Name: Zbieranie i kriochłodzenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu określenia struktury za pomocą krystalografii makromolekularnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: Naucz się zbierać i kriochłodzić kryształy białek błonowych hodowane w mezofazach lipidowych. Metoda in meso umożliwia przygotowanie próbek do krystalografii rentgenowskiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wiele osób przyczyniło się do powstania tej pracy, z czego większość to byli i obecni członkowie grupy Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group. Wszystkim, a w szczególności Jingquan Tan i Joseph Lyons, składamy najserdeczniejsze podziękowania i wyrazy uznania. Praca ta była częściowo finansowana z grantów Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 oraz U54GM094599) oraz FP7 COST i Marie Curie Actions (CM0902 oraz PIEF-GA-2009-235612).

1. Przygotowanie laboratorium przed zbiorem
<ol>
 <li>W ramach przygotowań do zbioru wypełnij suchy naczynie Dewar z pianki ciekłym azotem i ustaw je obok mikroskopu, przy którym będzie odbywał się zbiór. </li>
 <li>Zanurz kasetę do przechowywania otwartym końcem do góry w ciekłym azocie w naczyniu Dewar z pianki i poczekaj do jej całkowitego schłodzenia. </li>
 <li>Zamocuj mikromont o rozmiarze dopasowanym do kryształu przeznaczonego do zbioru na magnetycznym pręcie (Rysunek 5). Ważne jest, aby mieć pod ręką kilka zapasowych prętów magnetycznych z założonymi mikromontami na wypadek konieczności zebrania kilku kryształów z jednego bolusa. Zapasowe pręty powinny być dostępne przez cały czas. </li>
 <li>Obok mikroskopu do zbioru umieść mikropipetę, końcówki oraz roztwór precypitantu użyty do wzrostu kryształów. Może być on potrzebny do pokrycia mezofazy i zapobiegania wysychaniu po otwarciu dołka. </li>
 <li>Przygotuj na blacie w pobliżu notes i długopis i/lub otwórz komputer. Będą one służyć do zapisywania obserwacji dotyczących jakości, wyglądu, lokalizacji, numeru kasety do przechowywania itp. kryształów w miarę ich zbierania, chłodzenia kriogenicznego i umieszczania w magazynie. </li>
 <li>Jeśli dostępny jest asystent pomagający w zbiorze, osoba ta musi jasno rozumieć stosowany protokół, kolejność poszczególnych kroków oraz swoją rolę w całym procesie. </li>
</ol>
Po przygotowaniu wszystkich materiałów i sprzętu naszym następnym zadaniem jest:
2. Identyfikacja płytek i studzienek zawierających kryształy
<ol>
 <li>Najprostszym i najbardziej bezpośrednim sposobem znalezienia kryształów nadających się do zbioru jest ręczna inspekcja dołków przy użyciu mikroskopu w świetle normalnym oraz w skrzyżowanych polaryzatorach. Regulacja natężenia światła oświetlającego w mikroskopie może pomóc w zlokalizowaniu kryształów.</li>
 <li>Alternatywnie do poszukiwania kryształów można wykorzystać system obrazowania, w którym płytki są przesiewane automatycznie w świetle normalnym i w skrzyżowanych polaryzatorach.</li>
 <li>Dokonać wizualnej oceny zapisanych obrazów cyfrowych na monitorze komputera.</li>
 <li>Wyraźnie zaznaczyć dołki zawierające kryształy przeznaczone do zbioru oraz zapisać w notatniku lub w komputerze uwagi dotyczące wielkości, jakości i położenia kryształów w mezofazie.</li>
 <li>Wyjąć z urządzenia obrazującego płytkę zawierającą kryształy przeznaczone do zbioru.</li>
</ol>
3. Otwieranie studni z mezofazą kubiczną. Metoda 1
Płytki, w których kryształy rosną metodą in meso, są szklanymi płytkami kanapkowymi (Rysunek 2). Aby uzyskać dostęp do mezofazy i znajdujących się w niej kryształów, konieczne jest otwarcie studzienki. Odbywa się to poprzez przecięcie narzędziem do cięcia szkła górnego szkiełka zakrywającego, które uszczelnia studzienkę, a następnie jego usunięcie.
Istnieje kilka podejść do wycinania i usuwania szkiełka podstawowego z otworu krystalizacyjnego. Wybór metody zależy od rodzaju mezofazy, w której rośnie kryształ. Może to być bardzo lepka i ciągliwa faza sześcienna (Ryc. 3A) lub jej bardziej płynny wariant, faza gąbczasta (Ryc. 3B). W niniejszym artykule wideo pokazujemy, jak otwierać otwory i pozyskiwać kryształy z obu tych materiałów gospodarzy.
<ol>
 <li>Umieść szklaną płytkę krystalizacyjną typu „sandwich” na stoliku mikroskopu świetlnego.</li>
 <li>Za pomocą narzędzia do cięcia szkła lekko nacinaj szkiełko nakrywkę, tworząc dwa koncentryczne okręgi znajdujące się nad dystansem i tuż poza obrysem studzienki. W przypadku nowego narzędzia nacinanie wymaga minimalnego nacisku. Wymień narzędzie na nowe, gdy wymagany nacisk wzrośnie choćby nieznacznie; dzieje się to zazwyczaj po otwarciu 10 studzienek.</li>
 <li>Rozkrusz szkło w przestrzeni między dwoma naciętymi okręgami w celu uwolnienia wewnętrznego szkiełka nakrywki. Powoduje to powstanie wielu odłamków i pyłu szklanego. Usuń je za pomocą zwilżonego ręcznika papierowego.</li>
 <li>Usuń uwolnione szkiełko nakrywkę, chwytając je pęsetą z cienkimi końcówkami i odchylając od studzienki, aż całkowicie z niej zsunie. W ten sposób faza kubiczna pozostaje przytwierdzona do płytki podstawy studzienki.</li>
 <li>Zwiększ powiększenie, aby uzyskać wyraźniejszy obraz kubicznej mezofazy, która jest teraz gotowa do zbioru kryształów.</li>
</ol>
4. Otwieranie studni z mezofazą kubiczną. Metoda 2
<ol>
 <li>Za pomocą narzędzia do cięcia szkła nacinamy proste, równoległe linie w szkiełku nakrywkowym po jednej stronie studzienki, tak aby linie te przechodziły przez samą studzienkę. Umożliwia to łatwiejszy dostęp pęsetą do szkiełka nakrywkowego i jego usunięcie.</li>
</ol>
W tej konkretnej demonstracji szkiełko zakrywa pęka podczas oddzielania go od lepkiej powierzchni dystansera. W tym procesie szkiełko przesuwa się, a precypitant oddziela się od fazy kubicznej. Podczas podnoszenia szkiełka część precypitantu zostaje wraz z nim usunięta. Pozostaje odsłonięta grudka mezofazy bez otaczającego ją precypitantu. Należy niezwłocznie dodać za pomocą mikropipety 1 μl świeżego precypitantu na wierzch grudki, aby zapobiec wysychaniu mezofazy i zmianie fazy, która mogłaby uszkodzić kryształy. Grudka jest teraz gotowa do wykorzystania w procesie zbioru kryształów.
5. Otwieranie studni z fazą gąbczastą. Niepowodzenie
Faza gąbczasta jest trudniejsza w obróbce ze względu na jej zdolność do płynięcia. Jeśli w wyniku tego przepływu faza gąbczasta zetknie się z obwodem studzienki, zjawisko kapilarności spowoduje wyprowadzenie mezofazy na zewnątrz, co doprowadzi do utraty kryształów. Przykład takiego zdarzenia pokazano w tym fragmencie wideo.
<ol>
 <li>Przybliż obraz fazy gąbczastej i przełączaj się między światłem naturalnym a spolaryzowanym w świetle skrzyżowanym, aby zlokalizować kryształy w fazie gąbczastej.</li>
 <li>W ramach przygotowań do otwarcia studzienki, nacinaj i utnij szkiełko nakrywkę zgodnie z opisem w sekcji 3. W trakcie tego procesu szkiełko nakrywkowe pęka. Podczas próby otwarcia studzienki precypitant przemieszcza się w kierunku pęknięcia i ostatecznie styka się z dystansem. Wraz z precypitantem przemieszcza się część fazy gąbczastej oraz zawarte w niej kryształy, które ulegają utraceniu.</li>
</ol>
W tej konkretnej sekwencji polaryzatory w mikroskopie nie są całkowicie skrzyżowane, dzięki czemu kryształy są widoczne jako jasne obiekty, podczas gdy studzienka i jej zawartość pozostają widoczne.
6. Prawidłowe otwarcie studzienki z fazą gąbczastą
<ol>
 <li>Przybliżyć obraz fazy gąbczastej i zidentyfikować kryształ zarówno w świetle normalnym, jak i w świetle spolaryzowanym z krzyżnymi polaryzatorami.</li>
 <li>Naciąć, odciąć i usunąć fragment szkiełka nakrywkowego zakrywającego dołek, zgodnie z opisem w Sekcji 4.1. Do śledzenia kryształu należy używać niepełnie skrzyżowanych polaryzatorów.</li>
 <li>Wprowadzić kawałek suchego papieru chłonnego przez otwór w szkiełku nakrywkowym do wnętrza dołka, aż dotknie on roztworu precypitanta. Ostrożnie odsączyć roztwór, aż niemal całkowicie zniknie, a następnie usunąć papier. Spowoduje to cofnięcie się pozostałego precypitanta i fazy gąbczastej wraz z kryształem pod szkiełko nakrywkowe.</li>
 <li>Naciąć, odciąć i usunąć pęsetą resztę szkiełka nakrywkowego, zgodnie z opisem w Sekcji 4.1. W tym przypadku faza gąbczasta ulega rozdzieleniu; część pozostaje w dołku, a część przylega do szkiełka nakrywkowego. Kryształ znajduje się w grudce na szkiełku. Ze względu na bardzo małą ilość obecnego precypitanta, faza gąbczasta zaczyna przechodzić przejście fazowe, prawdopodobnie na skutek wysychania. Jest to widoczne jako pierścień dwójłomności przemieszczający się w stronę centrum grudki. Natychmiast dodać precypitant do grudki, aby zatrzymać to przejście. Grudka jest teraz gotowa do użycia w procesie pozyskiwania kryształów.</li>
