Name: Cyfrowe obrazowanie w czasie rzeczywistym interakcji leukocytów-śródbłonka w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym (IRI) mięśnia Cremaster szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Poznaj metodę cyfrowej mikroskopii wewnątrznaczyniowej do obserwacji interakcji leukocytów z śródbłonkiem w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym mięśnia Cremaster szczura. Protokół umożliwia analizę mechanizmów zapalnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana z grantu „Deutsche Forschungsgemeinschaft” przyznanego S.U. Eisenhardt (EI 866/1-1).

<ol><li>Cetin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+fucoidin+%28a+neutrophil+rolling+inhibitor%29+on+ischemia+reperfusion+injury%3A+experimental+study+in+rat+epigastric+island+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps.</a> Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+xanthine+oxidase+and+granulocytes+in+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury.</a> Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).</li>
<li>Lazarus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+ischaemia-reperfusion+injury+in+murine+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle.</a> J Pathol. 191, 443-448 (2000).</li>
<li>van den Heuvel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Ischaemia-reperfusion+injury+in+flap+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plast.+Reconstr.+Aesthet.+Surg%22%5BJournal%5D)">Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery.</a> J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).</li>
<li>Rosen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+lectins+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cell surface lectins in the immune system.</a> Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).</li>
<li>van der Flier, A., Sonnenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+interactions+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Function and interactions of integrins.</a> Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).</li>
<li>Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+adhesion%3A+avenues+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Sutton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+of+the+renal+microvascular+endothelium+alters+barrier+function+after+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia.</a> Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).</li>
<li>Serracino-Inglott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nitric+oxide+synthase+expression+during+hepatic+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion.</a> Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).</li>
<li>Eppinger, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+ischemia-reperfusion+injury+of+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung.</a> Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).</li>
<li>Dumont, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+apoptotic+cell-membrane+changes+at+the+single-cell+level+in+the+beating+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart.</a> Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Woeste, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octreotide+attenuates+impaired+microcirculation+in+postischemic+pancreatitis+when+administered+before+induction+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia.</a> Transplantation. 86, 961-967 (2008).</li>
<li>Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+mimics+the+cardioprotective+effect+of+ischemic+preconditioning+via+a+glibenclamide-sensitive+mechanism+in+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart.</a> Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).</li>
<li>Dobschuetz, E. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+intravital+fluorescence+microscopy--a+novel+method+for+the+assessment+of+microvascular+permeability+in+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic intravital fluorescence microscopy--a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis.</a> Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).</li>
<li>Vutskits, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+methylene+blue+on+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of methylene blue on the central nervous system.</a> Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).</li>
<li>Takasu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+time+with+combined+early+blood+transfusion+and+fluid+administration+in+uncontrolled+hemorrhagic+shock+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma%22%5BJournal%5D)">Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats.</a> J. Trauma. 8, 312-316 (2010).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Cremaster+Muscle+Preparation+for+Intravital+Imaging+of+the+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2874(2011).</li>
<li>Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postischemic+inflammation%3A+a+role+for+mast+cells+in+intestine+but+not+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle.</a> Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).</li>
<li>Leoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflamed+phenotype+of+the+mesenteric+microcirculation+of+melanocortin+type+3+receptor-null+mice+after+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion.</a> FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).</li>
