lodzie przez 30 minut. Poddać szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 45 sekund, a następnie ponownie umieścić na lodzie na 2 minuty. Dodać 900 μl pożywki SOC i hodować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.</li>
 <li>Wysiać 50-100 μl transformowanych bakterii na płytkę LB-Agar-Amp, używając zagiętej sterylnej pipety Pasteura. Inkubować płytkę stroną agarową do góry w inkubatorze w 37 °C przez 5 minut, a następnie odwrócić i hodować przez noc.</li>
 <li>Z płytki pobrać pojedynczą kolonię do przygotowania białka z tagiem GST (krok 2.1). Do późniejszego wykorzystania zapakować i przechowywać płytki odwrócone w temperaturze 4 °C przez około 3 tygodnie. Dodatkowo, do dłuższego przechowywania można przygotować banki bakterii, hodując pojedyncze kolonie w 2 ml sterylnego LB-Amp przez noc w 37 °C z wytrząsaniem. Wymieszać alikwot ze sterylnym 80% glicerolem w stosunku 1:1 i zamrozić w -80 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kulek GST-RhoA(G17A)
<ol>
 <li>Przygotować pożywkę LB, dodając 25 g LB do 1 L dH20, a następnie poddać autoklawowaniu. Po ostygnięciu dodać 50 μl Amp ze stocku do 50 ml LB (stężenie końcowe 50 μg/ml). Zaszczepić dobrze wyizolowaną kolonią transformowanych bakterii i inkubować przez noc w 37 °C z wytrząsaniem. Po osiągnięciu pełnej gęstości (OD600 &gt; 1,0) rozcieńczyć z 450 ml LB-Amp i hodować przez dodatkowe 30 minut w 37 °C.</li>
 <li>Przygotować 100 mM roztwór stockowy izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), rozpuszczając 0,238 g w 10 ml dH2O. Przechowywać w alikwotach w -20 °C. Indukować produkcję białka Rho przez dodanie 500 μl 100 mM IPTG do 500 ml kultury (stężenie końcowe 100 μM). Obniżyć temperaturę do 22-24 °C i hodować przez ok. 16 h.</li>
 <li>Wirować kulturę przy 3600 g przez 10 minut w 4 °C. W razie potrzeby 500 ml kultury można podzielić do probówek 50 ml w celu odwirowania. Zamrozić osad(y) przez co najmniej 1 godzinę (lub najlepiej przez noc) w -80 °C.</li>
 <li>Przygotować 200 ml buforu do lizy zawierającego 20 mM HEPES (0,95 g)/ pH 7,5; 150 mM NaCl (1,75 g); 5 mM MgCl2 (0,203 g); 1% TX-100 (2 ml). Przygotować roztwory stockowe 1M DTT (1,542 g w 10 ml dH2O) oraz 100 mM PMSF (0,174 g/10 ml EtOH). Aby przygotować bufor do lizy +, uzupełnić 10 ml o 1mM DTT (10 μl ze stocku), 1 mM PMSF (100 μl ze stocku) oraz jedną tabletkę Complete Mini Protease Inhibitor.</li>
 <li>Pracując na lodzie, dodać 10 ml buforu do lizy+ do osadów z kroku 2.3. Dokładnie resuspendować poprzez delikatne wierzgnięcie (vortexing) i pipetowanie. Unikać pienienia. Sonicować na lodzie przez 1 minutę przy ustawieniu 4 z 50% impulsem. Wirować zsonicowany lizat przy 15 000-20 000 g przez 15 minut w 4 °C i przenieść klarowny sonikat (nadpłyn) do sterylnej zamkniętej probówki 15 ml.</li>
 <li>Przygotować Glutathione Sepharose, delikatnie mieszając oryginalną probówkę zawierającą 75% zawiesinę, a następnie przenieść 335 μl do probówki 15 ml. Do pipetowania kulek użyć końcówki o szerokim wlocie. Dodać 10 ml zimnego PBS i wirować przy 500 g przez 5 minut w 4 °C. Odrzucić nadpłyn, dodać 1 ml buforu do lizy+ do kulek i wirować tak jak podczas poprzedniego przemywania. Odrzucić nadpłyn i dodać bufor do lizy+, aby przygotować 50% zawiesinę.</li>
 <li>Dodać 250 μl zrównoważonej zawiesiny kulek do nadpłynu z kroku 2.5. Rotować w 4 °C przez 45 minut.</li>
 <li>Przygotować 500 ml HBS zawierającego 20 mM HEPES (2,38 g)/pH 7,5 oraz 150 mM NaCl (4,38 g) w dH2O. Przygotować roztwory stockowe 1M MgCl2 (0,952 g w 10 ml dH2O) oraz 1M DTT (1,542 g w 10 ml dH2O). Aby przygotować HBS+, uzupełnić 100 ml bezpośrednio przed użyciem o 5 mM MgCl2 (50 μl ze stocku) oraz 1 mM DTT (100 μl ze stocku).</li>
 <li>Wirować kulki z kroku 2.7 przy 500 g przez 5 minut w 4 °C. Odrzucić nadpłyn i przemyć kulki 2x 10 ml buforem do lizy+ oraz 2x 10 ml HBS+. Po ostatnim przemyciu przygotować 50% zawiesinę poprzez resuspensję kulek w HBS+ uzupełnionym inhibitorem proteaz BD BaculoGold (20 μl 50x BD BaculoGold/ml).</li>