</ol>
7. Zbiór i schładzanie kryształów z fazy sześciennej w temperaturach kriogenicznych
<ol>
 <li>Przełączaj się między normalnym a skrzyżowanym światłem spolaryzowanym, aby zlokalizować kryształy w kropelce fazy kubicznej w otwartym dołku. W tej sekwencji wideo w kropelce fazy kubicznej przy skrzyżowanym świetle spolaryzowanym można zauważyć do czterech kryształów dwójłomnych.</li>
 <li>Użyj zamontowanej pętli kriogenicznej (Rycina 5), aby przeszukać świeżo odsłoniętą mezofazę w poszukiwaniu kryształów, wyłowić je, a następnie natychmiast po pobraniu zanurzyć je wraz z pętlą w ciekłym azocie w naczyniu Dewara. Idealnie, pobranie i gwałtowne schładzanie powinny odbyć się w jednym, ciągłym i szybkim ruchu. Wraz z kryształem powinno zostać pobrane jak najmniej przylegającej mezofazy. W naszym doświadczeniu w przypadku kryształów hodowanych in meso nie jest wymagany krioprotektant.</li>
 <li>Ponieważ nie jest możliwe sprawdzenie obecności kryształu w pętli kriogenicznej bezpośrednio po pobraniu, obejrzyj kropelkę mezofazy użytą do pobrania, aby zweryfikować, czy kryształ już w niej nie występuje, co sugeruje pomyślne pobranie.</li>
</ol>
8. Zbiór i kriochłodzenie kryształów z fazy gąbczastej
<ol>
 <li>Przełączaj się między zwykłym a skrzyżowanym światłem spolaryzowanym, aby zlokalizować kryształy w kuleczce fazy gąbczastej w otwartym dołku. W tej sekwencji wideo w kuleczce pod skrzyżowanym światłem spolaryzowanym widocznych jest wiele kryształów dwójłomnych.</li>
 <li>Użyj zamocowanej pętelki kriogenicznej (Rysunek 5), aby wyłowić kryształy z fazy gąbczastej i natychmiast po ich pobraniu zanurzyć je, wraz z pętelką, w ciekłym azocie w naczyniu Dewara. Podobnie jak przy pobieraniu z fazy kubicznej, proces schładzania kriogenicznego powinien odbyć się idealnie w momencie wyłowienia kryształu, tak aby czas między samym pobraniem a zanurzeniem w ciekłym azocie był jak najkrótszy. Należy pobrać kryształ wraz z jak najmniejszą ilością przylegającej fazy gąbczastej. Jak wspomniano, w przypadku kryształów hodowanych in meso nie jest wymagany krioprotektant.</li>
</ol>
9. Przechowywanie kryształów w naczyniach Dewara
<ol>
 <li>Po zanurzeniu zamontowanej pętli w ciekłym azocie, umieść ją w jednym z gniazd uchwytu w dysku magazynowym w piankowym naczyniu Dewara. Wszystkie manipulacje wykonuje się tak, aby pętla, górna część magnetycznego pręta oraz dysk pozostawały zanurzone w ciekłym azocie.</li>
 <li>Zapisz w notesie i/lub w komputerze lokalizację oraz szczegóły dotyczące pobranego i schłodzonego kriogenicznie kryształu.</li>
 <li>Gdy dysk w piankowym naczyniu Dewara zostanie zapełniony lub gdy zakończone zostanie pobieranie kryształów na dany dzień, przenieś dysk do wielopoziomowego uchwytu w naczyniu Dewara do przechowywania lub transportu wypełnionym ciekłym azotem. Kryształy mogą być transportowane w naczyniach Dewara do ośrodka synchrotronowego w celu przeprowadzenia pomiarów dyfrakcyjnych.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Celem zaprezentowanych tutaj ćwiczeń z zakresu pobierania i chłodzenia kriogenicznego jest przeniesienie kryształu z otaczającej go mezofazy do pętli kriogenicznych, witryfikacja kryształu w pętli oraz umieszczenie go w ciekłym azocie w naczyniu typu Dewar. Sytuacją idealną jest przeprowadzenie pobierania i chłodzenia kriogenicznego w taki sposób, aby w procesie tym zachowana została jakość dyfrakcyjna kryształu. Wraz z kryształem należy pobrać jak najmniej mezofazy. Ma to na celu ułatwienie lokalizacji kryształu i jego centrowania w wiązce promieni rentgenowskich, przyspieszenie chłodzenia kriogenicznego w celu witryfikacji oraz zminimalizowanie zakłócającego rozproszenia tła pochodzącego z mezofazy podczas zbierania danych dyfrakcyjnych. Przykłady próbek chłodzonych kriogenicznie, na których kryształ jest widoczny lub niewidoczny, przedstawiono na Rysunku 6. W przypadkach, gdy kryształ nie jest widoczny gołym okiem, zazwyczaj konieczne jest zastosowanie skanowania dyfrakcyjnego (rastering), aby zlokalizować kryształ i wycentrować go w wiązce w celu zbierania danych27.
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Struktura błony komórkowej; schemat przedstawiający dwuwarstwę fosfolipidową, białka i cząsteczki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczne przedstawienie błony biologicznej ukazujący dwuwarstwę lipidową, w której i na której znajdują się różne białka. 
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Schemat układu do krystalizacji mikrofluidycznej; płytka 96-dołkowa, faza kubiczna, krystalizacja białek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. W pełni wypełniona i zamknięta szklana płytka krystalizacyjna typu sandwich z 96 dołkami. Każdy dołek zawiera 50 nl fazy kubicznej i 1 μl roztworu precypitantu. Dla przejrzystości faza kubiczna została zabarwiona czerwienią Sudanu, a roztwór precypitantu zawiera błękit metylenowy. Z referencji 5.
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe pokazują mikrostruktury kryształów w skalach 25 μm i 30 μm do analizy strukturalnej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Kryształy białek błonowych rosnące w lipidowej mezofazie. A. Faza sześcienna z kryształem bakteriorodopsyny z H. halobium. B. Faza gąbczasta zawierająca kryształ receptora/transportera witaminy B12, BtuB, z E. coli. Z odniesienia 25. Fazy sześcienna i gąbczasta mają odmienny wygląd, co jest oczywiste po porównaniu paneli A i B. Faza sześcienna w A jest niezwykle lepka i zachowuje swój pierwotny kształt. Nie przepływa. Jest to szczególnie widoczne na krawędziach kropelki mezofazy, które mają chropowaty wygląd. W przeciwieństwie do niej, faza gąbczasta jest znacznie mniej lepka i wykazuje zdolność do przepływu. W związku z tym faza gąbczasta nie zachowuje swojego pierwotnego kształtu, a jej krawędzie są charakterystycznie gładkie. Precypitanty zawierające Jeffamine, PEG 400, 2-metylo-2,4-pentandiol, propoksylan pentaerytrytolu, butandiol i heksandiol mogą prowadzić do przejścia z fazy sześciennej w fazę gąbczastą4,26.
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Schemat procesu krystalizacji białek przedstawiający kroki, fazy i wyniki eksperymentalne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Schemat blokowy podsumowuje kroki zaangażowane w produkcję, pozyskiwanie i chłodzenie kriogeniczne kryształów białek błonowych hodowanych in meso (A). W niniejszym artykule JoVE omówiono jedynie kroki otoczone czerwoną przerywaną linią, opisane szczegółowo w części (B). Panel A pochodzi z publikacji 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Układ elektrofizjologiczny: elektroda patch-clamp, końcówka pipety. Rejestracja sygnału w badaniach neuronów." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Pusta pętla kriogeniczna zamocowana na pinie, który jest utrzymywany w miejscu przez magnetyczny uchwyt. Przedstawiono powiększone widoki pinu (A) oraz mikromocowania (B) tego istotnego narzędzia służącego do pobierania próbek i ich schładzania kriogenicznego. Pusta pętla na końcu mikromocowania na obrazie B ma średnicę 30 μm. Choć nie testowaliśmy szeroko innych typów pętli, stwierdzono, że pokazane pętle MiTeGen sprawdzają się dobrze zarówno w fazach sześciennych, jak i gąbczastych. 
<img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Obraz mikroskopowy wzrostu kryształów ze skalą pomiarową, uwypuklający mikrostrukturę w skali 25-50 µm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Zebrane i schłodzone kriogenicznie kryształy białek błonowych w pętlach kriogenicznych, widziane za pomocą mikroskopu w linii na wiązce synchrotronowej. A, B. Przykłady zebranych kryształów (cytochrom oksydaza caa334 (A), kinaza diacyloglicerylowa, DgkA (B)), w których kryształy (niebieska strzałka) są widoczne przez schłodzoną kriogenicznie mezofazę na pętli kriogenicznej. C. Przykład, w którym zebrany kryształ nie jest widoczny w schłodzonej kriogenicznie mezofazie na pętli kriogenicznej. Końcówkę pętli oznaczono czerwoną strzałką. Przylegającą, schłodzoną kriogenicznie mezofazę oznaczono niebieską strzałką.