<li>Simoncini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+oestrogen+receptor+with+the+regulatory+subunit+of+phosphatidylinositol-3-OH+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase.</a> Nature. 407, 538-541 (2000).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Mori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+induced+microvascular+responses+in+LDL-receptor+-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice.</a> Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Molecular+Changes+Induced+by+Ischemia%2FReperfusion+in+Human+Free+Muscle+Flap+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plast.+Surg%22%5BJournal%5D)">Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples.</a> Ann. Plast. Surg. , (2011).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+activation-specific+human+anti-%7Balpha%7DM%7Bbeta%7D2+single-chain+antibodies+as+potential+diagnostic+tools+and+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents.</a> Blood. 109, 3521-3528 (2007).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+pentameric+to+monomeric+C-reactive+protein+on+activated+platelets+localizes+inflammation+to+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques.</a> Circ Res. 105, 128-137 (2009).</li>
<li>Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-reactive+protein%3A+how+conformational+changes+influence+inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties.</a> Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).</li>
<li>Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGranger%2C+DN+%22Physiology+and+pathophysiology+of+leukocyte+adhesion%22">Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion</a>. , Oxford University Press. New York. 520(1995).</li>
<li>Baatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+white+blood+cell+staining+by+intravascular+administration+of+rhodamine+6G%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Microcirc.+Clin.+Exp%22%5BJournal%5D)">Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G.</a> Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).</li>
<li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
<li>Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorescent+dyes+on+selectin+and+integrin-mediated+stages+of+adhesion+and+migration+of+flowing+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes.</a> J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Oddziaływanie leukocytów z śródbłonkiem, produkcja reaktywnych form tlenu oraz aktywacja układu dopełniacza są kluczowymi cechami dysfunkcji tkanek wywołanej przez IRI.26 Mikrokrążenie dotkniętej tkanki jest uważane za główną lokalizację inicjacji stanu zapalnego. Poza eksperymentami ex vivo, takimi jak testy w komorach przepływowych27, 28, niezbędne jest zapewnienie dobrze ugruntowanych modeli obrazowania intravitalnego w celu dalszej oceny istotności in vivo. Choć IRI jest powiąz...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa sprzętu:&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Firma:&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Nr katalogowy:&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Uwagi:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Forene 100% (V/V)</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td>izofluran API</td></tr><tr><td>Szew terylenowy</td><td>Serag Weissner</td><td>OC108000</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenowa rurka o małej średnicy Portex</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/100</td><td>średnica wewnętrzna 0,28 mm</td></tr><tr><td>0,9% roztwór soli fizjologicznej</td><td>Fresinus Kabi</td><td>808771</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kauteryzacji Change-A-tip deluxe</td><td>Bovie Medical</td><td>DEL1</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula Abbocath -T 14G</td><td>Venisystems</td><td>G713 - A01</td><td>używana jako rurka soczewkowa</td></tr><tr><td>Wentylator Servo 900C</td><td>Maquet</td><td></td><td>używany jako respirator dla zwierząt</td></tr><tr><td>Logiczny przetwornik ciśnienia</td><td>Smiths Medical</td><td>MX1960</td><td></td></tr><tr><td>Monitor Sirecust 404</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analizator blatu ABL 700</td><td>Radiometer</td><td></td><td>do pomiaru gazów krwi</td></tr><tr><td>Mata grzewcza</td><td>Effenberger</td><td>8319</td><td></td></tr><tr><td>Stolik aluminiowy</td><td>Alfun</td><td>AW7022</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny OPMI 6-SDFC</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjny zestaw instrumentów mikrochirurgicznych</td><td>S&amp;amp;T</td><td>767</td><td></td></tr><tr><td>Klamra naczyniowa Biemera</td><td>Diener</td><td>64.562</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do klamer</td><td>Diener</td><td>64.568</td><td>do klamer naczyniowych Biemera</td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina biała DAB</td><td>Winthrop</td><td>2726853</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td></td><td></td><td>32x32 mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Układ intravitalny&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Zeis Axio Scope A-1 MAT</td><td>Carl Zeis</td><td>490036</td><td>mikroskop epifluorescencyjny</td></tr><tr><td>LED 470 nm</td><td>Carl Zeis</td><td>423052</td><td>źródło światła fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>System Colibri 2</td><td>Carl Zeis</td><td>423052</td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC</td><td>Carl Zeis</td><td>421452</td><td>obiektyw z imersją w wodzie</td></tr><tr><td>AxioCam MRm Rev. 3 FireWire</td><td>Carl Zeis</td><td>426509</td><td>cyfrowa kamera wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Axio vision LE</td><td>Carl Zeis</td><td>410130</td><td>do analizy offline</td></tr></tbody></table>

obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (iri) mięśnia kremaster szczura

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) bierze udział w wielu stanach patologicznych, takich jak udar mózgu, zawał mięśnia sercowego, niedokrwienie jelit, a także występuje po przeszczepach i operacjach naczyniowo-sercowych.1 Reperfuzja uprzednio niedokrwionej tkanki, choć jest niezbędna do zapobiegania nieodwracalnym uszkodzeniom tkanek, wywołuje nadmierny stan zapalny w dotkniętym obszarze. Obok produkcji reaktywnych form tlenu, aktywacji układu dopełniacza i zwiększonej przepuszczalności mikro naczyniowej, aktywacja leukocytów jest jednym z głównych czynników w patologicznej kaskadzie zapalnego uszkodzenia tkanek podczas reperfuzji.2, 3 Aktywacja leukocytów jest procesem wieloetapowym, składającym się z toczenia, trwałej adhezji oraz transmigracji, a jest ona mediowana przez złożoną interakcję cząsteczek adhezyjnych w odpowiedzi na chemoatraktanty, takie jak czynniki dopełniacza, chemokiny lub czynnik aktywujący płytki krwi.4
Podczas gdy toczenie się leukocytów w żylkach pocapilarnych jest głównie zapośredniczone przez oddziaływanie selektyn5 z ich przeciwligandami, trwała adhezja leukocytów do śródbłonka jest kontrolowana przez selektyny poprzez wiązanie z cząsteczkami adhezyjnymi międzykomórkowymi (ICAM) oraz cząsteczkami adhezyjnymi komórek naczyniowych (VCAM).6, 7 
Złotym standardem w obserwacji in vivo oddziaływań leukocytów z endotelium jest technika mikroskopii witalnej, opisana po raz pierwszy w 1968 roku.8
Choć opisano różne modele IRI (uszkodzenia niedokrwienno-reperfozyjnego) dla wielu organów, 9-12 tylko kilka z nich nadaje się do bezpośredniej wizualizacji rekrutacji leukocytów w łożysku mikronaczyniowym przy wysokiej jakości obrazowania.8 
W niniejszej pracy promujemy cyfrową intravitalną mikroskopię epifluorescencyjną żyłcek pomostkowych w mikrokrążeniu mięśnia kremaster szczura 13 jako wygodną metodę jakościowej i ilościowej analizy rekrutacji leukocytów w badaniach nad niedokrwienno-reperfuzją (IRI) w tkance mięśni poprzecznie prążkowanej, a także przedstawiamy szczegółowy instruktaż wykonania tej techniki. Ponadto ilustrujemy częste błędy i podajemy przydatne wskazówki, które pozwolą czytelnikowi w pełni zrozumieć i bezpiecznie przeprowadzić tę metodę.
W protokole krok po kroku przedstawiamy sposób rozpoczęcia znieczulenia kontrolowanego przez oddychanie przy zastosowaniu odpowiedniego monitorowania, aby utrzymać zwierzę w stanie głębokiej anestezji przez dłuższy czas. Następnie opisujemy przygotowanie mięśnia żylnego (cremasteric preparation) w formie cienkiego, płaskiego arkusza dla uzyskania doskonałej rozdzielczości optycznej oraz przedstawiamy ugruntowany w naszych laboratoriach protokół obrazowania leukocytów w procesie IRI.

Cyfrowa intravitalna mikroskopia epifluorescencyjna żyłek posutniczych w mikrokrążeniu mięśnia dźwigacza jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w interakcje leukocytowo-śródbłonkowe in vivo w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) prążkowanej tkanki mięśniowej. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół bezpiecznego wykonania tej techniki oraz omawiamy jej zastosowania i ograniczenia.

Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Urazy niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) są zaangażowane w szeroki wachlarz stanów patologicznych, takich jak udar mózgu, zawał mięśnia sercowego, ...