 <li>Rozcieńczyć 10 μl końcowego preparatu kulek 2x buforem do próbek Laemmli zawierającym β-merkaptoetanol. Przygotować standardy albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Użyć stocku 2 mg/ml (0,02 g BSA w 10 ml dH2O). Wymieszać 10 μl stocku z 10 μl Laemmli (końcowo 20 μg); 5 μl stocku z 5 μl dH2O i 10 μl Laemmli (końcowo 10 μg); oraz 2,5 μl stocku z 7,5 μl dH2O i 10 μl Laemmli (końcowo 5 μg). Zagotować wszystkie próbki (5 min). Wirować próbkę z kulkami i nałożyć nadpłyn wraz ze standardami BSA oraz markerami masy cząsteczkowej na 10% żel SDS-poliakrylamidowy.</li>
 <li>Przygotować barwnik Coomassie Blue (0,1 g w 10 ml kwasu octowego, 40 ml metanolu i 50 ml dH2O) oraz roztwór do odbarwiania (500 ml dH2O, 400 ml metanolu i 100 ml kwasu octowego). Przechowywać w temperaturze pokojowej. Barwić żel przez 20-30 minut, usunąć barwnik (można go użyć wielokrotnie) i przemyć roztworem do odbarwiania dwukrotnie. Kontynuować odbarwianie przy delikatnym wstrząsaniu przez kilka godzin, aż prążki będą wyraźnie widoczne.</li>
 <li>Oszacować stężenie GST-RhoA(G17A) związanego z kulkami, korzystając ze standardów BSA jako referencji (Rys. 2). Alikwotować równą objętość kulek zawierających ok. 10-15 μg białka do probówek do mikrowirowania 1,5 ml. Przechowywać kulki w 4 °C do użycia w ciągu jednego dnia. Zamrozić w -80 °C w mieszaninie HBS+/glicerol w stosunku 3:1 do użycia w ciągu kilku dni.</li>
</ol>
3. Test GEF Pulldown z użyciem kulek RhoA(G17A) wolnych od nukleotydów
<ol>
 <li>Hodować komórki w szalkach 10 cm do osiągnięcia konfluencji. Poddać deprywacji surowicy przez co najmniej 3 godziny i traktować zgodnie z wymaganiami.</li>
 <li>Przygotować bufor do lizy+ zgodnie z krokiem 2.4. Przygotować ilość buforu wystarczającą na 700 μl/szalkę oraz niewielką nadwyżkę, aby zrekompensować błędy pipetowania. Inhibitory proteaz dodać bezpośrednio przed użyciem.</li>
 <li>Pracując w lodzie, usunąć pożywkę z szalek i przemyć lodowatym HBS. Usunąć cały HBS i dodać 700 μl buforu do lizy+ do każdej szalki. Zamieszać szalkami okrężnymi ruchami, aby pokryć całą powierzchnię, zeskrobać i zebrać lizaty do ponumerowanych probówek 1,5 ml. Wirować przy 15,000 g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Nadpływ zostanie wykorzystany do analizy.</li>
 <li>Jeśli liczba komórek we wszystkich badanych szalkach jest równa, można pominąć oznaczanie białek i przejść do kroku 3.5. W przeciwnym razie zmierzyć stężenie białka w każdym nadpływie za pomocą testu Bio-Rad quick protein assay i wyrównać objętość oraz stężenie nadpływów. Ilość całkowitego białka zależy od użytych typów komórek (zazwyczaj 1-1,5 mg białka dla komórek LLC-PK1).</li>
 <li>Pobrać 30 μl każdego nadpływu i zmieszać z 30 μl 2x redukującego buforu do próbek Laemmli, zagotować i odstawić do kroku 3.7. Pozostałe nadpływy dodać do alikwotów kuleczek GST-RhoA(G17A) z kroku 2.12. Inkubować w rotatorze przez 45 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Wirować kuleczki przy 6800 g przez 10 sekund w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadpływ i przemyć kuleczki 3x buforem do lizy, wirować w ten sam sposób pomiędzy myciami. Całkowicie usunąć ostatnią porcję buforu myjącego za pomocą strzykawki 1 cc z igłą 30 G i dodać 20 μl 2x redukującego buforu do próbek Laemmli. Gotować przez 5 min. Wirować, aby osadzić kuleczki, a następnie natychmiast poddać nadpływ elektroforezie (zalecane) lub przechowywać go w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.</li>
