Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mięśnia czworogłowowego uda (CRE) jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w procesy niedokrwienia oraz uszkodzenia reperfuzyjnego w tkance mięśni poprzecznie prążkowanej. W protokole krok po kroku przedstawiamy, jak rozpocząć anestezję z kontrolą oddychania przy jednoczesnym odpowiednim monitorowaniu za pomocą kaniulacji tętniczej, aby utrzymać zwierzę w głębokiej narkozie przez dłuższy czas. Ilustrujemy sposób kaniulacji żyły szyjnej, a następnie opisujemy przygotowanie mięśnia CRE w formie cienkiego, płaskiego płata w celu uzyskania doskonałej rozdzielczości optycznej.

Przedstawiamy protokół obrazowania leukocytów w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym, który został szczegółowo opracowany w naszych laboratoriach. Model ten może być wykorzystany do analizy mechanizmów aktywacji w badaniach nad urazem niedokrwienno-reperfuzyjnym.

Uszkodzenie reperfuzyjne w wyniku niedokrwienia jest zaangażowane w szeroki zakres stanów patologicznych, takich jak zawał mięśnia sercowego, niedokrwienie jelit, a także występuje po transplantacji i operacjach sercowo-naczyniowych. Nadperfuzja wcześniej niedokrwionej tkanki, choć niezbędna do zapobiegania nieodwracalnym uszkodzeniom tkankowym, wywołuje nadmierny stan zapalny dotkniętej tkanki, czemu towarzyszy produkcja reaktywnych form tlenu, aktywacja układu dopełniacza oraz zwiększona przepuszczalność mikro naczyniowa. Aktywacja leukocytów jest jednym z głównych czynników w patologicznej kaskadzie zapalnego uszkodzenia tkanki podczas reperfuzji.

W niniejszej pracy promujemy mikroskopię intravitalną opuszek posutylarnych jako wygodną metodę analizy aktywacji leukocytów w urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym. Ponadto omawiamy częste błędy i przedstawiamy przydatne wskazówki, które powinny umożliwić czytelnikowi pełne zrozumienie i bezpieczne wykonanie tej metody. Po uzyskaniu zgody komisji etycznej i zBeforeText znieczuleniu samców szczurów o masie ciała od 120 do 180 g, umieszczono szczura w pudełku z pleksiglasu i podano od 2 do 3% objętościowo izofluranu za pomocą waporyzatora izofluranu.

Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia szczura należy zważyć i ogolić w okolicy brzusznej szyi. Umieść zwierzę w pozycji grzbietowej na podgrzewaczce, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C, i podawaj izofluran w stężeniu 2% objętościowo przy użyciu maski silikonowej. Kolejne etapy przygotowania najlepiej przeprowadzić przy użyciu mikroskopu chirurgicznego.

Wykonaj poziome cięcie skóry o długości dwóch centymetrów w okolicy wcięcia nadmostkowego SRAs. Zmobilizuj ślinianki grudolaki bocznie. Obecnie widoczne są brzuszne mięśnie szyi.

Ostrożnie rozdziel je w linii środkowej i odnajdź tchawicę. Odsłoń jeden do dwóch centymetrów tchawicy i za pomocą mikropincety unieś ją od spodu. Następnie, mniej więcej w połowie brzusznej strony tchawicy, wprowadź rurkę o rozmiarze 14 G jako rurkę intubacyjną do dolnej części tchawicy, która została wcześniej podłączona do respiratora dla zwierząt.

Następnie można zastosować wentylację z kontrolą objętości przy częstotliwości od 35 do 45 oddechów na minutę. Objętość oddechowa powinna wynosić od 4,5 do 5 ml, a stężenie izofluranu od 1,5 do 2% objętościowo podczas kaniulacji tętnicy szyjnej. Prawy mięsień mostkowo-językowy oddziela się za pomocą tępej dyssekcji.

Aby zlokalizować tętnicę szyjną, należy ostrożnie oddzielić nerw błędny od tętnicy szyjnej, a następnie przymocować tętnicę za pomocą mikropincety Anki, aby zatrzymać przepływ krwi z serca. Poniżej tętnicy szyjnej, w odniesieniu do serca, zakłada się dwa szwy: szew dystalny wiąże się ciasno, natomiast szew proksymalny wiąże się luźno wokół tętnicy szyjnej. Zastosowanie drugiego szwu proksymalnego zapobiega krwawieniu po usunięciu mikropincety. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się niewielkie nacięcie tętnicy szyjnej pomiędzy dwiema ligaturami. Następnie wprowadza się wypełniony roztworem soli fizjologicznej cewnik polietylenowy podłączony do przetwornika ciśnienia.

Usuń mikropincetę i wprowadź kaniulę głębiej do tętnicy. Przeprowadź okresowe analizy gazometryczne krwi za pomocą analizatora gazów krwi i utrzymuj pH krwi w granicach fizjologicznych podczas dożylnej aplikacji barwników fluorescencyjnych lub innych interesujących leków. Skupiając uwagę na obszarze lewej żyły szyjnej za pomocą mikroskopu chirurgicznego i trzymając pincety w obu dłoniach, rozdziel cienką powięź, aby odsłonić żyłę szyjną.

Zamocuj żyłę za pomocą kątowej mikropincety, aby zatrzymać przepływ krwi. Używając pincety, przeprowadź dwa fragmenty szwy o równej długości pod żyłą szyjną w sposób analogiczny do kaniulacji tętnicy szyjnej, wykonaj niewielkie nacięcie w żyle szyjnej i wprowadź cewnik polietylenowy przepłukany roztworem linii komórkowej. Przesuń cewnik w kierunku serca i zaciśnij ligaturę znajdującą się bliżej serca.