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structure+determination+using+crystallography+and+lipidic+mesophases+-+recent+advances+and+successes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes.</a> Biochemistry. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+dopamine+D3+receptor+in+complex+with+a+D2%2FD3+selective+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist.</a> Science. 330, 1091-1095 (2010).</li>
<li>Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+delta-opioid+receptor+bound+to+naltrindole%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole.</a> Nature. 485, 400-404 (2012).</li>
<li>Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+M2+muscarinic+acetylcholine+receptor+bound+to+an+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist.</a> Nature. 482, 547-551 (2012).</li>
<li>Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+lipid+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor.</a> Science. 335, 851-855 (2012).</li>
<li>Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2.6+angstrom+crystal+structure+of+a+human+A2A+adenosine+receptor+bound+to+an+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist.</a> Science. 322, 1211-1217 (2008).</li>
<li>Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor.</a> Nature. 482, 552-556 (2012).</li>
<li>Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+micro-opioid+receptor+bound+to+a+morphinan+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist.</a> Nature. 485, 321-326 (2012).</li>
<li>Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469, 175-180 (2011).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal++structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+engineering+yields+high-resolution+structural+insights+into+beta2-adrenergic+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function.</a> Science. 318, 1266-1273 (2007).</li>
<li>Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+irreversible+agonist-beta%282%29+adrenoceptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex.</a> Nature. 469, 236-240 (2011).</li>
<li>Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+histamine+H1+receptor+complex+with+doxepin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin.</a> Nature. 475, 65-70 (2011).</li>
<li>Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+nociceptin%2Forphanin+FQ+receptor+in+complex+with+a+peptide+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic.</a> Nature. 485, 395-399 (2012).</li>
<li>Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+Chemokine+GPCR+with+Small-Molecule+and+Cyclic+Peptide+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid%27s+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li>
<li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein%2Fwater+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Ii%22%5BJournal%5D)">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li>
<li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712(2010).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000(2012).</li>
<li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa%283%29-type+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

