Name: Mikrofluidyka śródbłonkowa do badania interakcji mikronaczyniowych w chorobach hematologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj metodę mikrofluidyki śródbłonkowej do badania interakcji komórkowych w chorobach hematologicznych. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę warunków biologicznych i fizycznych w modelu in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy T. Huntowi, M. Rosenbluthowi oraz zespołowi Lam Lab za rady i pomocne dyskusje. Wyrażamy wdzięczność G. Spinnerowi oraz Instytutowi Elektroniki i Nanotechnologii w Georgia Institute of Technology za udzielone wsparcie. Finansowanie niniejszej pracy zapewniły grant NIH K08-HL093360, nagroda UCSF REAC, grant NIH Nanomedicine Development Center PN2EY018244 oraz fundusze z Center for Endothelial Cell Biology w Children's Healthcare of Atlanta.

1. Wykonanie mikro urządzenia śródbłonkowego
<ol>
 <li>Przygotuj fotomaskę, przesyłając rysunek urządzenia mikrofluidycznego wykonany w programie do wspomaganego projektowania komputerowego (CAD) do zewnętrznego dostawcy masek. Wykorzystana maska składała się z warstwy chromu na szkle sodowo-wapniowym. W tym przypadku szerokość kanału mikrofluidycznego wynosiła 30 μm.</li>
 <li>Wyczyść niepowlekany wafelek krzemowy roztworem piranha (stosunek kwasu siarkowego do nadtlenku wodoru 10:1) przez 15 minut, a następnie zanurz w kwasie fluorowodorowym na 30 sekund. Płucz wodą dejonizowaną (DI) przez około 10 sekund.</li>
 <li>Za pomocą powlekarki rotacyjnej nanieś fotorezyst Microchem SU-8 2025 na wafelek, aby uzyskać wysokość 30 μm. Dla SU-8 2025 zalecana prędkość obrotowa wynosi 3000 rpm. Dostępne są inne lepkości SU-8, które pozwolą osiągnąć tę wysokość. Pełne instrukcje dotyczące stosowania SU-8 są dostępne na stronie <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">www.microchem.com</a></li>
 <li>Umieść wafelek z SU-8 na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby odparować nadmiar rozpuszczalnika. 
 Uwaga: Suszenie wafelka w piekarniku przebiega inaczej niż na płycie grzewczej i nie jest zalecane.</li>
 <li>Umieść maskę z pożądanym kształtem elementów nad wafelkiem i naświetl światłem UV (160 mJ/cm2 mierzone przy 365 nm) w naświetlarce z wyrównywaczem masek (Karl Suss, MA-6). Powoduje to sieciowanie fotorezystu.</li>
 <li>Umieść wafelek ponownie na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez dodatkowe 5 minut, aby dalej przyspieszyć polimeryzację SU-8.</li>
 <li>Zanurz wafelek w wywoływaczu SU-8 Developer, składającym się głównie z PGMEA (octanu metylowego eteru glikolu propylenowego), na 4 minuty w celu usunięcia niesieciowanego SU-8.</li>
 <li>Płucz nowo wywołany wafelek 100% alkoholem izopropylowym (IPA) przez 10 s. Następnie wafelek można wysuszyć za pomocą sprężonego azotu lub pozwalając rozpuszczalnikowi odparować z wafelka w czystej dygestorium przez kilka minut.</li>
 <li>Przyklej krawędzie wysuszonego wafelka z naniesionym wzorem SU-8 do szalki Petriego, aby zapobiec jego przesuwaniu się.</li>
 <li>Nanieś 1 mL Sigmacote na wafelek za pomocą pipety, przykryj pokrywką szalki Petriego i obracaj wafelkiem, aby zapewnić jego całkowite pokrycie, następnie zdejmij pokrywkę i pozostaw wafelek do wyschnięcia na kilka minut, aż cały rozpuszczalnik odparuje.</li>
</ol>
2. Przygotowanie PDMS (polidimetylosiloksanu)
<ol>
 <li>Wymieszać polimer PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 (w/w) i usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą desykatora próżniowego. Czas potrzebny na odgazowanie PDMS zależy od mocy dostępnego systemu próżniowego, ale zazwyczaj wynosi od kilku minut do jednej godziny. Dla sześciocalowej szalki Petriego, w której wcześniej nie wlewano PDMS, zaleca się całkowitą objętość 60 mL polimeru.</li>
