Name: Bezkontaktowe, bezznacznikowe monitorowanie komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą spektroskopii Ramana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Poznaj spektroskopię Ramana do bezstykowej, bezznacznikowej analizy komórek i tkanek. Ta metoda umożliwia monitorowanie integralności biologicznych próbek oraz identyfikację typów komórkowych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Steffenowi Kochowi za wsparcie techniczne oraz Shannon Lee Layland (oboje z Fraunhofer IGB Stuttgart) za pomocne sugestie dotyczące manuskryptu. Praca ta była finansowana z programu Attract Fraunhofer-Gesellschaft oraz BMBF (oba granty dla K.S.-L.).

1. Przygotowanie próbki biologicznej
<ol>
	<li>Przygotowanie żywych komórek
	<ol>
		<li>Przygotowanie komórek adherentnych
		<ol>
			<li>Wysiać komórki hodowane in vitro lub świeżo izolowane na szalkę z szklanym dnem (Greiner BioOne/Germany) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do całkowitego przylegania komórek.</li>
			<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i przed pomiarem delikatnie przemyć trzy razy PBS. Przez cały czas trwania procedury pomiarowej komórki powinny być przykryte PBS lub pożywką hodowlaną.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie komórek w zawiesinie
		<ol>
			<li>Odłączyć komórki hodowane in vitro zgodnie z powszechnymi protokołami (np. trypsyna-EDTA, skrobanie komórek), odwirować komórki i ponownie zawiesić otrzymany osad komórkowy w PBS lub pożywce hodowlanej.</li>
			<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej (stężenie: maks. 100,000 komórek/ml) na szalkę z szklanym dnem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tkanek natywnych
	<ol>
		<li>Po pobraniu tkanek przenieść je do sterylnego, lodowatego PBS i przechowywać nie dłużej niż 12 godzin w temperaturze 4 °C lub w lodzie przed pomiarem. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że przedłużony czas przechowywania (czas zimnego niedokrwienia &gt; 12 godzin w 4 °C) prowadził do zmian spektralnych wynikających z naturalnych procesów degradacji.</li>
		<li>Pomiary muszą być wykonywane z tkanką przykrytą PBS lub pożywką, aby uniknąć uszkodzenia białek ECM i komórek na skutek wysychania tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Spektrometr Ramana
Nasz dostosowany spektrometr Raman łączy standardowy mikroskop fluorescencyjny (Olympus IX 71) ze spektrometrem Raman, co umożliwia bezpośrednie porównywanie obrazów w polu jasnym i fluorescencyjnych ze spektrami Raman. Podstawowy układ składa się z lasera diodowego o długości fali 784 nm (Toptica photonics AG/Niemcy), filtra notch do oddzielenia światła rozproszonego Ramanowsko od światła wzbudzenia, mikroskopu oraz spektrografu (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor/USA) z urządzeniem ładunkowym (kamera CCD) zoptymalizowanym pod kątem detekcji informacji spektralnych (F-view od Soft Imaging Systems/Niemcy).
3. Kontrola funkcji lasera
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie Andor Solis (Andor/United Kingdom) i ustaw temperaturę kamery CCD na -60 °C, aby zminimalizować szum wywołany prądami termicznymi w kamerze.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia procedury kalibracji umieść podłoże krzemowe na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Włącz laser i ustaw jego moc na 85 mW.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania Cell B (Olympus/Germany) skup laser na podłożu, aż pojawi się obraz XY.</li>
	<li>Wykonaj pomiar podłoża krzemowego z pojedynczym czasem integracji 1 sec, używając obiektywu powietrznego 60x.</li>
	<li>W oprogramowaniu Andor Solis zmień jednostkę osi x z numeru piksela na przesunięcie ramanowskie (cm-1).</li>
	<li>Reguluj ogniskowanie lasera dla piku krzemu przy 520 cm-1 w zebranym widmie, aby uzyskać maksymalną możliwą intensywność dla tego pasma Ramanowskiego. Minimalna liczba zliczeń musi być wyższa niż 11 000, aby kalibracja zakończyła się powodzeniem.</li>
</ol>
4. Pomiary spektroskopowe Ramana
Wszystkie pomiary są wykonywane w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Ustawienia podstawowe
	<ol>
		<li>Do zbierania widm próbek należy użyć obiektywu imersyjnego 60x (Olympus/Germany) z aperturą numeryczną 1,2.</li>
		<li>Zmienić ustawienia akwizycji na 10 integracji/ 10 sekund, co daje łącznie 100 sekund na każdy pomiar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar komórek adherentnych
	<ol>
		<li>Wziąć naczynko z dnem szklanym zawierające komórki i umieścić je na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Aby uzyskać lepszy sygnał i zapewnić powtarzalność, należy skupić wiązkę lasera na jądrze komórkowym, wyłączyć oświetlenie mikroskopu i rozpocząć zbieranie widma.</li>
		<li>Co 10 widm należy zmierzyć referencyjne widmo tła, przesuwając ogniskową lasera poza obszar komórki. Należy pamiętać, że przy każdej zmianie głębokości ogniskowania konieczne jest zebranie nowego tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar komórek w zawiesinie
	<ol>
		<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do naczynka z dnem szklanym i umieścić je na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Skupić wiązkę lasera na środku komórki, wyłączyć oświetlenie mikroskopu i rozpocząć zbieranie widma.</li>
		<li>Co 10 widm należy zmierzyć referencyjne widmo tła, przesuwając ogniskową lasera poza obszar komórki. Przy zmianie głębokości ogniskowania należy zebrać nowe tło dla nowej głębokości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar tkanek natywnych
	<ol>
		<li>Wziąć próbkę i umieścić ją w naczynku z dnem szklanym. Obszar zainteresowania (ROI) powinien być skierowany w stronę dna naczynka.</li>