 <li>Nanieść 20 μl całkowitego lizatu komórkowego oraz wszystkie próbki białek wytrąconych na żel SDS-poliakrylamidowy o odpowiednim stężeniu dla wielkości badanego GEF. Wykryć wybrany GEF metodą Western blotting przy użyciu specyficznego przeciwciała.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Część 1 i 2 protokołu opisuje przygotowanie białka GST-RhoA(G17A) sprzężonego z kulkami GSH-sepharose oraz jego weryfikację za pomocą SDS-PAGE (patrz schemat protokołu na Rys. 1). Typowy żel barwiony Coomassie przedstawiono na Rys. 2. Próbka z eluowanym białkiem powinna zawierać pojedynczy prążek o masie około 50 kDa (Rys. 2, ścieżka 6). Stężenie białka można oszacować, korzystając z próbek referencyjnych BSA. W przykładzie na Rys. 2 stężenie RhoA(G17A) szacuje się na 15 μg/10 μl. W związku z tym przygotowano alikwoty po 10 μl na probówkę. Typowa wydajność w naszych badaniach wynosi 15-20 μg białka z 10 ml lizatu bakteryjnego. Część 3 protokołu opisuje test wytrącania powinowactwa (patrz przegląd na Rys. 1). Pomyślny test GEF wykrywający aktywację czynnika wymiany GEF-H1 przedstawiono na Rys. 3. Białko RhoA(G17A) wychwyciło część GEF-H1 z kontrolnych (niepoddanych działaniu czynnika) lizatów komórkowych, co sugeruje, że GEF-H1 wykazuje aktywność podstawową. Ilość wytrąconego białka wzrasta jednak w komórkach traktowanych zapalną cytokiną Tumor Necrosis Factor -α (TNF- α), co jest zgodne z tezą, że TNF-α aktywuje GEF-H1 5,7. Co ważne, całkowite lizaty komórkowe wykazują podobne ilości GEF-H1 w próbce kontrolnej i traktowanej, co sugeruje, że zabieg nie zmienił poziomu GEF-H1, a ilość materiału wejściowego użytego w teście była jednakowa.
<img alt="Schemat transformacji bakteryjnej; analiza białka GST-RhoA(G17A); obejmuje SDS-PAGE i Western blotting." src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd protokołu.
<img alt="Wynik elektroforezy SDS-PAGE, rozdział białek według masy cząsteczkowej, wykazujący BSA i GST-RhoA." src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny wynik protokołu przygotowania kulek. Przedstawiono żel barwiony Coomassie po udanej preparatyce kulek GST-RhoA(G17A). Próbka z kulek oraz standardy białkowe BSA zostały rozdzielone metodą SDS-PAGE przy użyciu żelu z 10% akrylamidem. W celu przetestowania kulek, 10 μl końcowej zawiesiny kulek zawierającej GST-RhoA(G17A) rozcieńczono w stosunku 1:1 z redukującym buforem do próbek Laemmli i gotowano przez 5 minut. Kulki kręcono krótko w wirówce, a nadsącz naniesiono na żel. Naniesiono następujące próbki: ścieżka 1: marker masy cząsteczkowej (MW) (FroggaBio BLUeye prestained protein ladder); ścieżki 2-4: 5, 10 i 20 μg albuminy surowicy bydlęcej (BSA); ścieżka 5 jest pusta; ścieżka 6: 10 μl świeżo przygotowanych kulek RhoA(G17A). Po zakończeniu rozdziału żel zabarwiono błękitem Coomassie, a następnie odbarwiono, aby uwidocznić białka. Masa cząsteczkowa białka GST-RhoA(G17A) wynosi w przybliżeniu 50 kDa i znajduje się na poziomie markera 48 kDa. Stężenie białka GST-Rho w tej konkretnej próbce szacuje się na około 15 μg/10 μl zawiesiny.
<img alt="Analiza białek metodą Western blot; wpływ TNF-α na aktywność GEF-H1; eksperymentalne prążki białkowe." src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywny test aktywacji GEF wykazujący indukowaną przez TNF-α aktywację GEF-H1. Konfluentne komórki LLC-PK1 poddano działaniu 10 ng/ml TNF-α przez 5 minut. Po zakończeniu inkubacji komórki zlizowano, a aktywne GEF wyizolowano za pomocą kulek związanych z GST-RhoA(G17A). Obecność GEF-H1 w białkach wytrąconych (górny blot) oraz w próbkach całkowitego lizatu komórkowego (dolny blot) wykryto za pomocą techniki Western blotting z użyciem przeciwciała anty-GEF-H1 (Cell Signaling). Należy zwrócić uwagę na zwiększoną ilość wytrąconego GEF-H1 w komórkach traktowanych TNF-α w porównaniu z komórkami nietraktowanymi w stosunku do równoważnych ilości materiału wejściowego, co wskazuje na pomyślny wynik.
<img alt="Schemat Western blot, aktywny vs całkowity GEF-H1 po stymulacji TNF-α, analiza ekspresji białek." src="/files/ftp_upload/3932/3932fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. „Nieprawidłowy wynik”. Chociaż przeprowadzony tutaj test pulldown GEF doprowadził do wychwycenia pewnej ilości GEF-H1 przez kuleczki, ilości wytrącone z komórek kontrolnych oraz komórek traktowanych TNF-α są takie same. Zatem TNF-α, znany aktywator GEF-H1, w tym przypadku nie wywołał aktywacji. W tym konkretnym eksperymencie późniejsza analiza przyczyn błędu sugerowała, że użyte TNF-α nie było wystarczająco świeże i prawdopodobnie uległo degradacji.