 <li>Wlać mieszaninę na podłoże krzemowe, tworząc warstwę o grubości około 5 mm. Wlać również do naczynia z płaskim dnem, aby stworzyć cienką arkusz PDMS o grubości około 1 mm. Utwardzać w piecu w temperaturze 60 °C przez noc.</li>
 <li>Za pomocą noża lub skalpela wyciąć obszar wokół utwardzonego urządzenia z PDMS i zdjąć je z podłoża krzemowego. Dodatkowo wyciąć cienki arkusz PDMS nieco większy niż urządzenie.</li>
 <li>Wyciąć otwory wlotowe i wylotowe w urządzeniu z PDMS za pomocą dziurkacza o średnicy 1,0 mm. Można to zrobić przy użyciu uchwytu precyzyjnego, Harris Uni-Core lub podobnego narzędzia.</li>
 <li>Oczyścić powierzchnie urządzenia i arkusza za pomocą taśmy klejącej.</li>
 <li>Za pomocą oczyszczacza plazmowego poddać powierzchnie urządzenia z PDMS i arkusza PDMS działaniu plazmy tlenowej przez 30 s. Plazma tlenowa tworzy reaktywne grupy na odsłoniętej powierzchni PDMS, które wiążą się po zetknięciu fizycznym.</li>
 <li>Połączyć cieńszą rurkę z krótkim odcinkiem (kilka centymetrów) grubszej rurki, która z kolei jest połączona ze strzykawką z tępyj igłą, wypełnioną roztworem 50 μg/ml fibronektyny z ludzkiej plazmy w PBS. Rurki i igła są tak dobrane, aby zapewnić ciasne dopasowanie między rurkami. Włożyć cieńszą rurkę do wlotu mikrourządzenia z PDMS i wywrzeć nacisk na strzykawkę, aby całkowicie wypełnić kanały roztworem fibronektyny i stworzyć małą kroplę o objętości 100 μL w porcie wylotowym, aby zapewnić zwilżenie kanałów. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C przez 40-60 min.</li>
 <li>Podłączyć nową strzykawkę wypełnioną PBS do tępej igły. Wywrzeć nacisk na strzykawkę, aby przepłukać urządzenie roztworem PBS.</li>
</ol>
3. Zasiewanie komórek śródbłonka w urządzeniu mikrofluidycznym
<ol>
 <li>Przygotować zawiesinę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs) o stężeniu 1 000 000 cells/mL w pożywce wzrostowej dla komórek śródbłonka z dodatkiem 8% dekstranu. Pomyślnie stosowano zakres od 500 000 do 2 000 000 cells/mL. Dodanie dekstranu do medium do ładowania komórek zwiększa lepkość cieczy, co zmniejsza prędkość komórek śródbłonka podczas wprowadzania ich do systemu mikroprzepływowego powleczonego fibronektyną. Zwiększa to z kolei prawdopodobieństwo, że komórki przylgną i będą pomyślnie hodowane wewnątrz mikrourządzenia.</li>
 <li>Podłączyć nową strzykawkę i rurkę zgodnie z krokiem 2.7, ale z użyciem dłuższej rurki (o długości około 1 metra).</li>
 <li>W celu optymalizacji pracy systemu krytyczne jest na tym etapie zapobieganie wszelkim wyciekom lub powstawaniu pęcherzyków powietrza w całym systemie perfuzji; jakikolwiek wyciek roztworu lub obecność pęcherzyków w medium zmieni przepływ i uniemożliwi pomyślne zasiewanie komórek śródbłonka. Dlatego niezbędne jest szczelne dopasowanie rurek, aby wyeliminować nieszczelności na wszystkich połączeniach. Pęcherzyki w strzykawce i/lub rurkach muszą zostać usunięte przed wprowadzeniem komórek do mikrourządzenia, a cały system perfuzji należy przepłukać roztworem komórek przed podłączeniem rurki do układu mikroprzepływowego, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Używając pompy strzykawkowej, wprowadzić zawiesinę komórkową do urządzenia PDMS z natężeniem przepływu objętościowego 1,23 μl/min przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Optymalne wyniki uzyskano, gdy pompa strzykawkowa znajdowała się na tej samej wysokości co urządzenie PDMS. W przypadku wlotu dłuższa rurka, którą można zwinić wewnątrz inkubatora, zapewnia odpowiednie ogrzanie komórek i medium przed kontaktem z urządzeniem. W naszym systemie natężenie przepływu objętościowego 1,23 μl/min odpowiada prędkości w głównym nurcie wynoszącej ~1 mm/s w najmniejszych mikrokanałach, co przy zastosowaniu pełnej krwi odpowiada naprężeniu ścinającemu na ściankach o wartości ~1 dyne/cm2 w tych kanałach.</li>
