Name: Mapowanie funkcjonalnych sieci i szlaków bakteryjnych w Escherichia Coli przy użyciu syntetycznych macierzy genetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Poznaj technologię eSGA do mapowania interakcji genetycznych w Escherichia coli. Ta metoda pozwala identyfikować funkcjonalne sieci bakteryjne i szlaki metaboliczne poprzez analizę podwójnych mutantów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana ze środków Genome Canada, Ontario Genomics Institute oraz grantów Canadian Institutes of Health Research przyznanych J.G. i A.E. AG jest laureatem stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship.

<ol><li>Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+protein+complexes+from+quantitative+genetic+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data.</a> PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+the+genetic+interaction+map+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Charting the genetic interaction map of a cell.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-4231 (2010).</li>
<li>Fiedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+S.+cerevisiae+phosphorylation+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network.</a> Cell. 136, 952-963 (2009).</li>
<li>Roguev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+rewiring+of+functional+modules+revealed+by+an+epistasis+map+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast.</a> Science. 322, 405-4010 (2008).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Wilmes, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+interaction+map+of+RNA-processing+factors+reveals+links+between+Sem1%2FDss1-containing+complexes+and+mRNA+export+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing.</a> Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+approaches+for+identifying+and+analyzing+genetic+interaction+networks+in+Escherichia+coli+and+extensions+to+other+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes.</a> Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+synthetic+genetic+array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">coli synthetic genetic array analysis.</a> Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peptidoglycan+synthesis+by+outer-membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins.</a> Cell. 143, 1097-10109 (2010).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+maps+in+Escherichia+coli+reveal+functional+crosstalk+among+cell+envelope+biogenesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways.</a> PLoS Genet. 7, e1002377(2011).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+synthetic+genetic+screens+to+map+bacterial+pathways+and+functional+networks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli.</a> Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+recombination+system+for+chromosome+engineering+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).</li>
<li>Typas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((quantitative+analyses+of+genetic+interactions+in%5BTitle%5D)+AND+%22E.+coli.+Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">quantitative analyses of genetic interactions in.</a> E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).</li>
<li>Zeghouf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Peptide+Affinity+%28SPA%29+system+for+the+identification+of+mammalian+and+bacterial+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes.</a> J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).</li>
<li>Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+peptide+affinity+purification+system+for+the+systematic+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli.</a> Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).</li>
<li>Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+network+containing+conserved+and+essential+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli.</a> Nature. 433, 531-537 (2005).</li>
<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Anderson, R. P., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+genetic+duplications+in+phage+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tandem genetic duplications in phage and bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446, 806-8010 (2007).</li>
<li>Le Meur, N., Gentleman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+synthetic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling synthetic lethality.</a> Genome Biol. 9, R135(2008).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Wong, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biological+networks+to+predict+genetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining biological networks to predict genetic interactions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).</li>
<li>Gagarinova, A., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+genetic+manipulation+methods+for+exploring+bacterial+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology.</a> Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).</li>
<li>Dewey, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+orthology%3A+putting+genomic+evolutionary+relationships+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context.</a> Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).</li>
<li>St Onge, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+pathway+analysis+using+high-resolution+fitness+profiling+of+combinatorial+gene+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions.</a> Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiliśmy krok po kroku protokół wykorzystania robotycznego przesiewania metodą eSGA do badania funkcji genów bakteryjnych na poziomie szlaków poprzez analizę GI. Podejście to można stosować do badania pojedynczych genów, jak i całych systemów biologicznych w E. coli. Staranne wykonanie opisanych powyżej kroków eksperymentalnych, z uwzględnieniem wszystkich odpowiednich kontroli, a także rygorystyczna analiza i niezależna walidacja danych GI są kluczowymi aspektami sukcesu metody eSGA w odkrywaniu nowych f...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;I. Antybiotyki&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sklep z odczynnikami i sprzętem laboratoryjnym</td><td>#CLR201</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td></td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td></td><td># AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Pożywka Luria-Bertani&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sproszkowana pożywka LB</td><td>Sklep biotechnologiczny</td><td>#LBL405</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sklep biologiczny</td><td>#AGR003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Szczepy bakteryjne i plazmidy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Szczep Hfr Cavalli &amp;#955;&lt;sub&gt;czerwony&lt;/sub&gt; system (JL238)</td><td>Babu &lt;em&gt;i wsp.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKD3</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Genetic Stock Centre, Yale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keio &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Kolekcja szczepów biorców F-</td><td>Krajowy Projekt Biozasobów (NBRP) w Japonii&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypomorficzny &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;szczepy F- z tagiem SPA</td><td>Otwarte biosystemy; Babu &lt;em&gt;i wsp.&lt;/em&gt;&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Startery&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>odsolone startery stałe oparte na wektorze pKD3</td><td></td><td></td><td>F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3'&#039;&lt;br/&gt; R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'</td></tr><tr><td>Odsolone primery niestandardowe</td><td></td><td></td><td>Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3'&#039;&lt;br/&gt; Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'</td></tr><tr><td>Odsolone startery niestandardowe</td><td></td><td></td><td>F2 i R2: 20 nt stałych regionów opartych na sekwencji pKD3 oraz 45 nt niestandardowych regionów homologii&lt;br/&gt; Region stały F2:&lt;br/&gt; 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3'&#039;&lt;br/&gt; Region stały R2:&lt;br/&gt; 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
S1 i S2: 27 nt stałych regionów do inicjacji amplifikacji kasety SPA-Cm oraz 45 nt niestandardowych regionów homologii&lt;br/&gt; Region stały S1:&lt;br/&gt; 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3&#039;&lt;br/&gt; region stały S2:&lt;br/&gt; 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'&#039;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; KOCO-F i KOCO-C: primery o długości 20 nt, zlokalizowane 200 bp od miejsca delecji genu nieessentialnego lub genu essentialnego&lt;br/&gt; miejsce insercji znacznika SPA w genie</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;5. Odczynniki do PCR i elektroforezy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>polimeraza DNA Taq</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>bufor do PCR 10X</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sklep z odczynnikami i sprzętem laboratoryjnym</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do ładowania</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sklep z odczynnikami i sprzętem laboratoryjnym</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>bufor TBE 10X</td><td>Sklep z odczynnikami i sprzętem laboratoryjnym</td><td># ETB444.10</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Sklep biotechnologiczny</td><td># TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma</td><td># T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Marker wielkości DNA</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;6. Zestawy do izolacji i oczyszczania DNA&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji i oczyszczania DNA genomowego</td><td>Promega</td><td>#A1120</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do midi-preparatyki plazmidów</td><td>Qiagen</td><td># 12143</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do oczyszczania produktów PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>#28104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;7. Wyposażenie do PCR, transformacji i przenoszenia kolonii metodą replica-pinningu&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>BioRad, iCycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforeza w żelu agarozowym</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-Rad GenePulser II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kuweta do elektroporacji 0,2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &amp;deg;łaźnia wodna z wytrząsaniem</td><td>Innova 3100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wirówka Beckman Coulter TJ-25</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;inkubator z wytrząsaniem</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &amp;deg;inkubator do płytek C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>robot laboratoryjny RoToR-HDA</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>podkładki o gęstości 96, 384 i 1536 pinów</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 lub 384 długie piny</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;8. Sprzęt obrazujący&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Statyw do aparatu</td><td>Kaiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy, 10 megapikseli</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stoły świetlne, Testrite 16&quot; x 24&quot; jednostki</td><td>Testrite</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;9. Recykling podkładek lub płytek &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10% roztwór wybielacza</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda destylowana</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa ultrafioletowa</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;10. Sprzęt laboratoryjny&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>probówki polipropylenowe 50 ml</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolby stożkowe 250 ml</td><td>VWR</td><td># 29140-045</td><td></td></tr><tr><td>sterylne probówki do hodowli o pojemności 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td># 366052</td><td></td></tr><tr><td>Probówki kriogeniczne</td><td>VWR</td><td># 479-3221</td><td></td></tr><tr><td>Płytki prostokątne</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki mikrotitracyjne 96- i 384-dołkowe</td><td>Singer Instruments</td><td>Nunc</td><td></td></tr><tr><td>Rolka do uszczelniania płytek wielodołkowych</td><td>Sigma</td><td>#R1275</td><td></td></tr><tr><td>płytki</td><td>ABgene</td><td># AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Samoprzylepne uszczelki do płytek</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;Zamrażarka C</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w escherichia coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Fenotypy są determinowane przez złożony szereg oddziaływań fizycznych (np. białko-białko) i funkcjonalnych (np. gen-gen lub genetycznych) (GI)1. O ile oddziaływania fizyczne mogą wskazywać, które białka bakteryjne są powiązane w kompleksy, o tyle niekoniecznie ujawniają one zależności funkcjonalne na poziomie szlaków metabolicznych1. Przesiewy GI, w których mierzy się wzrost podwójnych mutantów posiadających dwa usunięte lub nieaktywne geny i porównuje go z odpowiednimi pojedynczymi mutantami, mogą naświetlić zależności epistatyczne między loci, a tym samym stanowić sposób badania i odkrywania nowych zależności funkcjonalnych2. Opisano wielkoskalowe mapy GI dla organizmów eukariotycznych, takich jak drożdże3-7, jednak informacje o GI dla prokariontów pozostają nieliczne8, co utrudnia adnotację funkcjonalną genomów bakteryjnych. W związku z tym my i inni opracowaliśmy wysokoprzepustowe ilościowe metody przesiewania oddziaływań genetycznych (GI) u bakterii9, 10.
W niniejszej pracy przedstawiamy kluczowe etapy wymagane do przeprowadzenia ilościowej procedury screeningu syntetycznych macierzy genetycznych (eSGA) dla E. coli w skali genomu9, wykorzystując naturalną koniugację bakteryjną oraz rekombinację homologiczną do systematycznego generowania i pomiaru dostosowania (fitness) licznych mutantów podwójnych w formacie macierzy kolonii. W skrócie, robot jest wykorzystywany do przenoszenia drogą koniugacji alleli mutantów znakowanych chloramfenikolem (Cm) z engineered szczepów „donora” Hfr (High frequency of recombination) do uporządkowanej macierzy szczepów biorców F- znakowanych kanamycyną (Kan). Typowo stosujemy pojedyncze mutanty z utratą funkcji, posiadające delecje genów nieessentialnych (np. kolekcja „Keio”11) oraz mutacje hypomorficzne genów essentialnych (tzn. allele powodujące obniżoną ekspresję, stabilność lub aktywność białka9, 12, 13), aby badać powiązania funkcjonalne odpowiednio genów nieessentialnych i essentialnych. Po koniugacji i następującej po niej wymianie genetycznej zapośredniczonej przez rekombinację homologiczną, powstałe mutanty podwójne są selekcjonowane na podłożu stałym zawierającym oba antybiotyki. Po wyroście płytek wykonuje się ich obrazowanie cyfrowe, a rozmiary kolonii są ilościowo oceniane przy użyciu wewnętrznego zautomatyzowanego systemu przetwarzania obrazu14. Interakcje genetyczne (GI) ujawniają się, gdy tempo wzrostu mutanta podwójnego jest znacząco lepsze lub gorsze niż oczekiwano9. Pogarszające (lub negatywne) GI często występują pomiędzy mutacjami z utratą funkcji w parach genów z szlaków kompensacyjnych, które wpływają na ten sam proces essentialny2. W takim przypadku utrata pojedynczego genu jest buforowana, tak że każdy z mutantów pojedynczych jest żywotny. Jednak utrata obu szlaków jest szkodliwa i prowadzi do letalności syntetycznej lub osłabienia organizmu (tzn. spowolnionego wzrostu). I odwrotnie, łagodzące (lub pozytywne) interakcje mogą występować między genami w tym samym szlaku lub kompleksie białkowym2, ponieważ delecja każdego z genów osobno jest często wystarczająca, aby zaburzyć normalną funkcję szlaku lub kompleksu w taki sposób, że dodatkowe zaburzenia nie redukują już aktywności, a tym samym wzrostu, w dalszym stopniu. Ogólnie rzecz biorąc, systematyczna identyfikacja i analiza sieci GI może dostarczyć nieobiektywnych, globalnych map relacji funkcjonalnych między dużymi liczbami genów, z których można wywnioskować informacje na poziomie szlaków, pomijane przez inne podejścia9.

Interakcje genetyczne (GI) ujawniają funkcjonalne zależności między genami. Podobnie, ponieważ geny w tej samej ścieżce wykazują podobne wzorce GI, a podobieństwo profili GI reprezentuje zgodność fenotypów, możemy grupować funkcjonalnie powiązane geny w ścieżki poprzez klasteryzację ich profili GI. Integracja sieci GI i korelacji GI z informacjami o oddziaływaniach fizycznych lub innymi danymi o powiązaniach, takimi jak relacje kontekstu genomicznego (GC), może również ujawnić organizację funkcjonalnych modułów wyższego ...

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Fenotypy są determinowane przez złożony szereg oddziaływań fizycznych (np. białko-białko) i funkcjonalnych (np. gen-gen lub genetycznych) (GI)1. Podczas gdy ...

Celem niniejszej procedury jest zbadanie zależności funkcjonalnych między genami a szlakami metabolicznymi bakterii. Jest to realizowane poprzez przygotowanie macierzy szczepów *Escherichia coli*, będących mutantami pojedynczymi, które zostaną poddane koniugacji lub krzyżowaniu. Drugim krokiem jest przeprowadzenie koniugacji mutantów pojedynczych w formacie macierzy na szalkach.Następnie wyselekcjonowane zostają podwójne mutanty. Ostatnim krokiem jest wykonanie obrazowania płytek z podwójnymi mutantami oraz kwantyfikacja kolonii podwójnych mutantów w celu określenia kondycji szczepów. Ostatecznie dane dotyczące wielkości kolonii są analizowane w celu obliczenia wyników interakcji genetycznych oraz zidentyfikowania funkcjonalnie oddziałujących genów, szlaków i procesów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mutageza losowa, jest możliwość stworzenia wielu indywidualnych szczepów podwójnie mutantowych. Ponadto można jednocześnie ocenić interakcje między wieloma genami, niezależnie od wielkości genu, jego niezbędności czy kondycji mutanta pojedynczego genu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii systemów, takie jak

mapping-bacterial-functional-networks-pathways-escherichia-coli-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Odwzorowywanie bakterii funkcyjnych sieci i ścieżek w Escherichia Coli za pomocą syntetycznych tablic genetycznych

Analiza ekspresji genów bakteryjnych z wykorzystaniem mikromacierzy

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Ten artykuł przedstawia serię protokołów do rozwoju inżynieryjnych komórek i funkcjonalizowanych powierzchni, które umożliwiają syntetycznie modyfikowanym E. coli kontrolowanie i manipulowanie programowalnymi powierzchniami materiałów.

Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

Tutaj moc losowej insercji niekodującego elementu DNA za pośrednictwem transpozonu została wykorzystana do określenia jego optymalnej pozycji chromosomalnej.

Określenie optymalnej lokalizacji chromosomalnej dla elementu DNA w Escherichia coli przy użyciu nowatorskiego podejścia opartego na transpozonach

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

Tutaj przedstawiono protokół projektowania, konstruowania i dostarczania sterowanego tetracykliną indukowalnego obwodu syntetycznego. Wpływ obwodów syntetycznych na eliminację pasożytów i ekspresję cytokin można badać poprzez kanalizację prezentowanego rurociągu. Protokół ten jest istotny dla naukowców badających syntetyczne terapie oparte na obwodach w chorobach zakaźnych.

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Poznaj technologię eSGA do mapowania interakcji genetycznych w Escherichia coli. Ta metoda pozwala identyfikować funkcjonalne sieci bakteryjne i szlaki metaboliczne poprzez analizę podwójnych mutantów.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Przeglądaj więcej filmów