Name: Generacja myszy pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj metodę generowania dorosłych myszy z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez dopełnianie zarodków tetraploidalnych. Technika ta pozwala potwierdzić pełną pluripotencję linii iPSC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wsparcie dla KKB, MJB, JLH oraz KLN zostało zapewnione przez California Institute for Regenerative Medicine, Pew Charitable Trusts Biomedical Scholars Program, Esther B. O'Keeffe Family Foundation oraz Shapiro Family Foundation. KKB jest stypendystą naukowym Donald E. and Delia B. Baxter Foundation Faculty Scholar.

<ol><li>Boland, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mice+generated+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult mice generated from induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 461, 91-94 (2009).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Generation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cell-derived+embryos+and+mice+by+tetraploid-embryo+complementation%22">Generation of embryonic stem (ES) cell-derived embryos and mice by tetraploid-embryo complementation</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>McLaughlin, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tetraploid+embryos+by+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Production of tetraploid embryos by electrofusion.</a> Methods Enzymol. 225, 919-930 (1993).</li>
<li>Humpherys, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+instability+in+ES+cells+and+cloned+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic instability in ES cells and cloned mice.</a> Science. 293, 95-97 (2001).</li>
<li>Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+can+support+full-term+development+of+tetraploid+blastocyst-complemented+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos.</a> Cell Stem Cell. 5 (09), 135-138 (2009).</li>
<li>Zhao, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+produce+viable+mice+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation.</a> Nature. 461, 86-90 (2009).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+mice+produced+from+three-factor+induced+pluripotent+stem+%28iPS%29+cells+through+tetraploid+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Viable mice produced from three-factor induced pluripotent stem (iPS) cells through tetraploid complementation.</a> Cell Res. 21, 546-549 (2011).</li>
<li>Zhao, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+Fertile+Mice+Generated+from+Fully+Pluripotent+iPS+Cells+Derived+from+Adult+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Viable Fertile Mice Generated from Fully Pluripotent iPS Cells Derived from Adult Somatic Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 6, 390-397 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+improves+the+germ-line+competency+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx3 improves the germ-line competency of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 463, 1096-1100 (2010).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+prevents+loss+of+Dlk1-Dio3+imprinting+and+facilitates+generation+of+all-iPS+cell+mice+from+terminally+differentiated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells.</a> Nat. Genet. 44, 398-405 (2012).</li>
<li>Stadtfeld, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+silencing+of+imprinted+genes+on+chromosome+12qF1+in+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 465, 175-181 (2010).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Go, W. Y., Ho, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+direct+comparison+of+the+dimerizer+and+reverse+tet+transcriptional+control+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems.</a> The Journal of Gene Medicine. 4, 258-270 (2002).</li>
<li>Huangfu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+by+defined+factors+is+greatly+improved+by+small-molecule+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds.</a> Nature. 26, 795-797 (2008).</li>
<li>Li, X. -y, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell and Tissue Research. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>George, S. H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168(2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Generowanie myszy z linii iPSC przy użyciu testów TEC stanowi rygorystyczny test funkcjonalny pluripotencji linii iPSC. Test ten może być przydatny do oceny względnej skuteczności różnych metod reprogramowania lub do identyfikacji linii iPSC, które mogą być najbardziej użyteczne w generowaniu określonych typów komórek in vitro. Myszy wygenerowane z iPSC mogą być wykorzystane do rygorystycznego badania długoterminowej stabilności i tumorigeniczności tkanek pochodnych z iPSC. Niniejszy protokół będzie przydatny dla badaczy pragnących wygenerować w pełni pluripotencyjne linie iPSC lub myszy iPSC, a także do porównania względnej użyteczności różnych metod reprogramowania.