W niniejszym artykule wideo zademonstrowaliśmy, w jaki sposób kryształy wyhodowane w mezofazie lipidowej są zbierane i chłodzone kriogenicznie w celu przygotowania ich do gromadzenia danych dyfrakcyjnych, a w konsekwencji do wyznaczenia struktury. Mezofaza gospodarza może być lepka i kleista faza kubiczna lub bardziej płynna faza gąbczasta4. Sposób otwierania szklanych płytek typu „sandwich” oraz metoda zbierania kryształów zależą w dużej mierze od rodzaju mezofazy. Dlatego ważne jest, aby z wyprzedzeniem wiedzieć, z którą z tych dwóch faz mamy do czynienia. W tym względzie istotne są tożsamość zastosowanego lipidu gospodarza oraz czynnika wytrącającego, a do ich rozróżnienia można wykorzystać wygląd fizyczny grudki mezofazy w studzience krystalizacyjnej (Rycina 3). W niniejszym artykule zilustrowano proces zbierania kryształów z obu typów mezofaz.
Wyodrębnianie małych kryształów z mezofazy lipidowej w szklanych płytkach kanapkowych jest żmudnym procesem, który wymaga czasu, umiejętności, doświadczenia, cierpliwości i pewnej ręki. Ważne jest, aby zarezerwować odpowiednią ilość czasu na wyodrębnianie oraz przygotować laboratorium w taki sposób, aby wszystkie materiały i sprzęt były z wyprzedzeniem pod ręką. Pomoc drugiej osoby przy wyodrębnianiu nie jest niezbędna, ale jest zalecana. Taka osoba może pomagać w podawaniu wcześniej oznakowanych płytek osobie dokonującej wyodrębniania, a także w umieszczaniu schłodzonych pętli montażowych z wyodrębnionymi kryształami w kasecie do przechowywania. Asystent może również pełnić ważną rolę wspierającą w dokumentowaniu obserwacji dotyczących kryształów sporządzonych podczas wyodrębniania, które mogą okazać się kluczowe podczas zbierania danych dyfrakcyjnych. W przypadku braku asystenta, do celów dokumentacji można z korzyścią wykorzystać urządzenie do nagrywania audio aktywowane głosem.
Postępowanie zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule pomoże użytkownikowi rozpocząć pracę z procesem pozyskiwania kryształów. Należy jednak mieć świadomość, że proces ten nie jest prosty i wymaga praktyki przed przystąpieniem do pozyskiwania cennych kryształów białek błonowych. Zaleca się zatem, aby w pierwszej kolejności przeprowadzić doświadczenia na płytkach testowych z kryształami białek, które nie są szczególnie wartościowe. Pozwoli to początkującemu nabyć cenne doświadczenie w cięciu szkła, usuwaniu odłamków szklanych, podnoszeniu szkiełka nakrywkowego znad mezofazy, wykorzystywaniu funkcji polaryzacji w mikroskopie do lokalizacji kryształów i śledzenia ich podczas pozyskiwania, a na koniec w obchodzeniu się z różnymi rodzajami mezofaz i pozyskiwaniu z nich kryształów. Tekstura mezofazy, a co za tym idzie łatwość, z jaką można pozyskać kryształy, zmienia się w czasie trwania krystalizacji. Ważne jest zatem, aby ćwiczyć pozyskiwanie na mniej cennych kryształach, lecz takich, które wyrosły w tych samych warunkach co kryształy bardziej wartościowe. Możliwe jest otrzymanie kryształów lysozymu i taumatyny metodą in meso lub metodą lipidowej fazy kubicznej28, co należy rozważyć w celu zapoznania się z materiałami i metodą. Warto również najpierw popracować z mezofazą wolną od białek, aby poznać jej specyfikę. 
Procedury zaprezentowane w niniejszym materiale zostały przeprowadzone w temperaturze około 20 °C. Możliwe jest otrzymywanie kryształów metodą in meso w niższych temperaturach. Przykładowo, jako lipid gospodarz w metastabilnym stanie fazowym można zastosować monooleinę w temperaturze 4 °C 1,2,29,30. Alternatywą jest wykorzystanie racjonalnie zaprojektowanego 7.9 MAG do krystalizacji w niskiej temperaturze31. W przypadku niektórych docelowych białek błonowych rutynowo przeprowadzamy krystalogenezę w niskich temperaturach. W takim przypadku wzrost i zbiór kryształów odbywa się w chłodni w temperaturze 4 °C. Praca w takich warunkach wiąże się z określonymi wyzwaniami, z których nie mniej istotnym jest konieczność noszenia ciepłej i wygodnej odzieży. 
Kolejnym krokiem w ogólnym procesie wyznaczania struktury za pomocą krystalografii makromolekularnej jest zebranie danych dyfrakcyjnych z kryształów, które zostały pobrane i gwałtownie schłodzone w sposób przedstawiony w niniejszym artykule. Kryształy hodowane in meso są zazwyczaj małe. Niemniej jednak, możliwe było użyteczne gromadzenie danych dyfrakcyjnych z kryształów o maksymalnym wymiarze 20 μm9. W tym celu wykorzystuje się mikro-wiązki promieniowania rentgenowskiego synchrotronowego, co jest przedmiotem osobnego artykułu JoVE w tej serii32,33.

