Proces Green Monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie szczepów drożdży posiadających wielokrotne delecje znakowane genem reporterowym białka fluorescencyjnego GFP. Jest to osiągane poprzez wstępne przygotowanie haploidalnych pojedynczych mutantów, zwanych pro monsterami, z których każdy posiada kasetę delecyjną GFP w miejsce jednego z genów docelowych. Drugim krokiem jest sortowanie delekcji poprzez krzyżowanie i sporulację szczepów drożdży z wykorzystaniem dwóch zestawów diploidowych i haploidalnych markerów selekcyjnych, zwanych GM toolkit A oraz GM toolkit alpha, które są również obecne w szczepach pro monster.

Następnie, z populacji meiotycznej za pomocą cytometrii przepływowej wyselekcjonowane są komórki o wysokiej fluorescencji w celu wzbogacenia szczepów posiadających dwa delecje. Ostatnim krokiem jest potwierdzenie genotypów posortowanych szczepów. Ostatecznie powtarzane cykle krzyżowania i wzbogacania metodą cytometrii przepływowej, rozpoczynające się od uzyskanych szczepów, prowadzą do wygenerowania szczepów z większą liczbą delecji.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak metoda G służąca do ponownego wykorzystania markerów i sekwencyjnego usuwania genów, jest możliwość uzyskania wielu delecji w jednym cyklu, co prowadzi do szybszego otrzymania mutantów wielokrotnych. Po wygenerowaniu pro-mutantów, zgodnie z opisem w protokole pisemnym dołączonym do tego filmu, rozpoczyna się cykle rozmnażania płciowego poprzez przygotowanie kultur ustalonych szczepów pro-mutantów z delecją GFP w probówkach typu Eppendorf o pojemności 1,6 ml. Przygotowano szczep z delecją typu macierzyście A w 100 µL syntetycznej pożywki kompletnej pozbawionej histydyny, określanej jako pożywka minus his. Przygotowano również szczep z delecją typu macierzyście alpha w 100 µL syntetycznej pożywki kompletnej pozbawionej leucyny (pożywka minus lu) w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,6 ml w celu zapewnienia wymiany powietrza.

W nakrętkach probówek wykonać otwory za pomocą pinezki potraktowanej 70% etanolem. Probówki rotować w pozycji poziomej w temperaturze 30 °C przez noc. Oś obrotu musi być równoległa do osi podłużnej probówki.

Szacując na podstawie gęstości optycznej, wymieszano około 250 000 komórek haploidalnych typu a oraz 250 000 komórek haploidalnych typu alpha szczepów z delecją GFP w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,6 ml. Liczba komórek ta zazwyczaj odpowiada 7 µL każdej z kultur nocnych po wymieszaniu w wirówce wortex. Następnie komórki te poddano wirowaniu przy 800 ×g przez dwie minuty.

Po zdjęciu nadlewki, wykonaj otwór w wieczku za pomocą pinezki potraktowanej 70% ethanol. Aby umożliwić wymianę powietrza, dodaj 50 µL pożywki YPDA, a następnie krótko wymieszaj na wirówce typu vortex w 800 G przez pięć minut. Następnie umieść probówkę w komorze wilgotnościowej przygotowanej z pustego pudełka na końcówki, małego statywu na końcówki oraz mokrego ręcznika papierowego.

Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 30 °C. Przenieść 10 µL mieszaniny do krzyżowania do 500 µL pożywki GNA bez agaru, zawierającej antybiotyki G 4 1 8 oraz nat, do probówki o pojemności 5 ml z poluzowaną zakrętką; początkowa gęstość optyczna przy 600 nm wynosi około 0,1. Hodowlę inkubować w rotatorze w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.

Umożliwia to selekcję diploidów, ponieważ tylko diploidy zawierające zarówno MX4 w zestawie GM toolkit A, jak i nat MX4, mogą rosnąć w obecności G418 i Nat. Przenieś 20 µL jednodniowej hodowli do 500 µL świeżego podłoża GN zawierającego G418 i Nat. Początkowa gęstość optyczna przy 600 nm wynosi w przybliżeniu 0,2.

