Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest lokalizacja białek na mikrografach elektronowych przy użyciu skorelowanej mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej. Metoda ta, znana jako nano FEM, jest wykorzystywana do lokalizacji białek w C. elegans. W pierwszej kolejności robak transgeniczny wykazujący ekspresję histony TD-eos zostaje zatopiony w plastiku i poddany sekcjonowaniu.

Każdy przekrój obrazowano za pomocą zarówno mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej fotoaktywacją (PALM), jak i skaningowej mikroskopii elektronowej. Dwa mikrografy dla każdego przekroju zostały wyrównane w programie Photoshop przy użyciu markerów fiducjalnych. Obraz korelacyjny pokazuje lokalizację cząsteczek histonów w jądrze komórkowym.

Główną zaletą techniki, którą opiszemy dzisiaj, jest to, że zamiast immuno-EM wykorzystujemy genetycznie kodowane fluorofore, dzięki czemu każde białko jest powiązane z białkiem fluorescencyjnym. W przypadku immuno-EM wiele przeciwciał nie reaguje z tworzywami sztucznymi. Są one po prostu niekompatybilne, a jeśli już są, przeciwciała nie są w stanie wniknąć głęboko w przekrój, w którym znajdują się antygeny.

Dzięki zastosowaniu białek fluorescencyjnych każde białko zostaje oznakowane fluoroforem. Dzisiaj Shige Wbi zademonstruje tę technikę. Poniższa procedura zostanie przedstawiona z wykorzystaniem transgenicznych nicieni wykazujących ekspresję histonów oznakowanych białkiem fluorescencyjnym TDE os.

W tej demonstracji użyjemy bakterii jako środka krioprotekcyjnego, jednak do mrożenia sea elegance można również zastosować 20% BSA. Na godzinę przed substytucją mrożenia należy napełnić automatyczne urządzenie do substytucji mrożenia lub urządzenie FS ciekłym azotem. Należy również z wyprzedzeniem przygotować niezbędne utrwalacze zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie, rozdzielić utrwalacze na aliquoty o objętości 1 mL w probówkach kriogenicznych i przechowywać je w ciekłym azocie do momentu użycia.

Za pomocą pędzla pobierz zwierzęta z lawns bakterii i przenieś je, aby wypełnić nośnik próbek o rozmiarze 100 mikronów. Napełnij naczynko nieco ponad poziom, aby upewnić się, że nie ma w nim pęcherzyków powietrza. Po przygotowaniu umieść naczynko z próbką w uchwycie mrożarki wysokociśnieniowej w celu zamrożenia. Następnie niezwłocznie przenieś próbkę do kąpieli w ciekłym azocie znajdującej się obok komory mrożącej.

Następnie, używając pęsety i szczypiec, przenieś preparat do fiolki kriogenicznej zawierającej utrwalacze. Upewnij się, że preparat przez cały czas pozostaje w ciekłym azocie. Powtórz ten proces dla każdego preparatu, a następnie przenieś wszystkie fiolki kriogeniczne do jednostki FS.

Po umieszczeniu wszystkich fiolek kriogenicznych w urządzeniu FS należy uruchomić program. Protokół mrożenia i przetwarzania przedstawiono na tym schemacie. Podczas początkowej inkubacji w temperaturze -90 °C lód witryfikowany zostaje zastąpiony utrwalaczem w acetonie.

Następnie, w miarę wzrostu temperatury próbki, utrwalacz w ciekłym acetonie tworzy wiązania krzyżowe w próbce, aby zachować jej strukturę. Gdy temperatura w jednostce a FS osiągnie -60 °C, umieść w a FS fiolki scyntylacyjne zawierające 20 mL 95% acetonu w celu ich schłodzenia. Następnie, gdy temperatura osiągnie -50 °C, użyj pipety Pasteura z końcówką P 200, aby usunąć utrwalacz i dodać około 1 mL uprzednio schłodzonego 95% acetonu do każdej próbki żółci.

Powtarzaj ten proces co 20 minut przez dwie godziny. Ponadto podczas inkubacji w temperaturze -50 °C umieść w komorze FS fiolkę scyntylacyjną zawierającą 20 ml 0,1% octanu uranylu w 95% acetonie, aby schłodzić ją do -50 °C. Następnie, po ostatnim przemyciu acetonem, dodaj do każdej fiolki około 1 ml roztworu octanu uranylu, aby zabarwić próbkę i zwiększyć kontrast błony.

Jeśli program został wstrzymany, należy go wznowić. Po osiągnięciu temperatury -40°C umieść w komorze FS fiolki scyntylacyjne zawierające 95% etanol. Gdy temperatura osiągnie -30°C, użyj pipety Pasteura, aby wymieniać octan mocznika na 95% etanol co 20 minut przez dwie godziny.