<table><tbody><tr><td>Pinceta zakrzywiona</td><td>Sigma</td><td>F4142</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Jednorazowe końcówki do pipet</td><td>Gilson</td><td>Różne</td><td>Jednorazowe</td></tr><tr><td>Pojemnik Dewar z pianki</td><td>Spearlab</td><td>FD-500</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Pojemniki na odpady szklane i metalowe</td><td>Daniels Healthcare</td><td>DD479OL</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Pętle do zbierania kryształów</td><td>MiTeGen</td><td>Różne</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Mikroskop do zbierania kryształów</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Notatnik laboratoryjny</td><td>Różne</td><td>NA</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Magnetyczny pręt do załadunku próbek z przyciskiem</td><td>Hampton Research/Molecular Dimensions</td><td>HR4-729/MD7-411</td><td>Narzędzie </td></tr><tr><td>Oryginalny Puck (do użytku wyłącznie z robotami typu ALS)</td><td>Crystal Positioning Systems</td><td>CP-111-035</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Urządzenia pipetujące</td><td>Gilson</td><td>Różne</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Roztwory precypitantów</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Zgięte kleszcze kriogeniczne do Pucków</td><td>Crystal Positioning Systems</td><td>CP-111-030</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Pręt transportowy z półkami do Pucków (oryginalny typ ALS) z hakiem i blokadą</td><td>Crystal Positioning Systems</td><td>CP-111-029</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Woda oczyszczona</td><td>Millipore</td><td></td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Okulary ochronne</td><td>Różne</td><td>NA</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Podstawy pinów do próbek – magnetyczne (niemiedziane)</td><td>Crystal Positioning Systems</td><td>CP-111-015</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Pojemnik Dewar do transportu</td><td>Taylor-wharton</td><td>CX100</td><td>Narzędzie</td></tr><tr><td>Chusteczki</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Jednorazowe</td></tr><tr><td>Węglikowo-wolframowy przecinak do szkła (rylec TCT)</td><td>Silverline Tools (Yeovil, UK)</td><td>633657</td><td>Narzędzie</td></tr></tbody></table>

pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Ważną drogą do zrozumienia mechanizmów funkcjonowania białek jest poznanie struktury białka docelowego, idealnie w rozdzielczości atomowej. Obecnie istnieje tylko jedna metoda pozyskiwania takich informacji w odniesieniu do białek błonowych integralnych (Rycina 1) oraz tworzonych przez nie kompleksów, a jest nią makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX). Do przeprowadzenia MX niezbędne są kryształy o jakości dyfrakcyjnej, które w przypadku białek błonowych nie tworzą się łatwo. Metoda krystalizacji białek błonowych wykorzystująca mezofazy lipidowe, a konkretnie fazy kubiczne i gąbczaste1-5, zyskała ostatnio znaczną uwagę dzięki sukcesom osiągniętym w dziedzinie receptorów sprzężonych z białkiem G6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). Jednakże metoda ta, zwana odtąd metodą in meso lub metodą lipidowej fazy kubicznej, wiąże się z własnymi wyzwaniami technicznymi. Wynikają one częściowo z ogólnie lepkej i gęstej natury mezofazy lipidowej, w której rosną kryształy, często będące mikrokryształami. W konsekwencji manipulowanie kryształami staje się trudne, zwłaszcza podczas ich zbioru22,23. Problemy pojawiają się również na etapie poprzedzającym zbiór, który wymaga otwarcia szklanych płytek typu sandwich, w których rosną kryształy (Rycina 2)24,25, aby odsłonić bolus mezofazy oraz zawarte w nim kryształy w celu ich zbioru, schłodzenia kriogenicznego i ostatecznego zebrania danych dyfrakcyjnych rentgenowskich.
Warianty mezofazy sześcianowej i gąbczastej (Rycina 3), z których należy pozyskiwać kryształy, charakteryzują się skrajnie różną reologią4,26. Faza sześcianowa jest lepka i gęsta, przypominając konsystencją gęstą pastę do zębów. Z kolei faza gąbczasta jest bardziej płynna i wykazuje wyraźną tendencję do przepływu. W związku z tym konieczne jest zastosowanie różnych podejść do otwierania studni krystalizacyjnych zawierających kryształy rosnące w fazie sześcianowej i gąbczastej, podobnie jak wymagane są odmienne metody pozyskiwania kryształów z obu tych typów mezofaz. Protokoły służące do realizacji tych zadań zostały dopracowane i wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran (MS&amp;FB) i są szczegółowo opisane w niniejszym artykule JoVE (Rycina 4). Przedstawiono przykłady sytuacji, w których kryształy zostały pomyślnie pozyskane i schłodzone kriogenicznie. Podajemy również przykłady przypadków, w których wystąpiły problemy prowadzące do nieodwracalnej utraty kryształów, oraz opisujemy, jak można uniknąć tych błędów. W artykule tym Widz otrzyma instrukcje krok po kroku dotyczące otwierania szklanych studni krystalizacyjnych typu kanapkowego, pozyskiwania oraz chłodzenia kriogenicznego kryształów białek błonowych rosnących w fazach sześcianowej i gąbczastej.