 <li>Używając tej samej pompy strzykawkowej i długiej rurki, perfundować świeżą pożywkę wzrostową przez 2-8 dni z natężeniem 1,23 μl/min. W sprawnie działającym urządzeniu warstwa pojedyncza komórek śródbłonka powinna wyrosnąć na wewnętrznej powierzchni urządzenia w ciągu 24-48 godzin. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że konfluentne warstwy pojedyncze odpowiednio eksponują VE-cadherin w złączach międzykomórkowych w całym urządzeniu14.</li>
 <li>Wstrzyknąć krew lub zawiesinę komórkową do systemu w celu przeprowadzenia eksperymentów.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Zgodnie z tym protokołem, standardowe techniki litograficznego mikrowytwarzania są wykorzystywane do stworzenia formy niezbędnej do produkcji kanałów mikroprzepływowych, które fizjologicznie naśladują skalę rozmiarów mikrokrążenia (Ryc. 1A). Dzięki zastosowaniu zoptymalizowanej techniki perfuzji, komórki śródbłonka zasiedlają i tworzą konfluentną kulturę na całej wewnętrznej powierzchni systemu mikroprzepływowego w ciągu 24-48 godzin od wysiania komórek (Ryc. 1B). Ponieważ system mikroprzepływowy jest przezroczysty, całe mikrourządzenie można umieścić na stole mikroskopu w świetle przechodzącym/fluorescencyjnym w celu obrazowania i gromadzenia danych.
Nasz system można następnie zastosować do badania chorób hematologicznych związanych ze zmienionymi właściwościami biofizycznymi, takich jak anemia sierpowata, w której zwiększona sztywność sierpowatych erytrocytów oraz zaburzona adhezja leukocytów i komórek śródbłonka przyczyniają się do niedrożności mikronaczyniowej. Hydroksymocznik, lek zatwierdzony klinicznie, łagodzi objawy, jednak jego bezpośredni wpływ na przepływ mikronaczyniowy pozostaje nieznany. Nasz test uwzględnia zarówno sztywność komórek, jak i adhezję, wykazując, że hydroksymocznik znacząco poprawia przepływ w anemii sierpowatej (Rysunek 2).
Anemia sierpowata jest tylko jednym z przykładów zastosowania układu mikrokrążenia na chipie (microvasculature-on-a-chip), ponieważ system ten jest idealnie dostosowany do badania wszelkich procesów hematologicznych, w których komórki krwi oddziałują ze sobą oraz z komórkami śródbłonka w mikrokrążeniu. Inne istotne klinicznie zastosowania obejmują schorzenia zapalne, sepsę/uszkodzenie płuc, mikroangiopatie zakrzepowe, malarię oraz przerzuty nowotworowe, natomiast zastosowania bardziej podstawowe obejmują m.in. biologię leukocytów i biologię hematopoetycznych komórek macierzystych.
<img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig1.jpg" alt="Eksperyment z wykorzystaniem chipa mikrofluidycznego; A: urządzenie z złączami; B: powiększony widok kanału, skala 30 μm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. A) początkowe urządzenie mikrofluidyczne z PDMS przed endotelializacją. W tym przypadku do mikrourządzenia wstrzyknięto barwnik spożywczy, aby zilustrować skalę rozmiarów i ogólną konstrukcję systemu. B) Mikroskopia w polu jasnym pokazuje, że system mikrofluidyczny został całkowicie endotelializowany w ciągu 48 godzin od wysiania komórek zgodnie z opisanym tutaj protokołem.
