Name: Proces Green Monster do wytwarzania szczepów drożdży z wieloma delecjami genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Poznaj metodę Green Monster do tworzenia szczepów drożdży z wieloma delecjami genów z wykorzystaniem GFP i cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia szybką selekcję fluorescencyjną i efektywną manipulację genetyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez kontrakt N66001-12-C-4039 amerykańskiej Agencji Projektów Badawczych w Zakresie Obrony (DARPA) przyznany Y.S., grant z Fundacji Alfreda P. Sloana dla R.S.L. oraz granty R01 HG003224 i R21 CA130266 z amerykańskich Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) dla F.P.R. F.P.R. otrzymał również wsparcie w ramach stypendium z Kanadyjskiego Instytutu Badań Zaawansowanych (CIFAR) oraz programu Canada Excellence Research Chairs.

1. Generowanie ProMonsterów
<ol>
	<li>Przygotuj uniwersalną kasetę zastępującą GFP poprzez amplifikację markera tetO2-GFP oraz markera URA3 z plazmidu pYOGM012 (oporność na ampicylinę) przy użyciu starterów o sekwencjach: 
	GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCCCAAGCTCCTCGAGTAATTCG oraz GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCACGTACCGGGTAATAACTGATATAAT (pogrubione regiony zapewniają homologię do regionów flankujących kasetę KanMX4, co umożliwia celową zastąpienie). Reakcję PCR należy przeprowadzić z użyciem polimerazy Phusion, buforu HF oraz 3% dimetylosulfotlenku (New England BioLabs), zaczynając od stężenia matrycowego DNA wynoszącego 0,5 ng/μl. Program PCR obejmuje 98 °C przez 30 s oraz 35 cykli: 98 °C przez 10 s, 49 °C przez 30 s i 72 °C przez 1,5 min. Objętość reakcji powinna wynosić &gt; 50 μl, aby zapewnić wystarczającą ilość DNA dla każdego eksperymentu transformacyjnego. Produkt oczyszczamy za pomocą zestawu do oczyszczania PCR QIAquick (Qiagen), przetwarzając ok. 50 μl reakcji PCR na kolumnę, jednak pominięcie etapu oczyszczania może zwiększyć wydajność transformantów. 
	Alternatywnie, uwolnij fragment zawierający markery tetO2-GFP i URA3 oraz regiony homologiczne do celowania w KanMX4 poprzez trawienie plazmidu pYOGM057 (oporność na ampicylinę) za pomocą enzymu restrykcyjnego EcoRI (New England BioLabs). Stężenie DNA w tej reakcji powinno wynosić ~30 ng/μl. Objętość reakcji powinna być &gt; 34 μl. 
	W przypadku integracji kasety GFP w regionie innym niż KanMX4, dostosuj region homologiczny powyższych starterów PCR do odpowiednich sekwencji homologicznych.</li>
	<li>Transformuj szczep haploidalny a z kolekcji knockoutów drożdżowych KanMX412 uniwersalną kasetą delecyjną GFP. Zgodnie z protokołem Woodsa i Gietza13, do każdego eksperymentu transformacyjnego należy użyć 0,34 μl próbki DNA (oczyszczonego produktu PCR lub nieoczyszczonego trawienia restrykcyjnego). Wyseń jedną piątą mieszaniny transformacyjnej na płytkę CAA-Ura (0,67% yeast nitrogen base, 2% glukozy, 0,6% kwasów casamino, 0,0025% hemisiarczanu adeniny, 0,005% tryptofanu i 2% agaru).</li>
	<li>Wyseń transformanty na świeżą płytkę CAA-Ura w celu uzyskania odizolowanych kolonii.</li>
	<li>Przenieś komórki z kolonii na płytkę YPDA zawierającą 200 μg/ml G418, aby potwierdzić brak wzrostu. Aby potwierdzić pomyślną integrację GFP, wykonaj koloniową PCR zgodnie z krokami (1.5) – (1.9).</li>
