Name: Nano-fEM: Lokalizacja białek za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej światłem i mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Poznaj metodę nano-fEM do lokalizacji białek w mikrografach elektronowych z wykorzystaniem skorelowanej mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie lokalizacji białek w organizmach transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Haraldowi Hessowi i Ericowi Betzigowi za udostępnienie mikroskopu PALM do eksperymentów potwierdzających zasadę działania, a Richardowi Fetterowi za udostępnienie protokołów fiksacji, odczynników oraz wsparcie. Dziękujemy Michaelowi Davidsonowi, Geraldine Seydoux, Stefanowi Eimerowi, Rudolfowi Leube, Keithowi Nehrke, Christianowi Frøkjr-Jensenowi, Aude Ada-Nguema i Marcowi Hammarlundowi za konstrukty DNA. Dziękujemy również firmie Carl Zeiss Inc. za umożliwienie dostępu do Zeiss PAL-M, wersji beta mikroskopu Zeiss Elyra P.1 PALM.

<ol><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24(2010).</li>
<li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li>
<li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images%3A+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li>
<li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light%2C+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li>
<li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li>
<li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+background-free%2C+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+%28SOFI%29%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li>
<li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching%2Fblinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Carl Zeiss, Inc.

W niniejszym materiale opisujemy sposób utrwalania białek fluorescencyjnych w tworzywie sztucznym, lokalizacji białek fluorescencyjnych w przekrojach oraz obrazowania ultrastruktury przy użyciu mikroskopii elektronowej. Białka zostały zlokalizowane poniżej limitu dyfrakcyjnego za pomocą mikroskopii PALM z rozdzielczością nanometryczną. Aby dostosować ten protokół do konkretnych preparatów, należy wziąć pod uwagę następujące parametry: fluorofor, kwantyfikację oraz dopasowanie.
Wybór białka fluorescencyjnego lub organicznego fluoroforu zależy od zastosowania i systemu modelowego. Przetestowaliśmy różne białka fluorescencyjne, w tym EGFP, YFP, Citrine, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, PA-mCherry oraz Dendra12. Zachowanie fluorescencji każdego z fluoroforów było podobne, co sugeruje, że wszystkie białka fluorescencyjne mogą zostać zachowane przy użyciu opisanego метода. Wybraliśmy tdEos, ponieważ dobrze ulegał ekspresji w C. elegans, białka po fuzji z tdEos zachowywały funkcjonalność, a jego charakterystyka fotoaktywacji była optymalna dla mikroskopii PALM. Jednakże sporadycznie obserwowano agregację lub brak ekspresji tdEos12. 
W zależności od zastosowania, lepszym wyborem może być inny fluorofor. W wielu przypadkach nie jest konieczne stosowanie fotoaktywnego białka fluorescencyjnego. Prosta korelacyjna mikroskopia fluorescencyjno-elektronowa nie wymaga użycia fotoaktywnego białka fluorescencyjnego. Do obrazowania fluorescencji białek znakowanych w przekrojach powyżej limitu dyfrakcyjnego można wykorzystać GFP lub barwniki organiczne. Na przykład, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej można obrazować akson w neuropilu i korelować sygnał fluorescencji z konkretnym aksonem na mikrografie elektronowym, obrazując fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym. Inne techniki superrozdzielcze, takie jak mikroskopia z deplecją emisji stymulowanej (STED)12, mikroskopia z deplecją stanu podstawowego z następującym po niej powrotem pojedynczej cząsteczki (GSDIM)13 oraz mikroskopia z iluminacją strukturalną (SIM)14, nie wymagają stosowania fotoaktywnych białek fluorescencyjnych. Ponadto z łatwością można zastosować techniki obrazowania superrozdzielczego wykorzystujące barwniki organiczne9,15,16 lub wewnętrzne właściwości sond fluorescencyjnych17.
