Funkcjonalna ocena motywności jelit i stanu zapalnego ściany jelita u gryzoni: analizy w zestandaryzowanym modelu manipulacji jelitowej
11 września 2012
Pooperacyjny niedrożność jelit (POI) jest powikłaniem operacji w obrębie jamy brzusznej, prowadzącym do zwiększonej zachorowalności i przedłużonego pobytu w szpitalu. Ze względu na brak strategii profilaktycznych lub terapeutycznych konieczne są intensywne badania. W związku z tym opracowaliśmy zstandaryzowany i wykonalny model mysi, aby zbadać patofizjologię POI oraz przestudiować potencjalne opcje terapeutyczne.
Ogólnym celem następujących eksperymentów jest przeprowadzenie manipulacji jelitowej w celu zbadania powstawania i ustępowania się pozabiegowego porażenia jelit w modelu gryzoni; osiąga się to poprzez standaryzowaną manipulację jelitem cienkim pomiędzy dwoma wilgotnymi aplikatorami bawełnianymi. Następnie analizowany jest pasaż żołądkowo-jelitowy i okrężniczy w celu pomiaru motoryki pozabiegowej. W dalszej kolejności przeprowadzana jest analiza histochemiczna i hodowla organowa warstwy mięśniowej jelita cienkiego (muscularis externa), aby zbadać poziom stanu zapalnego.
Uzyskane wyniki wykazują silną infiltrację granulocytów neutrofilnych do błony śluzowej oraz nadmierną produkcję tlenku azotu w kulturach błony śluzowej, co skutkuje wydłużeniem czasu pasażu żołądkowo-jelitowego i jelita grubego. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i rozwiązywania problemu pooperacyjnego niedrożności jelit oraz w badaniu potencjalnej profilaktyki lub terapii. Procedurę zademonstruje Mario Lewison, technik z naszego laboratorium. Po podaniu 0,8 do 1% isofluranu w tlenie samcowi myszy, umieść zwierzę w pozycji na plecach i użyj taśmy klejącej do unieruchomienia kończyn.
Użyj lekkiego bodźca bólowego, aby sprawdzić głębokość sedacji. Następnie wykonaj laparotomię pośrodkową o długości dwóch centymetrów. Dalej, wprowadź dwa sterylne rozwieraki, aby utrzymać jamę brzuszną otwartą, a następnie ostrożnie wysuń jelito cienkie na lewą stronę i umieść je na wilgotnej gazie bawełnianej.
Używając dwóch zwilżonych aplikatorów watnych, opróżnij treść światła całego jelita cienkiego, jednocześnie przesuwając aplikatory od pori do kątnicy. Wprowadź jelito z powrotem do jamy otrzewnej, dbając o to, aby go nie skręcić, co zapobiegnie niedokrwieniu lub niedrożności mechanicznej, a następnie użyj dwóch warstw ciągłych szwów niewchłanialnych z poliamidu 5.0. Zamknij nacięcie brzuszne.
Umieścić zwierzę pod lampą grzewczą i monitorować je do czasu wybudzenia z narkozy. Następnie umieścić mysz z powrotem w klatce i zapewnić jej dostęp do pożywienia i wody. Następnego dnia.
Po pełnym znieczuleniu myszy, ostrożnie odchyl głowę do tyłu i za pomocą tępych pęsety wysuń język. Napełnij strzykawkę o objętości 1 ml co najmniej 100 µl dekstranu znakowanego fluoresceiną. Podłącz ją do cewnika tętniczego i ostrożnie wprowadź cewnik do żołądka jako zgłębnik żołądkowy. Szybko wstrzyknij 100 µl dekstranu FITC i wyjmij cewnik.
Pozwól zwierzęciu odzyskać przytomność i odczekaj 90 minut. Po upływie 90 minut uśmierć mysz i wyjmij cały przewód pokarmowy, od żołądka do odbytu. Umieść jelito na podkładce polistyrenowej, unikając jego rozciągania.
Następnie zmierz pełną długość jelita cienkiego oraz jelita grubego. Użyj kaniul, aby przymocować jelita do podkładki polistyrenowej. Podziel jelito cienkie na 10 równych segmentów, a jelito grube na trzy równe segmenty.