	<li>Dodaj komórki pobrane z kolonii do 2 μl buforu lizującego (0,1 M fosforan sodu, pH 7,4, 1 jednostka zymolazy od ZymoResearch) w probówce PCR 0,2 ml lub do dołka płytki 96-dołkowej. Wymieszaj, pipetując roztwór do końcówki pipety i z powrotem.</li>
	<li>Przykryj jedną kroplą (ok. 20 μl) oleju mineralnego za pomocą Pipetmana P200 (Gilson).</li>
	<li>Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 20 min, a następnie w 95 °C przez 10 min.</li>
	<li>Rozcieńcz lizat 50 μl wody. Wymieszaj, pipetując roztwór dziesięć razy.</li>
	<li>Analizuj 1 μl lizatu za pomocą reakcji PCR o objętości 10 μl z zastosowaniem: (A) startera forward, który hybrydyzuje z regionem flankującym powyżej, w parze ze starterem o sekwencji CCTGAGAAAGCAACCTGACC (285 bp od początku kasety), (B) startera reverse, który hybrydyzuje z regionem poniżej, w parze ze starterem o sekwencji GCATTGGGTCAACAGTATAG (375 bp od końca), (C) dwóch starterów hybrydyzujących z KanMX4 o sekwencjach CGTACTCCTGATGATGCATG i GACGAAATACGCGATCGCTG (181 bp) oraz (D) dwóch starterów hybrydyzujących z sekwencją typu dzikiego targetowanego genu (Rysunek 4). Punkt (D) jest istotny, ponieważ wiadomo, że około 8% szczepów w kolekcjach delecyjnych wykazuje aneuploidię14. Prawidłowy transformant powinien być pozytywny dla (A) i (B) oraz negatywny dla (C) i (D).</li>
	<li>Aby wprowadzić GMToolkit do transformanta, dodaj około 250 000 komórek szczepu transformowanego oraz 250 000 komórek RY0146 (zawierającego GMToolkit-a) lub RY0148 (zawierającego GMToolkit-α) do probówki Eppendorf 1,6 ml. Wymieszaj na wortexie. Genotypy RY0146 i RY0148 to odpowiednio MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ::GMToolkit-a [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-Sp-his5] oraz MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ::GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr-LEU2]. „pr” oznacza promotor. Liczbę komórek należy oszacować na podstawie gęstości optycznej poprzedniej hodowli.</li>
	<li>Wirować przy 800 x g przez 2 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant.</li>
	<li>Aby umożliwić wymianę powietrza, wykonaj otwór w zakrętce za pomocą szpilki potraktowanej 70% etanolem.</li>
	<li>Dodaj 50 μl pożywki YPDA (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy i 0,003% hemisiarczanu adeniny). Wymieszaj na wortexie.</li>
	<li>Wirować przy 800 x g przez 5 min.</li>
	<li>Umieść probówkę w wilgotnym pudełku. Można je stworzyć z pustego pudełka na końcówki, małego stojaka na końcówki i mokrego ręcznika papierowego.</li>
	<li>Inkubuj pudełko przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Wyselekcjonuj zapłodnione diploidy, najpierw wysewając komórki na płytkę CAA-Ura. Inkubuj płytkę w 30 °C przez jeden dzień.</li>
	<li>Pobierając komórki z obszaru zlanego, wyseń je w celu uzyskania odizolowanych kolonii na płytkach YPDA (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy, 0,003% hemisiarczanu adeniny i 2% agaru) zawierających 200 μg/ml G418 do selekcji diploidów zawierających GMToolkit-a lub 100 μg/ml nourseothricyny (Nat)15 do selekcji diploidów zawierających GMToolkit-α.</li>
	<li>Inkubuj płytkę w 30 °C przez 3 dni.</li>