Mechanizmy kontrolujące generowanie i identyfikację w pełni pluripotencjalnych iPSC pozostają słabo poznane i istnieje możliwość, że niektóre linie iPSC wytworzone tą metodą nie przejdą testu TEC. Wiele czynników może różnić się pomiędzy eksperymentami, w tym tło genetyczne, miano lentiwirusa, wzorce insercji lentiwirusowej, parametry cyklu komórkowego populacji dawcy, różnice międzylaboratoryjne w poszczególnych etapach procedury TEC oraz zmienna skłonność iPSC do nabywania aberracji genetycznych lub epigenetycznych. Aby jak najlepiej zapewnić sukces, dbamy o ustalenie odpowiedniego poziomu ekspresji genów lentiwirusowych w eksperymentach z pochodzenia iPSC, testując rozcieńczenia wirusa na kontrolnych MEF, aby upewnić się, że każdy wirus jest wystarczająco skoncentrowany, by wywołać wykrywalną ekspresję genu w co najmniej 80%, a idealnie w 100% komórek MEF. Pozwala nam to zidentyfikować linie z wieloma kopiami różnych lentiwirusów, ograniczając jednocześnie toksyczność dla MEF i wytwarzając kolonie bez nadmiernego zagęszczenia studzienek. Należy zauważyć, że wiele innych protokołów wykazało zdolność do wytwarzania iPSC o pełnym potencjale rozwojowym, przy użyciu wielu metod i źródeł komórek dawców, co sugeruje istnienie wielu dróg do pełnej pluripotencjalności1,8-13,15. Obecnie jednak nie zidentyfikowano żadnego definitywnego biomarkera w pełni pluripotencjalnych iPSC, dlatego test TEC pozostaje złotym standardem sprawdzania, czy linia iPSC może wygenerować wszystkie linie komórkowe w organizmie.

<table><tbody><tr><td>DMEM (wysoka zawartość glukozy)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS kwalifikowany dla komórek ES</td><td>Invitrogen</td><td>104392-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płytki surowica bydlęca)</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma</td><td>Sigma M7522</td><td></td></tr><tr><td>0,1% żelatyny</td><td>Millipore</td><td>ES006-B</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka 199</td><td>Invitrogen</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (mysi LIF)</td><td>Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Kwas walproinowy</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyny-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS z Ca2+&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>PBS z Ca2+&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; bezpłatny</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina z surowicy klaczy w ciąży, do superowulacji, liofilizat, 2000 IU</td><td>Instytut Badawczy Harbor-UCLA</td><td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.</td><td></td></tr><tr><td>gonadotropina kosmotropowa, ludzka</td><td>Sigma</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>pożywka FHM z hialuronidazą</td><td>Millipore</td><td>MR-056-F</td><td></td></tr><tr><td>pożywka KSOM-1/2 AA</td><td>Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Woda do transferu embrionów, embrion przetestowany</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny, testowany na embrionach</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA), testowane na embrionach</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>embrionalne fibroblasty mysie, nienaświetlane</td><td>Millipore</td><td>PMEF-CFL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przełożenia materiałów na język polski zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji terminologicznej oraz naturalnego stylu protokołów badawczych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Pożywki i bufory użyte w tym protokole&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz specjalizujący się w treściach naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przełożenia materiału na język polski, zachowując najwyższe standardy merytoryczne, terminologiczne i stylistyczne właściwe dla środowiska akademickiego.&quot;&gt;Pożywka wzrostowa dla komórek HEK293T. 90% DMEM, 10% FBS, 100 J/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny. Z pożywki HEK stosowanej w dniu transfekcji należy usunąć penicylinę i streptomycynę. Pożywkę HEK można przechowywać w temperaturze 4 &amp;deg;w temperaturze C do 1 miesiąca.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Prosimy o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 12 mM dekstrozy. pH wynosi 7,1 +/- 0,1. pH jest krytyczne! Przefiltrować przez filtr sterylny i przechowywać w temperaturze 4°C. &amp;deg;C.