		<li>Wypełnić naczynko odpowiednią ilością PBS, aby całkowicie przykryć próbkę.</li>
		<li>Położyć szkiełko nakrywkę na próbce, aby zapobiec jej przemieszczaniu się podczas pomiarów.</li>
		<li>Ustawić ogniskową lasera w strukturze zainteresowania (rozdzielczość głębokości zależy od lasera i rodzaju tkanki) i rozpocząć zbieranie widm.</li>
		<li>Co 10 widm należy zebrać referencyjne widmo tła, przesuwając ogniskową lasera poza cały obszar tkanki. Przy zmianie głębokości ogniskowania należy zebrać nowe tło dla nowej głębokości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar kriosiekcji znakowanych immunofluorescencyjnie (IF)
	<ol>
		<li>Przygotować skrawki z tkanek świeżych, zamrożonych błyskawicznie, używając standardowego kriotomu, a następnie osadzić je na szkiełkach nakrywkach powlekanych krzemionką.</li>
		<li>Kriosiekcje należy barwić zgodnie z rutynowym protokołem IF, stosując jedynie krótki etap fiksacji (maks. 10 minut w 4% paraformaldehydzie) i używając odpowiednich przeciwciał do detekcji badanego białka.</li>
		<li>Wykonać pomiary Ramanowskie, skupiając wiązkę w obszarze, w którym występuje fluorescencja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Doświadczenia nad degradacją elastyny
	<ol>
		<li>Umieścić warstwę ventricularis wyciętych listków zastawki aorty świni (warstwa bogata w elastynę, znajdująca się po stronie dopływu krwi do zastawki serca) skierowaną w stronę dna naczynka z dnem szklanym.</li>
		<li>Zmierzyć tkankę natywną jako „kontrolę nieinkubowaną” w 30 losowych punktach na całej powierzchni tkanki, skupiając wiązkę na strukturach włóknistych.</li>
		<li>Podzielić próbkę na 3 części i umieścić je w oddzielnych probówkach Eppendorf o pojemności 2,5 ml, wypełnionych 2 ml roztworu elastazy (5 U/ ml, Worthington/Germany).</li>
		<li>Inkubować tkankę przez 15 lub 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po inkubacji przez 15 lub 30 minut wyjąć tkanki z probówek Eppendorf i dokładnie przemyć PBS, aby całkowicie zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
		<li>Zmierzyć każdą próbkę w 30 losowych punktach, skupiając wiązkę na strukturach włóknistych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przetwarzanie i analiza danych
<ol>
	<li>Przetwarzanie widm Ramana 
	Wstępna obróbka wygenerowanych widm została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania OPUS (Bruker Optik GmbH/Niemcy).
	<ol>
		<li>Aby zredukować sygnały zakłócające pochodzące ze szkła i medium, a także uniknąć zmienności spowodowanej zmianami ogniskowania podczas pomiarów, należy odjąć odpowiednie widmo tła od zebranych widm.</li>
		<li>Ogranicz widma do zakresu liczb falowych między 400-1800 cm-1, który dostarcza największej ilości informacji.</li>
		<li>W razie potrzeby znormalizuj widma do maksymalnego piku. Normalizacja eliminuje wahania intensywności i błędy systematyczne, co upraszcza wykrywanie zmian strukturalnych w widmach próbek.</li>
		<li>Wykonaj korekcję linii bazowej, aby zwiększyć porównywalność między różnymi eksperymentami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza widm Ramana 
	Widma Ramana analizowano metodą PCA przy użyciu oprogramowania The Unscrambler (CAMO/ Norwegia). Ta analiza wielowariancyjna wykrywa różnice i podobieństwa w zestawach danych spektralnych. Każde widmo jest przedstawione jako pojedynczy punkt w przestrzeni wielowymiarowej na podstawie liczby zliczeń dla każdego przesunięcia Ramanowskiego. Każda główna składowa (PC) opisuje określoną ilość całkowitej informacji zawartej w oryginalnych danych. Pierwsza składowa PC zawiera największe źródło zmienności. Każda kolejna składowa PC zawiera kolejno mniej informacji niż poprzednia. Każda zmienna posiada wartość wyniku (score) oraz ładunek (loading) dla każdej składowej PC. Poprzez wykreślenie składowych PC (=scores) można wykazać istotne korelacje między próbkami. Ładunki opisują wkład każdej analizowanej zmiennej do PCA.
	<ol>
		<li>Oznacz każdą grupę pomiarów, tworząc zakresy wierszy dla każdej grupy próbek.</li>
		<li>Użyj następujących podstawowych ustawień dla PCA: walidacja krzyżowa (cross validation), algorytm NIPALS, brak rotacji i uruchom analizę. Ustawienia te zależą od rodzaju widm.</li>
		<li>Wykonaj analizę PCA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Widma Ramana generowane z komórek adherentnych często wykazują niski stosunek sygnału do szumu oraz niską całkowitą intensywność sygnału (Rys. 1).11 Ze względu na to, że ognisko lasera musi zostać ustawione blisko szklanego dna, wpływ interferującego sygnału szkła jest dość wysoki, co powoduje maskowanie właściwego sygnału próbki. W konsekwencji sygnał próbki może zostać zminimalizowany lub nawet usunięty podczas późniejszego odejmowania tła. Dlatego do analizy spektroskopowej Ramana preferujemy stosowanie komórek w zawiesinie, ponieważ pozwalają one na detekcję bardziej szczegółowych informacji spektralnych. Niemniej jednak widma komórek adherentnych i w zawiesinie wykazują te same główne piki, różniące się jedynie intensywnością.
W celu charakterystyki różnych typów komórek w zawiesinie nie jest wymagane żadne przygotowanie wstępne. Średnie widma Ramana oraz odchylenia standardowe dla ludzkich fibroblastów, mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs), chondrocytów i keratynocytów zmierzonych w zawiesinie przedstawiono na Rysunku 2. Wszystkie widma Ramana mają podobną strukturę, z pikami pochodzącymi od typowych biomolekuł, takich jak białka, kwasy nukleinowe i lipidy (patrz Tabela 1).12 Dla tych typów komórek obszar widmowy między 600 a 1800 cm-1 zawiera większość istotnych informacji spektralnych, dzięki którym można wykryć wyraźne różnice między poszczególnymi typami komórek (Rys. 2A). Przykładowo, wyróżniliśmy jeden obszar widmowy (1280-1350 cm-1) wykazujący wyraźne różnice strukturalne, który można przypisać wibracjom molekularnym kolagenu i lipidów. W przeciwieństwie do tego, analizy morfologiczne nie nadają się do identyfikacji i rozróżnienia większości komórek (Rys. 2B-I). Podczas gdy różnica między chondrocytami a komórkami skóry jest zauważalna (Rys. 2D,H w porównaniu z B,F i E,I), fibroblasty i MSCs są trudne do rozróżnienia przy użyciu wyłącznie mikroskopii w polu jasnym (Rys. 2B,F w porównaniu z C,G).13