	<li>Zaczynając od odizolowanej kolonii, przenieś większość komórek do 500 μl pożywki GNA bez agaru (1% ekstraktu drożdżowego, 3% bulionu odżywczego Difco i 5% glukozy; glukozę oraz pozostałe składniki autoklawuj oddzielnie jako roztwory 2×, aby uniknąć karmelizacji) do probówki hodowlanej 5 ml z poluzowaną zakrętką.</li>
	<li>Obracaj probówkę poziomo przez pięć godzin w 30 °C. Oś obrotu musi być równoległa do długiej osi probówki.</li>
	<li>Potwierdź, że kolonie użyte w (1.21) są Ura+, wysewając je na płytkę CAA-Ura.</li>
	<li>Wirować probówkę przy 800 x g przez 2 min. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodaj 500 μl minimalnej pożywki do sporulacji (1% octanu potasu, 0,005% octanu cynku; sterylizuj przez filtr). Wymieszaj na wortexie.</li>
	<li>Wirować probówkę przy 800 x g przez 2 min. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Powtórz kroki (1.25) – (1.26) dwukrotnie.</li>
	<li>Dodaj 1 ml minimalnej pożywki do sporulacji uzupełnionej o 7,5 μg/ml lizyny, 7,5 μg/ml leucyny, 5 μg/ml histydyny, 5 μg/ml metioniny i 1,25 μg/ml uracylu (aby zwiększyć tempo sporulacji szczepów auksytroficznych). Wymieszaj na wortexie.</li>
	<li>Obracaj probówkę w temperaturze pokojowej przez jeden dzień.</li>
	<li>Obracaj probówkę w 30 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Odwiruj 125 μl tej mieszaniny w probówce Eppendorf 1,6 ml przy 800 x g przez 2 min. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodaj 50 μl roztworu zymolazy (100 mM bufor fosforan sodu, pH 7,4, 1 M sorbitolu i 2 jednostki zymolazy od ZymoResearch). Wymieszaj, pipetując roztwór do końcówki pipety i z powrotem.</li>
	<li>Inkubuj w 30 °C przez 1 h.</li>
	<li>Dodaj 50 μl 0,02% NP-40. Wymieszaj, pipetując roztwór do końcówki pipety i z powrotem.</li>
	<li>Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.</li>
	<li>Dodaj 500 μl wody.</li>
	<li>Umieść probówkę na lodzie.</li>
	<li>Sonicuj tę mieszaninę dwukrotnie przy ustawieniu mocy 1 (najniższe ustawienie) przez 15 s, używając mikrokońcówki 3,2 mm w Sonifierze 450 (Branson). Pomiędzy dwiema seriami sonikacji umieść probówkę na lodzie, aby obniżyć temperaturę do ~0 °C.</li>
	<li>Wirować probówki przy 800 x g przez 5 min. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodaj 200 μl pożywki SC-Ura-His (a) lub SC-Ura-Leu (α), w zależności od tego, czy krzyżówka służy do inkorporacji GMToolkit-a czy GMToolkit-α. Aby przygotować pożywki, sporządź pożywkę SC-Ura-His-Leu (0,67% yeast nitrogen base, 2% glukozy, 0,01% argininy, 0,01% kwasu asparaginowego, 0,01% kwasu glutaminowego, 0,01% izoleucyny, 0,01% lizyny, 0,01% metioniny, 0,01% fenyloalaniny, 0,08% seryny, 0,04% treoniny, 0,002% tyrozyny, 0,03% waliny, 0,0025% adeniny, 0,005% tryptofanu, 0,003% adeniny i 0,005% tryptofanu) i uzupełnij ją przed użyciem sterylną histydyną lub leucyną do końcowego stężenia 0,01%.</li>
	<li>Wykonaj otwór w zakrętce za pomocą szpilki potraktowanej 70% etanolem.</li>
	<li>Obracaj probówkę poziomo w 30 °C przez 2 dni. Oś obrotu musi być równoległa do długiej osi probówki.</li>
	<li>Wyseń komórki na płytkę agarową SC-Ura-His lub SC-Ura-Leu (te same składniki co powyżej plus 2% agaru; treoninę i kwas asparaginowy należy dodać po autoklawowaniu; dodaj histydynę lub leucynę przed wlewaniem), aby uzyskać odizolowane kolonie dla szczepów ProMonster.</li>
</ol>
2. Cykl płciowy
<ol>
