Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie urządzenia mikrofluidycznego pokrytego komórkami śródbłonka. Osiąga się to poprzez najpierw wykonanie formy mikrofluidycznej. Drugim krokiem jest utworzenie kanału z PDMS.

Następnie komórki śródbłonka są wysiewane do urządzenia. Ostatnim krokiem jest hodowla komórek wewnątrz urządzenia. W rezultacie urządzenia mikroprzepływowe pokryte komórkami śródbłonka są wykorzystywane do wykazania oddziaływań międzykomórkowych in vitro.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest zapewnienie badaczowi ścisłej kontroli nad warunkami biologicznymi i biofizycznymi oraz kompatybilność z mikroskopią fluorescencyjną. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat biofizycznych oddziaływań międzykomórkowych w chorobach hematologicznych, można ją również zastosować do badania takich zjawisk jak biologia leukocytów, przerzuty nowotworowe oraz biologia hematopoetycznych komórek macierzystych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ warunki muszą być ściśle kontrolowane, aby zapewnić prawidłowe osadzanie się komórek.

W ramach przygotowania do procesu wytwarzania wykonano maskę fotolitograficzną, przekazując obraz projektu urządzenia mikrofluidycznego wykonany w programie CAD zewnętrznemu dostawcy masek. Otrzymana maska składa się z warstwy chromu na szkle sodowo-wapiennym. W tym przypadku szerokość kanału mikrofluidycznego wynosi 30 mikronów.

Aby rozpocząć wykonanie urządzenia mikroprzepływowego, należy oczyścić gołą płytkę krzemową za pomocą roztworu pirania przez 15 minut, a następnie opłukać wodą dejonizowaną przez 10 sekund. Następnie zanurz płytkę krzemową w kwasie fluorowodorowym na 30 sekund i opłucz wodą dejonizowaną przez około 10 sekund. W kolejnym kroku, używając nanoszenia wirówkowego, nanieś fotorezyst micro chem SU 8 20 25 na płytkę, aby uzyskać grubość 30 mikronów, stosując prędkość wirowania 3000 obr./min.

Umieść podłoże pokryte SU 8 20 25 na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C na pięć minut, aby odparować nadmiar rozpuszczalnika. Na tym etapie nie zaleca się stosowania pieca. Następnie nałóż maskę fotolitograficzną na podłoże i naświetl je światłem UV w naświetlarce, aby przeprowadzić sieciowanie fotorezystu SU 8 20 25.

Po sieciowaniu ponownie umieść wafelek na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez dodatkowe pięć minut, aby dodatkowo przyspieszyć polimeryzację fotorezystu SU 8 20 25. Następnie zanurz wafelek w wywoływaczu SU 8, który składa się głównie z P-G-M-E-A, na cztery minuty.

Działanie to usunie nieusieciowany fotorezyst SU 8 20 25. Przepłucz nowo wywołany wafelek 100% izopropanolowym alkoholem przez 10 sekund, a następnie osusz go za pomocą sprężonego azotu lub pozostawiając rozpuszczalnik do odparowania z wafla w czystej dygestorze przez kilka minut. Teraz przyklej wysuszony wafelek taśmą do środka szalki Petriego, dbając o to, aby taśma znajdowała się na krawędziach wafla.

Na koniec nanieś pipetą 500 µL sigma coat na wafer. Przykryj płytkę Petriego pokrywką, a następnie zakręć płytką, aby zapewnić całkowite pokrycie wafera. Zdejmij pokrywkę i pozostaw wafer do wyschnięcia przez kilka minut, aż cały rozpuszczalnik odparuje.

Po wymieszaniu polimeru PDMS i utwardzacza w stosunku wagowym 10:1, usuń pęcherzyki powietrza za pomocą desykatora próżniowego przez kilka minut do jednej godziny, w zależności od mocy dostępnego systemu próżniowego. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza wlej mieszaninę do naczynia tak, aby pokryła ona wafer oraz powierzchnię naczynia. Pozwoli to na utworzenie warstwy PDMS o grubości około 5 mm.

Należy również przygotować cienki, jednorodny fragment PDMS o grubości jednego milimetra. Następnie mieszaninę utwardzono w piecu w temperaturze 60 °C przez noc. Następnego dnia, za pomocą noża lub skalpela, wycięto obszar wokół wafla i wyjęto wiele mikroprzepływowych urządzeń PDMS.

Następnie przetnij arkusz, aby wyizolować poszczególne urządzenia. Przetnij arkusz PDMS tak, aby był nieco większy niż urządzenie mikroprzepływowe. Teraz użyj wkrętaka precyzyjnego Harris unicorn lub podobnego urządzenia, aby wykonać otwory wlotowe i wylotowe w urządzeniu mikroprzepływowym.

Następnie oczyść powierzchnie urządzenia mikrofluidycznego oraz arkusza za pomocą taśmy klejącej. Potem użyj oczyszczacza plazmowego, aby poddać powierzchnie urządzenia mikrofluidycznego i arkusza PDMS działaniu plazmy tlenowej przez 30 sekund. Plazma tlenowa tworzy na odsłoniętej powierzchni PDMS gatunki reaktywne, które tworzą wiązania po doprowadzeniu do fizycznego kontaktu.

Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml, wyposażoną w igłę tępą o rozmiarze 20 G, roztworem fibronektyny z ludzkiej plazmy w PBS o stężeniu 50 µg/ml, a następnie nałożyć na igłę odcinek drenu. Do pierwszego odcinka drenu należy wprowadzić cieńszą rurkę, aby uzyskać dopasowanie na wcisk pomiędzy oboma elementami.

Następnie podłącz drugi koniec cieńszego odcinka rurki do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Wywieraj nacisk na strzykawkę, aby całkowicie wypełnić kanały roztworem fibronektyny i utworzyć małą kroplę o objętości 100 µL przy porcie wylotowym, co zapewni utrzymanie wilgotności kanałów. Teraz inkubuj urządzenie mikroprzepływowe w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 40 do 60 minut.

Po inkubacji podłącz nową strzykawkę wypełnioną PBS do igły o tępym zakończeniu. Wywierając nacisk, przepłucz urządzenie mikrofluidyczne roztworem PBS. Przygotuj zawiesinę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (hve) w stężeniu od 500 000 do 2 milionów komórek na mililitr w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka z dodatkiem 8% dekstranu.

Dodatek dekstranu zwiększa prawdopodobieństwo, że komórki przylgną i będą pomyślnie hodowane w urządzeniu mikrofluidycznym. Napełnić czystą strzykawkę wyposażoną w igłę tępą i szerszą rurkę zawiesiną komórkową, a następnie podłączyć dłuższy odcinek rurki o długości około jednego metra. Kluczowe jest zapewnienie szczelnego dopasowania rurek, aby wyeliminować wycieki w miejscach połączeń.

Wypełnij przewody roztworem z komórkami, upewniając się, że w strzykawce oraz w żadnym z przewodów nie ma pęcherzyków powietrza, aby zoptymalizować działanie systemu. W tym momencie kluczowe jest zapobieganie wszelkim wyciekom lub przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do układu. Jakikolwiek wyciek roztworu lub obecność pęcherzyków w pożywce uniemożliwi prawidłowe osadzenie się komórek śródbłonka.

Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza i przepłukaniu całego odcinka rurki zawiesiną komórkową, należy umieścić strzykawkę w pompie i podłączyć drugi koniec rurki do wlotu układu mikrofluidycznego. Pompa strzykawkowa powinna znajdować się na tej samej wysokości co urządzenie mikrofluidyczne. Długi odcinek rurki należy ostrożnie zwinąć wewnątrz inkubatora, aby zapewnić odpowiednie ogrzanie komórek i pożywki przed ich kontaktem z urządzeniem.

Następnie zawiesinę komórkową wprowadza się do urządzenia mikroprzepływowego z natężeniem przepływu objętościowego 1,23 µL/min przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2 w naszym systemie. Natężenie przepływu objętościowego 1,23 µL/min odpowiada prędkości w głównym nurcie wynoszącej 1 mm/s w najwęższych kanałach. W przypadku użycia krwi pełnej odpowiada to przybliżonemu naprężeniu ścinającemu przy ściankach wynoszącemu 1 dyn/cm².

Po zakończeniu infuzji zawiesiny komórkowej, przy użyciu tej samej pompy strzykawkowej i długiego przewodu, ale z większą strzykawką, należy przeprowadzić infuzję świeżej pożywki wzrostowej przez okres od dwóch do ośmiu dni z prędkością 1,23 µL/min. Gdy monowarstwa komórek osiągnie pożądany poziom konfluencji, do systemu należy wstrzyknąć krew lub zawiesinę komórkową w celu przeprowadzenia eksperymentu. Tutaj przedstawiono urządzenie mikrofluidyczne przed endotelializacją.

Urządzenie mikrofluidyczne zostało wypełnione barwnikiem spożywczym, aby zilustrować rozmiar, skalę i ogólny projekt urządzenia naśladującego fizjologię naczyń krwionośnych. Mikroskopia w świetle przechodzącym wykazuje endotelizację urządzenia mikrofluidycznego. Obraz ten uzyskano mniej niż 48 godzin po zasiewaniu zgodnie z opisanym protokołem; zoptymalizowana technika perfuzji umożliwia komórkom śródbłonka utworzenie konfluentnej warstwy na całej wewnętrznej powierzchni systemu mikrofluidycznego.

W ciągu 24 do 48 godzin od wysiania komórek. Jak pokazano na tym obrazie konfokalnym, guź mikro naczyniowy na chipie z mikrokanałami przybliża rozmiar 30 mikronów naczyń pokapilarnych, które są miejscem większości zdarzeń zatorowych w mikrokrążeniu przy anemii sierpowatej. W tym eksperymencie krew pełna od zdrowych pacjentów jest infundowana do urządzenia z mikro naczyniami na chipie w warunkach odtlenowania.

Film ten pokazuje, że przepływ krwi pełnej w naszym śródbłonkowym systemie mikroprzepływowym jest regularny, łagodny i ciągły, bez obszarów niedrożności mikrokanałów. W tym przypadku krew pełna od pacjentów z anemią sierpowatą jest wprowadzana do urządzenia w postaci mikrovasculature na chipie. W warunkach odtlenienia obserwuje się znaczące zmiany w przepływie krwi, z występowaniem całkowitych okluzji w kilku kanałach.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas wymiany przewodów. Gotowe urządzenie jest kompatybilne z mikroskopią fluorescencyjną i może zostać dostosowane do tradycyjnych analiz fluorescencyjnych. Technika ta otwiera drogę hematologom eksperymentalnym do przeprowadzania badań na pojedynczych komórkach w kontrolowanym środowisku biofizycznym i hemodynamicznym.

Bez pęcherzyków powietrza.