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mięśnia czworogłowowego uda (CRE) jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w procesy niedokrwienia oraz uszkodzenia reperfuzyjnego w tkance mięśni poprzecznie prążkowanej. W protokole krok po kroku przedstawiamy, jak rozpocząć anestezję z kontrolą oddychania przy jednoczesnym odpowiednim monitorowaniu za pomocą kaniulacji tętniczej, aby utrzymać zwierzę w głębokiej narkozie przez dłuższy czas. Ilustrujemy sposób kaniulacji żyły szyjnej, a następnie opisujemy przygotowanie mięśnia CRE w formie cienkiego, płaskiego płata w celu uzyskania doskonałej rozdzielczości optycznej.Przedstawiamy protokół obrazowania leukocytów w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym, który został szczegółowo opracowany w naszych laboratoriach. Model ten może być wykorzystany do analizy mechanizmów aktywacji w badaniach nad urazem niedokrwienno-reperfuzyjnym.Uszkodzenie reperfuzyjne w wyniku niedokrwienia jest zaangażowane w szeroki zakres stanów patologicznych, takich jak zawał mięśnia sercowego, niedokrwienie jelit, a także występuje po transplantacji i operacjach sercowo-naczyniowych. Nadperfuzja wcześniej niedokrwionej tkanki, choć niezbędna do zapobiegania nieodwracalnym uszkodzeniom tkankowym, wywołuje nadmierny stan zapalny dotkniętej tkanki, czemu towarzyszy produkcja reaktywnych form tlenu, aktywacja układu dopełniacza oraz zwiększona przepuszczalność mikro naczyniowa. Aktywacja leukocytów jest jednym z głównych czynników w patologicznej kaskadzie zapalnego uszkodzenia tkanki podczas reperfuzji.W niniejszej pracy promujemy mikroskopię intravitalną opuszek posutylarnych jako wygodną metodę analizy aktywacji leukocytów w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym. Ponadto omawiamy częste błędy i przedstawiamy przydatne wskazówki, które powinny umożliwić czytelnikowi pełne zrozumienie i bezpieczne wykonanie tej metody. Po uzyskaniu zgody komisji etycznej i zBeforeText znieczuleniu samców szczurów o masie ciała od 120 do 180 g, umieszczono szczura w pudełku z pleksiglasu i podano od 2 do 3% objętościowo izofluranu za pomocą waporyzatora izofluranu.Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia szczura należy zważyć i ogolić w okolicy brzusznej szyi. Umieść zwierzę w pozycji grzbietowej na podgrzewaczce, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C, i podawaj izofluran w stężeniu 2% objętościowo przy użyciu maski silikonowej. Kolejne etapy przygotowania najlepiej przeprowadzić przy użyciu mikroskopu chirurgicznego.Wykonaj poziome cięcie skóry o długości dwóch centymetrów w okolicy wcięcia nadmostkowego SRAs. Zmobilizuj ślinianki grudolaki bocznie. Obecnie widoczne są brzuszne mięśnie szyi.Ostrożnie rozdziel je w linii środkowej i odnajdź tchawicę. Odsłoń jeden do dwóch centymetrów tchawicy i za pomocą mikropincety unieś ją od spodu. Następnie, mniej więcej w połowie brzusznej strony tchawicy, wprowadź rurkę o rozmiarze 14 G jako rurkę intubacyjną do dolnej części tchawicy, która została wcześniej podłączona do respiratora dla zwierząt.Następnie można zastosować wentylację z kontrolą objętości przy częstotliwości od 35 do 45 oddechów na minutę. Objętość oddechowa powinna wynosić od 4,5 do 5 ml, a stężenie izofluranu od 1,5 do 2% objętościowo podczas kaniulacji tętnicy szyjnej. Prawy mięsień mostkowo-językowy oddziela się za pomocą tępej dyssekcji.Aby zlokalizować tętnicę szyjną, należy ostrożnie oddzielić nerw błędny od tętnicy szyjnej, a następnie przymocować tętnicę za pomocą mikropincety Anki, aby zatrzymać przepływ krwi z serca. Poniżej tętnicy szyjnej, w odniesieniu do serca, zakłada się dwa szwy: szew dystalny wiąże się ciasno, natomiast szew proksymalny wiąże się luźno wokół tętnicy szyjnej. Zastosowanie drugiego szwu proksymalnego zapobiega krwawieniu po usunięciu mikropincety. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się niewielkie nacięcie tętnicy szyjnej pomiędzy dwiema ligaturami. Następnie wprowadza się wypełniony roztworem soli fizjologicznej cewnik polietylenowy podłączony do przetwornika ciśnienia.Usuń mikropincetę i wprowadź kaniulę głębiej do tętnicy. Przeprowadź okresowe analizy gazometryczne krwi za pomocą analizatora gazów krwi i utrzymuj pH krwi w granicach fizjologicznych podczas dożylnej aplikacji barwników fluorescencyjnych lub innych interesujących leków. Skupiając uwagę na obszarze lewej żyły szyjnej za pomocą mikroskopu chirurgicznego i trzymając pincety w obu dłoniach, rozdziel cienką powięź, aby odsłonić żyłę szyjną.Zamocuj żyłę za pomocą kątowej mikropincety, aby zatrzymać przepływ krwi. Używając pincety, przeprowadź dwa fragmenty szwy o równej długości pod żyłą szyjną w sposób analogiczny do kaniulacji tętnicy szyjnej, wykonaj niewielkie nacięcie w żyle szyjnej i wprowadź cewnik polietylenowy przepłukany