W metodzie PALM liczba cząsteczek może zostać ilościowo określona, ponieważ fluorescencja każdej cząsteczki jest oddzielona przestrzennie i czasowo. Jednakże kwantyfikacja może być myląca z czterech powodów: utleniania, niedoszacowania, przeszacowania oraz nadekspresji. Po pierwsze, część białek fluorescencyjnych może ulec denaturacji lub utlenieniu podczas przetwarzania próbki5,12. Chociaż w naszym protokole dzięki utrwaleniu i zatopieniu zachowano ~90% sygnału fluorescencji, utlenienie białka fluorescencyjnego może wystąpić po przecięciu preparatu i wystawieniu jego powierzchni na działanie tlenu. Po drugie, aktywacja białek fotoaktywowalnych jest stochastyczna, w związku z czym w danym punkcie ograniczonym dyfrakcyjnie może zostać aktywowanych wiele cząsteczek8. Fluorescencja wielu cząsteczek pojawi się jako jeden punkt, co spowoduje niedoszacowanie całkowitej liczby białek. Po trzecie, podobny problem może prowadzić do przeszacowania. W metodzie PALM każde białko fluorescencyjne jest lokalizowane, a następnie „usuwane” poprzez wygaszanie. Jednakże białka fluorescencyjne mogą powrócić ze stanu ciemnego bez trwałego wygaszenia18. Takie cząsteczki zostaną wówczas policzone wielokrotnie. Po czwarte, białka znakowane są ekspresowane jako transgeny i często występują w wielu kopiach, co może prowadzić do nadekspresji. Zatem kwantyfikacja z PALM może służyć do szacowania, ale nie do precyzyjnego określania liczby cząsteczek w danej lokalizacji.
Dopasowanie obrazu PALM do mikrografii elektronowej może być również trudne ze względu na różnice w rozdzielczości mikroskopii świetlnej i elektronowej oraz zniekształcenia wywołane wiązką elektronów. Cząsteczki złota służą jako precyzyjnie zlokalizowane markery fiducjalne w mikrografią elektronowych. Jednak fluorescencja cząsteczek złota nie jest fotoaktywowana i przejawia się jako duża plamka ograniczona dyfrakcyjnie. W związku z tym nałożenie obrazu fluorescencyjnego na mikrografię elektronową jest jedynie szacunkowe. Zniekształcenia mogą również wynikać z oddziaływań elektronów z plastikowym przekrojem. Żywice akrylowe, takie jak GMA, są mniej stabilne pod wpływem wiązki elektronów, co może prowadzić do zmian wymiarów plastiku. W takich okolicznościach dopasowanie fluorescencji do ultrastruktury może wymagać nieliniowej transformacji markerów fiducjalnych.

<table><tbody><tr><td>Mrożarka wysokociśnieniowa</td><td>ABRA</td><td>HPM 010</td><td>Można również używać EMPact i HPM 100 firmy Leica lub hpf-01 firmy Wohlwend.</td></tr><tr><td>Automatyczna jednostka do substytucji zamrażania</td><td>Leica Microsystems</td><td>AFS 2</td><td>Można również używać AFS 1.</td></tr><tr><td>Zeiss PALM</td><td><a href="http://www.zeiss.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Zeiss, Inc.</a></td><td>ELYRA P.1</td><td>Nikon i Vutara sprzedają również komercyjne mikroskopy PALM.</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td><td>Nova nano</td><td>Można używać innych wysokorozdzielczych mikroskopów SEM.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>EMS</td><td>RT10016</td><td> </td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-1L</td><td> </td></tr><tr><td>Tetroksyd osmu</td><td>EMS</td><td>RT19134</td><td> </td></tr><tr><td>Permanganian potasu</td><td>EMS</td><td>RT20200</td><td> </td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-50G</td><td> </td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>21447-25</td><td>pH octanu uranylu z tej firmy jest nieco wyższe.</td></tr><tr><td>Glikol metakrylanowy (GMA)</td><td>SPI Supplies</td><td>02630-AA</td><td>Niska kwasowość, stopień TEM.</td></tr><tr><td>N,N-dimetylo-p-toluidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9912</td><td> </td></tr><tr><td>Probówki kriogeniczne</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5000-0020</td><td> </td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td>EMS</td><td>72632</td><td> </td></tr><tr><td>Folia Aclar</td><td>EMS</td><td>50425-10</td><td> </td></tr><tr><td>Kapsułka BEEM</td><td>EBSciences</td><td>TC</td><td>Polipropylen</td></tr><tr><td>Wykrojniki DISC 3/8"</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>54741</td><td> </td></tr><tr><td>Nanocząsteczki złota</td><td>microspheres-nanospheres.com</td><td>790122-010</td><td>Zamówić roztwór 2x skoncentrowany</td></tr></tbody></table>

nano-fem: lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapowanie rozkładu białek jest niezbędne do zrozumienia funkcji białek w komórce. Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do lokalizacji białek, jednak w obrazach fluorescencyjnych często brakuje kontekstu subkomórkowego. Z kolei immunomikroskopia elektronowa pozwala na lokalizację białek, ale technika ta jest ograniczona przez brak kompatybilnych przeciwciał, słabe zachowanie morfologii oraz fakt, że większość antygenów nie jest wystawiona na powierzchnię preparatu. Metody korelacyjne umożliwiają najpierw uzyskanie obrazu fluorescencyjnego całej komórki, pochodzącego z immunofluorescencji lub od białek znakowanych genetycznie. Następnie próbka jest utrwalana i zatapiana do mikroskopii elektronowej, a obrazy są korelowane 1-3. Jednakże niska rozdzielczość obrazu fluorescencyjnego oraz brak markerów fiducjalnych uniemożliwiają precyzyjną lokalizację białek.
Alternatywnie obrazowanie fluorescencyjne można przeprowadzić po zakonserwowaniu preparatu w plastiku. W tym podejściu blok zostaje pocięty na sekcje, a następnie koreluje się obrazy fluorescencyjne i mikrografie elektronowe tej samej sekcji 4-7. Jednakże limit dyfrakcyjny światła w obrazie skorelowanym zaciera lokalizację poszczególnych cząsteczek, a fluorescencja często wykracza poza granice komórki.
Fluorescencyjna mikroskopia elektronowa o rozdzielczości nanometrycznej (nano-fEM) została opracowana w celu lokalizacji białek w skali nano poprzez obrazowanie tych samych przekrojów z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (PALM) oraz mikroskopii elektronowej. Metoda PALM pozwala przekroczyć limit dyfrakcyjny dzięki obrazowaniu poszczególnych białek fluorescencyjnych i następującemu temu mapowaniu centroidu każdej plamki fluorescencyjnej 8-10.
Przedstawiamy technikę nano-fEM w pięciu krokach. Po pierwsze, próbkę utrwalono i zatopiono w warunkach zapewniających zachowanie fluorescencji białek znakowanych. Po drugie, bloki żywiczne pocięto na ultrawąskie sekcje (70-80 nm), które zamontowano na szkiełku nakrywkowym. Po trzecie, w tych sekcjach wykonano obrazowanie fluorescencji przy użyciu mikroskopu Zeiss PALM. Po czwarte, w tych samych sekcjach obrazowano struktury gęste elektronowo za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego. Po piąte, mikrografie fluorescencyjne i elektronowe wyrównano, wykorzystując cząsteczki złota jako markery fiducjalne. Podsumowując, subkomórkowa lokalizacja białek znakowanych fluorescencyjnie może zostać określona z rozdzielczością nanometrową w ciągu około jednego tygodnia.

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Mapowanie rozmieszczenia białek jest niezbędne do zrozumienia ich funkcji w komórce. Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowana do...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest lokalizacja białek na mikrografach elektronowych przy użyciu skorelowanej mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej. Metoda ta, znana jako nano FEM, jest wykorzystywana do lokalizacji białek w C. elegans. W pierwszej kolejności robak transgeniczny wykazujący ekspresję histony TD-eos zostaje zatopiony w plastiku i poddany sekcjonowaniu.Każdy przekrój obrazowano za pomocą zarówno mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej fotoaktywacją (PALM), jak i skaningowej mikroskopii elektronowej. Dwa mikrografy dla każdego przekroju zostały wyrównane w programie Photoshop przy użyciu markerów fiducjalnych. Obraz korelacyjny pokazuje lokalizację cząsteczek histonów w jądrze komórkowym.Główną zaletą techniki, którą opiszemy dzisiaj, jest to, że zamiast immuno-EM wykorzystujemy genetycznie kodowane fluorofore, dzięki czemu każde białko jest powiązane z białkiem fluorescencyjnym. W przypadku immuno-EM wiele przeciwciał nie reaguje z tworzywami sztucznymi. Są one po prostu niekompatybilne, a jeśli już są, przeciwciała nie są w stanie wniknąć głęboko w przekrój, w którym znajdują się antygeny.Dzięki zastosowaniu białek fluorescencyjnych każde białko zostaje oznakowane fluoroforem. Dzisiaj Shige Wbi zademonstruje tę technikę. Poniższa procedura zostanie przedstawiona z wykorzystaniem transgenicznych nicieni wykazujących ekspresję histonów oznakowanych białkiem fluorescencyjnym TDE os.W tej demonstracji użyjemy bakterii jako środka krioprotekcyjnego, jednak do mrożenia sea elegance można również zastosować 20% BSA. Na godzinę przed substytucją mrożenia należy napełnić automatyczne urządzenie do substytucji mrożenia lub urządzenie FS ciekłym azotem. Należy również z wyprzedzeniem przygotować niezbędne utrwalacze zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie, rozdzielić utrwalacze na aliquoty o objętości 1 mL w probówkach kriogenicznych i przechowywać je w ciekłym azocie do momentu użycia.Za pomocą pędzla pobierz zwierzęta z lawns bakterii i przenieś je, aby wypełnić nośnik próbek o rozmiarze 100 mikronów. Napełnij naczynko nieco ponad poziom, aby upewnić się, że nie ma w nim pęcherzyków powietrza. Po przygotowaniu umieść naczynko z próbką w uchwycie mrożarki wysokociśnieniowej w celu zamrożenia. Następnie niezwłocznie przenieś próbkę do kąpieli w ciekłym azocie znajdującej się obok komory mrożącej.Następnie, używając pęsety i szczypiec, przenieś preparat do fiolki kriogenicznej zawierającej utrwalacze. Upewnij się, że preparat przez cały czas pozostaje w ciekłym azocie. Powtórz ten proces dla każdego preparatu, a następnie przenieś wszystkie fiolki kriogeniczne do jednostki FS.Po umieszczeniu wszystkich fiolek kriogenicznych w urządzeniu FS należy uruchomić program. Protokół mrożenia i przetwarzania przedstawiono na tym schemacie. Podczas początkowej inkubacji w temperaturze -90 °C lód witryfikowany zostaje zastąpiony utrwalaczem w acetonie.Następnie, w miarę wzrostu temperatury próbki, utrwalacz w ciekłym acetonie tworzy wiązania krzyżowe w próbce, aby zachować jej strukturę. Gdy temperatura w jednostce a FS osiągnie -60 °C, umieść w a FS fiolki scyntylacyjne zawierające 20 mL 95% acetonu w celu ich schłodzenia. Następnie, gdy temperatura osiągnie -50 °C, użyj pipety Pasteura z końcówką P 200, aby usunąć utrwalacz i dodać około 1 mL uprzednio schłodzonego 95% acetonu do każdej próbki żółci.Powtarzaj ten proces co 20 minut przez dwie godziny. Ponadto podczas inkubacji w temperaturze -50 °C umieść w komorze FS fiolkę scyntylacyjną zawierającą 20 ml 0,1% octanu uranylu w 95% acetonie, aby schłodzić ją do -50 °C. Następnie, po ostatnim przemyciu acetonem, dodaj do każdej fiolki około 1 ml roztworu octanu uranylu, aby zabarwić próbkę i zwiększyć kontrast błony.Jeśli program został wstrzymany, należy go wznowić. Po osiągnięciu temperatury -40°C umieść w komorze FS fiolki scyntylacyjne zawierające 95% etanol. Gdy temperatura osiągnie -30°C, użyj pipety Pasteura, aby wymieniać octan mocznika na 95% etanol co 20 minut przez dwie godziny.Na tym etapie ważne jest użycie etanolu, ponieważ żywica nie polimeryzuje w obecności acetonu. W kolejnej części protokołu próbki są zatapiane w plastiku w temperaturze -30°C. W aparacie FS należy zastąpić 95% etanol uprzednio schłodzoną 30% żywicą metakrylanu glikolu lub GMA w 95% etanolu; po trzech do pięciu godzinach zastąpić 30% GMA 70% GMA, a po czterech do sześciu godzinach usunąć 70% GMA i inkubować próbki w 97% GMA przez noc.Stopniowy wzrost stężenia GMA pozwala na penetrację medium do tkanek. Należy zauważyć, że ponieważ do żywicy GMA dodaje się 3% wody, 97% GMA nie ulega rozcieńczeniu. Następnego dnia, po etanolu, przenieść próbki do formy do zatapiania w A FS za pomocą pipety Pasteura, umieścić próbki w formie do zatapiania, a następnie trzykrotnie wymienić 97% GMA na świeżo przygotowane GMA w ciągu sześciu godzin w temperaturze minus 30 degrees celsius.Po trzeciej wymianie stuknij w matrycę bakteryjną, aby oddzielić preparat od krioprotektanta. Do 97% GMA w fiolce wentylacyjnej dodaj inicjator nn dimetylo-urydynę. Ilość dodanego inicjatora wynosi 1,5 µL na jeden ml GMA; niezwłocznie dodaj roztwór GMA do każdej formy do zatapiania i umieść w niej zwierzęta w taki sposób, aby były rozmieszczone równomiernie.Zrestartuj program tak, aby temperatura wzrosła do -20 °C. Choć żywica polimeryzuje szybko w ciągu jednej godziny, pozwól tworzywu utwardzać się przez noc w temperaturze -20 °C, aby mieć pewność, że uległo całkowitej polimeryzacji.Po utwardzeniu tworzywa należy przechowywać preparat w worku próżniowym wypełnionym azotem w temperaturze -20 °C. Krojenie preparatu zatopionego w GMA należy następnie przeprowadzić zgodnie z opisem zawartym w towarzyszącym dokumencie dotyczącym mikroskopii lokalizacji aktywowanej foto-podświetleniem (PALM). System mikroskopowy powinien zostać skonfigurowany z kamerą EMCCD ustawioną na temperaturę -70 °C lub niższą.Za pomocą pipety nanieś około 50 µL cząsteczek złota o rozmiarze 100 nm w stężeniu 1×10¹⁰ cząsteczek/mL w roztworze na próbkę przeznaczoną do obrazowania. Przykryj próbki czarną osłoną i pozostaw roztwór na szkiełku nakrywnym na 30 sekund. Aby usunąć roztwór złota, wydmuchaj go do krawędzi szkiełka nakrywnego i wchłoń go za pomocą chusteczki Kimwipe.Następnie nałóż smar próżniowy na okrągły uchwyt szkiełka nakrywkowego i włóż szkiełko nakrywkowe. Na dolną stronę szkiełka nałóż olej immersyjny. Przesuń je bezpośrednio pod próbkę.Wsuń uchwyt do próbek do szczeliny w stole mikroskopu i ustaw go tak, aby był stabilnie zamocowany, a skrawki znajdowały się centralnie nad obiektywem. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć obiektywów. Następnie, korzystając z oświetlenia w polu jasnym, zlokalizuj skrawki za pomocą obiektywu 10 x.Następnie zmień obiektyw na 100 x i ustaw ostrość na preparacie. W razie potrzeby przełącz na oświetlenie fluorescencyjne, korzystając z lasera o długości fali 488 nanometrów przy natężeniu ustawionym na 10%. Odczekaj pięć minut, aż temperatura próbki się ustabilizuje. Następnie zidentyfikuj obszary o najsilniejszej fluorescencji i ustaw na nich ostrość.Przełącz lasery na 561 nanometrów i zwiększ intensywność do 100%. Aby wyblaknąć autofluorescencję tła, poddaj próbkę fotowybielaniu przez około dwie minuty. Jeśli podczas wybielania zmieni się ostrość, odczekaj pięć minut przed ponownym ustawieniem ostrości i wykonaniem zdjęć. Po zakończeniu wybielania aktywuj laser 405 nanometrów i ustaw go na najniższą intensywność.Rozpocznij zbieranie obrazów z częstotliwością 20 klatek na sekundę. Zbierz wystarczającą liczbę klatek, aby osiągnąć cel niniejszego eksperymentu. W celu określenia lokalizacji 584 białek histonowych w jądrze komórkowym pobiera się od 5 000 do 6 000 klatek.Po zebraniu 5 000 klatek, wszystkie cząsteczki są identyfikowane i mapowane przez oprogramowanie do obrazowania. Końcowy obraz fluorescencyjny, tzw. obraz sum turf, jest kompozytem całej fluorescencji wykrytej przez kamerę. Z kolei obraz palm mapuje OID każdego fluorescencyjnego punktu i wskazuje jedynie lokalizację każdego białka.Przed obrazowaniem SEM należy zabarwić skrawki, używając 2,5% octanu uranylu w wodzie przez cztery minuty. Następnie dokładnie wypłukać octan uranylu wodą milli QE z filtra. Po wyschnięciu skrawków należy użyć napylacza, aby pokryć szkiełko podstawowe warstwą węgla, aż stanie się ono dość ciemne.Nanieś przewodzącą taśmę węglową na krawędź szkiełka nakrywkowe z jednej strony oraz na metalowy stub z drugiej strony, aby elektrony gromadzące się na powierzchni szkiełka zostały uziemione. Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze SEM i zlokalizuj preparat w mikroskopie. Wykonaj obraz preparatu przy niskim powiększeniu, następnie przybliż interesujący region i uzyskaj obrazy przy wysokim powiększeniu.Powtarzaj ten proces dla kolejnych fragmentów, aż wszystkie sekcje zostaną obrazowane. Następnie należy dopasować obrazy z palm i EM. W tym celu najpierw otwórz pozyskane obrazy SEM w programie Photoshop.Utwórz nowe okno o wymiarach 5 000 na 5 000 pikseli i rozdzielczości 300 pikseli na cal. Skopiuj obraz z SEM przy niskim powiększeniu do nowego okna. Użyj polecenia