Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Celem niniejszej procedury jest zbadanie zależności funkcjonalnych między genami a szlakami metabolicznymi bakterii. Jest to realizowane poprzez przygotowanie macierzy szczepów *Escherichia coli*, będących mutantami pojedynczymi, które zostaną poddane koniugacji lub krzyżowaniu. Drugim krokiem jest przeprowadzenie koniugacji mutantów pojedynczych w formacie macierzy na szalkach.

Następnie wyselekcjonowane zostają podwójne mutanty. Ostatnim krokiem jest wykonanie obrazowania płytek z podwójnymi mutantami oraz kwantyfikacja kolonii podwójnych mutantów w celu określenia kondycji szczepów. Ostatecznie dane dotyczące wielkości kolonii są analizowane w celu obliczenia wyników interakcji genetycznych oraz zidentyfikowania funkcjonalnie oddziałujących genów, szlaków i procesów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mutageza losowa, jest możliwość stworzenia wielu indywidualnych szczepów podwójnie mutantowych. Ponadto można jednocześnie ocenić interakcje między wieloma genami, niezależnie od wielkości genu, jego niezbędności czy kondycji mutanta pojedynczego genu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii systemów, takie jak te dotyczące funkcji genów oraz funkcjonalnych powiązań między szlakami i procesami.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię infekcji bakteryjnych, ponieważ wiedza na temat większości genów i procesów kluczowych pod względem funkcjonalnym, a także zrozumienie tego, które kombinacje bakteryjnych genów, szlaków i procesów po zaburzeniu poprawiają lub zmniejszają kondycję bakterii, pomoże w opracowaniu najskuteczniejszych strategii interwencyjnych. Aby rozpocząć ten protokół, zastosowano dwuetapową zagnieżdżoną amplifikację PCR w celu zastąpienia docelowej ramki odczytu markerem oporności na chloramfenikol z plazmidu PKD3, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej.

Potwierdź obecność oczekiwanego produktu i oczyść uzyskany fragment metodą PCR zgodnie z protokołem producenta. Po elucji produktu PCR w 30 µL sterylnej wody destylowanej rozcieńcz go do stężenia około 50 mg/µL. Oczyszczony produkt przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu transformacji.

Następnie przygotuj kompetentne komórki szczepu HFR Caval o wysokiej częstotliwości rekombinacji do konstrukcji donora. W pierwszej kolejności zaszczep jeden mililitr nasyconej kultury nocnej szczepu HFR Cavalli do 70 mililitrów świeżej pożywki LB z dodatkiem 35 mikrolitrów ampicyliny w stężeniu 50 mg/mL w kolbie o pojemności 250 mililitrów.

Inkubować kulturę w temperaturze 32 °C, delikatnie wstrząsając przy 220 RPM, aż do uzyskania gęstości optycznej około 0,5 do 0,6. Następnie przenieść kulturę do łaźni wodnej w celu indukcji cieplnej systemu rekombinacji Lambda Red w temperaturze 42 °C przez 15 minut przy wstrząsaniu z prędkością 160 RPM, aby zakończyć indukcję. Przenieść kulturę do schłodzonej łaźni wodnej z kruszonką lodową na 10 do 20 minut przy 160 RPM.

Należy zadbać o to, aby komórki pozostawały w niskiej temperaturze aż do momentu przeprowadzenia transformacji. Po przemyciu i zebraniu komórek poprzez wirowanie, zgodnie z opisem w protokole pisemnym, odlać nadsącz i resuspender osad w 500 µL lodowatej, 10% glicerolu Eloqua. Rozdzielić komórki w objętościach 50 µL do poszczególnych, uprzednio schłodzonych probówek mikroodśrodkowych o pojemności 1,5 mL i niezwłocznie przystąpić do transformacji.

Do komórek kompetentnych dodać 100 nanogramów oczyszczonej kasety do delecji genu. Delikatnie potrząsnąć probówką i pozostawić zawiesinę w lodzie na pięć minut. Następnie przenieść zawiesinę do schłodzonej wcześniej kubka do elektroporacji i niezwłocznie poddać mieszaninę komórek elektroporacji.

Dodaj 1 ml medium SOC o temperaturze pokojowej, a następnie przenieś elektroporowane komórki w medium do probówki hodowlanej o pojemności 15 ml. Inkubuj komórki w temperaturze 32 °C przez jedną godzinę przy wytrząsaniu orbitalnym z prędkością 220 RPM. Po inkubacji odwiruj komórki przy 4 400 ×g przez pięć minut.

W temperaturze pokojowej usuń około 850 µL nadsączu i resuspender pellet komórkowy w pozostałej cieczy. Wyesej komórki na szalki z podłożem LB zawierającym 17 µg/mL chloramfenikolu i inkubuj w temperaturze 32 °C przez noc. Następnego dnia wyesej dwa poszczególne transformanty na szalki LB z chloramfenikolem w celu potwierdzenia mutacji; te same transformanty wyesej na szalki LB z kanamycyną, aby potwierdzić, że szczepy nie wykazują oporności na kanamycynę.

Następnie DNA jest amplifikowane przy użyciu trzech różnych zestawów starterów do potwierdzenia knock-outu, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Pierwszy zestaw starterów składa się z 20-nukleotydowego startera forward flankującego, zlokalizowanego 200 par zasad powyżej regionu docelowego, oraz startera reverse, który jest komplementarny do kasety oporności na chloramfenikol. Oczekuje się, że ta amplifikacja wytworzy amplikon o długości 445 nukleotydów.

Drugi zestaw obejmuje starter prawy, komplementarny do sekwencji kasety oporności na chloramfenikol, oraz starter potwierdzający flankujący prawy, zaprojektowany tak, aby hybrydyzować 200 par zasad poniżej końca 3' usuniętego genu. Oczekuje się, że ta reakcja amplifikacji wytworzy amplikon o długości 309 nukleotydów. Trzecia reakcja PCR zawiera startery flankujące zarówno powyżej, jak i poniżej badanego obszaru.

Reakcja ta jest niezbędna do potwierdzenia, że wybrany szczep nie jest diploidem szpiku, w którym jedno locus genu zostało zastąpione kasetą, a druga, zduplikowana, lecz w pozostałym zakresie dzika kopia genu nadal występuje. Oczekuje się, że amplifikacja ta przyniesie produkt o wielkości 1,4 KB. Kolekcja mutantów z delecją pojedynczego genu nieessentialnego e coli ke io została przeniesiona automatycznie za pomocą robota do 24 384.

Do studni mikroplatek wlewa się po 80 µL płynnej pożywki LB na każdą studnię. Pożywkę uzupełniono kanamycyną w stężeniu 50 µg/mL, aby zapewnić miejsce dla szczepu kontrolnego, który służy jako kontrola pozytywna i wspomaga normalizację płytek, a także zautomatyzowaną kwantyfikację kolonii. Należy usunąć zaszczepioną pożywkę z najbardziej zewnętrznych studni każdej płytki i przenieść ją do nowych płytek, pozostawiając zewnętrzne studnie puste.

W analogiczny sposób należy przygotować plamki kontroli negatywnej, usuwając dowolne dwa szczepy z innego miejsca na każdej płytce i przenosząc je na nową płytkę. Następnie należy wypełnić puste dołki, w tym dołki kontrolne na obrzeżach oraz dołki kontroli negatywnej, pożywką LV zawierającą 17 µg/mL chloramfenikolu. Oczekuje się, że plamki kontroli negatywnej będą puste w przypadku biorcy, a tym samym na płytkach z podwójnymi mutantami.

Służą one do upewnienia się, że nie wystąpiły błędy podczas przetwarzania lub operowania płytkami w trakcie numerowania obrazowania lub przypinania płytek. Po przygotowaniu dodatniej szczepu brzeżnego zgodnie z opisaną procedurą pisemną, szczepy macierzowe, jak i dodatni szczep brzeżny, są inkubowane przez noc w temperaturze 32 °C przy wstrząsaniu orbitalnym z prędkością 190 RPM. Następnego dnia należy wypełnić studzienki brzegowe około 80 µL kultury z nocnej inkubacji. Zmontowane płytki można wykorzystać do krzyżowania, zgodnie z opisem w następnej sekcji.

Alternatywnie, w przypadku przechowywania długoterminowego, do każdego dołka w płytkach odbiorczych dodaje się 15% glicerolu, a następnie miesza pożywkę z glicerolem. Płytki są następnie przechowywane w temperaturze -80 °C. Procedurę kojenia rozpoczyna się od nocnej hodowli szczepu donora HFR, posiadającego delecję badanego genu znakowaną kasetą oporności na chloramfenikol, w temperaturze 32 °C w bogatym płynnym pożywce LB z dodatkiem 17 µg/mL chloramfenikolu.

Kolekcję mutantów biorców zamówioną z TH naniesiono w gęstości 384 kolonii na stałe płytki LB uzupełnione o 50 µg/mL kanamycyny. Równolegle szczep mutanta dawcy zapytania naniesiono w gęstości 384 kolonii na taką samą liczbę płytek LB.

Uzupełnić 17 µg/mL chloramphenicolu. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 32 °C w celu koniugacji szczepów. Przenieść donora z nocnych płytek donorowych 3×84 kolonie na stałe płytki LB.

Następnie przenieś szczepy z jednej płyty odbiorczej z koloniami w układzie 384 na świeżo naniesione szczepy donora, pozostawiając je na noc. Inkubuj płyty do koniugacji w temperaturze 32 °C przez 16 do 24 godzin. Następnie przenieś każdą płytę do koniugacji o gęstości 384 na pojedynczą płytę z litym podłożem LB zawierającym chloramfenikol.

Następnie należy powtarzać ten proces, aż wszystkie płytki do konjugacji zostaną przeniesione. Świeżo zaszczepione pierwsze płytki selekcyjne należy inkubować od 16 do 36 godzin w temperaturze 32 °C. Po inkubacji należy ponownie przenieść mikrokolonie z każdej pierwszej płytki selekcyjnej na drugą płytkę selekcyjną z podwójną antybiotykoopornością w formacie 1536 SPOT, tak aby każda kolonia z pierwszej selekcji była reprezentowana przez cztery kolonie.

Na drugiej płytce selekcyjnej inkubuj płytki przez 16 do 36 godzin w temperaturze 32 °C, a następnie sfotografuj końcowe płytki selekcyjne podwójnych mutantów, aby ilościowo zmierzyć sprawność wzrostu mutantów i przeanalizować interakcje między parami genów. Ponieważ geny w tej samej ścieżce wykazują ściśle skorelowane wzorce GI, geny powiązane funkcjonalnie można grupować poprzez ich klastrowanie zgodnie z ogólną podobnością profili wyniku S.

Podobieństwo profilu GI reprezentuje zgodność fenotypów po mutacji dwóch genów i powinno wskazywać, czy oba geny działają w tym samym lub nakładającym się szlaku. Przedstawiono tutaj rozkład współczynników korelacji między profilami GI par genów kodujących fizycznie oddziałujące białka w porównaniu z losowo dobranymi parami genów. Przykład wykresu rozrzutu skorelowanych profili genetycznych dla dwóch transporterów, które tworzą kompleks heterotrymeryczny niezbędny do wydalania plemników, jest pokazany wraz z wykazanym genem linii ekologicznej drożdży.

Łagodzące interakcje z silnie skorelowanymi profilami GI mają tendencję do kodowania szlaków, które są fizycznie powiązane lub działają spójnie w ramach wspólnego szlaku biochemicznego. Tutaj przedstawiono reprezentatywny przykład, w którym komponenty funkcjonalnie redundantnych szlaków biosyntezy żelazo-siarkowej ISC i SUF, uczestniczące wspólnie w procesie niezbędnym do przeżycia, tworzą odrębne klastry połączone ze sobą licznymi interakcjami zaostrzającymi. Można zastosować miarę statystyczną, aby wykryć istotne wzbogacenie interakcji pomiędzy konkretnymi kombinacjami szlaków, integrację sieci GI z interakcjami fizycznymi oraz innymi danymi o powiązaniach funkcjonalnych, takimi jak kontekst genomiczny.

Relacje mogą ujawniać organizację funkcjonalnych modułów wyższego rzędu, które definiują podstawowe systemy biologiczne u bakterii. Analizę skupień można również zastosować do sieci GI w celu przewidywania funkcji adnotowanych genów. Ponieważ algorytmy klasteryzacji są zróżnicowane.

Należy jednak pamiętać, że domniemane przypisania funkcjonalne określone na podstawie klastrowania wymagają niezależnej weryfikacji eksperymentalnej. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest uwzględnienie wszystkich niezbędnych kontroli pozytywnych i negatywnych. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące funkcji konkretnych genów, a także charakteru relacji funkcjonalnych między genami a szlakami, można zastosować inne metody, takie jak proteomika, eksperymenty biochemiczne oraz genomika chemiczna.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak konstruować szczepy z podwójną mutacją, składać macierze biorców oraz przeprowadzać badania przesiewowe ESGA w celu zbadania zależności funkcjonalnych między genami a procesami w e coli.