Analiza spektroskopowa Ramana tkanek natywnych, w szczególności białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), wymaga wizualizacji obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą obrazowania w jasnym polu, aby umożliwić ustawienie ostrości na odpowiednią strukturę. W celu przypisania białka do konkretnego widma odciskowego wygenerowaliśmy widma Ramana komercyjnie dostępnych czystych białek oraz immunohistochemicznie barwionych skrawków mrożonych. Zidentyfikowaliśmy widma odciskowe włókien elastycznych w tkankach natywnych, porównując liofilizowaną elastynę oraz skrawki mrożone barwione immunofluorescencyjnie z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko elastynie. Jednak ze względu na wysoką autofluorescencję elastyny, która odbija się w widmach Ramana, analiza danych jest trudna (Ryc. 3A). Aby zredukować błędy systematyczne wynikające z właściwości specyficznych dla próbki, takich jak autofluorescencja, kluczowe jest odpowiednie przetworzenie zestawów danych. W naszych analizach danych zastosowaliśmy normalizację w celu wyeliminowania znacznie wyższej intensywności sygnału czystego białka elastyny, dzięki czemu mogliśmy wygenerować porównywalne widma Ramana (Ryc. 3B). Elastyna jest jednym z najtrwalszych białek ECM w organizmie i dlatego jest bardzo trudna do degradacji.14 W naszym układzie doświadczalnym wywołaliśmy degradację elastyny w zdrowych płatkach zastawki aorty świni poprzez trawienie enzymatyczne. Stosując wielowymiarową analizę PCA, zidentyfikowaliśmy istotne różnice między widmami Ramana próbek traktowanych enzymatycznie a kontrolami natywnymi (Ryc. 3C). Różnice spektralne te zaobserwowano w widmie obciążeń przy 861, 1003 i 1664 cm-1. Przewidywane zmiany strukturalne we włóknach zawierających elastynę, wynikające z wydłużonego czasu ekspozycji na elastazę, wykazano w barwieniu metodą HART (Ryc. 4), co znalazło odzwierciedlenie w bardziej wyraźnych, oddzielnych klastrach wyników (Ryc. 3C).
<img alt="Wykres analizy spektralnej fibroblastów odseparowanych i przylegających, pokazujący intensywność liczb falowych." src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Średnie widma Ramana fibroblastów odseparowanych i przylegających.
<img alt="Widma spektroskopii Ramanowskiej, fibroblasty, komórki macierzyste; analiza obrazów mikroskopowych; badania biomedyczne." src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. (A) Średnie widma Ramanowskie i odchylenia standardowe czterech różnych typów izolowanych komórek pierwotnych (fibroblastów, MSC, chondrocytów i keratynocytów). Ramka wyróżnia obszar widma od 1280 do 1350 cm-1 z różnicami strukturalnymi. (B-E) Obrazy w polu jasnym odspojonych (B) fibroblastów, (C) MSC, (D) chondrocytów i (E) keratynocytów. Pasek skali odpowiada 20 μm. (F-I) Obrazy w polu jasnym adherentnych (F) fibroblastów, (G) MSC, (H) chondrocytów i (I) keratynocytów. Pasek skali odpowiada 200 μm.
<img alt="Widma i diagram PCA dla analizy włókien elastycznych; obejmuje analizę widmową i grupowanie danych." src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. (A) Widma Ramanowskie bez normalizacji dla liofilizowanej elastyny (linia niebieska), krioprzekrojów znakowanych immunofluorescencją (IF) (linia pomarańczowa) oraz włókien elastycznych (linia czerwona) zmierzonych w natywnych płatkach zastawki aortalnej. Wysoka intensywność sygnału liofilizowanej elastyny wynika z autofluorescencji. (B) Widma Ramanowskie po normalizacji w celu wyeliminowania błędów systematycznych. (C) Wyniki (scores) i ładunki (loadings) z porównania między niepoddanymi działaniu enzymów włóknami kontrolnymi (kolor czerwony) a włóknami elastycznymi zdegradowanymi enzymatycznie (kolory niebieski i zielony) w tkance natywnej.
<img alt="Próbki tkanek histologicznych, obrazy mikroskopowe ilustrujące różnice strukturalne w skali 50 μm." src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Sączki zastawki aorty świń barwione metodą HART. Włókna elastyny są widoczne w kolorze czarnym. (A) i (B) przedstawiają nietraktowaną grupę kontrolną, a (C) i (D) ukazują próbki tkanek poddane działaniu elastazy, enzymu degradującego elastynę, przez 30 minut.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liczba falowa w cm⁻¹-1</td>
			<td colspan="2">Zadanie12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>717-719</td>
			<td>C-N</td>
			<td>Fosfolipidy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>785-788</td>
			<td>zasady DNA/RNA, 
			szkielet O-P-O</td>
			<td>DNA/RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1003- 1005</td>
			<td>Fenyloalanina</td>
			<td>Białko</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1220-1280</td>
			<td>Amid III</td>
			<td>Białko</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1445-1447</td>
			<td>CH2</td>
			<td>Białko/Lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1655-1680</td>
			<td>Amid I C=O</td>
			<td>Białko Lipid</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Prążki ramanowskie wykryte w widmach wszystkich typów komórek (fibroblastów, MSC, chondrocytów i keratynocytów).