roztworem linii komórkowej. Przesuń cewnik w kierunku serca i zaciśnij ligaturę znajdującą się bliżej serca.Wokół żyły i cewnika stosujemy aluminiowy etap czwarty obrazowania ścięgna kremaster, który szybko przyjmuje pożądaną temperaturę podkładki grzewczej. Pierwsze nacięcie wykonuje się w skórze i powięzi sromowej zewnętrznej powyżej moszny w najdalszym punkcie, po czym następuje ostrożne rozszerzenie przestrzeni podskórnej za pomocą nożyczek precyzyjnych. Po odsłonięciu tkanki zostaje ona nawilżona podgrzanym roztworem soli fizjologicznej.Tkanka łączna pomiędzy zewnętrzną powięzią nasienną a mięśniem kremaster zostaje starannie usunięta, aby uwolnić mięśnie kremaster od otaczających tkanek. Ciągła superfuzja podczas sekcji nawadnia tkankę, co ułatwia widoczność i usuwanie, tak jak w przypadku dystalnego końca mięśnia kremaster, aby go unieruchomić i lekko rozciągnąć koniec mięśnia wewnątrz dystalnego końca worka po stronie brzusznej oraz wydłużyć nacięcie proksymalnie. Za pomocą mikronozycyc starannie koaguluje się krwawiące naczynia wzdłuż linii nacięcia.Przy użyciu termicznego koagulatora, otwarty mięsień opuszkowy jądra spoczywa płasko na aluminiowej podstawie, będąc wciąż połączonym cienkimi więzadłami z nadjądrzem pod jądrem, w tym przez małą tętnicę i żyłę. Należy użyć koagulatora do zamknięcia naczyń oraz do przecięcia więzadeł łączących tkankę powięziową z tkanką mięśnia opuszkowego. Delikatnie odsuń wyizolowane jądro z powrotem do kanału pachwinowego.Po wykonaniu pierwszej fiksacji, składającej się z czterech szwów tkanki, i ostrożnym rozłożeniu nici, rozciągnij tkankę mięśnia kremaster radialnie na aluminiowym stole. Umieść dwa końce cewnika polietylenowego blisko tkanki mięśnia kremaster w celu przygotowania układu do superfuzji. Za pomocą strzykawki nanieś wokół mięśnia kremaster linię wazeliny, aby stworzyć komorę płynową.Umieść kwadratową lamellkę nad tkanką i mocno przyciśnij jej krawędzie do linii wazeliny. Tkanka mięśnia kremastra jest teraz gotowa do obrazowania mikroskopowego. Podstawowa konfiguracja badania intravitalnego może się różnić.Do obrazowania laminowania EP wykorzystujemy mikroskop epifluorescencyjny do badań in vivo, wyposażony w źródło światła LED o długości fali 470 nanometrów. Przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego osiągamy powiększenie około 800 x, a obserwacje rejestrujemy za pomocą cyfrowej kamery o wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie epifluorescencyjne powinno być przeprowadzane w ciemni.W celu znakowania leukocytów wstrzyknij rumine six J dożylnie przez cewnik żylny w stężeniu 0,4 mg/kg masy ciała. Wybierz naczynie dopokapilarne do obserwacji. Średnica naczynia powinna wynosić od 20 do 60 µm, a przepływ krwi powinien być wystarczający.Przed wystąpieniem niedokrwienia należy pozostawić tkankę do stabilizacji przez 30 minut. Następnie należy przeprowadzić 30-sekundowy pomiar w celu ustalenia wartości bazowych dla tocznia i adhezji leukocytów. Za pomocą pęsety aplikacyjnej należy delikatnie założyć zacisk naczyniowy Bemer wokół najbardziej proksymalnego końca odsłoniętej tkanki mięśnia kremastra.Zdejmij zacisk naczyniowy po 30 minutach niedokrwienia. Kolejne pomiary można przeprowadzać przez cały okres reperfuzji. W celu ilościowego określenia toczenia się leukocytów wyznacz wirtualną linię przecinającą naczynie pionowo, która będzie jednakowa dla wszystkich zapisów.Ręcznie policz liczbę toczących się leukocytów, które przekroczą linię w ciągu 30 sekund. W celu kwantyfikacji leukocytów przylegających wyznacz stały dla wszystkich pomiarów odcinek naczynia o długości 200 µm.Należy policzyć liczbę wyraźnie widocznych leukocytów, które pozostają w spoczynku przez 30 sekund. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w protokole pisemnym. Chociaż niedokrwienno-reperfuzja jest implikowana w różnych układach narządowych, w niniejszej pracy opisujemy metodę analizy oddziaływań leukocytów z śródbłonkiem podczas urazu reperfuzyjnego w tkance mięśni szkieletowych.W związku z tym ma to szczególne znaczenie dla chirurgii płatów, ponieważ przyjmuje się, że poischemiczne uszkodzenia tkanki innych narządów obejmują te same mechanizmy zapalne. Opisana metoda może zostać wykorzystana do uzyskania podstawowej wiedzy na temat mechanizmów patologicznych w niedokrwiennym uszkodzeniu zrostów. Wywołanie niedokrwienia w mięśniu kremastrze może być łatwo przeprowadzone i idealnie odzwierciedla warunki istotne klinicznie, takie jak operacje wolnych płatów.Ponadto można łatwo zastosować modyfikacje, takie jak niedokrwienie na zimno, niedokrwienie na ciepło lub superfuzję chromosteryczną substancjami wpływającymi na stan zapalny. W przypadku konieczności zastosowania leczenia na kilka godzin lub dni przed rejestracją, metodą z wyboru może być wstrzyknięcie dopodniebienne.