Na tym etapie ważne jest użycie etanolu, ponieważ żywica nie polimeryzuje w obecności acetonu. W kolejnej części protokołu próbki są zatapiane w plastiku w temperaturze -30°C. W aparacie FS należy zastąpić 95% etanol uprzednio schłodzoną 30% żywicą metakrylanu glikolu lub GMA w 95% etanolu; po trzech do pięciu godzinach zastąpić 30% GMA 70% GMA, a po czterech do sześciu godzinach usunąć 70% GMA i inkubować próbki w 97% GMA przez noc.

Stopniowy wzrost stężenia GMA pozwala na penetrację medium do tkanek. Należy zauważyć, że ponieważ do żywicy GMA dodaje się 3% wody, 97% GMA nie ulega rozcieńczeniu. Następnego dnia, po etanolu, przenieść próbki do formy do zatapiania w A FS za pomocą pipety Pasteura, umieścić próbki w formie do zatapiania, a następnie trzykrotnie wymienić 97% GMA na świeżo przygotowane GMA w ciągu sześciu godzin w temperaturze minus 30 degrees celsius.

Po trzeciej wymianie stuknij w matrycę bakteryjną, aby oddzielić preparat od krioprotektanta. Do 97% GMA w fiolce wentylacyjnej dodaj inicjator nn dimetylo-urydynę. Ilość dodanego inicjatora wynosi 1,5 µL na jeden ml GMA; niezwłocznie dodaj roztwór GMA do każdej formy do zatapiania i umieść w niej zwierzęta w taki sposób, aby były rozmieszczone równomiernie.

Zrestartuj program tak, aby temperatura wzrosła do -20 °C. Choć żywica polimeryzuje szybko w ciągu jednej godziny, pozwól tworzywu utwardzać się przez noc w temperaturze -20 °C, aby mieć pewność, że uległo całkowitej polimeryzacji.

Po utwardzeniu tworzywa należy przechowywać preparat w worku próżniowym wypełnionym azotem w temperaturze -20 °C. Krojenie preparatu zatopionego w GMA należy następnie przeprowadzić zgodnie z opisem zawartym w towarzyszącym dokumencie dotyczącym mikroskopii lokalizacji aktywowanej foto-podświetleniem (PALM). System mikroskopowy powinien zostać skonfigurowany z kamerą EMCCD ustawioną na temperaturę -70 °C lub niższą.

Za pomocą pipety nanieś około 50 µL cząsteczek złota o rozmiarze 100 nm w stężeniu 1×10¹⁰ cząsteczek/mL w roztworze na próbkę przeznaczoną do obrazowania. Przykryj próbki czarną osłoną i pozostaw roztwór na szkiełku nakrywnym na 30 sekund. Aby usunąć roztwór złota, wydmuchaj go do krawędzi szkiełka nakrywnego i wchłoń go za pomocą chusteczki Kimwipe.

Następnie nałóż smar próżniowy na okrągły uchwyt szkiełka nakrywkowego i włóż szkiełko nakrywkowe. Na dolną stronę szkiełka nałóż olej immersyjny. Przesuń je bezpośrednio pod próbkę.

Wsuń uchwyt do próbek do szczeliny w stole mikroskopu i ustaw go tak, aby był stabilnie zamocowany, a skrawki znajdowały się centralnie nad obiektywem. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć obiektywów. Następnie, korzystając z oświetlenia w polu jasnym, zlokalizuj skrawki za pomocą obiektywu 10 x.

Następnie zmień obiektyw na 100 x i ustaw ostrość na preparacie. W razie potrzeby przełącz na oświetlenie fluorescencyjne, korzystając z lasera o długości fali 488 nanometrów przy natężeniu ustawionym na 10%. Odczekaj pięć minut, aż temperatura próbki się ustabilizuje. Następnie zidentyfikuj obszary o najsilniejszej fluorescencji i ustaw na nich ostrość.

Przełącz lasery na 561 nanometrów i zwiększ intensywność do 100%. Aby wyblaknąć autofluorescencję tła, poddaj próbkę fotowybielaniu przez około dwie minuty. Jeśli podczas wybielania zmieni się ostrość, odczekaj pięć minut przed ponownym ustawieniem ostrości i wykonaniem zdjęć. Po zakończeniu wybielania aktywuj laser 405 nanometrów i ustaw go na najniższą intensywność.

Rozpocznij zbieranie obrazów z częstotliwością 20 klatek na sekundę. Zbierz wystarczającą liczbę klatek, aby osiągnąć cel niniejszego eksperymentu. W celu określenia lokalizacji 584 białek histonowych w jądrze komórkowym pobiera się od 5 000 do 6 000 klatek.

Po zebraniu 5 000 klatek, wszystkie cząsteczki są identyfikowane i mapowane przez oprogramowanie do obrazowania. Końcowy obraz fluorescencyjny, tzw. obraz sum turf, jest kompozytem całej fluorescencji wykrytej przez kamerę. Z kolei obraz palm mapuje OID każdego fluorescencyjnego punktu i wskazuje jedynie lokalizację każdego białka.