<ol><li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li>
<li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li>
<li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Med.+Devices%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues%3A+implications+for+long-term+graft+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li>
<li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+secondary+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12(1928).</li>
<li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+scattering+of+collagen%2C+gelatin%2C+and+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li>
<li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Artif.+Organs%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li>
<li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li>
<li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Spectroscopy%3A+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li>
<li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li>
<li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Laser+Application%22%5BJournal%5D)">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+elastic+tissue+biology%3A+elastin+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li>
<li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Raman+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li>
<li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li>
<li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Spektroskopia Ramana jest odpowiednim narzędziem do analizy próbek biologicznych, takich jak in vitro– komórki hodowlane i białka ECM, a także komórki w obrębie tkanek natywnych.11,15,16 W niniejszej pracy wykazaliśmy, że ta bezkontaktowa technika bez użycia znaczników pozwala na rozróżnianie różnych typów komórek oraz wykrywanie degradacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wyłącznie na podstawie wewnętrznego składu biomolekularnego tych próbek biologicznych.
Główną zaletą spektroskopii Ramana jest możliwość nieinwazyjnej ilościowej analizy sygnatury biochemicznej próbki na podstawie otrzymanych widm Ramana. W przeciwieństwie do spektroskopii w podczerwieni, która dostarcza podobnych informacji, widma Ramana mogą być pozyskiwane z próbek wodnych, ponieważ rozproszenie Ramana przez wodę jest słabe. Ponadto spektroskopia Ramana opiera się wyłącznie na detekcji wstecznego rozproszenia światła monochromatycznego, w związku z czym przed pomiarem nie jest wymagane żadne przygotowanie próbki. Cechy te sprawiają, że spektroskopia Ramana jest obiecującą alternatywą dla potencjalnych zastosowań obrazowania in vivo. W tym kontekście koherentna spektroskopia Ramana antystokesowska (CARS) jest bardzo interesującą techniką, ponieważ umożliwia szybsze i bardziej czułe pozyskiwanie danych w oparciu o te same sygnały wibracyjne, które wykorzystano w naszych eksperymentach.15,16 Inne metody alternatywne, w tym obrazowanie autofluorescencji indukowanej wielofotonowo oraz generowanie drugiej harmonicznej, okazały się wcześniej odpowiednie do nieinwazyjnego lub małoinwazyjnego monitorowania próbek biologicznych.17 Jednakże te modalności obrazowania wiążą się z bardzo wysokimi kosztami i są ograniczone do cząsteczek generujących autofluorescencję. Dodatkowo spektrometr Ramana można łatwo połączyć z konwencjonalnymi mikroskopami optycznymi. Charakterystyka ta sprawia, że spektroskopia Ramana jest cennym narzędziem do badania próbek biologicznych w środowiskach fizjologicznych.
Jednym z obecnych ograniczeń naszej konfiguracji spektroskopii Ramanowskiej jest stosunkowo mała ogniskowa wiązki lasera (250 nm pełnej szerokości połówki maksimum (FWHM) w płaszczyźnie bocznej i 700 nm FWHM w płaszczyźnie osiowej), generowana przez obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (NA=1.2). Chociaż wysoka apertura numeryczna pozwala na zebranie znacznej ilości emitowanego światła Ramanowskiego, co skutkuje wysokim stosunkiem sygnału do szumu, wysoka wartość NA tworzy w próbce jedynie niewielki obszar ogniskowania, który jest zazwyczaj znacznie mniejszy niż komórka. Aby porównać widma Ramanowskie różnych komórek, niezbędne jest zarejestrowanie widma reprezentatywnego, co jest trudne do osiągnięcia przy małym obszarze ogniskowania. Aby rozwiązać ten problem, pracujemy nad procesem automatyzacji zbierania sygnału w różnych punktach wewnątrz komórki (= mapowanie spektroskopowe Ramanowskie), co prowadzi do uśrednienia widma i uzyskania widma reprezentatywnego. Dodatkowo technika ta zapewni przegląd rozmieszczenia specyficznych pasm Ramanowskich, na przykład rozkładu białek wewnątrz komórki.
Próbki biologiczne są wysoce złożone i składają się z heterogenicznej mieszaniny biomolekuł, które wpływają na rejestrowane widma Ramana. W związku z tym wzorzec spektralny jest bardzo złożony, a monitorowanie pojedynczego typu cząsteczki w widmie Ramana jest trudne do osiągnięcia ze względu na nakładanie się sygnałów różnych cząsteczek. Dodatkowo wewnętrzna fluorescencja próbki może maskować cenne informacje zawarte w słabszych sygnałach Ramana. Co ciekawe, w niektórych z naszych poprzednich badań, przy użyciu odpowiedniego narzędzia analitycznego, zidentyfikowaliśmy autofluorescencję w widmach Ramana jako główny czynnik różnicujący typy komórek (MSC i fibroblasty).13 Stwierdziliśmy również, że zmiany w całkowitej intensywności sygnału Ramana mogą służyć jako wskaźnik stanu kolagenu i włókien kolagenowych w obrębie ECM płatków zastawki aortalnej.9 Jednakże analizując stan elastyny w tych tkankach, nie udało nam się uzyskać podobnych wyników. Jak wspomniano w sekcji wyników, byliśmy w stanie wykryć zmiany jedynie w specyficznych pasmach Ramana w próbkach traktowanych elastazą w porównaniu z natywnymi kontrolami. Nie zaobserwowaliśmy spodziewanego spadku całkowitego sygnału Ramana w próbkach traktowanych enzymatycznie. Obserwacje te skutkowały wykresem wyników (score plot), który nie wykazał wyraźnego tworzenia się skupisk, co miało miejsce w poprzednim badaniu.9 W przeciwieństwie do tego, wpływ traktowania enzymatycznego był wykrywalny w wynikach PCA. Zakładamy, że rozbieżności te między dwoma białkami ECM, elastyną i kolagenem, wynikają z różnic morfologicznych oraz odmiennych procesów degradacji enzymatycznej: w płatku zastawki aortalnej strefa bogata w kolagen (fibrosa) jest ciągłą warstwą, która ulega rozluźnieniu w wyniku traktowania enzymatycznego, podczas gdy strefa zawierająca elastynę (ventricularis) ma konfigurację sieciową, która po ekspozycji na elastazę wydaje się pofragmentowana (Rys. 4). Pomiary punktowe (single spot) nie były zatem odpowiednie do wykrycia tak niewielkich pęknięć w sieci elastyny. W tym przypadku mapowanie Ramanowskie tkanki pomogłoby zidentyfikować przerwy w sieci.
Kolejnym wyzwaniem w spektroskopii Ramanowskiej próbek biologicznych jest skrócenie czasu pomiaru. Jednym z rozwiązań jest zwiększenie mocy lasera, co jest dopuszczalne tak długo, jak próbki biologiczne nie ulegają fotouszkodzeniom. Wszystkie nasze obecne eksperymenty są badaniami typu proof-of-principle skupionymi na badaniach podstawowych; jednak naszym nadrzędnym celem jest wdrożenie spektroskopii Ramanowskiej w zastosowaniach klinicznych, w tym w medycynie regeneracyjnej (np. kontrola jakości produktów inżynierii tkankowej), monitorowaniu graftów przed transplantacją oraz w diagnostyce nowotworów.