<ol><li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. ho <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPases%3A+biochemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li>
<li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEF+means+go%3A+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li>
<li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPLN%2C+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB%2C+but+not+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li>
<li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li>
<li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-%7Balpha%7D-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation%3A+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li>
<li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li>
<li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK%2FGEF-H1%2FRhoA+pathway+in+tubular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li>
<li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catching+a+GEF+by+its+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li>
<li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li>
<li>Guilluy, G., Dubash, A. D., García-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li>
<li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li>
<li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Lsc%2Fp115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li>
<li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPLN%2C+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB%2C+but+not+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu jest jedynym dostępnym nieradiacyjnym testem aktywacji dla GEF, który pozwala na śledzenie aktywnej puli GEF w komórkach. Test ten jest podobny do testów wytrącania stosowanych w celu śledzenia aktywacji małych GTPaz, a także GEF działających na Rac i Cdc42. Testy te wykorzystują różne białka znakowane GST i wykazują niewielkie różnice w stosunku do metody opisanej tutaj, jednak podstawowe kroki pozostają takie same. W związku z tym niniejszy protokół można łatwo dostosować do innych testów aktywacji małych GTPaz i GEF.
Przedstawiony test GEF został niedawno zmodyfikowany w celu zastosowania go do frakcji jądrowych 9,10. Po wprowadzeniu dalszych modyfikacji możliwe może być również badanie aktywacji GEF w innych przedziałach subkomórkowych.
Przedstawioną metodę wykorzystujemy do badania aktywacji GEF w liniach komórek nabłonkowych5,6,7. Po pewnej optymalizacji test ten powinien być odpowiedni do wykrywania GEF z dowolnej linii komórkowej. Podczas adaptacji do konkretnego typu komórek należy dobrać optymalną liczbę komórek, objętość buforu do lizy oraz metodę detekcji dla badanego GEF (istotne jest zastosowanie dobrego przeciwciała do Western blottingu). Przy wstępnym ustawianiu testu zaleca się użycie bodźca, o którym wiadomo, że aktywuje badany GEF. W przypadku stosowania nieznanego bodźca należy zawsze użyć kontroli pozytywnej, aby zweryfikować poprawność działania testu. Metodę tę można wykorzystać do wykrywania aktywacji znanych GEF za pomocą Western blottingu. Jest ona jednak równie odpowiednia do identyfikacji nieznanych GEF. W tym celu przechwycone GEF z próbek kontrolnych i stymulowanych należy przeanalizować na żelu barwionym Coomassie. Prążki pojawiające się wyłącznie w próbkach stymulowanych mogą zawierać aktywowane GEF i mogą zostać przekazane do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas (np. 5).
Na koniec należy zamieścić pewną uwagę ostrzegawczą. Analiza opiera się na założeniu, że modyfikacje potranslacyjne aktywujące GEF są zachowane po lizie komórek. W rzeczywistości jest to ewidentne w przypadku wielu GEF i od momentu opracowania tej metody była ona wykorzystywana przez różne grupy badawcze do wykrywania aktywacji różnych GEF, w tym GEF-H1, p115RhoGEF oraz XPLN (np. 5,11,12,13). Zachowanie stanu aktywnego może jednak nie wystąpić w przypadku wszystkich GEF, w związku z czym dopuszczalne jest, że analiza ta nie będzie skuteczna dla każdego z nich. Należy również zauważyć, że wiele GEF wykazuje aktywność wobec więcej niż jednej małej GTPazy. Dlatego podczas badania konkretnego GEF zaleca się uzupełnienie tej analizy o testy precypitacji GEF dla innych małych GTPaz, a także o badania funkcjonalne z analizą RhoA, Rac1 oraz Cdc42.
Kluczowe etapy protokołu:
Kolonie przekształconych bakterii należy pobierać ze świeżych, prawidłowo przygotowanych szalek, aby zapewnić odpowiednią selekcję za pomocą Amp, prawidłowy wzrost i wydajność. Warunki transformacji dla komórek kompetentnych uzyskanych z innych źródeł mogą się różnić i powinny zostać sprawdzone.
Wszystkie etapy protokołu przygotowania białka (od kroku 2.3) oraz analizy (od kroku 3.2) należy przeprowadzić w temperaturze 4°C, używając schłodzonych roztworów i wirówek.
Liza bakterii (krok 2.5) powinna być dokładna i pełna, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Podczas lizy bakterii należy naprzemiennie mieszać lizat w wirówce typu vortex oraz pipetować, utrzymując go w temperaturze 4°C; sonikację należy przeprowadzać w lodzie, aby zapobiec denaturacji białka. W przypadku korzystania z innego modelu sonikatora może być konieczne dostosowanie parametrów. Inkubację sonikatu z kuleczkami należy zawsze przeprowadzać w temperaturze 4°C na rotatorze w celu zapewnienia odpowiedniego wiązania, dbając jednocześnie o zachowanie stałego czasu trwania tego procesu.
Mutanty GST-Rho są nieco niestabilne podczas ekspresji w bakteriach, dlatego najlepiej jest użyć przygotowanych kulek od razu lub w ciągu kilku dni.
Test wytrącania (część 3) jest wrażliwy na czas i temperaturę, ponieważ aktywne GEF mogą zostać łatwo utracone z lizatu komórkowego, dlatego poszczególne etapy należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe.
Poniższa sekcja zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów.
Brak lub bardzo mała ilość zmutowanego białka Rho w końcowym preparacie z koralikami: Może to być spowodowane nieefektywną indukcją, niewystarczającą lizą bakterii lub utratą białka podczas procesu przygotowania lub przechowywania. Aby pomóc w rozwiązaniu tych problemów, próbki bakterii można analizować przed i po indukcji. W przypadku słabej indukcji białka należy powtórzyć proces, wykorzystując kolonię ze świeżo wysianej płytki lub z ponownie transformowanych komórek kompetentnych. Należy również przetestować różne stężenia IPTG oraz czasy indukcji. Jeśli liza jest niewystarczająca (tzn. białko pozostaje w osadzie zamiast w nadosadzie), można spróbować zmienić stężenia soli i detergentów w buforze do lizy. Należy rozważyć zmianę czasu i ustawień sonikacji, a próbki przed i po sonikacji można sprawdzić pod mikroskopem, aby określić wydajność lizy.
Brak wytrąconego GEF, mimo obecności białka GST na kuleczkach: Może to wynikać z problemów technicznych podczas testu wytrącania lub z rzeczywistego braku aktywacji badanego GEF pod wpływem zastosowanego bodźca. Zawsze należy stosować znany bodziec jako kontrolę pozytywną, aby zweryfikować prawidłowe działanie testu. Przygotowane kuleczki należy wykorzystać w ciągu kilku dni. Jeśli test wytrącania nie wykazuje wykrywalnych ilości badanego GEF we wszystkich warunkach, należy sprawdzić, czy GEF jest obecny i dobrze wykrywalny w nadosadzie po wirowaniu, która ma zostać użyta do testu (krok 3.3). Należy upewnić się, że wszystkie bufory i inhibitory proteaz są świeże oraz wykonywać wszystkie kroki na lodzie tak szybko, jak to możliwe. Można zwiększyć ilość białka wejściowego (np. stosując lizaty z 2 płytek/próbkę). Jeśli test wytrącania wykazuje podstawowe wytrącanie GEF, ale nie widać różnic między próbką kontrolną a stymulowaną (Rys. 4), należy rozpocząć rozwiązywanie problemów od weryfikacji skuteczności zastosowanego bodźca, badając inne znane efekty (np. poprzez wykrycie aktywacji innych szlaków sygnalizacyjnych). Warto rozważyć zmianę warunków traktowania i/lub stężeń. W celu przewidzenia prawdopodobnych czasów i stężeń należy oprzeć się na danych literaturowych dotyczących aktywacji Rho lub innych sygnałów przez dany bodziec. Podczas optymalizacji czasu traktowania należy stosować zarówno krótkie, jak i długie punkty czasowe, ponieważ aktywacja GEF może być najlepiej wykrywalna w punkcie czasowym poprzedzającym wyraźną aktywację Rho. Wreszcie, ten sam bodziec może prowadzić do zmiennego stopnia aktywacji z powodu zmiany reaktywności komórek spowodowanej m.in. liczbą pasażów lub konfluencją komórek.