Inkubuj probówkę w temperaturze 30 °C przez pięć godzin, aby doprowadzić komórki do fazy logarytmicznej. Następnie przeprowadź sporulację diploidów i wyizoluj zarodniki. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w protokole pisemnym.

Następnie należy podzielić zawiesinę komórek związanych z SPO na dwie części po 300 µL i przelać każdą z nich do oddzielnej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 mL. Probówki należy wirować z prędkością 800 G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu S, w wieczku każdej probówki należy wykonać otwór.

Za pomocą pinu wypchnij 100 µL pożywki minus his do osadu w jednej probówce. Aby wyselekcjonować haplotypy PT w drugiej probówce, dodaj 100 µL pożywki minus loo. Aby wyselekcjonować haplotypy alfa.

Inkubować probówki w temperaturze 30 °C przez noc, obracając je. Końcowa gęstość optyczna przy 600 nm powinna być mniejsza niż 0,5. Jeśli gęstość optyczna przy 600 nm jest zbyt wysoka, inkubować w temperaturze pokojowej.

Aby indukować GFP, dodaj 100 µL świeżego pożywki minus hiss lub minus LU zawierającej 20 µg/mL doksycykliny do poszczególnych szczepów. Końcowe stężenie doksycykliny wynosi 10 µg/mL. Wymieszaj probówkę w wstrząsarzu wortexowym i inkubuj w rotacji w temperaturze 30 °C przez dwa dni.

Aby rozpocząć cytometrię przepływową, należy dodać 900 µL przefiltrowanego buforu TE do pięciomililitrowej probówki polipropylenowej, w której zakrętka została zastąpiona zakrętką z sitkiem do komórek z pięciomililitrowej probówki polistyrenowej. Probówki polipropylenowe są odpowiednie do cytometrii przepływowej. Zakrętka z sitkiem jest niezbędna do usuwania dużych cząstek.

Ostrożnie nanieś 75 µL buforu na pokrywkę sitka do oddzielania komórek. Dodaj 25 µL indukowanych komórek do roztworu na pokrywce, dociskając końcówkę pipety do siatki. Przepuść cały połączony roztwór przez sitko.

Dociśnij zakrętkę z filtrem i wymieszaj zawartość probówki w wirówce typu vortex. Przygotuj probówki do zbierania – probówki Fendor o pojemności 1,6 ml wypełnione 200 µl medium minus hiss lub minus lube. Uruchom sorter komórek i dostosuj ustawienia zgodnie z instrukcją producenta.

Wymieszaj probówki zbiorcze na wirówce typu vortex, aby pokryć ich ścianki medium. Przed załadowaniem komórek do sortera komórkowego wymieszaj również probówkę z zawiesiną komórkową. Pozyskaj dane z cytometrii przepływowej dla badanej próbki.

Szczep pozbawiony GFP może służyć jako kontrola negatywna. Wyznacz bramki sortowania w celu wyeliminowania agregatów komórkowych, które mogłyby wykazywać wysoką intensywność GFP. Odrzuć wartości odstające o nieproporcjonalnie dużej szerokości impulsu lub polu dla rozpraszania przedniego (FSC), wykorzystując wykres szerokości i wysokości impulsu lub wykres pola i wysokości FSC.

Ponieważ w przypadku agregatów komórkowych oczekiwane jest wysokie FSC, należy wybrać komórki z dolnych 20% zakresu FSC. Należy unikać obszarów z najniższymi wartościami FSC oraz rozproszenia bocznego (SSC), w których często znajduje się debris komórkowy. Sygnały SSC i GFP są często dodatnio skorelowane.

Aby uniknąć wzbogacenia populacji o komórki o wyższej wartości SSC, należy wyznaczyć bramkę wzdłuż obrysu populacji na wykresie intensywności GFP i SSC, aby pobrać podobny procent najjaśniejszych komórek z każdego punktu wzdłuż osi SSC. Do sortowania do probówki zbiorczej należy wyznaczyć od 0,1 do 1% subpopulacji wyselekcjonowanej w poprzednim kroku za pomocą bramek FSC i SSC. Probówkę zbiorczą należy wymieszać w wortexie, aby medium całkowicie pokryło posortowane komórki, a następnie przenieść je na płytkę.

Podzbiór komórek na płytce A-Y-P-D-A do genotypowania. Inkubować płytkę w temperaturze 30°C przez dwa dni po inkubacji. Przygotować lizat z około 12 kolonii.

Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w pisemnym protokole genotypowania. Przeanalizuj 1 µL rozcieńczonego lizatu, wykorzystując 10 µL reakcji PCR z primerem forward. Primer ten przyłącza się do regionu flankującego upstream każdego usuniętego genu, w parze z primerem wspólnym, który przyłącza się w obrębie wszystkich loci delecji.

Reakcję PCR można przeprowadzić w formacie 96- lub 384-dołkowym. Po amplifikacji należy przeanalizować produkty PCR za pomocą elektroforezy.

Zidentyfikuj haplotypy, które prawdopodobnie posiadają pożądane genotypy. Przenieś te szczepy na nową płytkę. Zamroź je również w 25% glicerolu w temperaturze -80°C.

Zaleca się przeprowadzenie dodatkowych testów, takich jak potwierdzenie braku sekwencji typu dzikiego dla usuniętych genów oraz elektroforezę w żelu po etapie field gel electrophoresis. Należy powtórzyć cykle rozmnażania płciowego z użyciem przydatnych szczepów. W potomstwie haploidalnym z krzyżówki dwóch szczepów indukowano ekspresję GFP.

Każda delecja genu zawierała kasetę GFP; przy użyciu bramkowania w cytometrze przepływowym wyselekcjonowano populację powstałych komórek. Jest mało prawdopodobne, aby w tej populacji znajdowały się zanieczyszczenia lub agregaty komórkowe. Wyselekcjonowano i zachowano 1% najjaśniejszych komórek, bramkując je na podstawie pola rozproszenia światła przedniego (forward scatter area) oraz wysokości rozproszenia światła przedniego (forward scatter height).

Agregaty komórkowe, które zazwyczaj wykazują nieproporcjonalnie duży obszar rozproszenia światła w przód (forward scatter), zostały odrzucone poprzez bramkowanie komórek na podstawie rozproszenia w przód (forward scatter) i rozproszenia bokiem (side scatter). Zaakceptowano komórki znajdujące się w dolnych 20% rozproszenia w przód, wykluczając jednocześnie resztki komórkowe (debris) o najniższych wartościach rozproszenia w przód i bokiem. Poprzez bramkowanie komórek na podstawie rozproszenia bokiem i sygnału GFP, wybrano komórki o wyższej fluorescencji w danym zakresie rozproszenia bokiem, aby umożliwić porównanie mieszaniny mytycznej z próbką kontrolną ujemną, która nie wykazuje ekspresji GFP. Na schemacie przedstawiono strategię bramkowania (GA) identyczną z tą, która była stosowana do selekcji populacji P trzy. W osobnych haplosach przeanalizowano metodą PCR podobnie wyselekcjonowane komórki kontroli ujemnej po ich indukowaniu do ekspresji GFP i posortowaniu na podstawie fluorescencji. Oczekiwana liczba delecji dla nieposortowanej komórki wynikająca z losowej segregacji wynosiła 7,5.

W tym konkretnym eksperymencie posortowane komórki charakteryzowały się średnią liczbą delecji wynoszącą 8,8 ± 0,3, w tym pięć komórek zawierających 10 delecji. Genotyp DO. Sortowanie szczepów PCL przeprowadzono z użyciem praimera odwrotnego.

Ten primer wiąże się z obszarem flankującym położonym poniżej (downstream) w parze z primerem forward. Ten primer wiąże się z końcem kasety. Obecność prążka wskazuje na obecność kasety GFP.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania metody green Monster do wprowadzania delecji w drożdżach.