W niniejszym opracowaniu opisano procedury wdrożone w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran Caffreya w celu zbioru i kriochłodzenia kryształów białek błonowych hodowanych w lipidowych fazach kubicznych i gąbczastych, przeznaczonych do wyznaczania struktur metodą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej.

Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

Ważną drogą do zrozumienia mechanizmów działania białek jest uzyskanie struktury białka docelowego, idealnie w rozdzielczości...

Witajcie w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran. Nazywam się Martin Caffery. Jest to kolejny artykuł z serii JoVE na temat krystalizacji białek błonowych w celu wyznaczenia ich struktury z wykorzystaniem metody in meso, czyli fazy lipidowej sześciennej.W pierwszym artykule, Jo of 1 7 1 2, zademonstrowaliśmy sposób przygotowania nasyconej białkiem fazy kubicznej oraz manualnego nakładania lepkiem i gęstej fazy misa na szklane płyty krystalizacyjne typu sandwich w celu przeprowadzenia prób krystalizacji. Niniejszy artykuł wideo opisze metodę zbierania i schładzania kriogenicznego kryształów otrzymanych metodą in meso. Materiały i sprzęt niezbędne do zbierania i schładzania kriogenicznego kryształów hodowanych metodą in meso są tutaj przedstawione.Niezbędne wyposażenie obejmuje zeszyt laboratoryjny do zapisywania informacji o kryształach i szczegółów ich zbioru do późniejszego wykorzystania, okulary ochronne, szklane i metalowe pojemniki na odpady oraz szklaną płytkę do krystalizacji metodą kanapkowe, z której będą pobierane kryształy. Studzienki zawierające kryształy są czytelnie oznakowane. Niezbędne są również: szklany przecinak do otwierania studzienek krystalizacyjnych, chusteczki, butelka z wodą, zakrzywiona pęseta, roztwór ekranujący wytrącacz, mikropipeta wraz z końcówkami, pętle kriogeniczne do zbioru kryształów, magnetyczna różdżka oraz pojemnik do przechowywania schłodzonych kriogenicznie pętli z kryształami. Wykorzystuje się również styropianowe pudełko wypełnione ciekłym azotem do chłodzenia kriogenicznego, pęsetę do kryształów, pojemnik transportowy lub do przechowywania oraz mikroskop do zbioru kryształów.W ramach przygotowania do zbioru, pojemnik do pienienia (foam doer) należy wcześniej napełnić ciekłym azotem i ustawić obok mikroskopu, przy którym będzie odbywał się zbiór. Pojemnik do przechowywania (storage puck) z otwartym końcem skierowanym do góry należy zanurzyć w ciekłym azocie w pojemniku i pozwolić mu się schłodzić; pętla kriogeniczna (cryo loop) o rozmiarze dopasowanym do kryształu, który ma zostać zebrany, powinna zostać zamocowana na uchwycie mikro (micro mount) na magnetycznej różdźcy, tak aby wszystkie materiały i sprzęt znajdowały się na miejscu. Naszym następnym zadaniem jest zidentyfikowanie płytek i studzienek zawierających kryształy.Można to przeprowadzić na dwa sposoby. Najprostsza i najbardziej bezpośrednia metoda polega na ręcznej inspekcji studzienek przy użyciu mikroskopu w świetle normalnym oraz spolaryzowanym. Druga metoda wykorzystuje system obrazowania, w którym płytki są przesiewane automatycznie w świetle normalnym i spolaryzowanym.Obrazy cyfrowe są rejestrowane przez urządzenie obrazujące i oceniane na monitorze komputera. Dołki zawierające kryształy przeznaczone do zbioru powinny być wyraźnie oznakowane. Uwagi dotyczące wielkości, jakości i lokalizacji kryształów w kropli powinny zostać zapisane w zeszycie laboratoryjnym lub w komputerze.Ułatwi to etap zbioru kryształów. W tym kroku płytka zawierająca kryształy przeznaczone do zbioru zostaje wyjęta z urządzenia obrazującego. Płytki, w których kryształy rosną metodą end-meso, to szklane płytki kanapkowe typu przedstawionego tutaj. Aby uzyskać dostęp do medium i znajdujących się w nim kryształów, konieczne jest otwarcie studni.Wykonuje się to za pomocą narzędzia do cięcia szkła, aby wyciąć górną szybkę przykrywkową uszczelniającą wgłębienie, którą następnie można usunąć. Istnieje kilka podejść do przeprowadzenia tej czynności. Wybór metody zależy od rodzaju medium, w którym wyrasta kryształ.Może to być bardzo lepka i kleista faza kubiczna lub jej bardziej płynna odmiana, określana jako faza gąbczasta. W tym artykule wideo pokazujemy, jak otwierać krople oraz pozyskiwać kryształy z obu tych materiałów gospodarzy. W tej sekwencji wideo demonstrujemy dwa sposoby nacinania szkiełka przykrywkowego w kropelce zawierającej lepką fazę kubiczną.Proces nacinania i wycinania jest szczegółowo pokazany podczas obserwacji pod mikroskopem świetlnym. Zaczynamy od zbadania pojedynczej studzienki krystalizacyjnej i zidentyfikowania jej poszczególnych części. Pierwsza czerwona strzałka wskazuje grudkę masy zawierającą kryształy.Przypadkowo w tej konkretnej sekwencji kryształy nie są widoczne. Druga strzałka wskazuje na roztwór wytrącający otaczający mease. Trzecia strzałka wskazuje na obrys studzienki.Czwarta strzałka wskazuje podwójny przekładkę prętkową, na której spoczywa szkiełko nakrywkowe podczas używania przecinaka do szkła. Na szkiełku nakrywowym wykonuje się delikatne nacięcia w postaci dwóch koncentrycznych okręgów znajdujących się tuż poza obrysem dołka. Następnie za pomocą przecinaka do szkła usuwa się fragment szkła znajdujący się w przestrzeni między dwoma nacięciami.W celu zwolnienia wewnętrznego szkiełka nakrywki proces ten generuje wiele odłamków szkła i pyłu, które można usunąć za pomocą wilgotnego ręcznika papierowego. Zwolnione szkiełko nakrywki opiera się na dystansie wzdłuż swojej okrągłej krawędzi. Szkiełko nakrywki usuwa się, chwytając je pęsetą z cienkimi końcówkami i przechylając je w stronę przeciwną do studzienki, aż wypadnie z niej.W tym przypadku faza kubiczna pozostaje unieruchomiona na dnie studni. Część precypitantu zostaje usunięta wraz z szkiełkiem zakrywowym, jednak znaczna jego część pozostaje w miejscu wokół grudki mease. Po powiększeniu otrzymujemy wyraźniejszy obraz kubicznej mease, która jest teraz gotowa do zbioru kryształów.W następnej sekwencji przedstawiamy drugi sposób otwierania studzienki do krystalizacji zawierającej lepką fazę kubiczną. W tym przypadku na szkiełku nakrywkowym, po jednej stronie studzienki, wykonuje się dodatkowe nacięcia proste i łukowate, które przechodzą przez samą studzienkę. Ułatwia to dostęp pęsetą do szkiełka nakrywkowego i jego usunięcie.W tej konkretnej demonstracji szkiełko nakrywki pęka i podczas uwalniania go z lepkej przestrzeni lub powierzchni, samo szkiełko przesuwa się, a osad oddziela się od fazy kubicznej. Po podniesieniu szkiełka nakrywki część osadu zostaje wraz z nim usunięta. Wstawka przedstawia powiększony widok tego procesu.Obecnie pozostała odsłonięta grudka mease, bez otaczającego jej osadnika, który zapobiegłby wysychaniu mease i zmianie fazowej, co mogłoby uszkodzić kryształy. Za pomocą mikropipety na wierzch grudki nanosi się