<table><tbody><tr><td>pGEX-RhoA(G17A) </td><td>Addgene</td><td>Wkrótce dostępne</td><td>Wygenerowano w laboratorium dr. Keitha Burridge'a (University of North Carolina) (ref &lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;) </td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258-012</td><td>Przechowywać w -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Pożywka SOC </td><td>BioShop Canada</td><td>SOC001.10</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>BioShop Canada</td><td>LBL407.1</td><td>Przechowywać w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>BioShop Canada</td><td>GLY002.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>BioShop Canada</td><td>AMP201.25</td><td>Przechowywać roztwór stokowy w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropyl-β-D-1-tiogalakto-piranozyd)</td><td>Calbiochem</td><td>420322</td><td>Przechowywać roztwór stokowy w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Kulki Sepharose z glutationem</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9272</td><td>Dodać bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>TX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>OmniPur, EMD Millipore</td><td>3860</td><td>Dodać bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7626</td><td>Dodać bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Inhibitor proteaz 50x</td><td>BD Biosciences</td><td>51-21426Z</td><td>Dodać bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Complete Mini, bez EDTA 10x</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>Dodać bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Laemmliego 2x</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Dodać bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Bio-Rad</td><td>R-250</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>CALEDON</td><td>1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>CALEDON</td><td>6701-7</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td> drabinka BLUeye</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Wykorzystane odczynniki</td></tr><tr><td>Wirówka RC-5B</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Rotor SS-34</td><td>Stosować w 4&amp;#x00B0;C </td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>ST-16R</td><td>Stosować w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Stosować w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem do bakterii</td><td>INFORS HT Ecotron</td><td>AG CH-1403 Bottmingen</td><td>Stosować w 37&amp;#x00B0;C lub w 22&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Branson</td><td>Sonifier-450</td><td>Stosować w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Glas-Col</td><td>099A CR4012</td><td>Stosować w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Wykorzystany specjalistyczny sprzęt</td></tr></tbody></table>