<table><tbody><tr><td>elastaza</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS006363</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko elastynie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA018111</td><td>1:75; bufor cytrynianowy</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>szalki z szklanym dnem</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627860</td><td></td></tr><tr><td>The Unscrambler</td><td>CAMO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opus</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii ramanowskiej

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

W badaniach biomedycznych niezbędne są nieniszczące, bezkontaktowe i bezetykietowe technologie do monitorowania kultur komórkowych i tkankowych.1-5 Jednak obecnie dostępne rutynowe metody wymagają etapów przetwarzania i zmieniają integralność próbek. Spektroskopia Ramana jest szybką metodą, która umożliwia pomiar próbek biologicznych bez konieczności przeprowadzania dalszych etapów obróbki. Ta oparta na laserach technologia wykrywa niespójne rozpraszanie światła monochromatycznego.6 Ponieważ każdemu drganiu chemicznemu przypisana jest konkretna pasmo Ramanowskie (liczba falowa w cm-1), każda próbka biologiczna charakteryzuje się typowym wzorcem widmowym wynikającym z jej wrodzonego składu biochemicznego.7-9 W widmach Ramana intensywność piku koreluje z ilością obecnych wiązań molekularnych.1 Podobieństwa i różnice w zbiorach danych spektralnych można wykryć, stosując analizę wielowymiarową (np. analizę głównych składowych (PCA)).10
W niniejszym materiale przeprowadzamy spektroskopię Ramanowską żywych komórek oraz tkanek natywnych. Przed pomiarem komórki są wysiewane na szalki z dna szklanego lub utrzymywane w zawiesinie w standardowych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 5% CO2). Tkanki natywne są preparowane i przechowywane w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w temperaturze 4 °C przed pomiarami. W zależności od konfiguracji eksperymentalnej skupialiśmy się na jądrze komórkowym lub białkach macierzy pozakomórkowej (ECM), takich jak elastyna i kolagen. we wszystkich badaniach mierzone jest minimum 30 komórek lub 30 losowych punktów zainteresowania w obrębie ECM. Etapy przetwarzania danych obejmowały odejmowanie tła oraz normalizację.

Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

W dziedzinie badań biomedycznych istnieje zapotrzebowanie na niedestrukcyjne, bezkontaktowe i niewymagające znakowania technologie do monitorowania hodowli komórkowych i tkankowych.1-5 Jednakże, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie komórek i tkanek za pomocą bezkontaktowej metody niewymagającej znakowania. Jest to realizowane poprzez spektroskopię Ramana – technologię opartą na laserze, która wykrywa niesprężyste rozpraszanie światła monochromatycznego, generując charakterystyczny wzór widmowy dla każdej próbki biologicznej na podstawie jej wrodzonego składu biochemicznego, przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego połączonego ze spektrometrem Ramana. Bezpośrednie porównanie obrazów w polu jasnym i fluorescencyjnym z widmami Ramana służy do monitorowania licznych próbek biologicznych.Każdej wibracji chemicznej przypisany jest konkretny pasmo Ramana, a intensywność piku koreluje z ilością obecnych wiązań molekularnych. Wykrywane są podobieństwa i różnice w zestawach danych spektralnych. Dzięki zastosowaniu analizy wielowymiarowej otrzymane widma mogą być wykorzystane do sprawdzenia integralności tkanek po pobraniu biopsji lub do potwierdzenia sterylności wyizolowanych komórek.Ponadto technika ta umożliwia charakteryzację i identyfikację różnych typów komórek in vitro. W ostatecznym rozrachunku spektroskopia ramana jest obiecującą techniką opartą na laserze, znajdującą zastosowanie w inżynierii tkankowej i aplikacjach klinicznych dzięki bezkontaktowej analizie bez użycia znaczników. Procedurę zademonstrują Daniel Cabal Barrio, technik, oraz Miriam Tala, doktorantka w moim laboratorium. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami rutynowymi, takimi jak histologia i obrazowanie immunofluorescencyjne, jest brak konieczności przygotowania próbek.Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w stan pojedynczych komórek i składniki macierzy, może ona być również stosowana do tkanek i organów wielokomórkowych. Aby przygotować spersonalizowane widma ramen, standardowy mikroskop fluorescencyjny zostaje połączony ze spektrometrem ramen, co umożliwia bezpośrednie porównanie obrazów fluorescencyjnych z widmami ramen. Podstawny układ składa się z diodowego lasera o długości fali 784 nanometrów, filtra notch do oddzielenia rozproszonego światła ramen od światła wzbudzenia, mikroskopu oraz spektrografu z urządzeniem CCD zoptymalizowanym pod kątem detekcji informacji spektralnych.Aby sterować funkcjami lasera, uruchom oprogramowanie Solace i ustaw temperaturę kamery CCD na -60°C, aby zminimalizować szum wywołany prądami termicznymi w kamerze. W celu przeprowadzenia procedury kalibracji umieść podłoże krzemowe na stole mikroskopu. Włącz laser i ustaw jego moc na 85 mW.Użyj komórki oprogramowania B, aby ustawić ostrość lasera na waflu, aż pojawi się XY. Wykonaj pomiar wafla krzemowego z pojedynczym czasem integracji wynoszącym jedną sekundę. Korzystając z obiektywu powietrznego 60 X, zmień jednostkę osi X z numeru piksela na ramen.Przesunięcie w oprogramowaniu Soli zmienia ogniskowanie lasera dla piku krzemu przy liczbie falowej 520 w zebranym widmie. Aby uzyskać maksymalną możliwą intensywność dla tego pasma ramanowskiego, minimalna liczba zliczeń musi przekraczać 11 000, aby kalibracja przed pomiarem spektralnym zakończyła się powodzeniem. Próbki biologiczne należy przygotować zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Wszystkie pomiary są wykonywane w temperaturze pokojowej.Używając obiektywu imersyjnego 60x o aperturze numerycznej 1,2, widma należy zbierać, wykonując 10 integracji co 10 sekund, co daje łącznie 100 sekund na pomiar. Aby przeprowadzić pomiar komórek adherentnych, należy umieścić na stoliku mikroskopu szalkę z dnem szklanym zawierającą komórki. W celu uzyskania lepszego sygnału i zapewnienia powtarzalności, należy skupić wiązkę lasera na jądrze komórkowym, wyłączyć oświetlenie mikroskopu i rozpocząć zbieranie widma.Mierz widmo referencyjne tła co 10 widm, przesuwając ogniskową lasera obok komórki. Należy pamiętać, że przy zmianie ogniskowej dla każdej głębokości ogniskowania musi zostać pobrane nowe tło. Alternatywnie, w celu pomiaru komórek w zawiesinie, przenieś 100 µL zawiesiny komórkowej do szklanego naczynia z dnem.Po umieszczeniu na stoliku mikroskopu, ustaw ostrość lasera na środku komórki, wyłącz oświetlenie mikroskopu i ponownie rozpocznij zbieranie widma. Co 10 widm mierz widmo referencyjne tła, przesuwając ogniskową lasera obok komórki. Aby zmierzyć widma tkanek natywnych, umieść próbkę w szkiełku z dna szklanego.Obszar zainteresowania powinien być zorientowany przodem do dna naczynia. Napełnij naczynie odpowiednią ilością PBS, aby przykryć próbkę. Umieść szkiełko podstawowe nad próbką, aby zapobiec jej przemieszczaniu się.Podczas pomiarów ustaw ostrość lasera na badaną strukturę i rozpocznij zbieranie widm. Co 10 widm zbieraj widmo referencyjne tła, przesuwając ostrość lasera poza obszar tkanki; w przypadku pomiaru widmowym immunofluorescencji w skrawkach mrożonych zawsze zbieraj nowe tło dla każdej głębokości ostrzenia. Przygotuj skrawki z utrwalonych metodą błyskawicznego mrożenia świeżych próbek tkankowych.Używając standardnego kriotomu, należy przenieść je na szkiełka przedmiotowe pokryte krzemionką. Przebarwienie sekcji mrożonych należy przeprowadzić zgodnie z rutynowym protokołem immunofluorescencji, stosując jedynie krótki etap fiksacji i używając odpowiednich przeciwciał do detekcji badanego białka. Pomiary Ramena należy przeprowadzić, koncentrując się na obszarze, w którym występuje fluorescencja.Aby przeprowadzić eksperymenty dotyczące degradacji elastyny, fragmenty brzeżne rozczłonkowanej porcine aortic valve są ustawione stroną brzuszną do dna szalki szklanej. Próbkę tkanki natywnej, służącą jako kontrola nieinkubowana, należy zmierzyć w 30 losowych punktach na całej powierzchni tkanki.Skupiając się na strukturach włóknistych, podzielono próbkę na dwie sekcje i umieszczono je w oddzielnych probówkach typu eppendorf o pojemności 2,5 ml, wypełnionych dwoma mililitrami roztworu elastazy. Inkubowano tkankę przez 15 lub 30 