świeży osadnik. Grudka jest teraz gotowa do wykorzystania w procesie pozyskiwania kryształów.Faza gąbczasta jest nieco trudniejsza w obróbce ze względu na jej zdolność do przepływu. Jeśli ten przepływ spowoduje, że faza gąbczasta zetknie się z obwodem dołka, zostanie ona wyciągnięta, a kryształy zostaną utracone. Przykład takiego zdarzenia pokazano w następnym klipie wideo.Nagranie rozpoczyna się od przybliżenia fazy gąbczastej, a następnie przełączania między światłem normalnym a światłem spolaryzowanym w skrzyżowanych polaryzatorach. Kryształy, które w świetle normalnym można dostrzec z pewnym trudnością, są wyraźnie widoczne w skrzyżowanych polaryzatorach jako jasne refleksy na czarnym tle. W celu przygotowania do otwarcia dołka, szkiełko nakrywkowe zostaje nacięte i przecięte zgodnie z powyższym opisem.W trakcie tego procesu krawędź szkiełka nakrywkowego pęka w niepożądanym miejscu. Podjęto próby kontynuowania procesu otwierania studzienki, jednak osad przesuwa się w stronę pęknięcia i ostatecznie styka się z separatorem, a wraz z osadem – niefortunnie – przedostaje się część fazy gąbczastej wraz z jej zawartością. Oczywiście, w przypadku kryształów w tej konkretnej sekwencji polaryzatory mikroskopu nie są całkowicie skrzyżowane, dzięki czemu kryształy są widoczne jako jasne obiekty, podczas gdy studzienka i jej zawartość pozostają widoczne.W następnym klipie pokazujemy, jak problem ten rozwiązuje się poprzez uprzednie usunięcie nadmiaru czynnika wytrącającego. Zaczynamy od powiększenia fazy gąbczastej i identyfikacji kryształu, zarówno w świetle normalnym, jak i w spolaryzowanym z krzyżowymi polaryzatorami; następnie fragment szkiełka nakrywkowego zostaje nacięty, odcięty, a potem ostrożnie usunięty z dołka. Ponownie wykorzystuje się światło spolaryzowane, aby monitorować kryształ, który wyraźnie rozświetla się w polu widzenia.Kawałek suchej chusteczki higienicznej wprowadza się przez otwór w szkiełku nakrywce do dołka, aż dotknie on roztworu precypitanta. Roztwór jest ostrożnie odsysany kapilarnie, dopóki niemal całkowicie nie zniknie, a faza gąbczasta nie zacznie przesuwać się w kierunku chusteczki. Usunięcie chusteczki powoduje, że pozostały precypitant oraz faza gąbczasta z nadal znajdującymi się w niej kryształami cofają się pod szkiełko nakrywkowe.Dla większej przejrzystości tutaj pokazano powtórzenie tej ostatniej sekwencji w zwolnionym tempie. Pozostała część szkiełka nakrywkowego zostaje nacięta i przecięta. Jak opisano wcześniej, szkiełko nakrywkowe jest teraz podnoszone za pomocą pęsety.Wstawka przedstawia widok procesu w mniejszym powiększeniu. W tym konkretnym przypadku faza gąbczasta rozdziela część pozostałości w studzience, a część przylega do szkiełka nakrywkowego. Okazuje się, że kryształ znajduje się w grudce na szkiełku nakrywkowym przy zastosowaniu polaryzatorów skrzyżowanych.Kryształ jest wyraźnie widoczny w fazie gąbczastej, lecz ze względu na bardzo małą ilość obecnego czynnika wytrącającego zaczyna on przechodzić przejście fazowe, prawdopodobnie z powodu wysychania. Przejawia się to w postaci pierścienia frędzlebi (bio fringes), który przemieszcza się w kierunku centrum bolusa. Poprzez dodanie czynnika wytrącającego do bolusa proces ten można zatrzymać i odwrócić w ramach przygotowania do kolejnego kroku, którym jest zbieranie kryształów.Po otwarciu studni i odsłonięciu fazy gospodarza Misa, kolejnym krokiem w procesie jest wycinanie kryształów. W następnych klipach pokazujemy przykłady wycinania z fazy sześciennej oraz z fazy gąbczastej. Fazę mea w świeżo otwartej studni bada się pod mikroskopem w celu zlokalizowania odpowiednich kryształów.Przełączanie się między światłem normalnym a spolaryzowanym może znacznie ułatwić ten proces. Roztwory precypitantu powinny znajdować się pod ręką, aby można było dodać je do bolusa w celu spowolnienia lub zatrzymania procesu wysychania. Następnie używa się zamontowanej pętli kriogenicznej do badania świeżo odsłoniętej fazy wizualnej w poszukiwaniu kryształów, wyłowienia ich, a następnie natychmiastowego zanurzenia pętli z kryształami w ciekłym azocie bezpośrednio po ich pozyskaniu.W dalszej części prezentujemy proces zbierania kryształów, zaczynając od lepkiej i kleistej fazy kubicznej w tej sekwencji zbierania aż do czwartego brzegu Biore; kryształy w grudce fazy kubicznej są widoczne w świetle spolaryzowanym. Pętla do krio-montażu wchodzi z prawej strony, nabiera kryształ z jak najmniejszą ilością przylegającej masy, jest natychmiast krio-chłodzona, a następnie pętla zostaje umieszczona w dysku do przechowywania w ciekłym azocie. Proces zbierania zostaje powtórzony w tym klipie trzykrotnie.Przy każdym użyciu polaryzatora sprawdzane jest położenie kryształu. Ponieważ po pobraniu nie jest możliwe odszukanie kryształu w pętli kriogenicznej, warto sprawdzić fazę mesa, z której kryształ został pobrany, aby potwierdzić, że nie ma go już w niej, co sugeruje pomyślne przeprowadzenie zabiegu. W następnej sekwencji pokazano pobieranie z bardziej płynnej fazy gąbczastej; podobnie jak w przypadku fazy kubicznej, należy pobrać jak najmniejszą ilość fazy gąbczastej wraz z kryształem.Im więcej substancji znajduje się w pętli kriogenicznej otaczającej kryształ, tym trudniej będzie zlokalizować go gołym okiem. Podczas zbierania danych dyfrakcyjnych spowoduje to zwiększone rozpraszanie tła w trakcie pomiaru. W następnej sekwencji przedstawiamy proces chłodzenia kriogenicznego, który powinien nastąpić niezwłocznie.Kryształ jest pobierany w taki sposób, aby upłynął jak najkrótszy czas między samym momentem pobrania a zanurzeniem go w ciekłym azocie. Po zanurzeniu zamontowanej pętli w ciekłym azocie, jest ona umieszczana w jednym ze slotów magazynowych w dysku przechowywalnym w drzwiach (w tym przypadku w pozycji numer jeden), a następnie uwalniana z pręta magnetycznego. Na tym etapie należy zapisać w notatniku lub komputerze lokalizację oraz szczegóły dotyczące pobranych i schłodzonych kriogenicznie kryształów.Gdy puck w szufladzie z pianki zostanie całkowicie wypełniony lub po zakończeniu zbiorów na dany dzień, przenieś puck do półkowego uchwytu na pucki w pojemniku do przechowywania lub transportu J wypełnionym ciekłym azotem. Dwa kolejne obrazy przedstawiają krio-schłodzone kryształy w pętlach krio, które zostały zebrane. Stosując powyższy protokół, kryształy są wyraźnie widoczne w fazie meza wewnątrz pętli.W tym przypadku kryształ nie jest jednak widoczny i musiałby zostać zlokalizowany za pomocą promieniowania dyfrakcyjnego. Kolejnym krokiem w całym procesie wyznaczania struktury za pomocą krystalografii makromolekularnej jest zebranie danych dyfrakcyjnych z kryształów pozyskanych w sposób przedstawiony w niniejszym artykule. Jest to zazwyczaj realizowane z wykorzystaniem promieniowania rentgenowskiego synchrotronu i stanowi przedmiot osobnego artykułu JoVE w tej serii.