wytrącanie powinowactwa aktywnych czynników gef białka rho z wykorzystaniem białka rho z mutacją z tagiem gst (gst-rhoa(g17a)) z lizatów komórek nabłonkowych

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Białka z rodziny małych GTPaz Rho są kluczowymi regulatorami cytoszkieletu i kontrolują szeroki wachlarz procesów komórkowych, w tym migrację komórek, ekspresję genów, progresję cyklu komórkowego oraz adhezję komórkową 1. Białka Rho są przełącznikami molekularnymi, które są aktywne w stanie związania z GTP i nieaktywne w stanie związania z GDP. Ich aktywacja jest pośredniczona przez rodzinę białek czynników wymiany nukleotydów guaninowych (GEF). Rho-GEF stanowią liczną rodzinę o nakładających się swoistościach 2. Choć poczyniono znaczne postępy w identyfikacji GEF aktywowanych przez konkretne sygnały, wciąż pozostaje wiele pytań dotyczących regulacji tych białek w obrębie konkretnych szlaków. Liczba Rho-GEF przekracza 70, a każda komórka ekspresuje więcej niż jedno białko GEF. Ponadto wiele z tych białek aktywuje nie tylko Rho, ale i inne członków tej rodziny, co dodatkowo przyczynia się do złożoności sieci regulacyjnych. Co istotne, badanie sposobu regulacji GEF wymaga metody pozwalającej na śledzenie aktywnej puli poszczególnych GEF w komórkach aktywowanych różnymi bodźcami. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół metody służącej do oceny i ilościowego oznaczania dostępnych aktywnych GEF specyficznych dla Rho z wykorzystaniem testu precypitacji powinowactwa. Test ten został opracowany kilka lat temu w laboratorium Burridge'a 3,4, a my zastosowaliśmy go w liniach komórkowych kanalików nerkowych 5,6,7. Test wykorzystuje mutant RhoA „wolny od nukleotydów”, wykazujący wysokie powinowactwo do aktywnych GEF. Mutacja (G17A) sprawia, że białko nie jest w stanie wiązać GDP ani GTP, a stan ten naśladuje stan pośredni związany z GEF. Wersja tego białka mutantowego z tagiem GST jest ekspresowana i oczyszczana z E. coli, wiązana z kuleczkami sefarozy glutationowej i używana do precypitacji aktywnych GEF z lizatów komórek niepoddanych działaniu bodźca oraz komórek stymulowanych. Ponieważ większość GEF jest aktywowana poprzez modyfikacje potranslacyjne lub uwalnianie z wiązań inhibicyjnych, ich stan aktywny jest zachowany w lizatach komórkowych i mogą one zostać wykryte za pomocą tego testu8. Wychwycone białka mogą być badane pod kątem znanych GEF poprzez detekcję specyficznymi przeciwciałami z wykorzystaniem Western blottingu lub analizowane metodą spektrometrii mas w celu identyfikacji nieznanych GEF aktywowanych przez określone bodźce.

Metoda przedstawiona w niniejszej publikacji opisuje test służący do monitorowania aktywacji specyficznych dla RhoA czynników wymiany GDP/GTP (GEFs) w hodowlach komórkowych, z wykorzystaniem zmutowanego białka fuzyjnego RhoA GST, które wykazuje wysokie powinowactwo do aktywowanych GEFs. Białka GEFs są wytrącane z lizatów komórkowych, wykrywane za pomocą techniki Western blotting i ilościowo oznaczane metodą densytometrii.

Wytrącanie powinowactwa aktywnych czynników GEF białka Rho z wykorzystaniem białka Rho z mutacją z tagiem GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych

Białka z rodziny małych GTPaz Rho są kluczowymi regulatorami cytoszkieletu i kontrolują szeroką gamę procesów komórkowych, w tym ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie aktywacji RO specyficznych czynników wymiany G-D-P-G-T-P lub gafów w hodowlach komórkowych poprzez wykorzystanie mutantu białka fuzyjnego RO A GST, który wykazuje wysokie powinowactwo do aktywowanych gs. Osiąga się to najpierw poprzez produkcję mutantu białka row z tagiem GST w bakteriach. Następnie przeprowadza się oczyszczanie białka GST row A sprzężonego z kuleczkami.Następnie, za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, ocenia się czystość i stężenie białka GST RO A. Na koniec przygotowuje się lizat komórkowy i przeprowadza analizę precypitacji GEF z użyciem białka GST RO A. W rezultacie, dzięki analizie western blot precypitowanych białek z zastosowaniem swoistego przeciwciała anty-GF oraz kwantyfikacji metodą densytometrii, można uzyskać wyniki wykazujące zwiększoną precypitację aktywowanego GS w komórkach poddanych działaniu preparatu.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na szereg interesujących pytań w dziedzinie surowego GTPS, takich jak sposób regulacji wielu czynników wymiany G-D-P-G-T-P w sposób specyficzny dla sygnału oraz sposób koordynacji ich aktywności. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać początkowe trudności, ponieważ białko GST RO G 17 A jest stosunkowo niestabilne i może ulegać degradacji podczas przygotowania. Ważne jest również, aby przeprowadzić test precypitacji GF szybko i konsekwentnie. Procedurę tę zaprezentuje Pfizer Vahid, student studiów magisterskich z mojego laboratorium, w celu transformacji e coli.Szybko dodaj 1 µL DNA PX row A G 17 A o stężeniu od 25 do 50 ng/µL do 1/4 objętości kompetentnych komórek DH5α w kąpieli lodowej. Delikatnie potrząśnij probówką, aby wymieszać zawartość, i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Przeprowadź szok termiczny komórek w temperaturze 42 °C przez 45 sekund, a następnie ponownie umieść je na lodzie na dwie minuty.Dodaj 900 µL medium SOC i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Za pomocą zgiętej sterylnej pipety Pasteura roznieś od 50 do 100 µL przekształconych bakterii na wcześniej przygotowaną płytkę z agarem LB i persyną. Inkubuj płytkę w pozycji prawidłowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez pięć minut, a następnie odwróć ją i inkubuj przez noc.Wybierz dobrze odizolowaną kolonię transformowanych bakterii i użyj jej do zaszczepienia 50 mililitrów LB z ampicyliną. Hoduj przez noc w temperaturze 37 °C przy mieszaniu. Po osiągnięciu przez kulturę pełnej gęstości rozcieńcz ją 450 mililitrami LB z ampicyliną i hoduj przez kolejne 30 minut. W temperaturze 37 °C indukuj produkcję białka row w bakteriach, dodając 500 mikrolitrów 100 milimolarnym IPTG do 500 mililitrów kultury.Obniż temperaturę do 22–24 °C i inkubuj przez około 16 godzin. Wirowanie hodowli należy przeprowadzić z prędkością 3 600 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Osady zamrozić na co najmniej jedną godzinę, a najlepiej na noc, w temperaturze -80 °C.Po przygotowaniu 200 mililitrów buforu do lizy zgodnie z opisem w protokole pisemnym, należy przygotować bufor do lizy plus, uzupełniając 10 mililitrów o 1 mM DTT, 1 mM PMSF oraz jedną tabletkę inhibitora proteaz, pracując w lodzie. Do osadów Thor należy dodać 10 mililitrów buforu do lizy plus i dokładnie resuspender poprzez pipetowanie oraz mieszanie w wstrząsarze typu vortex. Zawiesinę należy sonykować w lodzie przez jedną minutę przy ustawieniu cztery z 50% impulsem.Odwiruj lizat po sonikacji z prędkością od 15 000 do 20 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przenieś oczyszczony sonikat do sterylnej probówki z nakrętką o pojemności 15 ml. Przygotuj kulki z glutationem, delikatnie mieszając zawiesinę 75% i przenosząc 335 µL do probówki 15 ml za pomocą końcówki o szerokim otworze. Dodaj 10 ml zimnego PBS i odwiruj z prędkością 500 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.Odciąć supernatant. Dodać 1 mL buforu do lizy plus do kulek i ponownie wirować. Ponownie odciąć supernatant i dodać bufor do lizy.Dodatkowo, aby przygotować 50% zawiesinę, połącz 2 × 50 µL zrównoważonej zawiesiny kulek z przygotowanym supernatorem. Inkubuj w rotatorze w temperaturze 4 °C przez 45 minut. Przygotuj HBS plus, uzupełniając 100 mL buforu HBS o 5 mM chlorku magnezu oraz 1 mM DTT. Odwiruj supernatant i kulki przy 500 ×g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.Odrzuć supernatant i przemyj kulki dwukrotnie 10 mililitrami buforu do lizy plus oraz dwukrotnie 10 mililitrami HBS plus. Po ostatnim przemyciu przygotuj 50% zawiesinę, resuspendując kulki w HBS plus uzupełnionym o inhibitor proteaz. Rozcieńcz 10 mikrolitrów końcowego preparatu z kulkami, używając dwukrotności objętości buforu do próbek LAM ly zawierającego beta-merkaptoetanol.Następnie przygotuj trzy próbki wzorca BSA, mieszając odpowiednio 10 µL, 5 µL oraz 2,5 µL roztworu stockowego BSA o stężeniu 2 mg/mL z 10 µL buforu Laemmli.Gotuj próbki przez pięć minut, następnie krótko odwiruj i rozdziel je wraz z markerem masy cząsteczkowej na 10% żelu poliakrylamidowym SDS; po barwieniu i odbarwieniu żelu oszacuj ilość GST row A G 17 A, używając standardów BSA jako referencji. Przenieś równą objętość kulek zawierających około 10 do 15 µg białka do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Aby przygotować się do testu pull down GF, hoduj komórki przeznaczone do badania do osiągnięcia konfluencji w naczyniach o średnicy 10 cm i poddaj je deprywacji surowiczej przez co najmniej trzy godziny przed przeprowadzeniem testu.Tuż przed rozpoczęciem analizy. Przygotować bufor do lizy z dodatkiem inhibitorów proteaz, pracując w lodzie. Usunąć pożywkę z płytek i przemyć je lodowatym roztworem HBS.Usunąć cały HBS i dodać 700 µL buforu do lizy plus do każdej płytki. Rozprowadzić płyn, aby pokryć całą powierzchnię płytek.Następnie zeskrob i zbierz lizaty do ponumerowanych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Wiruj przy 15 000 ×g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zachowaj nadsącz do analizy; jeśli liczba komórek w każdej płytce była taka sama, pobierz 30 µL z każdego nadsączu i zmieszaj z 30 µL dwukrotnie stężonego buforu do próbek redukujących.Następnie zagotować i odstawić na lód. Pozostałe supernatranty dodać do alikwotów kulek GST row a G 17 A i inkubować w rotatorze przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Wirować kulki z prędkością 6 800 ×g przez 10 sekund w temperaturze 4 °C.Odlej supernatant i przemyj kuleczki trzy razy buforem do lizy. Używając strzykawki o pojemności 1 CC z igłą o średnicy 30 G, całkowicie usuń ostatni płukanie i dodaj 20 µL dwukrotnie stężonego buforu do próbek lizacyjnych redukujących. Gotuj próbki przez pięć minut, odwiruj w celu osadzenia kuleczków, a następnie przeprowadź elektroforezę całkowitych lizatów komórkowych oraz próbek białek z precipytatu na żelu SDS-PAGE o procentowym stężeniu odpowiednim dla wielkości badanego GF.Na koniec wykonaj western blotting w celu wykrycia odpowiedniego GFA w udanym teście GF. Przedstawiono tutaj wykrywanie aktywacji czynnika wymiany GFH one. Wiersz A G 17 A białko wychwytuje część GFH one z lizatów komórek kontrolnych, co sugeruje, że GFH one wykazuje aktywność podstawową.Ilość wytrąconego białka wzrosła jednak w komórkach traktowanych zapalną cytokiną czynnikiem martwicy nowotworu alfa, co jest zgodne z tezą, że TNF alfa aktywuje G FH one. Co istotne, całkowity lizat komórkowy wykazuje podobne ilości gfh one w próbce kontrolnej i traktowanej, co sugeruje, że zabieg nie zmienił poziomu G FH one i że ilość materiału wyjściowego użytego w analizie była równa. Podczas adaptacji tej procedury ważne jest, aby utrzymywać białko GSE RO G 17 A oraz lizaty komórkowe w temperaturze 0°C (na lodzie).Należy przeprowadzać analizę GF szybko i w sposób spójny oraz stosować odpowiednie kontrole pozytywne, które umożliwią unieważnienie wyników i rozwiązywanie problemów.