<img src="/files/ftp_upload/3958/3958fig2.jpg" alt="Schemat urządzenia mikroprzepływowego do hodowli komórek z obrazowaniem fluorescencyjnym i w skali szarości; obserwacja komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. A) Urządzenie mikroprzepływowe do modelowania mikrokrążenia (microvasculature-on-a-chip) z mikrokanałami o rozmiarach zbliżonych do żylek poprzystaczkowych (30 μm), które są miejscem większości incydentów zatorowości mikro naczyniowej w anemii sierpowatej. Krew pełna od pacjentów z anemią sierpowatą przyjmujących hydroksymocznik oraz od pacjentów nieprzyjmujących hydroksymoczniku jest przepuszczana przez dwa różne urządzenia typu microvasculature-on-a-chip. B) Krew pełna od pacjentów z anemią sierpowatą przyjmujących hydroksymoczniki przepływa z relatywną łatwością w obrębie endotelializowanych mikrokanałów. C) W tych samych warunkach hemodynamicznych krew pełna od pacjentów z anemią sierpowatą nieprzyjmujących hydroksymoczniku wykazuje znacznie wolniejszy przepływ z obturacją mikrokanałów. Dolny kanał jest całkowicie zablokowany, bez przepływu, a prędkości przepływu w pozostałych endotelializowanych mikrokanałach są znacznie niższe niż w przypadku stosowania hydroksymoczniku. Pasek skali na wszystkich trzech obrazach wynosi 30 μm.

<ol><li>Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Level+of+Laboratory+Testing+Required+for+Diagnosis+or+Exclusion+of+a+Platelet+Function+Disorder+Using+Platelet+Aggregation+and+Secretion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays.</a> Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).</li>
<li>Young, E. W. K., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microfluidic+cell+culture+in+controlled+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments.</a> Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).</li>
<li>Young, E. W. K., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macro-+microscale+fluid+flow+systems+for+endothelial+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology.</a> Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).</li>
<li>Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+vasoocclusion+and+rescue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).</li>
<li>Rosano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Technology+in+Vascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Technology in Vascular Research.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+nature+of+extracellular+ATP+as+a+concentration-dependent+platelet+P2X1+agonist+and+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist.</a> Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).</li>
<li>Kotz, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+microfluidics+for+neutrophil+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics.</a> Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).</li>
<li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).</li>
<li>Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+model+for+single-cell+capillary+obstruction+by+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).</li>
<li>Borenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+endothelialized+microvascular+networks+with+circular+cross-sections+in+a+tissue+culture+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate.</a> Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).</li>
<li>Nesbitt, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat. Med. 15, 665-673 (2009).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolytic+uraemic+syndrome%3A+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Nasz system mikro urządzeń z endotelizacją najlepiej sprawdza się w połączeniu z eksperymentami in vivo, a jego redukcjonistyczne podejście może pomóc w wyjaśnieniu biofizycznych mechanizmów procesów hematologicznych obserwowanych u ludzi i w modelach zwierzęcych. Co więcej, nasz system nie jest pozbawiony ograniczeń. Na przykład nasze kanały mikrofluidyczne mają kwadratowy przekrój poprzeczny. Choć technicznie możliwe jest wytworzenie okrągłych mikrokanałów10,11, zdecydowaliśmy się na zastosowanie pr...

<table><tbody><tr><td>igła tępokrawędziowa</td><td>OK International</td><td>920050-TE</td><td>Precision TE needle 20 Gauge x 1/2&quot;, różowa</td></tr><tr><td>dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz (uchwyt precyzyjny)</td><td>Technical Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka pępowiny (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczacz plazmowy</td><td>Plasma</td><td>PDC-326</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Zestaw elastomeru silikonowego Sylgard 184</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>Microchem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Developer SU-8</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3008</td><td>PHD-ULTRA</td></tr><tr><td>przewód (większy)</td><td>Cole-Parmer Instrument Company</td><td>06418-02</td><td>Przewód mikrobore Tygonreg, 0,020&quot; ID x 0,060&quot; OD</td></tr><tr><td>przewód (mniejszy)</td><td>Cole-Parmer Instrument Company</td><td>06417-11</td><td>Przewód mikrobore PTFE, 0,012&quot; ID x 0,030&quot; OD</td></tr></tbody></table>

endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Postępy w technikach mikrowytwarzania umożliwiły produkcję tanich i powtarzalnych systemów mikrofluidycznych do przeprowadzania eksperymentów biologicznych i biochemicznych w skalach mikro- i nanometrycznych 1,2. Ponadto mikrofluidyka była specjalnie wykorzystywana do ilościowej analizy procesów hematologicznych i mikronaczyniowych ze względu na możliwość łatwego kontrolowania dynamicznego środowiska płynowego i warunków biologicznych3-6. W związku z tym badacze w ostatnim czasie wykorzystywali systemy mikrofluidyczne do badania deformowalności komórek krwi, agregacji komórek krwi, przepływu krwi w mikronaczyniach oraz oddziaływań między komórkami krwi a komórkami śródbłonka6-13. Jednakże systemy mikrofluidyczne te albo nie zawierały hodowanych komórek śródbłonka, albo były większe niż skala rozmiarów istotna dla patologicznych procesów mikronaczyniowych. Aby pogłębić naszą wiedzę na temat podstaw biofizycznej patofizjologii chorób hematologicznych obejmujących mikronaczynia, niezbędna jest platforma mikrofluidyczna z hodowanymi komórkami śródbłonka, która dokładnie odwzorowuje środowisko komórkowe, fizyczne i hemodynamiczne mikrokrążenia.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę tworzenia „uendotelyzowanego” modelu mikrokrążenia in vitro, z wykorzystaniem prostego procesu mikrowytwarzania z jedną maską w połączeniu ze standardowymi technikami hodowli komórek śródbłonka, w celu badania patologicznych biofizycznych oddziaływań mikro naczyniowych występujących w chorobach hematologicznych. Ten „układ mikrokrążenia na chipie” dostarcza badaczowi niezawodnego testu, który ściśle kontroluje warunki biologiczne i biofizyczne, a jego obsługa odbywa się przy użyciu standardowej pompy strzykawkowej oraz mikroskopii w świetle przechodzącym i fluorescencyjnej. Parametry takie jak hemodynamiczne warunki mikrokrążenia, typ komórek śródbłonka, typ(y) i stężenie(ia) komórek krwi, stężenie leku/inhibitora itp., mogą być łatwo kontrolowane. W ten sposób nasz mikrosystem zapewnia metodę ilościowego badania procesów chorobowych, w których przepływ mikro naczyniowy jest upośledzony z powodu zmian w adhezji, agregacji i odkształcalności komórek, co stanowi funkcjonalność niedostępną w istniejących testach.

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Postępy w technikach mikrowytwarzania umożliwiły produkcję tanich i powtarzalnych systemów mikroprzepływowych do prowadzenia badań biologicznych i...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie urządzenia mikrofluidycznego pokrytego komórkami śródbłonka. Jest to realizowane poprzez najpierw wykonanie formy mikrofluidycznej. Drugim krokiem jest stworzenie kanału z PDMS.Następnie komórki śródbłonka są wysiewane do urządzenia. Ostatnim krokiem jest hodowla komórek wewnątrz urządzenia. W końcowym etapie urządzenia mikroprzepływowe pokryte komórkami śródbłonka są wykorzystywane do wykazania oddziaływań międzykomórkowych in vitro.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest zapewnienie badaczowi ścisłej kontroli nad warunkami biologicznymi i biofizycznymi oraz kompatybilność z mikroskopią fluorescencyjną. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat biofizycznych oddziaływań międzykomórkowych w chorobach hematologicznych, można ją również zastosować do badania zjawisk takich jak biologia leukocytów, przerzuty nowotworowe oraz biologia hematopoetycznych komórek macierzystych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ w celu skutecznego osadzenia komórek konieczne jest rygorystyczne kontrolowanie warunków.W ramach przygotowań do procesu wytwarzania stworzono maskę fotolitograficzną, przesyłając obraz projektu urządzenia mikroprzepływowego wykonany w programie wspomagania projektowania (CAD) do zewnętrznego dostawcy masek. Otrzymana maska składa się z warstwy chromu na szkle sodowo-wapniowym. W tym przypadku szerokość kanału mikroprzepływowego wynosi 30 µm.Aby rozpocząć wykonanie urządzenia mikroprzepływowego, należy oczyścić czysty wafelek krzemowy roztworem pirania przez 15 minut, a następnie przepłukać go wodą dejonizowaną przez 10 sekund. Następnie wafelek krzemowy zanurza się w kwasie fluorowodorowym na 30 sekund i płucze wodą dejonizowaną przez około 10 sekund. W kolejnym kroku, przy użyciu powlekarki wirówkowej, nanosi się na wafelek fotorezyst micro chem SU 8 20 25, aby uzyskać warstwę o grubości 30 mikronów, stosując prędkość wirowania 3000 obrotów na minutę.Umieść podłoże pokryte SU 8 20 25 na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C przez pięć minut, aby odparować nadmiar rozpuszczalnika. Na tym etapie nie zaleca się stosowania pieca. Następnie nałóż maskę fotolitograficzną na podłoże i naświetl promieniowaniem UV w wyrównywaczu masek (mask liner), aby doprowadzić do sieciowania fotorezystu SU 8 20 25.Po sieciowaniu umieść podłoże ponownie na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez dodatkowe pięć minut, aby dalej przyspieszyć polimeryzację fotorezystu SU 8 20 25. Następnie zanurz podłoże w wywoływaczu SU 8, składającym się głównie z PGMEA, na cztery minuty.Działanie to usunie niesieciowany fotorezyst SU 8 20 25. Przepłucz nowo wywołany wafelek 100% izopropanolu przez 10 sekund, a następnie osusz go za pomocą sprężonego azotu lub pozostawiając rozpuszczalnik do odparowania z wafla w czystej dygestorium przez kilka minut. Teraz przymocuj wysuszony wafelek taśmą do środka szalki Petriego, uważając, aby taśmę umieścić na krawędziach wafla.Na koniec nanieś pipetą 500 µL sigma coat na wafelek. Przykryj szalkę Petriego pokrywką, a następnie zakręć szalką, aby zapewnić całkowite pokrycie wafelka. Zdejmij pokrywkę i pozostaw wafelek do wyschnięcia na kilka minut, aż cały rozpuszczalnik odparuje.Po zmieszaniu polimeru PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, usuń pęcherzyki powietrza za pomocą desykatora próżniowego przez kilka minut do jednej godziny, w zależności od mocy dostępnego systemu próżniowego. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza wlej mieszaninę do naczynia w taki sposób, aby pokryła ona wafer i powierzchnię naczynia. Pozwoli to na utworzenie warstwy PDMS o grubości około 5 mm.Należy również przygotować cienki, gładki fragment PDMS o grubości 1 mm. Następnie mieszaninę utwardza się w piekarniku w temperaturze 60 °C przez noc. Następnego dnia, używając noża lub skalpela, należy wyciąć obszar wokół wafla i wyjąć kilka mikroprzepływowych urządzeń z PDMS.Następnie dotnij arkusz, aby wyizolować poszczególne urządzenia. Dotnij arkusz PDMS tak, aby był nieco większy niż urządzenie mikroprzepływowe. Teraz użyj wiertarki ręcznej Harris unicorn lub podobnego narzędzia, aby wykonać otwory wlotowe i wylotowe w urządzeniu mikroprzepływowym.Następnie oczyść powierzchnie urządzenia mikroprzepływowego oraz arkusza za pomocą taśmy klejącej. Potem użyj urządzenia do plazmowania, aby poddać powierzchnie urządzenia mikroprzepływowego i arkusza PDMS działaniu plazmy tlenowej przez 30 seconds. Plazma tlenowa tworzy reaktywne formy chemiczne na odsłoniętej powierzchni PDMS, które wiążą się podczas bezpośredniego kontaktu fizycznego.Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml, wyposażoną w stępioną igłę o rozmiarze 20 G, roztworem fibronektyny z ludzkiej osocza w PBS o stężeniu 50 µg/ml, a następnie nałożyć odcinek rurki na igłę. Do pierwszej rurki należy wsunąć odcinek rurki o mniejszej średnicy, aby uzyskać ciasne dopasowanie obu elementów.Następnie przymocuj drugi koniec cieńszej rurki do wlotu urządzenia mikrofluidycznego. Wywrzyj nacisk na strzykawkę, aby całkowicie wypełnić kanały roztworem fibronektyny i utworzyć małą kroplę o objętości 100 µL w porcie wylotowym, co zapewni utrzymanie wilgotności kanałów. Teraz inkubuj urządzenie mikrofluidyczne w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C przez 40 do 60 minut.Po inkubacji podłącz nową strzykawkę wypełnioną PBS do tępej igły. Wywieraj nacisk, aby przepłukać urządzenie mikroprzepływowe PBS. Przygotuj zawiesinę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (hve) w stężeniu od 500 000 do 2 milionów komórek na mililitr w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka z dodatkiem 8% dekstranu.Dodatek dekstranu zwiększa prawdopodobieństwo, że