Wokół żyły i cewnika stosujemy aluminiowy etap czwarty obrazowania ścięgna kremaster, który szybko przyjmuje pożądaną temperaturę podkładki grzewczej. Pierwsze nacięcie wykonuje się w skórze i powięzi sromowej zewnętrznej powyżej moszny w najdalszym punkcie, po czym następuje ostrożne rozszerzenie przestrzeni podskórnej za pomocą nożyczek precyzyjnych. Po odsłonięciu tkanki zostaje ona nawilżona podgrzanym roztworem soli fizjologicznej.

Tkanka łączna pomiędzy zewnętrzną powięzią nasienną a mięśniem kremaster zostaje starannie usunięta, aby uwolnić mięśnie kremaster od otaczających tkanek. Ciągła superfuzja podczas sekcji nawadnia tkankę, co ułatwia widoczność i usuwanie, tak jak w przypadku dystalnego końca mięśnia kremaster, aby go unieruchomić i lekko rozciągnąć koniec mięśnia wewnątrz dystalnego końca worka po stronie brzusznej oraz wydłużyć nacięcie proksymalnie. Za pomocą mikronozycyc starannie koaguluje się krwawiące naczynia wzdłuż linii nacięcia.

Przy użyciu termicznego koagulatora, otwarty mięsień opuszkowy jądra spoczywa płasko na aluminiowej podstawie, będąc wciąż połączonym cienkimi więzadłami z nadjądrzem pod jądrem, w tym przez małą tętnicę i żyłę. Należy użyć koagulatora do zamknięcia naczyń oraz do przecięcia więzadeł łączących tkankę powięziową z tkanką mięśnia opuszkowego. Delikatnie odsuń wyizolowane jądro z powrotem do kanału pachwinowego.

Po wykonaniu pierwszej fiksacji, składającej się z czterech szwów tkanki, i ostrożnym rozłożeniu nici, rozciągnij tkankę mięśnia kremaster radialnie na aluminiowym stole. Umieść dwa końce cewnika polietylenowego blisko tkanki mięśnia kremaster w celu przygotowania układu do superfuzji. Za pomocą strzykawki nanieś wokół mięśnia kremaster linię wazeliny, aby stworzyć komorę płynową.

Umieść kwadratową lamellkę nad tkanką i mocno przyciśnij jej krawędzie do linii wazeliny. Tkanka mięśnia kremastra jest teraz gotowa do obrazowania mikroskopowego. Podstawowa konfiguracja badania intravitalnego może się różnić.

Do obrazowania laminowania EP wykorzystujemy mikroskop epifluorescencyjny do badań in vivo, wyposażony w źródło światła LED o długości fali 470 nanometrów. Przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego osiągamy powiększenie około 800 x, a obserwacje rejestrujemy za pomocą cyfrowej kamery o wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie epifluorescencyjne powinno być przeprowadzane w ciemni.

W celu znakowania leukocytów wstrzyknij rumine six J dożylnie przez cewnik żylny w stężeniu 0,4 mg/kg masy ciała. Wybierz naczynie dopokapilarne do obserwacji. Średnica naczynia powinna wynosić od 20 do 60 µm, a przepływ krwi powinien być wystarczający.

Przed wystąpieniem niedokrwienia należy pozostawić tkankę do stabilizacji przez 30 minut. Następnie należy przeprowadzić 30-sekundowy pomiar w celu ustalenia wartości bazowych dla tocznia i adhezji leukocytów. Za pomocą pęsety aplikacyjnej należy delikatnie założyć zacisk naczyniowy Bemer wokół najbardziej proksymalnego końca odsłoniętej tkanki mięśnia kremastra.

Zdejmij zacisk naczyniowy po 30 minutach niedokrwienia. Kolejne pomiary można przeprowadzać przez cały okres reperfuzji. W celu ilościowego określenia toczenia się leukocytów wyznacz wirtualną linię przecinającą naczynie pionowo, która będzie jednakowa dla wszystkich zapisów.

Ręcznie policz liczbę toczących się leukocytów, które przekroczą linię w ciągu 30 sekund. W celu kwantyfikacji leukocytów przylegających wyznacz stały dla wszystkich pomiarów odcinek naczynia o długości 200 µm.

Należy policzyć liczbę wyraźnie widocznych leukocytów, które pozostają w spoczynku przez 30 sekund. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w protokole pisemnym. Chociaż niedokrwienno-reperfuzja jest implikowana w różnych układach narządowych, w niniejszej pracy opisujemy metodę analizy oddziaływań leukocytów z śródbłonkiem podczas urazu reperfuzyjnego w tkance mięśni szkieletowych.

W związku z tym ma to szczególne znaczenie dla chirurgii płatów, ponieważ przyjmuje się, że poischemiczne uszkodzenia tkanki innych narządów obejmują te same mechanizmy zapalne. Opisana metoda może zostać wykorzystana do uzyskania podstawowej wiedzy na temat mechanizmów patologicznych w niedokrwiennym uszkodzeniu zrostów. Wywołanie niedokrwienia w mięśniu kremastrze może być łatwo przeprowadzone i idealnie odzwierciedla warunki istotne klinicznie, takie jak operacje wolnych płatów.

Ponadto można łatwo zastosować modyfikacje, takie jak niedokrwienie na zimno, niedokrwienie na ciepło lub superfuzję chromosteryczną substancjami wpływającymi na stan zapalny. W przypadku konieczności zastosowania leczenia na kilka godzin lub dni przed rejestracją, metodą z wyboru może być wstrzyknięcie dopodniebienne.