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pokrewna Precypitacja Aktywnych Rho-GEF przy Użyciu GST-Oznaczonego Mutantnego Białka Rho (GST-RhoA(G17A)) z Lysatów Komórek Epitelialnych

Niniejszy protokół wykorzystuje test pull-down do oznaczenia poziomów aktywnej GTPazy RhoC w komórkach.

Test aktywacji GTPazy RhoC

Endocytoza zależna od klatryny opiera się na białkach adaptorowych, które koordynują selekcję ładunku i montaż otoczki klatrynowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy procedury służące do badania fizycznych oddziaływań między białkami adaptorowymi a klatryną oraz metody obrazowania żywych komórek, wykorzystując jako model drożdżowe białko adaptorowe endocytozy Sla1p.

Badania in vivo i in vitro nad oddziaływaniem adaptora z klatryną

Ten film demonstruje test konkursowy do badania partnerów białkowych wiążących GTPazę. Wykorzystując białko GTPazy związane z nukleotydami unieruchomione na kulkach magnetycznych, można badać konkurencyjne wiązanie między dwoma oddziałującymi partnerami białkowymi dla tego samego miejsca wiązania na GTPazie w celu oceny powinowactwa wiązania partnerów białkowych.

Test wiązania konkurencji w celu zbadania konkurujących partnerów białkowych wiążących GTPazę

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Ten protokół porównuje względne pokrewieństwo partnerów wiążących dla GTPaz rodziny Rho, w tym Rac1. In vivo białka wiążące Rac1 konkurują o pojedynczy interfejs wiążący, którego konformacja jest podyktowana przez związany nukleotyd. Nukleotyd jest zarówno ważny, jak i trudny do kontrolowania eksperymentalnie ze względu na wysoką szybkość hydrolizy.

Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

W manuskrypcie opisujemy użycie testu reporterowego fluorescencji na bazie drożdży do identyfikacji składników komórkowych zaangażowanych w procesy transportu i zabijania podjednostki cytotoksycznej A toksyny roślinnej rycyny (RTA).

Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Tutaj opisujemy protokół do badania prenylacji i obciążenia guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) GTPazy Rho. Protokół ten składa się z dwóch szczegółowych metod, a mianowicie frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentu sprzężonego z GTPazą. Protokół może być używany do pomiaru prenylacji i obciążenia GTP różnych innych małych GTPaz.

Wykrywanie prenylacji małej GTPazy i wiązania GTP za pomocą frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentowego sprzężonego z GTPazą

Opracowanie dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF) jest nowatorskie dla eliminacji szkodliwych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół syntezy cząsteczki DCAF1, która może selektywnie blokować przeciwciało 4G2 w celu wyeliminowania efektu wzmocnienia zależnego od przeciwciał podczas infekcji wirusem dengi.

Celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF)

Niniejsze badanie przedstawia metody eksperymentalne biochemicznie charakteryzujące GFAP i jego mutacje wywołujące choroby, koncentrując się na składaniu, agregacji i modyfikacji potranslacyjnej filamentu. Analizowano białka GFAP o wysokiej czystości, co ujawniło wgląd w mechanizmy choroby Alexandra, które mogą stanowić ramy do badania potencjalnych celów terapeutycznych oraz zrozumienia mutacji GFAP i powiązanych schorzeń.

Eksperymentalne podejścia do analizy biochemicznej białka kwaśnego glia włóknistego i jego wariantów związanych z chorobą

Poznaj metodę wytrącania aktywnych Rho-GEF z lizatów komórek nabłonkowych przy użyciu zmutowanego białka GST-RhoA(G17A). Technika ta umożliwia badanie aktywacji czynników wymiany nukleotydów w komórkach.

Wytrącanie powinowactwa aktywnych Rho-GEF przy użyciu zmutowanego białka Rho znakowanego GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych (Wideo) | JoVE Journal

Wytrącanie powinowactwa aktywnych czynników GEF białka Rho z wykorzystaniem białka Rho z mutacją z tagiem GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych

Przeglądaj więcej filmów