Przed obrazowaniem SEM należy zabarwić skrawki, używając 2,5% octanu uranylu w wodzie przez cztery minuty. Następnie dokładnie wypłukać octan uranylu wodą milli QE z filtra. Po wyschnięciu skrawków należy użyć napylacza, aby pokryć szkiełko podstawowe warstwą węgla, aż stanie się ono dość ciemne.

Nanieś przewodzącą taśmę węglową na krawędź szkiełka nakrywkowe z jednej strony oraz na metalowy stub z drugiej strony, aby elektrony gromadzące się na powierzchni szkiełka zostały uziemione. Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze SEM i zlokalizuj preparat w mikroskopie. Wykonaj obraz preparatu przy niskim powiększeniu, następnie przybliż interesujący region i uzyskaj obrazy przy wysokim powiększeniu.

Powtarzaj ten proces dla kolejnych fragmentów, aż wszystkie sekcje zostaną obrazowane. Następnie należy dopasować obrazy z palm i EM. W tym celu najpierw otwórz pozyskane obrazy SEM w programie Photoshop.

Utwórz nowe okno o wymiarach 5 000 na 5 000 pikseli i rozdzielczości 300 pikseli na cal. Skopiuj obraz z SEM przy niskim powiększeniu do nowego okna. Użyj polecenia swobodnej transformacji (free transform) z menu Edycja, aby przeskalować obraz tak, by wypełniał całe okno.

Następnie skopiuj obrazy SEM o większym powiększeniu, a następnie przeskaluj i przekształć je w razie potrzeby. Wybierz obrót obrazu z rozwijanego paska menu obrazu i odwróć poziomo obraz sum turf. Skopiuj i wklej obraz sum turf do nowej warstwy.

Użyj polecenia swobodnej transformacji (free transform) w menu edycji, aby przeskalować obraz tak, by miał on zbliżony rozmiar do mikrografii elektronowej o niskim powiększeniu. Następnie obróć obraz w taki sposób, aby fluorescencja cząsteczek złota pokrywała się z odpowiadającymi im strukturami widocznymi w SEM. W kolejnym kroku skopiuj obraz dłoni do nowej warstwy i zastosuj tę samą transformację, aby wyodrębnić obraz o wyższym powiększeniu.

Przybliż obszar zainteresowania i skopiuj obraz dłoni z tego regionu. Wklej obraz do zdjęcia SEM o wyższej rozdzielczości w celu prezentacji. Do obrazu dłoni należy zastosować gradient przezroczystości w taki sposób, aby przezroczyste stało się jedynie czarne tło, a nie sygnały pochodzące z dłoni.

Skopiuj obraz przekształconej dłoni do nowej warstwy. Wybierz sygnały z dłoni, pomijając tło, korzystając z funkcji zakresu kolorów w rozwijanym menu zaznaczania. Następnie zaznacz piksel tła jako punkt odniesienia i włącz opcję odwrócenia zaznaczenia.

Wytnij wybrane sygnały dłoni i wklej je na nową warstwę. Zastosuj przezroczystość do warstwy tła i ustaw ją na 10%. Pozwala to na wizualizację sygnałów dłoni poprzez uczynienie tła przezroczystym bez utraty intensywności. Białko histonowe.

Oznaczony His11 TD eos był stabilnie ekspresowany w nicieniu c elgan, a zwierzęta transgeniczne zostały poddane obróbce i obrazowaniu zgodnie z protokołem opisanym w tym filmie. Mikrografie PALM i elektronowe wykonano z tego samego przekroju. Nanocząsteczki złota, widoczne zarówno na mikrografach fluorescencyjnych, jak i elektronowych, zostały następnie wykorzystane do wyrównania obu obrazów.

Tutaj przybliżamy obszar znajdujący się w pobliżu górnej krawędzi mikrofotografii. Jak widać tutaj, widoczne są szczegóły subkomórkowe, takie jak jądro komórkowe.

Można zaobserwować jądro, pory jądrowe oraz retikulum endoplazmatyczne. Jednakże znakowane cząsteczki histonów są zlokalizowane wyłącznie w jądrze, a nie poza nim. Zgodnie z oczekiwaniami, korelacyjna mikroskopia PALM i elektronowa pozwala zatem na lokalizację białek z najwyższą rozdzielczością. Po przeprowadzeniu tej procedury można pobrać te przekroje z rozkładem białek i ułożyć je w stos za pomocą tomografii macierzowej, aby wygenerować strukturę trójwymiarową, która pokazuje, w których miejscach w komórce rozłożone są białka.

Należy pamiętać, że podczas pracy z tetrotlenkiem osmu mamy do czynienia z bardzo niebezpieczną substancją chemiczną, dlatego zawsze należy używać rękawiczek.