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pobieranie i kriogeniczne schładzanie kryształów białek błonowych wyhodowanych w mezofazach lipidowych w celu określenia struktury za pomocą krystalografii makrocząsteczkowowej

W niniejszym opracowaniu opisano procedurę stosowaną w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Białek Błonowych Caffreya w celu ręcznego przygotowania prób krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych.

Krystalizacja białek błonowych do wyznaczania struktury z wykorzystaniem mezofaz lipidowych

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Bicele są mieszaninami lipidów i amfifili, które utrzymują białka błonowe (MPs) w obrębie dwuwarstwy lipidowej, lecz wykazują unikalne zachowanie fazowe, co ułatwia wysokoprzepustowe przesiewy za pomocą robotów krystalizacyjnych. Technika ta pozwoliła na uzyskanie wielu struktur o wysokiej rozdzielczości pochodzących zarówno z organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Niniejszy film opisuje protokoły przygotowania lipidowej mieszaniny bicel, wprowadzania białek błonowych do mieszaniny...

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek błonowych z wykorzystaniem metody lipidowych biceli

W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.

Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Naucz się zbierać i kriochłodzić kryształy białek błonowych hodowane w mezofazach lipidowych. Metoda in meso umożliwia przygotowanie próbek do krystalografii rentgenowskiej.

Zbieranie i kriochłodzenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu określenia struktury za pomocą krystalografii makromolekularnej (Wideo) | JoVE Journal

Pozyskiwanie i mrożenie kryształów białek błonowych hodowanych w mezofazach lipidowych w celu wyznaczenia struktury metodą krystalografii makromolekularnej

Przeglądaj więcej filmów