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji tkanki wyjęto z probówki i starannie przemyto PBS, aby całkowicie zatrzymać reakcję enzymatyczną.Każdą próbkę należy zmierzyć w 30 losowych punktach, koncentrując się na strukturach włóknistych. Przetwarzanie widm Ramanowskich rozpoczyna się od wstępnej obróbki wygenerowanych widm przy użyciu oprogramowania Opus. Najpierw należy odjąć odpowiednie widmo tła od zebranych widm, aby zredukować sygnały zakłócające pochodzące ze szkła i medium, a także aby uniknąć zmienności spowodowanej zmianami w ogniskowaniu.Podczas pomiarów, w razie potrzeby, ogranicz widma do zakresu liczb falowych między 401 a 800, co zapewnia największą ilość informacji. Zastosuj normalizację widm do maksimum piku, co pozwala wyeliminować fluktuacje intensywności wynikające z błędów systematycznych, ułatwiając wykrywanie zmian strukturalnych w widmach próbek. Przeprowadź korekcję linii bazowej, aby zwiększyć porównywalność wyników między różnymi eksperymentami.Przeanalizuj widma Ramana, stosując analizę głównych składowych (PCA) za pomocą oprogramowania Unscrambler. Ta analiza wielowymiarowa pozwala wykryć różnice i podobieństwa w zestawach danych widmowych. Każde widmo jest przedstawione jako pojedynczy punkt w przestrzeni wielowymiarowej na podstawie zebranych zliczeń dla każdego przesunięcia Ramana.Każda główna składowa, w skrócie PC, opisuje określoną ilość całkowitych informacji zawartych w oryginalnych danych. Pierwsza PC jest tą, która zawiera najwyższe źródło zmienności. Każda kolejna PC zawiera kolejno mniej informacji niż poprzednia.Każda zmienna posiada wynik (score) oraz ładunek (loading) dla każdego PC. Poprzez wykreślenie PC można ujawnić istotne korelacje między próbkami. Ładunki opisują wkład każdej analizowanej zmiennej w PCA. Oznacz każdą grupę pomiarów, tworząc zakresy wierszy dla każdej grupy próbek, użyj następujących podstawowych ustawień dla walidacji krzyżowej PCA: algorytm NipAls, brak rotacji, a następnie rozpocznij analizę.Ustawienia te zależą od widm. Na koniec należy przeprowadzić PCA; surowe widma ramana generowane z komórek adherentnych często wykazują niski stosunek sygnału do szumu oraz niską całkowitą intensywność sygnału. Ogniskowa wiązka lasera musi zostać ustawiona w pobliżu szklanego dna, co maskuje rzeczywisty sygnał próbki.W konsekwencji sygnał próbki może zostać zminimalizowany lub nawet całkowicie usunięty podczas następczego odejmowania tła. Z kolei komórki w zawiesinie umożliwiają wykrycie bardziej szczegółowych informacji spektralnych. Niemniej jednak widma komórek adherentnych i zawiesinowych wykazują te same główne piki, różniące się jedynie intensywnością; dla charakterystyki różnych typów komórek w zawiesinie nie jest wymagane żadne przygotowanie wstępne.Przedstawiono tutaj średnie widma Ramana oraz odchylenia standardowe dla ludzkich fibroblastów, mezenchymalnych komórek macierzystych, chondrocytów i keratynocytów mierzonych w zawiesinie. Wszystkie widma Ramana mają podobną strukturę z pikiemami pochodzącymi od typowych biomolekuł, takich jak białka, kwasy nukleinowe i lipidy. Dla tych typów komórek obszar spektralny między liczbami falowymi 601 a 800 zawiera najistotniejsze informacje spektralne, dzięki którym można wykryć wyraźne różnice między poszczególnymi typami komórek.Przykładowy obszar spektralny wykazuje wyraźne różnice strukturalne, które można przypisać wibracjom molekularnym kolagenu i lipidów. Z kolei analizy morfologiczne nie nadają się do identyfikacji i rozróżnienia większości komórek. Choć różnica między chondrocytami a komórkami skóry jest zauważalna, fibroblasty i mezenchymalne komórki macierzyste są trudne do oddzielenia.Wykorzystując wyłącznie mikroskopię w polu jasnym do przypisania tkanki natywnej do konkretnego widma odcisku palca, wygenerowano widma Ramana komercyjnie dostępnych czystych białek oraz krioprzekrojów barwionych immunohistochemicznie. W niniejszej pracy widma odcisków palca włókien elastycznych zidentyfikowano w tkankach natywnych poprzez porównanie ich z liofilizowaną elastyną oraz krioprzekrojami barwionymi immunofluorescencyjnie przy użyciu przeciwciała przeciwko elastynie. Jednakże, ponieważ elastyna charakteryzuje się wysoką autofluorescencją, co znajduje odzwierciedlenie w widmach Ramana, analiza danych w celu zredukowania błędów systematycznych wynikających z właściwości specyficznych dla próbek, takich jak autofluorescencja, jest wymagająca, a odpowiednie przetwarzanie zestawów danych jest kluczowe.W analizie danych zastosowano normalizację w celu wyeliminowania znacznie wyższej intensywności sygnału czystego białka elastyny, co pozwoliło na uzyskanie porównywalnych widm Ramanowskich. Elastyna jest jednym z najstabilniejszych białek macierzy pozakomórkowej w organizmie, przez co jest bardzo trudna do degradacji. Tutaj.Degradację elastyny w zdrowych płatkach zastawki aortalnej świni wywołano poprzez trawienie enzymatyczne; stosując analizę wielowariancyjną PCA, zidentyfikowano istotne różnice między widmami Ramana próbek poddanych działaniu enzymów a kontrolami natywnymi. Różnice widmowe te zaobserwowano w widmie ładunkowym przy liczbach falowych 861, 1003 oraz 1664. Oczekiwane zmiany strukturalne w włóknach zawierających elastynę, wynikające z przedłużonego czasu ekspozycji na elastazę, odzwierciedliły się w bardziej wyraźnych, rozdzielnych klastrach wyników; przedstawione tutaj wyniki pochodzą z porównania kontroli niepoddanej działaniu enzymów z enzymatycznie zdegradowanymi włóknami elastynowymi w tkance natywnej. Te oczekiwane zmiany strukturalne są również widoczne w barwionych płatkach zastawki aortalnej świni, co zilustrowano na tym wstawieniu poprzez porównanie kontroli niepoddanej działaniu enzymów z próbkami tkanki eksponowanymi na elastazę – enzym degradujący elastynę – przez 30 minut.Technika ta otwiera przed badaczami w dziedzinach biologii komórki i macierzy, a także medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej, możliwość nie tylko analizy fenotypu komórek w czasie rzeczywistym, ale również identyfikacji kluczowych oddziaływań międzykomórkowych oraz oddziaływań między komórką a macierzą w wymiarze Z w środowisku natywnym.

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niekontaktowe, bez etykiet monitorowanie komórek i macierzy pozakomórkowej za pomocą spektroskopii Ramana

Omówiono konstrukcję i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje ultraszybkie przełączanie całkowicie optyczne do izolacji sygnałów Ramanowskich od sygnałów fluorescencyjnych. Dzięki zastosowaniu tego układu możliwe jest skuteczne rozdzielenie sygnałów Ramanowskich i fluorescencyjnych przy użyciu energii impulsów oraz mocy średniej, które pozostają bezpieczne biologicznie.

Eliminacja tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Opisujemy wytwarzanie i charakterystykę systemów nanobiologicznych łączących nanostrukturalne podłoża z unieruchomionymi białkami i aptamerami. Przedstawiono odpowiednie etapy eksperymentalne obejmujące litograficzną produkcję substratów nanostrukturalnych, biofunkcjonalizację i charakterystykę spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS). Wykazano detekcję SERS białek unieruchomionych powierzchniowo oraz sondowanie wiązania białko-ligand i aptamer-ligand.

Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

W tym manuskrypcie opisana jest implementacja mikroskopu z wymuszonym rozpraszaniem Ramana (SRS), uzyskanego przez integrację eksperymentalnego zestawu SRS z laserowym mikroskopem skaningowym. Mikroskop SRS oparty jest na dwóch femtosekundowych (fs) źródłach laserowych, Ti-Sapphire (Ti:Sa) i zsynchronizowanym optycznym oscylatorze parametrycznym (OPO).

Wdrożenie mikroskopu nieliniowego opartego na wymuszonym rozpraszaniu Ramana

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS), która jest w stanie osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki. Spektroskopia Ramana może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowej na leki, podczas gdy stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do ukierunkowanej i ilościowej analizy wychwytu i metabolizmu leków.

Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

W tym badaniu opracowaliśmy tanią nanosondę odcisków palców opartą na powierzchniowo wzmocnionym rozpraszaniu Ramana (SERS) o korzystnej biokompatybilności, aby pokazać bezznacznikowe bioobrazowanie żywych komórek i wykryć dwa szczepy bakterii, pokazując szczegółowo, jak uzyskać widma SERS żywych komórek w sposób nieniszczący.

Bezznacznikowa bioanaliza rozpraszania Ramana ze wzmocnieniem powierzchniowym oparta na nanosondach Au@Carbon dot

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

Mikroskop szerokokątowy z transformatem Fouriera, oparty na kompaktowym i ultrastabilnym interferometrze dwułamannym, umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D. Podejście w dziedzinie czasowej umożliwia rozplątanie sygnałów fotoluminescencyjnych i Ramana oraz umożliwia szybkie mapowanie Ramana (~5 ms/piksel) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną 23 cm-1 .

Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Poznaj spektroskopię Ramana do bezstykowej, bezznacznikowej analizy komórek i tkanek. Ta metoda umożliwia monitorowanie integralności biologicznych próbek oraz identyfikację typów komórkowych in vitro.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

Przeglądaj więcej filmów