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. Przesłano jedynie identyfikator `jove_content` bez treści właściwej. Po otrzymaniu tekstu przygotuję wierne tłumaczenie na język polski, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i terminologii naukowej.&quot;&gt;Pożywka do hodowli embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) (stosowana również z komórkami karmicielnymi). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 J/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4°C. &amp;deg;C przez maksymalnie 1 miesiąc.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.&quot;&gt;Pożywka wzrostowa dla ESC. 85% DMEM, 15% FBS kwalifikowany do hodowli komórek ES, 1x Glutamax, 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 0,1 mM &amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol, 1000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny. Pożywka do ESC może być przechowywana w temperaturze 4 &amp;deg;w temperaturze C przez maksymalnie trzy tygodnie.&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;Podłoże do elektrofuzji. 0,3 M mannitolu, 0,1 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 50 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;oraz 3% BSA w wodzie testowej do embrionów. Przechowywać w temperaturze 4°C &amp;deg;w temperaturze C do 3 miesięcy.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Produkcja indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) z komórek somatycznych umożliwia tworzenie cennych narzędzi do badań podstawowych, a także może dostarczyć źródła komórek dopasowanych do pacjenta w terapiach regeneracyjnych. Komórki iPSCs mogą być generowane przy użyciu wielu protokołów i pochodzić z różnych źródeł komórkowych. Po wygenerowaniu iPSCs są testowane za pomocą szeregu analiz, w tym immunobarwienia na markery pluripotencji, generowanie trzech warstw zarodkowych w ciałach embrionalnych i teratomałach, porównywanie ekspresji genów z embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESCs) oraz tworzenie myszy chimerycznych z wkładem linii zarodkowej lub bez niego2. Co istotne, linie iPSC, które przechodzą te testy, nadal różnią się zdolnością do wytwarzania różnych typów zróżnicowanych komórek2. Utrudnia to ustalenie, które protokoły wyprowadzania iPSC, źródła komórek dawców lub metody selekcji są najbardziej użyteczne w różnych zastosowaniach.
Najbardziej rygorystycznym testem sprawdzającym, czy linia komórek macierzystych posiada wystarczający potencjał rozwojowy do wytworzenia wszystkich tkanek niezbędnych do przeżycia organizmu (tzw. pełną pluripotencję), jest komplementacja embrionów tetraploidalnych (TEC)3-5. Technicznie TEC polega na elektrofuzyjnym połączeniu embrionów dwukomórkowych w celu uzyskania tetraploidalnych (4n) embrionów jednokomórkowych, które można hodować in vitro do stadium blastocysty6. Następnie diploidalne (2n) pluripotencjalne komórki macierzyste (np. ESC lub iPSC) wstrzykuje się do jamki zarodkowej blastocysty tetraploidalnej, a następnie przenosi do samicy biorcy w celu inkubacji (patrz Rysunek 1). Składnik tetraploidalny komplementowanego embrionu przyczynia się niemal wyłącznie do powstania tkanek pozazarodkowych (łożyska, pęcherzyka żółtkowego), podczas gdy komórki diploidalne tworzą właściwy zarodek, w wyniku czego powstaje płód pochodzący w całości z wstrzykniętej linii komórek macierzystych.
Niedawno donieśliśmy o wyprowadzeniu linii iPSC, które powtarzalnie generują dorosłe myszy poprzez TEC1. Linie iPSC te dają początek żywym młodszym z wydajnością 5-13%, co jest porównywalne z ESC3,4,7 i wyższe niż wartości raportowane dla większości innych linii iPSC8-12. Raporty te pokazują, że bezpośrednie przeprogramowanie może prowadzić do powstania w pełni pluripotencjalnych iPSC, które dorównują ESC pod względem potencjału rozwojowego i wydajności generowania młodych w testach TEC. Obecnie nie jest jasne, co odróżnia w pełni pluripotencjalne iPSC od linii o mniejszej potencjalności13-15. Nie jest również jasne, które metody przeprogramowania pozwolą na otrzymanie tych linii z najwyższą wydajnością. W niniejszej pracy opisujemy jedną z metod pozwalającą na otrzymanie w pełni pluripotencjalnych iPSC oraz myszy „all-iPSC”, co może być pomocne dla badaczy pragnących porównać pluripotencjalność linii iPSC lub ustalić równoważność różnych metod przeprogramowania.

