Mapowanie funkcjonalnych sieci i szlaków bakteryjnych w Escherichia Coli przy użyciu syntetycznych macierzy genetycznych

Celem tej procedury jest zbadanie funkcjonalnych zależności między genami i szlakami bakteryjnymi. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw macierzy ceia coli, pojedynczych zmutowanych szczepów, które będą sprzężone lub kojarzone. Drugim krokiem jest sprzężenie pojedynczych mutantów w formacie tablicowym na płytkach.

Następnie wybierane są podwójne mutanty. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie podwójnie zmutowanych płytek i kwantyzacja podwójnie zmutowanych kolonii w celu określenia dopasowania szczepu. Ostatecznie dane dotyczące wielkości kolonii są analizowane w celu obliczenia wyników interakcji genetycznych i zidentyfikowania funkcjonalnie oddziałujących genów, ścieżek i procesów.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mutageneza losowa, jest to, że można stworzyć wiele indywidualnych podwójnie zmutowanych szczepów. Co więcej, interakcje między wieloma genami mogą być oceniane jednocześnie, niezależnie od wielkości genu, niezbędności lub dopasowania do mutacji pojedynczego genu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii systemowej, takie jak te związane z funkcjami genów i funkcjonalnymi przesłuchami między szlakami i procesami.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zakażeń bakteryjnych, ponieważ wiedza na temat najbardziej funkcjonalnie centralnych genów i procesów, a także zrozumienie, które kombinacje genów, szlaków i procesów bakteryjnych, gdy są zaburzone, poprawiają lub zmniejszają sprawność bakterii, pomogą opracować najskuteczniejsze strategie interwencyjne. Zagnieżdżone dwuetapowe. Amplifikację PCR stosuje się w celu zastąpienia docelowej otwartej ramki odczytu markerem oporności na chloramfenikol z plazmidu PKD three, jak opisano w pisemnej procedurze.

Potwierdź oczekiwany produkt i PCR oczyść otrzymany fragment zgodnie z protokołem producenta. Po elucji produktu PCR w 30 mikrolitrach sterylnej wody destylowanej rozcieńczyć do około 50 miligramów na mikrolitr stężenia. Oczyszczony produkt jest przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przed przekształceniem.

Następnie należy przygotować kompetentne komórki o wysokiej częstotliwości rekombinacji lub HFR Caval do budowy dawcy. Najpierw zaszczepij jeden mililitr nasyconej nocnej kultury szczepu HFR Cavalli w 70 mililitrach świeżej pożywki LB z 35 mikrolitrami po 50 miligramów na mililitr. Ampicylina w kolbie o pojemności 250 mililitrów.

Inkubować kulturę w temperaturze 32 stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając z prędkością 220 obr./min, aż do uzyskania gęstości optycznej około 0,5 do 0,6. Następnie przenieś kulturę do łaźni wodnej w celu indukcji ciepła systemu rekombinacji Lambda Red w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 15 minut z wytrząsaniem przy 160 obr./min, aby zatrzymać indukcję. Przenieś kulturę do schłodzonej łaźni wodnej z zawiesiną lodową na 10 do 20 minut przy 160 obr./min.

Upewnij się, że komórki są zimne do czasu przemiany. Po umyciu i zebraniu komórek przez odwirowanie, jak opisano w pisemnym protokole, zdekantować senes i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach lodowatego 10% glicerolu Eloqua. Komórki w objętościach 50 mikrolitrów umieszcza się w pojedynczych, wstępnie schłodzonych 1,5-mililitrowych probówkach mikro centri i natychmiast przechodzą do transformacji.

Dodaj 100 nanogramów oczyszczonej delecji genu, kasetę do właściwych komórek. Przesuń rurkę i pozwól zawiesinie osiąść na lodzie przez pięć minut. Następnie przenieś zawiesinę do wstępnie schłodzonego elektroporacji vete electro, natychmiast uruchom mieszaninę ogniw.

Dodaj jeden mililitr pożywki SOC o temperaturze pokojowej i przenieś elektroporowane ogniwa w pożywce do 15-mililitrowej probówki hodowlanej. Inkubuj komórki w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez godzinę z wytrząsaniem orbitalnym przy 220 obr./min. Po inkubacji odwirować komórki 4 400 razy G przez pięć minut.

W temperaturze pokojowej usuń około 850 mikrolitrów supinianu i ponownie zawiesić osad komórkowy w pozostałej cieczy. Rozłóż komórki na płytkach LB zawierających 17 mikrogramów na mililitr, chloramfenikolu i inkubuj w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia usuń dwa pojedyncze transformanty na płytkach chloramfenikolu LB w celu potwierdzenia mutantu, usuń te same transformanty na płytkach mycyny LB Can, aby potwierdzić, że szczepy nie są odporne na mycynę w puszkach.

Następnie DNA jest amplifikowane trzema różnymi zestawami starterów potwierdzających nokaut, zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Pierwszy zestaw starterów składa się z 20 nukleotydów flankujących starter do przodu umieszczony 200 par zasad przed docelowym regionem oraz startera odwrotnego, który jest uzupełnieniem kasety oporności na chloramfenikol. Oczekuje się, że ta amplifikacja wytworzy amplikon nukleotydowy 445.

Drugi zestaw zawiera starter do przodu, klęczący do sekwencji kasety oporności na chloramfenikol i starter potwierdzający odwrotne flankowanie, który jest przeznaczony do ułożenia 200 par zasad poniżej trzech głównych końców usuniętego genu. Oczekuje się, że ta reakcja amplifikacji wytworzy amplikon nukleotydowy 309. Trzeci PCR zawiera zarówno startery flankujące przed i za nim.

Reakcja ta jest wymagana do potwierdzenia, że wybrany szczep nie jest diploidalnym szczepem szpiku, w którym jeden locus genu został zastąpiony przez kasetę, a inna zduplikowana, ale poza tym kopia genu typu dzikiego jest nadal obecna. Oczekuje się, że to wzmocnienie da produkt o wielkości 1,4 KB. Kolekcja pojedynczych mutantów z delecją genów nieistotnych jest replikowana przez robota do 24 384.

Cóż, mikropłytka zawierająca 80 mikrolitrów płynnego podłoża LB na dołek. Uzupełniona o 50 mikrogramów na mililitr puszki micyny, aby zrobić miejsce dla szczepu kontroli granicznej, którego brakowało jako kontroli pozytywnej i pomocy w normalizacji płytki, a także w automatycznej kwantyzacji kolonii. Usunąć zaszczepioną pożywkę z najbardziej zewnętrznych dołków każdej płytki i przenieść ją na nowe płytki, pozostawiając skrajne doły puste.

Podobnie, stwórz ujemne punkty kontroli, usuwając dowolne dwa szczepy z innego miejsca na każdej płytce i przenosząc szczepy na nową płytkę. Następnie należy napełnić puste studzienki, w tym studzienki kontroli granicznej i studzienki kontroli ujemnej, pożywką niskiego napięcia zawierającą 17 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu. Oczekuje się, że te plamki kontroli ujemnej będą puste u biorcy, a zatem podwójnie zmutowane płytki.

Służą one do zapewnienia, że nie wystąpiły żadne błędy w przetwarzaniu lub obsłudze płyt podczas numerowania, obrazowania lub przypinania płyt. Po przygotowaniu szczepu granicznego dodatniego zgodnie z opisem w pisemnej procedurze, szczepy matrycowe oraz szczep dodatni na granicy są hodowane przez noc w temperaturze 32 stopni Celsjusza z wytrząsaniem orbitalnym 190 obr./min następnego dnia, napełniając studzienki graniczne około 80 mikrolitrami kultury przez noc. Zmontowane płytki mogą być używane do łączenia zgodnie z opisem w następnym rozdziale.

Alternatywnie, w celu długotrwałego przechowywania, każda studzienka w płytkach biorczych jest uzupełniana 15% glicerolem, a pożywka i glicerol są mieszane. Płytki są następnie przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozpocznij procedurę krycia od wyhodowania szczepu dawcy HFR, z delecją genu zapytania oznaczoną kasetą oporności na chloramfenikol przez noc w temperaturze 32 stopni Celsjusza w bogatej pożywce płynnej LB z 17 mikrogramami na mililitr szpilki chloramfenikolu.

TH uporządkował kolekcję mutantów biorcy w gęstości kolonii 3 84 na solidnych płytkach LB. Uzupełniony 50 mikrogramami na mililitr puszki mycyny. Równolegle przypnij zmutowany szczep dawcy o gęstości kolonii 3 84 na tej samej liczbie płytek LB.

Uzupełniony 17 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 32 stopni Celsjusza, aby sprzęgnąć szczepy. Przypnij dawcę z 3 84 kolonii na noc na płytkach dawcy na solidnych płytkach LB.

Następnie przypnij szczepy z pojedynczej płytki biorcy na noc z 3 84 koloniami na świeżo przypiętych dawców. Inkubować przypięte płytki koniugacyjne w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Następnie przypnij każdą płytkę koniugacyjną o gęstości 384 do pojedynczej stałej płytki LB zawierającej chloramfenikol.

I czy mycyna może powtarzać ten proces, dopóki wszystkie płytki koniugacyjne nie zostaną przypięte? Inkubować świeżo przypięte płytki pierwszej selekcji przez 16 do 36 godzin w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Po inkubacji ponownie przypnij każdą pierwszą płytkę selekcyjną do drugiej podwójnej płytki selekcyjnej leku w formacie 1536 SPOT, tak aby każda pierwsza kolonia selekcyjna była reprezentowana przez cztery kolonie.

Na drugiej płytce selekcyjnej inkubować płytki przez 16 do 36 godzin. W temperaturze 32 stopni oss sfotografuj końcowe płytki selekcyjne podwójnych mutantów, aby ilościowo zmierzyć sprawność wzrostu mutantów i przeanalizować interakcje między parami genów. Ponieważ geny w tym samym szlaku wykazują ściśle skorelowane wzorce przewodu pokarmowego, funkcjonalnie powiązane geny można pogrupować, grupując je zgodnie z ogólnym podobieństwem ich profili S score.

Podobieństwo profilu przewodu pokarmowego reprezentuje zgodność fenotypów po mutacji dwóch genów i powinno wskazywać, czy te dwa geny działają w tym samym, czy nakładającym się szlaku. Przedstawiono tutaj rozkład współczynników korelacji między profilami GI par genów kodujących fizycznie oddziałujące białka w porównaniu z losowo dobranymi parami genów. Przykład wykresu rozrzutu skorelowanych profili genetycznych dla dwóch transporterów, które tworzą kompleks heterotrimeryczny wymagany do wydalania plemników, jest pokazany jako z wykazem genu ekoliny drożdży.

Łagodzenie interakcji z wysoce skorelowanymi profilami przewodu pokarmowego ma tendencję do kodowania szlaków, które są fizycznie powiązane lub działają spójnie we wspólnym szlaku biochemicznym. Przedstawiono tutaj reprezentatywny przykład, w którym składniki funkcjonalnie redundantnych szlaków biosyntezy siarki żelaza ISC i SUF, które wspólnie uczestniczą w podstawowym procesie, tworzą odrębne klastry, które są połączone ze sobą rozległymi interakcjami obciążającymi. Miara statystyczna może być wykorzystana do znalezienia znaczącego wzbogacenia interakcji między określonymi kombinacjami szlaków, integracji sieci przewodu pokarmowego z interakcjami fizycznymi i innymi funkcjonalnymi danymi asocjacyjnymi, takimi jak kontekst genomowy.

Relacje mogą ujawnić organizację modułów funkcjonalnych wyższego rzędu, które definiują podstawowe systemy biologiczne u bakterii. Analiza skupień może być również stosowana do sieci przewodu pokarmowego w celu przewidywania funkcji genów z adnotacjami. Ponieważ algorytmy grupowania różnią się między sobą.

Jednak przypuszczalne przypisania funkcjonalne określone za pomocą grupowania wymagają niezależnej weryfikacji eksperymentalnej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uwzględnieniu wszystkich niezbędnych pozytywnych i negatywnych skutków tej procedury. Inne metody, takie jak proteomika, biochemiczne eksperymenty uzupełniające i genomika chemiczna, mogą być przeprowadzone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące konkretnych funkcji genów, a także charakteru funkcjonalnych relacji między genami i szlakami.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak konstruować podwójnie zmutowane szczepy, składać macierze biorców i wykonywać badania przesiewowe ESGA w celu zbadania funkcjonalnych relacji między genami i procesami w E. coli.