Po przecięciu jelita w wyznaczonych miejscach, przepłucz sekcje raz jednym mililitrem buforu Krebsa-Heringa-Hurelewicza (KHB). Przenieś sekcje do kolejno oznakowanych probówek o pojemności dwóch mililitrów i energicznie wymieszaj w wstrząsarce wirowej. Następnie przenieś nadnadsadczyna do czystych, ponumerowanych probówek o pojemności 1,5 mililitra.
Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius w ciemności do momentu analizy. Następnie pipetować. Przenieść podwójne alikwoty po 100 µL każdego supernatantu do czarnej płytki 96-dołkowej i odczytać płytkę za pomocą czytnika fluorescencji w celu sprawdzenia czasu pasażu jelita grubego po cotygodniowym znieczuleniu zwierzęcia.
Dokładnie sprawdź drożność jelita grubego poprzez wprowadzenie fistuły. Za pomocą zgłębnika przeprowadź badanie przez odbyt do jelita grubego. Wprowadź szklaną kulkę o średnicy 2 mm na głębokość 3 cm do jelita grubego, a następnie wyjmij zgłębnik.
Natychmiast uruchom stoper. Umieść mysz w przezroczystej klatce i monitoruj ją przez czas potrzebny na wydalenie kulek kałowych. Do analizy histochemicznej próbek z części środkowej jelita.
Po wycięciu fragmentów tkanki jelita i zanurzeniu ich w zimnym KHB w naczyniu wypełnionym silikonem, należy przymocować krezkę do naczynia za pomocą igieł entomologicznych. Przeciąć fragmenty wzdłuż brzegu krezki i rozciągnąć tkankę do 120% jej długości i szerokości. Tkankę należy zabezpieczyć igłami, zaczynając od krezki. Mechanicznie.
Oddziel warstwę mięśniową zewnętrzną (muscularis externa) od błony śluzowej (tunica mucosa). Utrwal i zabarw próbki zgodnie z opisową częścią niniejszego protokołu hodowli. Warstwa mięśniowa.
24 godziny po zabiegu manipulacji jelitowej należy wyciąć cały jelito cienkie i umieścić je w zimnym roztworze KHB zawierającym penicylinę G i streptomycynę. Jelito należy pociąć na odcinki o długości trzech centymetrów, a każdy segment przypiąć do szklanej płytki pokrytej silikonem za pomocą cienkich nożyczek. Następnie należy usunąć krezkę i nasunąć jelito na igłę typu nodding needle, używając ostrych pęsety.
Delikatnie naciąć błonę śluzową (ME) za pomocą zwilżonego aplikatora bawełnianego. Oddzielić ją od błony podśluzowej i umieścić w zimnym KHB z dodatkiem Ps. Następnie pociąć paski ME na kawałki o długości od dwóch do czterech milimetrów i inkubować w lodowatym KHB z dodatkiem PS przez 30 minut. Przepłukać preparat kilkakrotnie.
Następnie przenieś około 50 do 60 miligramów materiału do sterylnej płytki 24-dołkowej zawierającej 500 µL DMEM. Inkubuj tkankę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny. Zbierz nadsącz i odwiruj przy 1000 RCF przez pięć minut.
Następnie należy szybko zamrozić tkankę w ciekłym azocie w celu oznaczenia poziomu cytokin lub tlenku azotu. Na koniec, osuszając tkankę mięśniową czystą chusteczką papierową przez 30 sekund, należy ją zważyć. Najważniejszym parametrem służącym do oceny stopnia nasilenia pooperacyjnego porażenia jelit jest badanie pasażu żołądkowo-jelitowego (GIT) in vivo.
Rysunek ten przedstawia typowy rozkład dekstranu FITC wzdłuż przewodu pokarmowego u nieleczonych kontroli oraz u myszy z manipulacjami jelitowymi 24 godziny po operacji. Jak pokazano tutaj, u zwierząt poddanych operacji pozorowanej stwierdzono prawidłowy pasaż w przewodzie pokarmowym z wyliczonym środkiem geometrycznym w kątnicy. Podczas gdy Im doprowadziło do znacznego opóźnienia pasażu w bliższym odcinku jelita czczego, w analizie motoryki okrężnicy z użyciem szklanej kulki, myszy po operacji pozorowanej wydaliły kulkę w czasie od 48 do 200 sekund, a Im wydłużyło czas wydalania do 470–775 sekund w celu pomiaru stanu zapalnego.