	<li>Inkubuj kulturę ustalonego szczepu z delecją GFP w 100 μl medium SC-His (a) lub SC-Leu (α), w zależności od typu krzyżowania, w temperaturze 30 °C przez noc w probówce Eppendorf o pojemności 1,6 ml, stosując rotację. Aby zapewnić wymianę powietrza, wykonaj otwór za pomocą szpilki potraktowanej 70% etanolem. Probówkę obracaj poziomo. Oś rotacji musi być równoległa do osi podłużnej probówki. Możliwe jest skrzyżowanie wielu szczepów poprzez krzyżowanie en masse. W przypadku bezpośredniego wykorzystania do tego celu próbki po sortowaniu, hoduj komórki w 200 μl w temperaturze 30 °C przez 2 dni. Aby przygotować medium, dodaj uracyl (stężenie końcowe: 0,0025%) i histydynę (0,01%) lub leucynę (0,01%) do medium SC-Ura-His-Leu.</li>
	<li>Wymieszaj 250 000 komórek haploidalnych a oraz 250 000 komórek haploidalnych α szczepów z delecją GFP w probówce Eppendorf o pojemności 1,6 ml. Wymieszaj na wortexie.</li>
	<li>Przeprowadź krzyżowanie tych komórek zgodnie z krokami (1.11) – (1.17).</li>
	<li>Przenieś 10 μl mieszaniny do krzyżowania do 500 μl medium GNA zawierającego 200 μg/ml G418 i 100 μg/ml Nat w probówce hodowlanej o pojemności 5 ml z poluzowaną zakrętką. Początkowa wartość OD600 wynosi około 0,1.</li>
	<li>Inkubuj kulturę z rotacją w temperaturze 30 °C przez 24 h. Pozwala to na selekcję diploidów, ponieważ tylko diploidy zawierające zarówno KanMX4 w GMToolkit-a, jak i NatMX4 w GMToolkit-α mogą rosnąć w obecności G418 i Nat (Rysunek 3).</li>
	<li>Przenieś 20 μl jednodniowej kultury do 500 μl świeżego medium GNA zawierającego G418 i Nat. Początkowa wartość OD600 wynosi około 0,2.</li>
	<li>Inkubuj probówkę z rotacją w temperaturze 30 °C przez 5 h, aby doprowadzić komórki do fazy logarytmicznej (OD600 ~ 1).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami (1.24)–(1.38), aby doprowadzić do sporulacji diploidów i wyizolować zarodniki.</li>
	<li>Podziel zawiesinę sporulowanych komórek na dwie części po 300 μl i przelej każdą do oddzielnej probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwiruj probówki przy 800 x g przez 5 min. Odlej nadsącz.</li>
	<li>Do osadu w jednej probówce dodaj 100 μl medium SC-His w celu selekcji haploidów a. Do osadu w drugiej probówce dodaj 100 μl medium SC-Leu w celu selekcji haploidów α.</li>
	<li>Inkubuj probówki z rotacją w temperaturze 30 °C przez noc. Końcowa wartość OD600 powinna być mniejsza niż 0,5. Jeśli OD600 ma tendencję do zbyt wysokich wartości, spróbuj hodować komórki w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby zindukować GFP, dodaj 100 μl świeżego medium SC-His (a) lub SC-Leu (α) zawierającego 20 μg/ml doksycykliny. Końcowe stężenie doksycykliny wynosi 10 μg/ml. Wymieszaj na wortexie.</li>
	<li>Inkubuj probówki z rotacją w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
</ol>
3. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Do probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml (BD Falcon #352063), w której nakrętkę zastąpiono nakrętką z sitkiem z probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml (BD Falcon #352235), dodaj 900 μl przefiltrowanego buforu TE (pH 7.5) zawierającego 10 μg/ml doksycykliny. Probówki polipropylenowe nadają się do cytometrii przepływowej. Nakrętka z sitkiem jest niezbędna do usuwania dużych cząsteczek.</li>