komórki przylgną i będą pomyślnie hodowane w urządzeniu mikroprzepływowym. Należy napełnić czystą strzykawkę wyposażoną w igłę tępą i szerszą rurkę zawiesiną komórkową, a następnie podłączyć dłuższy odcinek rurki o długości około jednego metra. Kluczowe jest zapewnienie szczelnego dopasowania rurek, aby wyeliminować wycieki na wszystkich połączeniach.Wypełnij przewody roztworem komórkowym, upewniając się, że w strzykawce oraz we wszystkich przewodach nie ma pęcherzyków powietrza, aby zoptymalizować działanie systemu. Na tym etapie kluczowe jest zapobieganie wszelkim wyciekom oraz przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do systemu. Jakikolwiek wyciek roztworu lub obecność pęcherzyków w medium uniemożliwi prawidłowe osadzenie się komórek śródbłonka.Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza i przepłukaniu całego odcinka rurki zawiesiną komórkową, należy umieścić strzykawkę w pompie, a drugi koniec rurki podłączyć do wlotu układu mikroprzepływowego. Pompa strzykawkowa powinna znajdować się na tej samej wysokości co urządzenie mikroprzepływowe. Długi odcinek rurki należy starannie zwinąć wewnątrz inkubatora, aby zapewnić odpowiednie ogrzanie komórek i pożywki przed ich kontaktem z urządzeniem.Następnie zawiesinę komórkową wprowadza się do urządzenia mikrofluidycznego z objętościowym natężeniem przepływu 1,23 µL/min przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w naszym systemie. Objętościowe natężenie przepływu 1,23 µL/min odpowiada prędkości wewnątrzkanałowej 1 mm/s w najwęższych kanałach. W przypadku użycia krwi pełnej odpowiada to przybliżonemu naprężeniu ścinającemu przy ściankach wynoszącemu 1 dyn/cm² w tych kanałach.Po zakończeniu infuzji zawiesiny komórek, należy użyć tej samej pompy strzykawkowej i długiego przewodu z większą strzykawką, aby przez okres od dwóch do ośmiu dni podawać świeżą pożywkę wzrostową z prędkością 1,23 µL/min. Gdy monowarstwa komórek osiągnie pożądany stopień konfluencji, do układu wstrzykuje się krew lub zawiesinę komórek w celu przeprowadzenia eksperymentu. Tutaj przedstawiono urządzenie mikrofluidyczne przed endotelizacją.Urządzenie mikrofluidyczne zostało wypełnione barwnikiem spożywczym, aby zilustrować rozmiar, skalę i ogólny projekt urządzenia imitującego fizjologię naczyń krwionośnych. Mikroskopia w polu jasnym wykazuje endotelizację urządzenia mikrofluidycznego. Obraz ten został uzyskany mniej niż 48 godzin po zasiewie zgodnie z opisanym protokołem; zoptymalizowana technika perfuzji pozwala komórkom śródbłonka na stworzenie konfluentnej hodowli na całej wewnętrznej powierzchni systemu mikrofluidycznego.W ciągu 24 do 48 godzin od wysiania komórek. Jak pokazano na tym obrazie konfokalnym, guź mikro naczyniowy na chipie z mikrokanałami przybliża 30 mikronową wielkość naczyń pocapilarnych, które są miejscem większości zdarzeń zatorowych w mikrokrążeniu w anemii sierpowatej. W tym eksperymencie krew pełna od zdrowych pacjentów jest infundowana do urządzenia z mikro naczyniami na chipie w warunkach beztlenowych.Film ten pokazuje, że przepływ krwi pełnej w naszym endotelialnym systemie mikrofluidycznym jest regularny, łagodny i ciągły, bez obszarów niedrożności mikrokanałów. W tym przypadku krew pełna pobrana od pacjentów z anemią sierpowatą jest infundowana do urządzenia z mikro naczyniami na chipie. W warunkach odtlenowania obserwuje się znaczące zmiany w przepływie krwi, z występowaniem całkowitych okluzji w kilku kanałach.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas wymiany przewodów. Gotowe urządzenie jest kompatybilne z mikroskopią fluorescencyjną i może zostać dostosowane do tradycyjnych testów fluorescencyjnych. Technika ta otwiera drogę hematologom eksperymentalnym do prowadzenia badań na pojedynczych komórkach w kontrolowanym środowisku biofizycznym i hemodynamicznym.Bez pęcherzyków powietrza.

endothelialized-microfluidics-for-studying-microvascular-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Endotelializowana mikrofluidyka do badania interakcji mikrokrążenia w chorobach hematologicznych

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.

System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii

Poznaj metodę mikrofluidyki śródbłonkowej do badania interakcji komórkowych w chorobach hematologicznych. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę warunków biologicznych i fizycznych w modelu in vitro.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Przeglądaj więcej filmów