W obrębie ME poziomy leukocytów analizowano za pomocą histochemii lub immunohistochemii, jak pokazano tutaj. U myszy kontrolnych zaobserwowano nieliczne neutrofile wielojądrzaste, jednakże zapalenie jelita cienkiego doprowadziło do ich silnej infiltracji. Wiele mediatorów zapalnych uwalnianych z komórek jest trudnych do wykrycia w tkance.
Lizaty kultur organowych umożliwiają wykrycie markerów stanu zapalnego w kulturze. Reprezentatywnym mediatorem w POI jest tlenek azotu, czyli NO, który jest głównym hamującym neuroprzekaźnikiem w przewodzie pokarmowym. Rysunek ten pokazuje, że NO nie zostało wykryte w me.
W hodowlach organów, w nadsączach z grupy kontrolnej oraz u myszy poddanych operacji pozorowanej zaobserwowano podstawowe poziomy nno. Jednakże hodowle pochodzące od myszy z manipulacją jelitową produkują znacznie więcej nno po 24-godzinnej inkubacji. Po opanowaniu ta technika manipulacji jelitowej może zostać wykonana w ciągu 15 minut, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, w jaki sposób wywołać pozabiegowy porażenie jelit u myszy oraz jak analizować stopień jego nasilenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia ustandaryzowany model gryzoni do badania pooperacyjnego porażenia jelit (POI) indukowanego manipulacją jelitową (IM), koncentrując się na stanie zapalnym w warstwie mięśniowej zewnętrznej (ME) oraz jego wpływie na motorykę przewodu pokarmowego. Protokół obejmuje ocenę in vivo pasażu żołądkowo-jelitowego i jelitowego, a także metody separacji i analizy ME w celu odróżnienia odpowiedzi zapalnych w różnych warstwach ściany jelita.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia przewodu pokarmowego
- Immunologia
- Modele zwierzęce chorób
Wstęp
- Zapalenie przewodu pokarmowego jest uwikłane w różne choroby ludzi.
- Warstwa mięśniowa zewnętrzna (ME) jest wysoce immunokompetentną warstwą ściany jelita, w której znajdują się rezydentne immunocyty.
- Pooperacyjny ileus (POI) jest częstym powikłaniem po operacjach brzusznych, charakteryzującym się przedłużonym zaburzeniem motoryki jelit spowodowanym stanem zapalnym, szczególnie w warstwie ME.
- W patogenezę POI zaangażowane są mediatory zapalne, takie jak IL-6, IL-1β oraz tlenek azotu (NO).
Cel badania
- Ustanowienie i zademonstrowanie powtarzalnego modelu POI u gryzoni poprzez manipulację jelitową.
- Ocena pasażu żołądkowo-jelitowego i okrężniczego jako miar motywności pooperacyjnej.
- Umożliwienie analizy immunologicznej ME oraz tunica mucosa, z rozróżnieniem ich odpowiednich odpowiedzi zapalnych.
Zastosowane metody
- Znormalizowana manipulacja jelitem cienkim u znieczulonych myszy przy użyciu wilgotnych aplikatorów bawełnianych.
- Ocena pasażu żołądkowo-jelitowego poprzez doustną administrację FITC-dekstranu i następującą po niej analizę segmentową przewodu pokarmowego.
- Pomiar pasażu jelita grubego poprzez wprowadzenie i pomiar czasu wydalenia szklanej kuleczki.
- Oddzielenie ME od tunica mucosa w celu przeprowadzenia analiz histochemicznych, immunohistochemicznych oraz hodowli organowych.
- Pomiar markerów stanu zapalnego, w tym infiltracji leukocytów i produkcji tlenku azotu, w hodowlach ME.
Główne wyniki
- Manipulacje jelitowe doprowadziły do znacznych opóźnień w pasażu zarówno żołądkowo-jelitowym, jak i okrężniczym w porównaniu z grupą kontrolną.
- Po IM zaobserwowano silną infiltrację granulocytów neutrofilnych w ME.
- Hodowle organowe ME z myszy poddanych manipulacjom wykazały znacznie wyższy poziom tlenku azotu po 24 godzinach w porównaniu z grupą kontrolną i zwierzętami po zabiegu pozorowanym.
- Wyniki te potwierdzają rolę stanu zapalnego ME w rozwoju i utrzymywaniu się POI.