real-time-digital-imaging-leukocyte-endothelial-interaction-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Czynne obrazowanie cyfrowe interakcji leukocytów z endotelem w urazie niedokrwienia-reperfuzji (IRI) mięśnia moszny szczura

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

To badanie demonstruje chirurgiczne przygotowanie mięśnia cremaster szczura do wizualizacji warstwy wolnej od komórek in vivo. W pracy omówiono istotne czynniki wpływające na dokładność pomiaru szerokości warstwy bezkomórkowej.

Wizualizacja i kwantyfikacja warstwy bezkomórkowej w tętniczkach mięśnia Cremaster szczura

Ten protokół opisuje indukcję modelu niedokrwienia-reperfuzji (IR) na skórze ucha myszy za pomocą zaciskania magnesem. Korzystając z niestandardowego modelu obrazowania przyżyciowego, badamy in vivo reakcje zapalne po reperfuzji. Uzasadnieniem dla opracowania tej techniki jest poszerzenie wiedzy na temat tego, w jaki sposób leukocyty reagują na uszkodzenia skóry w podczerwieni.

Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne nerek wiąże się z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością u hospitalizowanych pacjentów. W tym miejscu przedstawiamy prosty i skuteczny mysi model jednostronnego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego nerek i zapewniamy sekwencyjny przegląd reprezentatywnych zmian patologicznych obserwowanych w nerkach.

Skuteczny mysi model jednostronnego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego nerek

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w żyłkach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przepływ krwi w tętnicy krezkowej górnej był ograniczony przez 1 godzinę, po czym nastąpiła reperfuzja, co umożliwiło bezpośrednie ilościowe określenie adhezji leukocytów i NETozy.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Do monitorowania zmian przepływu krwi mikronaczyniowej nerki podczas jednostronnej niedokrwienności nerki po resekcji prawej nerki u myszy zastosowano laserowy system obrazowania z kontrastem plamkowym (plamkowatym).

Perfuzja mikronaczyniowa monitorowana za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym podczas uszkodzenia niedokrwienia nerek i reperfuzji u myszy

Poznaj metodę cyfrowej mikroskopii wewnątrznaczyniowej do obserwacji interakcji leukocytów z śródbłonkiem w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym mięśnia Cremaster szczura. Protokół umożliwia analizę mechanizmów zapalnych w czasie rzeczywistym.

Cyfrowe obrazowanie w czasie rzeczywistym interakcji leukocytów-śródbłonka w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym (IRI) mięśnia Cremaster szczura (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Przeglądaj więcej filmów