	<li>Delikatnie nanieś 75 μl buforu TE z doksycykliną na nakrętkę z sitkiem.</li>
	<li>Dodaj 25 μl indukowanych komórek do roztworu na nakrętce.</li>
	<li>Dociskając końcówkę Pipetmana do siatki, przepuść cały połączony roztwór przez sitko.</li>
	<li>Dociśnij nakrętkę z sitkiem i wymieszaj zawartość probówki na wortexie.</li>
	<li>Przygotuj probówki do zbierania (probówki Eppendorf 1,6 ml) wypełnione 200 μl pożywki SC-His lub SC-Leu.</li>
	<li>Uruchom sorter komórkowy i dostosuj ustawienia zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Przed załadowaniem na sorter komórkowy wymieszaj na wortexie zarówno probówkę do zbierania (aby pokryć ścianki pożywką), jak i probówkę zawierającą komórki.</li>
	<li>Zdobądź dane z cytometrii przepływowej dla próbki. Jako kontrolę negatywną można wykorzystać szczep nie zawierający GFP.</li>
	<li>Wyznacz bramki do sortowania. (A) Aby uniknąć agregatów komórkowych, które mogą wykazywać wysoką intensywność GFP, odrzuć wartości odstające z nieproporcjonalnie dużą szerokością impulsu dla rozproszenia światła w przód (FSC), korzystając z wykresu szerokości i wysokości impulsu dla sortera MoFlo, lub z nieproporcjonalnie małą wysokością FSC, korzystając z wykresu wysokości i pola FSC dla sortera FACSAria (Rycina 5, panel górny lewy). (B) Ponieważ w przypadku agregatów komórkowych spodziewane jest duże FSC (pole), wybierz tylko komórki z dolnych 20% FSC, unikając obszarów z najniższymi wartościami FSC i rozproszenia światła pod kątem (SSC), gdzie często znajduje się debris komórkowy (Rycina 5, panel górny prawy). (C) SSC (pole) i sygnał GFP (pole) są często dodatnio skorelowane. Ponieważ zwykłe wybranie najjaśniejszych komórek przy powyższych bramkach spowodowałoby również wzbogacenie o komórki z wysoką wartością SSC, wyznacz bramkę wzdłuż peryferii populacji, korzystając z wykresu intensywności GFP i SSC, aby pobrać podobny procent najjaśniejszych komórek z każdego punktu osi SSC (Rycina 5, schemat dolny lewy). Populacja wybrana w punkcie (C) powinna stanowić 0,1-1% populacji wybranej w punkcie (B).</li>
	<li>Posortuj 200 komórek do probówki do zbierania zgodnie z kryteriami z punktu (3.10). W przypadku procesu masowego (en masse) lub innych projektów wymagających bardziej złożonej populacji, posortuj więcej komórek zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>Wymieszaj probówkę do zbierania na wortexie, aby pokryć posortowane komórki pożywką.</li>
	<li>Wysiej podgrupę komórek (na przykład 50 komórek) na płytkę YPDA w celu genotypowania.</li>
	<li>Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Przygotuj lizat dla około 12 kolonii, postępując zgodnie z krokami (1.5) – (1.8).</li>
	<li>Przenieś pozostałe komórki z końcówki użytej w punkcie (1.5) na miejsce na płytce YPDA zawierającej G418 i Nat, delikatnie dotykając płytki końcówką. Wyselekcjonowane haploidy nie powinny rosnąć na tej płytce. Diploidy mogą mieć więcej kopii GFP, a zatem mogą być jaśniejsze. Test ten może wykazać wydajność selekcji haploidów.</li>
	<li>W celu genotypowania przeanalizuj 1 μl lizatu, przeprowadzając reakcję PCR w objętości 10 μl z zastosowaniem primera forward, który przyłącza się do regionu flankującego powyżej każdego usuniętego genu, w parze z primerem o sekwencji CCTGAGAAAGCAACCTGACC. 
	Jeśli to możliwe, wykonaj reakcje PCR w wersji multipleksowej (warunki można ustalić, korzystając z lizatów pojedynczych mutantów). PCR można przeprowadzić w formacie 96- lub 384-dołkowym. Ten drugi format nadaje się dla objętości reakcji wynoszącej nawet 5 μl. Przygotowanie mieszanin PCR różniących się primerami oraz dodawanie lizatów komórkowych do tych mieszanin można przeprowadzić za pomocą pipety wielokanałowej lub robota do obsługi cieczy. Zmiana końcówek jest opcjonalna przy dodawaniu tego samego lizatu do różnych mieszanin PCR.</li>
	<li>Przeanalizuj produkty PCR. System elektroforezy Gel XL Ultra V-2 (Labnet) jest kompatybilny z nakładaniem próbek za pomocą pipet wielokanałowych.</li>
	<li>Na podstawie informacji z punktów (3.16) i (3.18) zidentyfikuj prawdopodobne haploidy o pożądanych genotypach.</li>
	<li>Utrwal szczepy te na świeżej płytce (YPDA, CAA-Ura lub SC-Ura-His/Leu). Zamroź je również w 25% glicerolu w temperaturze -80 °C. Zaleca się dodatkowe testy, takie jak potwierdzenie braku sekwencji typu dzikiego dla usuniętych genów oraz elektroforezę w polu pulsacyjnym.</li>
	<li>Powtórz cykl seksualny od punktu (2.1) z użyciem przydatnych szczepów.</li>
</ol>

<ol><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117(2001).</li>
<li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li>
<li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li>
<li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li>
<li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519(1996).</li>
<li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome%3A+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li>
<li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li>
<li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+%28TREC%29%3A+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li>
<li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li>
<li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li>
<li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962(2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podczas opracowywania metody Green Monster obawialiśmy się możliwości rekombinacji pomiędzy różnymi kasetami zastępującymi GFP, co mogłoby prowadzić do reorganizacji genomu. Przeciwdziałaniem tej możliwości jest nasz dobór komórek, które pomyślnie przeszły wielokrotne rundy kojenia i mejozy. Oczekuje się, że komórki z reorganizowanym genomem będą wykazywać mniejszą przystosowalność po skrzyżowaniu z komórkami bez identycznej reorganizacji. Rzeczywiście nie zaobserwowaliśmy żadnej niestabilności genomu wynikającej z rekom...

<table><tbody><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720</td><td>Rozpuścić w wodzie i wysterylizować przez filtr (filtr 0,2-&amp;mu;m). Stężenie roztworu zapasowego: 200 mg/ml. Przechowywać w temperaturze 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>ClonNAT (nourseotrycyna)</td><td>WERNER BioAgents</td><td>5001000</td><td>Rozpuścić w wodzie i wysterylizować przez filtr (filtr 0,2-&amp;mu;m). Stężenie roztworu zapasowego: 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Rozpuścić w 50% etanolu i wysterylizować przez filtr (filtr 0,2-&amp;mu;m). Stężenie roztworu zapasowego: 10 mg/ml. Przygotowywać świeży roztwór co cztery tygodnie. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać w temperaturze 4 &amp;deg;C. </td></tr><tr><td>Zymolaza</td><td>ZymoResearch</td><td>E1005</td><td></td></tr><tr><td>Difco yeast nitrogen base bez aminokwasów</td><td>BD</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Revolver (rotator do probówek)</td><td>Labnet</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka elektroforetyczna Enduro Gel XL</td><td>Labnet</td><td>E0160</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 450 </td><td>Branson</td><td>101-063-198</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokońcówka do Sonifier 450</td><td>Branson</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>Sorter komórek FACSAria</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorter komórek MoFlo</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robot Biomek FX lub odpowiednik</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Opcjonalnie. Do przygotowania reakcji PCR do genotypowania.</td></tr></tbody></table>

proces green monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Fenotypy wynikające z delecji genu często ujawniają się dopiero wtedy, gdy mutacja zostanie przetestowana w określonym tle genetycznym lub warunkach środowiskowych1,2. Istnieją przykłady, w których usunięcie wielu genów jest konieczne do odsłonięcia ukrytych funkcji genowych3,4. Mimo potencjału do dokonania istotnych odkryć, interakcje genetyczne obejmujące trzy lub więcej genów pozostają w dużej mierze niezbadane. Wyczerpujące poszukiwania interakcji w wielokrotnych mutantach byłyby niepraktyczne ze względu na ogromną liczbę możliwych kombinacji delecji. Jednakże badania wybranych zestawów genów, takich jak zestawy paralogów z większą szansą a priori na pełnienie wspólnej funkcji, byłyby informatywne.
W drożdżach Saccharomyces cerevisiae nokaut genu przeprowadza się poprzez zastąpienie genu markerem selekcyjnym za pomocą rekombinacji homologicznej. Ze względu na ograniczoną liczbę markerów opracowano metody usuwania i ponownego wykorzystywania tego samego markera5,6,7,8,9,10. Jednak sekwencyjne wprowadzanie wielu mutacji przy użyciu tych metod jest czasochłonne, ponieważ wymagany czas rośnie liniowo wraz z liczbą generowanych delecji.
W niniejszej pracy opisujemy metodę Green Monster służącą do rutynowego wprowadzania wielokrotnych delecji u drożdży11. W metodzie tej reporter w postaci zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), zintegrowany z delecjami, jest wykorzystywany do ilościowego znakowania szczepów w zależności od liczby delecji zawartych w każdym z nich (Rysunek 1). Powtarzane cykle sortowania delecji znakowanych GFP poprzez krzyżowanie drożdży i mejozę, w połączeniu z wzbogacaniem za pomocą cytometrii przepływowej szczepów zawierających więcej tych delecji, prowadzą do akumulacji delecji w szczepach (Rysunek 2). Przeprowadzanie wielu procesów równolegle, przy czym każdy proces obejmuje jedną lub więcej delecji w każdej rundzie, skraca czas wymagany do konstrukcji szczepów.
Pierwszym krokiem jest przygotowanie haploidalnych pojedynczych mutantów nazwanych „ProMonsters”, z których każdy posiada reporter GFP w usuniętym locus oraz jedno z loci „zestawu narzędziowego” (toolkit) — albo Green Monster GMToolkit-a, albo GMToolkit-α w locus can1Δ (Rysunek 3). Wykorzystując szczepy z kolekcji delecji drożdży12, delecje znakowane GFP można wygodnie generować poprzez zastąpienie powszechnej kasety KanMX4, występującej w tych szczepach, uniwersalnym fragmentem GFP-URA3. Każdy GMToolkit zawiera: marker selekcyjny dla haploidów specyficzny dla typu zapłodnienia a lub α1 oraz dokładnie jeden z dwóch markerów, które przy obecności obu GMToolkitów wspólnie umożliwiają selekcję diploidów.
Drugim krokiem jest przeprowadzenie cykli rozmnażania płciowego, dzięki którym loci delecji mogą zostać połączone w obrębie jednej komórki poprzez losową segregację i/lub rekombinację meiotyczną towarzyszącą każdemu cyklowi kopulacji i sporulacji.

Po skrzyżowaniu szczepu a-haploidalnego z czterema GFP-zznaczonymi delecjami (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) ze szczepem α-haploidalnym z czterema delecjami (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), przy czym dwa szczepy dzieliły dwie wspólne delecje (ycl033cΔ yer042wΔ), uzyskano reprezentatywny wynik. Mieszaninę zapłodnioną hodowano w medium YPDA zawierającym G418 i Nat w celu selekcji diploidów. Powstałe diploidy hodowano w medium do sporulacji. Zarodniki rozdzielono za po...

Metoda Green Monster umożliwia szybkie tworzenie wielokrotnych delecji oznakowanych genem reporterowym kodującym zielone białko fluorescencyjne. Metoda ta opiera się na przeprowadzaniu szczepów drożdży przez powtarzalne cykle seksualnego sortowania delecji oraz wzbogacania komórek posiadających więcej delekcji na podstawie fluorescencji.

Proces Green Monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Fenotypy dla delecji genu często ujawniają się dopiero wtedy, gdy mutację przetestuje się w określonym tle genetycznym lub warunkach środowiskowych1,2. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie szczepów drożdży posiadających wielokrotne delecje znakowane genem reporterowym białka fluorescencyjnego GFP. Jest to osiągane poprzez wstępne przygotowanie haploidalnych pojedynczych mutantów, zwanych pro monsterami, z których każdy posiada kasetę delecyjną GFP w miejsce jednego z genów docelowych. Drugim krokiem jest sortowanie delekcji poprzez krzyżowanie i sporulację szczepów drożdży z wykorzystaniem dwóch zestawów diploidowych i haploidalnych markerów selekcyjnych, zwanych GM toolkit A oraz GM toolkit alpha, które są również obecne w szczepach pro monster.Następnie, z populacji meiotycznej za pomocą cytometrii przepływowej wyselekcjonowane są komórki o wysokiej fluorescencji w celu wzbogacenia szczepów posiadających dwa delecje. Ostatnim krokiem jest potwierdzenie genotypów posortowanych szczepów. Ostatecznie powtarzane cykle krzyżowania i wzbogacania metodą cytometrii przepływowej, rozpoczynające się od uzyskanych szczepów, prowadzą do wygenerowania szczepów z większą liczbą delecji.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak metoda G służąca do ponownego wykorzystania markerów i sekwencyjnego u

the-green-monster-process-for-generation-yeast-strains-carrying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Proces Zielonego Potwora do generacji szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Prezentowany tutaj jest ujednolicony opis technik, które mogą być użyte do rozwoju, transformacji, podawania i testowania ekspresji heterologicznego białka probiotycznych drożdży Saccharomyces boulardii.

Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Niniejszym opisujemy metody molekularnej manipulacji genetycznej szczepu Yarrowia lipolytica Po1g w celu poprawy efektywności delecji genów. Powstałe w ten sposób zmodyfikowane szczepy Y. lipolytica mają potencjalne zastosowania w produkcji biopaliw i biochemii.

Inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Mutanty delecji genów generowane przez rekombinację homologiczną są złotym standardem w badaniach funkcji genów. Opisano metodę OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) służącą do szybkiego generowania konstruktów delecyjnych. Następuje przemiana grzybów za pośrednictwem Agrobacterium. Na koniec przedstawiono metodę potwierdzania delecji genów w transformantach grzybowych opartą na PCR.

Szybkie wytwarzanie delecji u grzybów za pośrednictwem Agrobacterium transformacji konstruktów delecji OSCAR

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię losowej mutagenezy docelowego genu u drożdży rozszczepieniowych. Jako przykład celujemy w rpt4 +, który koduje podjednostkę proteasomu 19S i badamy pod kątem mutacji, które destabilizują heterochromatynę.

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Poznaj metodę Green Monster do tworzenia szczepów drożdży z wieloma delecjami genów z wykorzystaniem GFP i cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia szybką selekcję fluorescencyjną i efektywną manipulację genetyczną.

Proces Green Monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Przeglądaj więcej filmów