Wnioski
- Opisany model wiarygodnie indukuje POI i pozwala na szczegółową analizę procesów zapalnych w ścianie jelita.
- Izolacja i analiza ME są kluczowe dla zrozumienia specyficznych dla poszczególnych przedziałów odpowiedzi immunologicznych.
- Niniejszy protokół można przenieść na inne modele badawcze analizujące funkcje i stany zapalne przewodu pokarmowego.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustandaryzowane modele gryzoni do manipulacji jelitowych umożliwiają rygorystyczną ocenę motoryki jelit oraz stanu zapalnego w konkretnych przedziałach, co bezpośrednio wpływa na wczesną walidację celów terapeutycznych w przypadku poreoperacyjnego porażenia jelit oraz powiązanych zaburzeń żołądkowo-jelitowych. Ilościowa ocena pasażu żołądkowo-jelitowego i okrężniczego, wraz z profilowaniem immunologicznym warstwy mięśniowej (muscularis externa), zwiększa wiarygodność przewidywań w zakresie hipotez mechanistycznych oraz zapewnia ciągłość translacyjną w badaniach przedklinicznych. Podejście to wspomaga proces podejmowania decyzji portfelowych poprzez wyjaśnienie ryzyka biologicznego oraz punktów końcowych funkcjonalności w procesie odkrywania leków stosowanych w schorzeniach układu pokarmowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków zapalnych i mechanizmów neuromodulacyjnych leżących u podstaw pozoperacyjnego porażenia jelit.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez ilościowe określanie nacieku komórek odpornościowych oraz uwalniania mediatorów w warstwie mięśniowej zewnętrznej (muscularis externa).
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez bezpośredni pomiar upośledzenia motoryki oraz efektów zapalnych.
- Zapewnia powtarzalną platformę do oceny potencjalnych interwencji w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane odczyty in vivo dla pasażu żołądkowo-jelitowego i okrężniczego, wspierając dalsze procesy przesiewowe.
- Umożliwia standaryzację ilościowych testów motoryki oraz punktów końcowych immunologicznych w celu zapewnienia powtarzalności.
- Przygotowuje systemy biologiczne do skalowalnej oceny związków ukierunkowanych na motorykę i zapalenie jelit.
- Wspiera gotowość testów do porównawczej analizy interwencji farmakologicznych i genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele przedkliniczne do mechanizmów związanych z chorobą, obserwowanych w przypadku pooperacyjnego niedrożności jelit oraz stanu zapalnego jelit.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając analizę biomarkerów specyficznych dla poszczególnych przedziałów tkankowych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe dane dotyczące motoryki i stanu zapalnego.
- Wzmacnia translacyjne strategie biomarkerowe poprzez rozróżnienie odpowiedzi błony śluzowej i warstwy mięśniowej zewnętrznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje się z continuum od odkrycia do badań przedklinicznych, dostarczając solidnych funkcjonalnych i immunologicznych punktów końcowych in vivo dla badań nad przewodem pokarmowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków zapalnych i neuromodulacyjnych w zaburzeniach motoryki jelit.
- Przesiewy: Oferuje odtwarzalne, ilościowe testy pasażu i stanu zapalnego do oceny kandydatów.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wyniki, takie jak geometryczny środek rozkładu FITC-dekstranu oraz ilościowe oznaczenie tlenku azotu.
- Badania translacyjne: Umożliwia powiązanie wyników przedklinicznych z cechami klinicznymi poprzetokowego porażenia jelit.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Zapewnia przenaszalną platformę dla różnorodnych badań nad funkcją i stanami zapalnymi przewodu pokarmowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad motoryką jelit.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności analiz in vivo oraz ex vivo.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka oraz rozwój programów terapeutycznych w obszarze gastroenterologii.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgicznych modeli gryzoni oraz fizjologii układu pokarmowego.
- Wymaga dostępu do czytników fluorescencji oraz infrastruktury histochemicznej i immunohistochemicznej.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji protokołów badań motoryki oraz testów immunologicznych.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych szczepów gryzoni i modeli chorób przewodu pokarmowego po optymalizacji protokołu.
- Wyniki zależą od precyzyjnej separacji warstw ściany jelita w celu przeprowadzenia analizy specyficznej dla poszczególnych warstw.