W kroku 3, „Wyprowadzenie iPSC z MEF”, należy zaobserwować heterogeniczność morfologiczną i tworzenie niedojrzałych kolonii iPSC rozpoczynające się 4-5 dni po dodaniu doksycykliny/VPA, a dojrzałe kolonie między 7. a 10. dniem (Rycina 2). Produkcja jednokomórkowych embrionów tetraploidalnych w kroku 5 jest bardzo wydajna (Rycina 3). Rutynowo obserwujemy, że do 95% traktowanych embrionów dwukomórkowych ulega pomyślnemu zapłodnieniu/fuzji, dając w efekcie tetraploidalne embriony jednokomórkowe. Protokół wstrzykiwania iPSC do tetraploidalnych blastocyst (krok 6, Rycina 4) jest podobny do protokołu wstrzykiwania ESC do diploidalnych blastocyst w celu generowania myszy chimerycznych i może być wykonany przez doświadczonego specjalistę od mikroiniekcji. Liczba urodzonych żywych szczeniąt zależy od linii komórkowej (Tabela 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">Wydajność przeprogramowania MEF 0,01-0,03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Wydajność otrzymywania myszy iPSC przy użyciu TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Nazwa</td>
			<td>Opis</td>
			<td>Wstrzyknięte blastocysty</td>
			<td>Żywy noworodek</td>
			<td>Dorosłe osobniki żywe</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC (indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste)</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1(0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Reprezentatywne wyniki.
<img alt="Schemat komplementacji blastocysty tetraploidalnej; tworzenie myszy iPSC z diploidowych zarodków E13." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat projektu doświadczalnego. Góra po lewej: Produkcja blastocyst tetraploidalnych. Zapłodnione zarodki dwukomórkowe od myszy albinosów poddawane są elektrofuzji w celu wygenerowania tetraploidalnych zarodków jednokomórkowych, które są hodowane in vitro do stadium blastocysty. Dół po lewej: Reprogramowanie. Embrionalne fibroblasty mysie są transdukowane cząstkami lentiwirusowymi kodującymi Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc oraz białko rtTAM2.2 (odwracalny aktywator transkrypcji tetracykliny). Dodanie doksycykliny prowadzi do ekspresji transgenu i rozpoczęcia reprogramowania do iPSC. Po prawej: Produkcja myszy iPSC. iPSC pochodzące od myszy pigmentowanych są wstrzykiwane do blastoceli blastocyst tetraploidalnych, a następnie chirurgicznie implantowane do pseudociążnych myszy biorców. Noworodki myszy iPSC są wyjmowane drogą cesarskiego cięcia i przekazywane pod opiekę kocic zastępczych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Proces przeprogramowania komórek; obrazy mikroskopowe; transformacja MEF w iPSC przy powiększeniu 10x, 20x." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zmiany morfologiczne związane z przeprogramowaniem. Od lewej do prawej: Przykłady progresji morfologicznej od fibroblastów do kolonii iPSC w trakcie eksperymentu z przeprogramowaniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<img alt="Etapy rozwoju embrionu: 2-komórkowy (2n), fuzja blastomerów, 1-komórkowy (4n); obrazy mikroskopowe." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Produkcja embrionów tetraploidalnych. Diploidalne embriony dwukomórkowe są poddawane impulsowi elektrycznemu, co prowadzi do fuzji blastomerów i powstania jednokomórkowych embrionów tetraploidalnych.
<img alt="Wstrzyknięcie iPSC do blastocysty, skutkujące narodzinami myszy iPSC oraz myszą iPSC w wieku 3 tygodni; wyniki badania komórkowego." src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Produkcja myszy iPSC. Po lewej: iPSC są wstrzykiwane do jamki zarodkowej blastocysty tetraploidalnej. Środek: Noworożki myszy iPSC wyróżniają się pigmentacją oczu. Po prawej: Mysz iPSC w trzech tygodniach po urodzeniu.

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Produkcja indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) z komórek somatycznych umożliwia stworzenie cennych narzędzi do badań podstawowych i może również ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie dorosłych myszy z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, lub iPSC, poprzez komplementację embrionu tetraploidalnego. Osiąga się to najpierw poprzez wyprowadzenie iPSC z fibroblastów embrionalnych myszy z wykorzystaniem lentiwirusów niosących OCT four, SOX two, KLA four i cmic oraz uzupełnianie pożywki kwasem walproinowym lub VPA.Po wygenerowaniu iPSC poddawane są one charakterystyce poprzez barwienie immunocytochemiczne, liczenie chromosomów oraz analizę tworzenia struktur ciał zarodkowych. Kolejnym krokiem jest wytworzenie blastocyst tetraploidalnych biorców poprzez fuzję i hodowlę in vitro. Następnie iPSC są wstrzykiwane do blastocyst tetraploidalnych, a dopełnione blastocysty są przeszczepiane do samic biorców w celu inkubacji.W ostatnim kroku zwierzęta w pełnym terminie ciąży są wyjmowane poprzez cięcie cesarskie i przekazywane matkom zastępczym, aby można było monitorować rozwój postnatalny. Ostatecznie pozwala to ustalić, czy wygenerowano żywotne zwierzęta w pełnym terminie rozwoju.Linia iPSC zastosowana w analizie jest uważana za w pełni pluripotencjalną. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami generowania iPSC jest to, że nasza metoda pozwala na powtarzalne otrzymywanie w pełni pluripotencjalnych linii komórek iPSC. Linie komórek iPSC wygenerowane tymi metodami mogą być przydatne dla innych badaczy chcących porównać pluripotencjalność własnych komórek iPSC lub ustanowić równoważność innych metod reprogramowania. Metody te będą przydatne dla naukowców pragnących wygenerować w pełni pluripotencjalne linie komórek iPSC do konkretnych zastosowań następczych, takich jak testy różnicowania in vitro.Dalsza generacja wszystkich myszy iPSC. Zastosowanie komplementacji telomerowej może służyć jako użyteczne narzędzie do określenia stabilności genetycznej i epigenetycznej różnych linii komórkowych. Mikro manipulacje związane z komplementacją zarodków tetraploidalnych są wymagające pod względem technicznym.Opanowanie technik, w których opracowano IPSC, może zająć kilka miesięcy. Ta metoda wymaga warunków hodowli podobnych do tych stosowanych w tradycyjnych eksperymentach z celowaniem genetycznym w liniach ESL. 24 godziny po transfekcji komórek HEC 2 9 3 T lentiwirusem należy usunąć pożywkę wzrostową i zastąpić ją 25 mililitrami świeżego, uprzednio ogrzanego medium.Przenieś TRANSFECTED hex z pożywką z powrotem do inkubatora na 24 godziny. Po 48 godzinach od transfekcji komórek HEC 2 9 3 T lentiwirusem zbierz pożywkę wzrostową zawierającą cząsteczki lentiwirusowe z transfektowanych komórek. Usuń zanieczyszczenia cząsteczkowe z pożywki zawierającej wirusa poprzez wirowanie przy 3000 Gs przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie skoncentruj wirusa za pomocą ultrawirowania przez 20% poduszkę sacharozy przez dwie godziny przy 112 000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie zlej ciecz do pojemnika na odpady w celu dekontaminacji, aby nie zaburzyć osadu wirusowego. Resuspenduj osad wirusowy w 0,4 ml pożywki dla zarodkowych fibroblastów mysich i szczelnie zamknij probówkę. Następnie delikatnie kołysz ją w temperaturze 4 °C przez 15 do 30 minut.Cząstki wirusowe i jednorazowe alikwoty należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Linie iPSC są pochodne od embrionalnych fibroblastów mysich lub komórek MEF. Gdy kolonie iPSC wykażą jasną, refrakcyjną, wyraźnie zdefiniowaną krawędź i będą zawierały od 30 do 50 komórek, są gotowe do ręcznego pobrania i namnożenia jako niezależne linie iPSC.Pobierz pojedyncze kolonie za pomocą końcówki do nakładania próbek na żel i przenieś każdą kolonię bezpośrednio do osobnej studni płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U, zawierającej 20 µL 0,25% trypsyny z EDTA. Inkubuj pobrane kolonie z trypsyną przez około osiem minut w temperaturze 37 °C lub do momentu rozpadu kolonii na pojedyncze komórki. Monitoruj postęp dysocjacji za pomocą mikroskopii świetlnej. Może być konieczne delikatne wytrząsanie.Przenieść zawiesinę dysocjowanych komórek na płytkę 96-dołkową zawierającą warstwę komórek karmionych oraz 150 µL medium ESC uzupełnionego o doksycyklinę i VPA. Gdy w każdym dołku ponownie pojawią się kolonie iPSC, przenieść je do większych dołków w celu przeprowadzenia analizy i bankowania komórek, stosując standardowe procedury pochodzenia ESC i hodowli komórkowej, aby rozpocząć procedurę generowania tetraploidalnych embrionów wspomagających rozwój blastocysty. Jednokomórkowe embriony pobrane od samic myszy hoduje się przez noc w KSOM w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide aż do stadium dwukomórkowego. Następnego dnia umieścić preparat BTX micro slide w 10 cm szalce Petriego.Wlej tyle medium do elektrofuzji o temperaturze pokojowej, aby zanurzyć szkiełko w roztworze, ale nie tak dużo, aby bieguny elektrody zostały całkowicie zakryte. Włącz manipulator komórek elektrycznych BTX ECM 2001 oraz wzmacniacz BTX enhancer 400. Podłącz kable ECM do elektrody na mikroszkiełku i przymocuj kable do boku szalki Petriego, aby zapobiec niezamierzonemu przesunięciu szkiełka.Wykonaj jeden impuls manualny, aby odczytać wartość na wzmacniaczu BTX i zanotuj napięcie przykładanych prądów DC. Prąd AC będzie kontrolował prędkość, z jaką embriony ustawiają się pomiędzy elektrodami. Prąd DC spowoduje fuzję blastomerów, a czas impulsu określi długość impulsu DC.Dobrym punktem wyjścia są wartości: AC 3 V, DC 100 V oraz czas 0,05 ms. Optymalne napięcie DC mieści się w zakresie od 90 do 150 V. Używając pipety ustnej.Przenieś od 30 do 42 embrionów komórkowych z hodowli KSOM do kropli medium do elektrofuzji. Przepłucz je w kilku kroplach medium do elektrofuzji. Następnie pobierz świeże medium do elektrofuzji z podstawki do mikroslajdów za pomocą pipety ustnej.Przenieś umyte embriony i umieść je w szczelinie o szerokości 1 mm pomiędzy elektrodami na preparacie mikroskopowym. Należy zadbać o to, aby embriony były ustawione wzdłuż środka szczeliny i nie stykały się ze sobą. Przyłóż prąd przemienny (AC), naciskając manualny przycisk start.Zarodki będą obracać się w polu prądu zmiennego (AC), aż płaszczyzna kontaktu blastomerów znajdzie się równolegle do elektrod. Jeśli zarodki nie ustawią się w ciągu kilku sekund, należy zwiększyć ustawienie AC. Po wyrównaniu zarodków należy ponownie nacisnąć przycisk startu ręcznego, aby przyłożyć impuls prądu stałego (DC) z medium do elektrofuzji w pipecie.Zebrać zarodki z mikroszkiełka, przemyć je kilkoma kroplami pożywki KSOM, a następnie hodować w pożywce KSOM pod warstwą oleju mineralnego w temperaturze 37°C i przy 5% carbon dioxide. Fuzja blastomerów powinna zostać zakończona w czasie krótszym niż 30 minut. Podczas hodowli monitorować i wybierać zarodki z pomyślnie zfuzowany blastomerami.Zlane zarodki będą wyglądać jak będące w stadium jednej komórki; należy usunąć zarodki lizowane oraz dwukomórkowe po 30 minutach hodowli, a następnie kontynuować hodowlę zlanych zarodków w mikrokroplach KSOM pod olejkiem mineralnym w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. Aby przygotować IPC do wstrzykiwania w blastocysty, rozmrozić wcześniej zmagazynowane IPC i wysiać je na warstwach komórek karmnych w medium ESC; komórki należy pasażować na warstwach karmnych co najmniej raz po rozmrożeniu, przed użyciem do wstrzykiwania.Jeden dołek płytki sześciodołkowej zawierający IPCs o stopniu konfluencji od 70 do 80% zapewni wystarczającą liczbę komórek do iniekcji. Odssać pożywkę wzrostową i przemyć komórki trzema mililitrami PBS bez wapnia i magnezu. Dodać 0,5 mililitra podgrzanej do odpowiedniej temperatury 0,05% trypsyny EDTA do komórek i inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut, sporadycznie kołysząc płytką. Dodać 3,0 mililitra pożywki ESC i powtarzać czynność, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przebadać komórki pod mikroskopem świetlnym w celu upewnienia się, że uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek; kolonie lub agregaty komórkowe mogą zapchać pipetę do iniekcji. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek dodać do dołka jeden mililitr pożywki ESC i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37°C.Inkubować przez około 15 minut lub do momentu, gdy większość komórek pokarmowych zacznie przylegać, a następnie delikatnie usunąć medium zawierające IPC. Należy uważać, aby nie oderwać przytwierdzonych komórek pokarmowych. Przenieść IPC do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml medium ESC i wirować przy 200 Gs przez 5 minut.Odssać nadsącz i usunąć pozostałość medium ESC za pomocą mikropipety. Opukać probówkę, aby oderwać osad, a następnie delikatnie resuspender komórki w 0,2 do 0,5 mililitrów schłodzonego wcześniej medium FHM. Przechowywać komórki w lodzie do czasu i w trakcie wstrzykiwania do tetraploidalnych blastocyst. W celu zapoznania się z protokołem wstrzykiwania do blastocyst należy odnieść się do rękopisu towarzyszącego niniejszemu artykułowi oraz do wcześniej opublikowanego artykułu JoVE, którego fragment jest wyświetlany tutaj na ekranie.Przykłady progresji morfologicznej od fibroblastów do kolonii iPSC w trakcie eksperymentu z reprogramowaniem przedstawiono na tych obrazach. Heterogenność morfologiczną oraz tworzenie się częściowo reprogramowanych kolonii iPSC należy obserwować począwszy od czwartego do piątego dnia po dodaniu doksycykliny i VPA, co pokazano na panelach od B do EESC. Kolonie podobne do iPSC powinny pojawić się między siódmym a dziesiątym dniem, jak pokazano na panelu F. Produkcja embrionów jednokomórkowych poprzez elektrofuzję diploidowych embrionów dwukomórkowych jest wysoce wydajna.Typowo obserwuje się, że do 95% poddanych zabiegowi embrionów dwukomórkowych ulega udanej fuzji, w wyniku której powstają tetraploidalne embriony jednokomórkowe. Protokół zastosowany w tym doświadczeniu do wstrzykiwania iPSC do tetraploidalnych blastocyst jest podobny do protokołu wstrzykiwania ESC do diploidalnych blastocyst w celu generowania myszy