swobodnej transformacji (free transform) z menu Edycja, aby przeskalować obraz tak, by wypełniał całe okno.Następnie skopiuj obrazy SEM o większym powiększeniu, a następnie przeskaluj i przekształć je w razie potrzeby. Wybierz obrót obrazu z rozwijanego paska menu obrazu i odwróć poziomo obraz sum turf. Skopiuj i wklej obraz sum turf do nowej warstwy.Użyj polecenia swobodnej transformacji (free transform) w menu edycji, aby przeskalować obraz tak, by miał on zbliżony rozmiar do mikrografii elektronowej o niskim powiększeniu. Następnie obróć obraz w taki sposób, aby fluorescencja cząsteczek złota pokrywała się z odpowiadającymi im strukturami widocznymi w SEM. W kolejnym kroku skopiuj obraz dłoni do nowej warstwy i zastosuj tę samą transformację, aby wyodrębnić obraz o wyższym powiększeniu.Przybliż obszar zainteresowania i skopiuj obraz dłoni z tego regionu. Wklej obraz do zdjęcia SEM o wyższej rozdzielczości w celu prezentacji. Do obrazu dłoni należy zastosować gradient przezroczystości w taki sposób, aby przezroczyste stało się jedynie czarne tło, a nie sygnały pochodzące z dłoni.Skopiuj obraz przekształconej dłoni do nowej warstwy. Wybierz sygnały z dłoni, pomijając tło, korzystając z funkcji zakresu kolorów w rozwijanym menu zaznaczania. Następnie zaznacz piksel tła jako punkt odniesienia i włącz opcję odwrócenia zaznaczenia.Wytnij wybrane sygnały dłoni i wklej je na nową warstwę. Zastosuj przezroczystość do warstwy tła i ustaw ją na 10%. Pozwala to na wizualizację sygnałów dłoni poprzez uczynienie tła przezroczystym bez utraty intensywności. Białko histonowe.Oznaczony His11 TD eos był stabilnie ekspresowany w nicieniu c elgan, a zwierzęta transgeniczne zostały poddane obróbce i obrazowaniu zgodnie z protokołem opisanym w tym filmie. Mikrografie PALM i elektronowe wykonano z tego samego przekroju. Nanocząsteczki złota, widoczne zarówno na mikrografach fluorescencyjnych, jak i elektronowych, zostały następnie wykorzystane do wyrównania obu obrazów.Tutaj przybliżamy obszar znajdujący się w pobliżu górnej krawędzi mikrofotografii. Jak widać tutaj, widoczne są szczegóły subkomórkowe, takie jak jądro komórkowe.Można zaobserwować jądro, pory jądrowe oraz retikulum endoplazmatyczne. Jednakże znakowane cząsteczki histonów są zlokalizowane wyłącznie w jądrze, a nie poza nim. Zgodnie z oczekiwaniami, korelacyjna mikroskopia PALM i elektronowa pozwala zatem na lokalizację białek z najwyższą rozdzielczością. Po przeprowadzeniu tej procedury można pobrać te przekroje z rozkładem białek i ułożyć je w stos za pomocą tomografii macierzowej, aby wygenerować strukturę trójwymiarową, która pokazuje, w których miejscach w komórce rozłożone są białka.Należy pamiętać, że podczas pracy z tetrotlenkiem osmu mamy do czynienia z bardzo niebezpieczną substancją chemiczną, dlatego zawsze należy używać rękawiczek.

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nano-fEM: Lokalizacja białek za pomocą fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i mikroskopii elektronowej

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Obecny protokół opisuje technologię znakowania za pomocą klonowalnego mikroskopu elektronowego do wykrywania białek znakowanych metalotioneiną w komórkach za pomocą nowatorskiej techniki syntezy nanocząstek złota opartej na mechanizmie tłumienia autonukleacji.

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Poznaj metodę nano-fEM do lokalizacji białek w mikrografach elektronowych z wykorzystaniem skorelowanej mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej. Technika ta umożliwia precyzyjne badanie lokalizacji białek w organizmach transgenicznych.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów