Generacja myszy pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie dorosłych myszy z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub I PSC poprzez tetraploidalną komplementację zarodków. Osiąga się to poprzez pierwsze przybycie. I PSC z mysich fibroblastów embrionalnych przy użyciu lentiwirusów, przenoszących OCT cztery, SOX dwa, KLA cztery i cmic oraz uzupełniających pożywkę kwasem walproinowym lub VPA.

Po wygenerowaniu IPC charakteryzują się barwieniem immunologicznym, zliczaniem chromosomów i tworzeniem ciał zarodków. Kolejnym krokiem jest wygenerowanie tetraploidalnego wspomagania blastycznego biorcy poprzez fuzję i hodowlę in vitro. Następnie IPSC są wstrzykiwane do tetraploidalnego wspomagania wybuchowego, a uzupełnione wspomaganie blastyczne jest przeszczepiane samicom biorcy w celu zajścia w ciążę.

W ostatnim etapie zwierzęta urodzone w czasie są dostarczane przez cesarskie cięcie i do matek zastępczych. Dzięki temu można monitorować rozwój poporodowy. Ostatecznie, jeśli zostaną wyhodowane zdolne do życia zwierzęta donoszone.

Linia testowa IPSC jest uważana za w pełni pluripotencjalną. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami generowania I PSC jest to, że nasza metoda w sposób powtarzalny generuje w pełni pluripotencjalne linie komórkowe IPS: linie komórkowe IPS generowane tymi metodami mogą być przydatne dla innych badaczy chcących porównać pluripotencję swoich komórek IPS lub ustalić równoważność innych metod przeprogramowywania. Metody te będą przydatne dla badaczy chcących wygenerować w pełni pluripotencjalne linie komórkowe IPS do określonych dalszych zastosowań, takich jak testy różnicowania in vitro.

Dalsze generowanie wszystkich myszy IPSC. Zastosowanie komplementacji telo może służyć jako użyteczny sposób określania stabilności genetycznej i epigenetycznej różnych linii komórkowych. Manipulacje mikromami związane z tetraploidalną komplementacją zarodków są technicznie trudne.

Może minąć kilka miesięcy, zanim ktoś stanie się biegły W technikach, za pomocą których IPSC jest opracowywany, technika ta wymaga podobnych warunków hodowli, jak te stosowane w tradycyjnych eksperymentach z celowaniem w geny ESL. 24 godziny po transfekcji limfocytów T HEC 2 9 3 lentiwirusem. Usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją 25 mililitrami świeżej, wstępnie podgrzanej technologii.

Podłoże z transfekowanym heksem do inkubatora na 24 godziny, 48 godzin po transfekcji HEC 2 9 3 limfocyty T lentiwirusem zebrać pożywkę wzrostową zawierającą cząstki lentiwirusa z transfekowanych komórek. Usunąć cząstki stałe z pożywki zawierającej wirusa przez odwirowanie w temperaturze 3000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zagęścić wirusa przez ultrawirowanie przez 20% poduszkę sacharozową przez dwie godziny w temperaturze 112 000 g w czterech stopniach Celsjusza.

Ostrożnie przelać je do pojemnika na odpady w celu odkażenia, nie naruszając osadu wirusowego. Ponownie zawiesić osad wirusa w 0,4 mililitra mysiego podłoża z fibroblastami embrionalnymi i uszczelnić probówkę. Następnie delikatnie kołysz nim w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut.

Przechowuj cząsteczki wirusa i jednorazowe porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.IPSC. Linie pochodzą z mysich fibroblastów embrionalnych lub komórek metamfetaminy. Gdy kolonie IPSC mają jasną, refrakcyjną, dobrze zdefiniowaną granicę i zawierają od 30 do 50 komórek, są gotowe do ręcznego pobrania i namnażania jako niezależne linie IPSC.

Wybierz pojedyncze kolonie za pomocą końcówki pipety ładującej żel i przenieś każdą kolonię bezpośrednio do pojedynczego dołka 96-dołkowej płytki z dnem U zawierającej 20 mikrolitrów 0,25% trypsyny, EDTA, inkubuj wybrane kolonie i trypsynę przez około osiem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub do momentu, gdy kolonie rozdzielą się na pojedyncze komórki. Monitoruj postęp dysocjacji za pomocą mikroskopii świetlnej. Może być konieczne delikatne czyszczenie.

Przenieś zdysocjowaną zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę zawierającą warstwę zasilającą i 150 mikrolitrów pożywki ESC uzupełnionej doksycykliną i VPA Gdy kolonie IPSC pojawią się ponownie w każdym dołku, podziel się na większe studzienki w celu analizy i bankowania komórek przy użyciu standardowych procedur wyprowadzania ESC i hodowli komórek, aby rozpocząć procedurę generowania tetraploidalnego wspomagania blastycznego. Zarodki jednokomórkowe pobrane od samic myszy są hodowane na zarodki dwukomórkowe przez noc w KSOM w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla następnego dnia. Umieść mikroszkiełko BTX na 10-centymetrowej szalce Petriego.

Wlej wystarczającą ilość mediów elektrooporowych o temperaturze pokojowej, aby zanurzyć szkiełko w roztworze, ale nie na tyle, aby bieguny elektrody były całkowicie zanurzone. Włącz manipulator elektrokomórkowy BTX ECM 2001 i wzmacniacz BTX 400. Podłącz ECM do elektrody mikroprowadnic i przymocuj z boku szalki Petriego, aby zapobiec niezamierzonemu ruchowi prowadnicy.

Uruchom jeden impuls ręczny, aby uzyskać odczyt wzmacniacza BTX i zanotuj napięcie przyłożonych prądów stałych. Prąd przemienny będzie kontrolował prędkość, z jaką zarodki ustawiają się między elektrodami. Prąd stały połączy bluźnierców, a czas impulsu określi długość impulsu stałego.

Dobrym punktem wyjścia jest prąd przemienny o napięciu trzech woltów, prądzie stałym o napięciu 100 woltów i pogodzeniu 0,05 milisekundy. Optymalny prąd stały waha się w zakresie od 90 do 150 woltów. Za pomocą pipety do jamy ustnej.

Pobrać od 30 do 42 zarodków komórkowych z hodowli KSOM i przenieść je do kropli elektrofuzji. Medium przemyć przez kilka kropli medium elektrooporowego. Następnie narysuj świeże podłoże do elektrofuzji z naczynia z mikrosuwakiem do pipety do jamy ustnej.

Weź umyte zarodki i umieść je w milimetrowej szczelinie między elektrodami na mikroszkiełku. Uważaj, aby zarodki były wyrównane w środku szczeliny i nie stykały się ze sobą. Podłącz prąd AC, naciskając przycisk ręcznego uruchamiania.

Zarodki będą obracać się w polu prądu przemiennego, aż płaszczyzna blasku kontaktu będzie równoległa do elektrod. Jeśli zarodki nie zostaną wyrównane w ciągu kilku sekund, zwiększ ustawienie AC. Po wyrównaniu zarodków ponownie naciśnij przycisk ręcznego startu, aby zastosować impuls prądu stałego z podłożem do elektrooporu w pipecie.

Zebrać zarodki z mikroszkiełka, przemyć zarodki przez kilka kropli pożywki KSOM, a następnie wyhodować zarodki w KSOM pod olejem mineralnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Fuzja blastera powinna zostać zakończona w czasie krótszym niż 30 minut. W hodowli z powodzeniem monitoruj i selekcjonuj zarodki ze zrośniętymi blastomerami.

Połączone zarodki wydają się być w stadium jednokomórkowym, odrzucone przez lizę, a dwa zarodki komórkowe po 30 minutach w hodowli, kontynuuj hodowlę połączonych zarodków w mikrokroplach KSOM pod olejem mineralnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 5% dwutlenek węgla w celu przygotowania IPC do iniekcji strumieniowej rozmrozić wcześniej zbankowane IPC i umieścić je na podajnikach w pożywce ESC przejście do komórek co najmniej raz na karmnikach. Po rozmrożeniu przed użyciem do wstrzykiwań.

Jedna studzienka z sześciodołkowej płytki zawierającej od 70 do 80% zlewających się IPC zapewni więcej niż wystarczającą liczbę komórek do wstrzykiwań, aspiracyjna pożywka wzrostowa i przemyta komórki trzema mililitrami PBS bez wapnia lub magnezu w 0,5 mililitra wstępnie podgrzanej, 0,05% trystyki EDTA do komórek i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut z okazjonalnym kołysaniem w 3,0 mililitrach pożywki ESC i iterować, aby uzyskać pojedynczy zawiesina komórkowa. Obserwuj komórki za pomocą mikroskopii świetlnej, aby upewnić się, że zawiesina pojedynczej komórki, kolonie lub agregaty komórek zatkają pipetę do wstrzykiwań. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczej komórki dodaj jeden mililitr pożywki ESC do studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Inkubować przez około 15 minut lub do momentu, gdy większość komórek zasilających zacznie przylegać, delikatnie usunąć pożywkę zawierającą IPC. Uważając, aby nie usunąć tygodniowych przylegających komórek zasilających. Umieść IPC w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów pożywki wirówki ESC o stężeniu 200 G na pięć minut.

Odessać supernatant i usunąć pozostałą część pożywki ESC za pomocą mikropipety. Postukaj w rurkę, aby usunąć osad i delikatnie ponownie zawiesić komórki w 0,2 do 0,5 mililitra wstępnie schłodzonego podłoża FHM. Przechowuj komórki na lodzie do momentu wstrzyknięcia i podczas wstrzyknięcia do tetraploidalnego wspomagania wybuchu Aby zapoznać się z protokołem wstrzyknięcia wspomaganego przez blast, zapoznaj się z rękopisem dołączonym do tego artykułu oraz z wcześniej opublikowanym artykułem STARVE, którego fragment jest wyświetlany na ekranie tutaj.

Przykłady progresji morfologicznej od fibroblastów do kolonii IPSC w trakcie eksperymentu przeprogramowania pokazano na tych obrazach. Niejednorodność morfologiczną i częściowo przeprogramowane tworzenie kolonii IPSC należy obserwować począwszy od czterech do pięciu dni po edycji VPA doksycykliny, jak pokazano w panelach B do EESC. Podobnie jak IPSC, kolonie powinny pojawić się między siedmioma a 10 dniami, jak pokazano w panelu F. Produkcja jednokomórkowych zarodków telo przez elektrofuzję diploidalnych zarodków dwukomórkowych jest bardzo wydajna.

Rutynowo obserwuje się, że do 95% leczonych zarodków dwukomórkowych zostało pomyślnie połączonych w celu wytworzenia tetraploidalnych zarodków jednokomórkowych. Protokół zastosowany w tym eksperymencie do wstrzykiwania IPSC do tetraploidalnego wspomagania blastu jest podobny do protokołu wstrzykiwania E SES do diploidalnego wspomagania blastu w celu wygenerowania chimerycznych myszy, aby łatwo wykluczyć wytwarzanie diploidalnych chimer, pigmentacja szczepów myszy używanych do generowania IPS i zarodków tetraploidalnych jest starannie dobierana, jeśli to możliwe. W tym przykładzie zarodki tetraploidalne są wytwarzane ze szczepu albinosa, a IPSC są generowane ze szczepu barwnikowego.

Tak więc nowonarodzone myszy IPSC mają pigmentowane oczy i jednolicie napigmentowany kolor sierści w wieku dorosłym, podczas gdy diploidalne kyry wykazywałyby mieszane ubarwienie albinosów i pigmentów. Liczba urodzonych żywych młodych zależy od linii komórkowej, jak pokazano w tej tabeli. W przypadku przeciętnie dobrej linii IPSC, eksperymentatorzy powinni spodziewać się od 1% do 10% wstrzykniętej pomocy w zakresie blastu, aby uzyskać żywe nowonarodzone młode.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać w pełni pluripotencjalne komórki IPS, a także jak zweryfikować ich potencjał rozwojowy. Korzystanie z testu komplementacji tetraploidalnej Po opanowaniu tej techniki od wyprowadzenia MES do nowonarodzonego IPSC, myszy można ukończyć od dwóch do trzech miesięcy. Opracowanie i utrzymanie I PSC wymaga wysokiego poziomu techniki hodowli komórkowych.

Niezbędne jest wcześniejsze doświadczenie z kulturą ESL. Nie zapominaj o pracy z lentiwirusem, zwłaszcza skoncentrowany lentiwirus może być bardzo niebezpieczny. Należy zawsze nosić środki ochrony osobistej wymagane przez instytucję i upewnić się, że wszystko, co miało kontakt z wirusem, jest leczone 10% wybielaczem przez co najmniej 20 minut Postępując zgodnie z tą procedurą.

Wszystkie myszy IPSC i ich tkanki mogą być analizowane pod kątem fenotypów fizjologicznych, patologicznych i behawioralnych.