chimerycznych. Aby łatwo wykluczyć powstawanie chimer diploidalnych, w miarę możliwości starannie dobierano pigmentację szczepów myszy wykorzystywanych do generowania iPSC oraz embrionów tetraploidalnych. W tym przykładzie embriony tetraploidalne pochodzą ze szczepu albinotycznego, a iPSC zostały wygenerowane ze szczepu pigmentowanego.W związku z tym noworodki myszy IPSC wykazują pigmentację oczu oraz jednolity kolor pigmentacji sierści w wieku dorosłym, podczas gdy diploidalne kyras wykazywałyby mieszane ubarwienie albinistyczne i pigmentowane. Liczba urodzonych żywych szczeniąt zależy od linii komórkowej, co przedstawiono w tej tabeli. W przypadku przeciętnej, dobrej linii IPSC, eksperymentatorzy powinni spodziewać się, że od 1% do 10% wstrzykniętych blastocyst doprowadzi do narodzin żywych szczeniąt.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak otrzymywać w pełni pluripotencjalne komórki iPS oraz jak walidować ich potencjał rozwojowy. Wykorzystując test komplementacji tetraploidalnej, proces ten – od wyprowadzenia MES do narodzin myszy iPSC – można zrealizować w ciągu dwóch do trzech miesięcy, po opanowaniu tej techniki. Rozwój i utrzymanie komórek iPS wymagają wysokiego poziomu umiejętności w zakresie hodowli komórkowej.Niezbędne jest wcześniejsze doświadczenie w pracy z kulturami ESL. Należy pamiętać, że praca z lentiwirusem, zwłaszcza z lentiwirusem skoncentrowanym, może być niezwykle niebezpieczna. Zawsze należy nosić środki ochrony osobistej wymagane przez Twoją instytucję i upewnić się, że wszystko, co miało kontakt z wirusem, zostało poddane działaniu 10% wybielacza przez co najmniej 20 minut zgodnie z tą procedurą.Wszystkie myszy IPSC oraz ich tkanki mogą być analizowane pod kątem fenotypów fizjologicznych, patologicznych i behawioralnych.

generation-of-mice-derived-from-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych komórek pluripotencyjnych

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Poniższy protokół zawiera instrukcje dotyczące adaptacji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do hodowli bez warstwy komórek żerujących (feeder-free) z wykorzystaniem kompletnego medium KnockOut Serum Replacement Feeder-Free (KSR-FF). Po zakończeniu adaptacji przedstawiono również instrukcje dotyczące ich dalszego utrzymania.

Adaptacja bez użycia komórek karmicieli, hodowla i pasażowanie ludzkich komórek iPS z wykorzystaniem bezkomórkowego medium Complete KnockOut Serum Replacement

Niniejszy protokół opisuje szczegółową procedurę krioterapii ludzkich komórek iPS w medium do krioterapii KnockOut SR oraz odzyskiwania tych komórek w kompletnym medium KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) lub medium KnockOut SR z wykorzystaniem komórek zasilających (feeder-based).

Kriokonserwacja i odzyskiwanie ludzkich komórek iPS przy użyciu bezfeederowego pożywki Complete KnockOut Serum Replacement

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Obecny protokół opisuje metodę izolacji, ekspansji i przeprogramowania ludzkich i nieludzkich komórek pochodzących z moczu naczelnych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), a także instrukcje dotyczące konserwacji nowo wygenerowanych iPSC bez konieczności dostarczania pokarmu.

Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

Poznaj metodę generowania dorosłych myszy z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez dopełnianie zarodków tetraploidalnych. Technika ta pozwala potwierdzić pełną pluripotencję linii iPSC.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów