Name: Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i bioluminescencyjne obrazowanie in vivo ksenoprzeszczepów nowotworowych w mysim modelu glejaka wielopostaciowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj stereotaktyczną implantację komórek glejaka wielopostaciowego do mózgu myszy nude oraz bioluminescencyjne obrazowanie in vivo. Ta metoda umożliwia precyzyjne monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni dr. Andrew Hollanderowi, Sarze Davis, Lee Shumanowi, Timowi Jenkinsowi oraz dr. Xiangsheng Xu za ich ekspercką pomoc. Dziękujemy za wsparcie dr Ann Kennedy. B.C.B. otrzymał wsparcie w ramach grantu szkoleniowego z zakresu biologii radiacyjnej C5T32CA009677. J.F.D. otrzymał wsparcie w ramach Burroughs Wellcome Career Award for Medical Scientists (1006792). J.L.B. otrzymał wsparcie w ramach grantu SUPERs (5 R25 CA140116-03). Chcielibyśmy podziękować dr. Steve'owi Hahnowi, którego zachęta i wsparcie pomogły w realizacji naszych badań. Dziękujemy również University of Pennsylvania Nano-Bio Interface Center (NBIC) oraz dr. Dennisowi Discherowi za zachętę i pomocne uwagi. Dziękujemy Small Animal Imaging Facility (SAIF) na University of Pennsylvania za możliwość korzystania z zasobów MRI oraz Optical/Bioluminescence Core Facilities. Techniki te zostały opracowane w ramach projektów wspieranych przez National Institutes of Health (RC1 CA145075 oraz K08 NS076548-01).

A. Przygotowanie komórek nowotworowych przed operacją
<ol>
 <li>Przeprowadź transdukcję komórek glejaka wielopostaciowego U251 przy użyciu lentiwirusego wektora ekspresyjnego (pGreenFire, System Biosciences) w celu stabilnej ekspresji genu lucyferazy świetlikowej.</li>
 <li>Komórki te hodowano w 10 ml kompletnej pożywki Dulbecco's Modification of Eagle's medium (DMEM), składającej się z DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1% nieessentialnych aminokwasów, w kolbie do hodowli tkanek T75 w inkubatorze przy 5% C02 i 37 °C.</li>
 <li>Przeprowadź standardową procedurę hodowli komórkowej, zaczynając od przemycia komórek solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie przeprowadź trypsynizację.</li>
 <li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą kompletnej pożywki DMEM, przenieś zawiesinę do stożkowej probówki 50 ml i określ stężenie komórek za pomocą licznika Coulter Counter.</li>
 <li>Odwirowuj zebrane komórki w kompletnej pożywce DMEM przez 3 min przy prędkości około 3 000 obrotów na minutę.</li>
 <li>Po wirowaniu odessaj pożywkę, pozostawiając jedynie pellet komórek na dnie stożkowej probówki 50 ml.</li>
 <li>Działając szybko, aby zapobiec wyschnięciu komórek, resuspenduj je w objętości świeżej kompletnej pożywki DMEM, aby uzyskać pożądane stężenie 50 000 cells/μl, a następnie przenieś do sterylnej fiolki 2 ml umieszczonej w lodzie.</li>
 <li>Komórki w lodzie należy krótko mieszać na wortexie przy niskich obrotach co około 20 min, aby zapobiec ich adhezji. Komórki można bezpiecznie wykorzystać do implantacji wewnątrzczaszkowych do dwóch godzin od umieszczenia w lodzie.</li>
</ol>
B. Ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepu
<ol>
 <li>Zważ mysz naga atymiczna NCr (nu/nu), aby ustalić wyjściową masę ciała przed implantacją. Zazwyczaj wybieramy myszy w wieku 6–10 tygodni o masie od 17 do 24 g.</li>
 <li>Na 1 h przed implantacją podaj myszy lek przeciwzapalny niesteroidowy meloksykam w dawce 5 mg/kg drogą podskórną w celu łagodzenia bólu i stanu zapalnego po operacji.</li>
 <li>Zanurz zwierzę w narkozie poprzez podanie dootrzewnowe mieszaniny ketaminy i ksylazyny w dawkach odpowiednio 140 mg/kg i 10 mg/kg.</li>
 <li>Potwierdź wystarczający poziom znieczulenia myszy, oceniając jej odruchową reakcję na uciśnięcie palca u stopy. Jeśli zwierzę reaguje na uciśnięcie, odrocz procedurę do czasu zadziałania anestetyku lub rozważ podanie dodatkowej dawki znieczulenia (&lt;25% dawki pierwotnej).</li>
 <li>Przygotuj znieczuloną mysz do umieszczenia w stereotaktycznej platformie Stoelting Digital Just for Mouse (Stoelting Inc.), mocując siekacze myszy w rynience uchwytu pyska i dokręcając zacisk na pysku, upewniając się jednocześnie, że głowa myszy znajduje się w płaszczyźnie poziomej.</li>
 <li>Przenieś unieruchomioną mysz na platformę stereotaktyczną Stoelting, dostosowując położenie zwierzęcia tak, aby końcówki prętów usznych znajdowały się w tylnej części kanału słuchowego. Po ustawieniu zwierzęcia w osi głowowej-ogonowej zamocuj rynienkę do ramy stereotaktycznej. Mysz powinna spoczywać na sztywnej plastikowej płytce grzewczej (Harvard Apparatus) przymocowanej taśmą do platformy Stoelting, aby zapewnić regulację temperatury z pętlą sprzężenia zwrotnego podczas operacji.</li>
 <li>W razie potrzeby dostosuj wysokość prętów usznych, a następnie wprowadź je do tylnej części kanału słuchowego, mocując je tak, aby głowa myszy była w płaszczyźnie poziomej i nie przemieszczała się przy dotknięciu palcem. Po umieszczeniu prętów usznych uważnie monitoruj objawy niewydolności oddechowej. W przypadku wystąpienia duszności poluzuj i ponownie ustaw pręty.</li>
 <li>Wprowadź nasmarowaną końcówkę rektalnej sondy temperatury podłączonej do kontrolera temperatury TCAT-2DF (Harvard Apparatus), aby monitorować temperaturę zwierzęcia i sterować płytką grzewczą umieszczoną pod myszą, utrzymując temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 36 °C podczas procedury.</li>
 <li>Nałóż maść oftalmiczną na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
 <li>Nałóż roztwór betadyny na górną część głowy myszy w celu zdezynfekowania miejsca nacięcia, uważając, aby nie dopuścić do kontaktu z oczami.</li>
 <li>Wykonaj uciśnięcie palca u stopy, aby potwierdzić utratę przytomności myszy; w razie potrzeby podaj niewielką ilość dodatkowej ketaminy/ksylazyny (&lt;25% dawki początkowej).</li>
 <li>Oczyść wiertło z wiertłem kulistym 0,45 mm (Stoelting) zamontowane w wiertarce (Foredom Microdrill) za pomocą gazika z alkoholem, a następnie wysterylizuj wiertło w sterylizatorze koralikowym (Germinator 500, CellPoint Scientific) przez 15 s, zanurzając w koralikach tylko końcówkę wiertła.</li>
 <li>Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie o długości 0,75 cm wzdłuż środkowej części skóry czaszki, rozciągając je od poziomu oczu w kierunku ogonowym. Potwierdź widoczność bregmy.</li>
 <li>Zamocuj uchwyt wiertarki do platformy Stoelting i umieść w nim wiertarkę (Foredom Microdrill) z wiertłem kulistym 0,45 mm (Stoelting), zabezpieczając ją w pozycji roboczej.</li>
 <li>Ustaw wiertło dokładnie nad bregmą, a następnie wyzeruj współrzędne x, y, z na cyfrowym wyświetlaczu stereotaktycznym. Przesuń końcówkę wiertła w pozycję 2 mm tylnie i 1,5 mm bocznie od bregmy w prawej półkuli mózgu i wywierć otwór w czaszce zwierzęcia wiertarką Foredom, przebijając wyłącznie kość. Do delikatnego odsunięcia brzegów nacięcia w celu ułatwienia wizualizacji czaszki można użyć sterylnego tamponu bawełnianego.</li>
 <li>Zdejmij wiertarkę i uchwyt z platformy stereotaktycznej.</li>
 <li>Zamocuj pompę strzykawkową Nanomite (Harvard Apparatus) do platformy stereotaktycznej.</li>
 <li>Wyjmij komórki z lodu i delikatnie wymieszaj zawartość probówki z komórkami nowotworowymi za pomocą krótkich impulsów wirówki lub delikatnie stuknij w probówkę, aby resuspendować komórki. Pobierz 7 μl zawiesiny komórkowej przez igłę 30G o długości 1" z płaskim ścięciem, zamocowaną do strzykawki 10 μl (Hamilton Syringe). Unikaj dużych pęcherzyków powietrza w strzykawce. Upewnij się, że w początkowych 6 μl cieczy, które będą całkowitą objętością wstrzykniętą myszy, nie ma pęcherzyków powietrza. Małe pęcherzyki powietrza w pozostałym 1 μl nie stanowią problemu. Jeśli to możliwe, unikaj wielokrotnego pobierania zawiesiny komórkowej, aby zminimalizować uszkodzenia komórek.</li>
 <li>Umieść napełnioną strzykawkę w iniektorze. Za pomocą gazika z alkoholem usuń resztki zawiesiny komórkowej z końcówki igły, aby zapobiec zanieczyszczeniu miejsca nacięcia komórkami nowotworowymi, co mogłoby doprowadzić do wzrostu guza w przestrzeni poza czaszką.</li>
 <li>Ustaw pompę iniektora na podanie 6,0 μl z prędkością 0,5 μl/min. Pozostawienie 1 μl zawiesiny komórkowej w strzykawce po implantacji gwarantuje, że pęcherzyki powietrza, które często gromadzą się w strzykawce, nie zostaną wstrzyknięte do zwierzęcia. Wstrzyknięcie pęcherzyków powietrza mogłoby spowodować śmiertelną zatorowość powietrzną.</li>
 <li>Wprowadź igłę strzykawki do otworu wiertniczego, utrzymując igłę prostopadle (90 stopni) do czaszki. Po przebiciu czaszki wyzeruj współrzędne na cyfrowym wyświetlaczu stereotaktycznym, a następnie powoli przesuwaj końcówkę igły przez okres 4 min, aż osiągnie głębokość 2,5 mm. Igła przechodzi przez korę i części tylnego hipokampa. Współrzędne x, y, z dla implantacji stereotaktycznej wybrano tak, aby wygenerować guz położony bocznie w obrębie półkuli mózgu, unikając jednocześnie uszkodzenia krytycznych struktur mózgu, takich jak wzgórze, oraz bliskości komór, co zmniejsza prawdopodobieństwo zasiewu komórek nowotworowych do płynu mózgowo-rdzeniowego, co mogłoby prowadzić do niepożądanych guzów kręgosłupa. Wybrano lokalizację tylną względem bregmy, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo owrzodzenia dużego, miejscowo zaawansowanego guza w obrębie oczodołu. Pozostaw igłę na tej głębokości przez 2 min, a następnie rozpocznij implantację komórek.</li>
 <li>Podczas implantacji wielokrotnie osuszaj czaszkę za pomocą mikrosurgicalnego gąbkowego aplikatora, aby usunąć wszelkie ciecze zawierające komórki nowotworowe, które mogły wypłynąć z otworu wiertniczego podczas zabiegu. Unikaj przesuwania igły gąbką. Usunięcie tej cieczy powinno zmniejszyć prawdopodobieństwo wzrostu guza w przestrzeni poza czaszką.</li>
 <li>Po zakończeniu iniekcji pozostaw igłę w mózgu przez około 2 min, a następnie powoli wycofaj ją w czasie od 3 do 4 min.</li>
 <li>Poluzuj pręty uszne i uchwyt pyska, a następnie zdejmij mysz z aparatu stereotaktycznego.</li>
 <li>Zamknij otwór wiertniczy w czaszce za pomocą sterylnego wosku kostnego, wcierając go w otwór drewnianym końcem sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką. Nakładaj wosk kostny do czasu całkowitego uszczelnienia otworu, tak aby powierzchnia wosku była zrównana z sąsiednią częścią czaszki.</li>
 <li>Zbliż brzegi nacięcia za pomocą sterylnych tamponów bawełnianych i nałóż weterynaryjny klej tkankowy, aby zamknąć ranę, dbając o to, by klej nie dostał się do oczu zwierzęcia.</li>
 <li>Na koniec umieść mysz na macie grzewczej ustawionej na 37 °C, aż zwierzę odzyska przytomność. Przenieś zwierzę z powrotem do oryginalnej klatki, gdy mysz będzie czujna i będzie reagować na bodźce.</li>
</ol>
C. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) w celu monitorowania wzrostu guza i odpowiedzi na terapię
Poniżej znajdują się zwięzłe instrukcje dotyczące obrazowania bioluminescencyjnego.
<ol>
 <li>Myszy z uprzednio zaimplantowanymi guzami znieczulić w komorze z użyciem 2% izofluranu i tlenu.</li>
 <li>Podczas znieczulenia myszy wstrzyknąć im podskórnie lub doszpikowo 60 μl soli potasowej D-lucyferyny rozcieńczonej w PBS do stężenia 50 mg/ml.</li>
 <li>Włączyć przepływ środka znieczulającego do stożków nosowych w skanerze do obrazowania bioluminescencyjnego i szybko przenieść myszy do skanera, umieszczając ich pyszczki w stożkach nosowych.</li>
 <li>Umieścić czarne przegrody między myszami, aby ograniczyć przenikanie sygnału bioluminescencyjnego z guza o wysokiej intensywności sygnału do sąsiedniego guza o znacznie niższym sygnale.</li>
 <li>Za pomocą oprogramowania Living Image wykonać częste naświetlania seryjne przez łączny czas do 30 min od momentu wstrzyknięcia D-lucyferyny. Zaleca się ustawienie czasu naświetlania na „Auto”, aby zminimalizować ryzyko niedoświetlenia lub prześwietlenia obrazu. Żadne pojedyncze naświetlanie nie powinno trwać &gt;5 min.</li>
 <li>Powtarzać obrazowanie bioluminescencyjne w odpowiednich odstępach czasu. Seryjne obrazowanie cotygodniowe jest odpowiednim rozwiązaniem dla wielu eksperymentów podłużnych badających odpowiedź na leczenie.</li>
 <li>Po uzyskaniu obrazów użyć programu Living Image do analizy guzów poprzez wyznaczenie obszaru zainteresowania (ROI) wokół każdego guza na każdym obrazie pozyskanym podczas sesji obrazowania bioluminescencyjnego. Na każdym obrazie wyznaczyć drugi, mniejszy obszar zainteresowania w dolnej części boku każdej myszy jako obszar tła, aby skorygować sygnał bioluminescencyjny guza w zależności od stopnia intensywności sygnału tła. Preferujemy ustawienie „Radiance” zamiast „Counts” jako wartości wyjściowe dla sygnału bioluminescencyjnego.</li>
 <li>Wyeksportować wyniki ROI do programu Excel i wyznaczyć maksymalny sygnał bioluminescencyjny skorygowany o tło dla każdej myszy.</li>
 <li>Powtarzać obrazowanie bioluminescencyjne zgodnie z protokołem w celu seryjnego monitorowania wzrostu guza. W naszych eksperymentach wykonujemy BLI co tydzień. Preferujemy wyznaczanie maksymalnego sygnału BLI dla danej sesji obrazowania poprzez wykonywanie częstych naświetlań w czasie od 5 do 30 min po wstrzyknięciu D-lucyferyny.</li>
</ol>
D. Reprezentatywne wyniki
Ta technika implantacji stereotaktycznej wiąże się ze skutecznością przyjęcia guza na poziomie 90-100% oraz niską śmiertelnością okołoperacyjną, która zazwyczaj wynosi mniej niż 5%. Ryzyko niezamierzonych skutków ubocznych przy zastosowaniu tej techniki jest również niskie, w tym takie powikłania jak rozsiew komórek nowotworowych do rdzenia kręgowego z guzów wszczepionych do komór mózgu lub pozaczaszkowy wzrost guza wynikający z rozsiewu komórek nowotworowych w miejscu nacięcia bądź z niewłaściwego zamknięcia otworu trepanacyjnego, co umożliwia ekspansję guza wewnątrzczaszkowego przez otwór w czaszce.
Ex vivo analiza ksenoprzeszczepów nowotworowych wykazała spodziewane obszary niedotlenienia, zwiększoną ekspresję VEGF oraz martwicę. Mikroskopia fluorescencyjna w kierunku zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) stabilnie ekspresowanego przez naszą linię komórkową GBM ujawniła naciekający charakter tych ksenoprzeszczepów.
Rysunek 1 przedstawia wyniki typowej, udanej implantacji stereotaktycznej komórek GBM do mózgu myszy. Jest to obraz MRI mózgu myszy w obrazowaniu T2, wykonany przy użyciu magnesu 9,4 Tesla 21 dni po implantacji metodą opisaną w niniejszym protokole. Rysunek 1 ukazuje pojedyncze ognisko guza w prawej półkuli (obrysowane na różowo) o objętości 19 mm3, zlokalizowane dokładnie w koordynatach miejsca implantacji.
Rysunek 2 przedstawia wyniki obrazowania bioluminescencyjnego z wykorzystaniem opisanych tutaj technik dla grupy 10 myszy z guzami wszczepionymi stereotaktycznie, które zostały równomiernie podzielone na podstawie maksymalnej intensywności sygnału bioluminescencyjnego w celu otrzymania naświetlania czaszkowego (4 Gy x 4 frakcje dziennie) lub braku leczenia. W tym eksperymencie obrazowanie bioluminescencyjne wykazuje, że radioterapia hamuje proliferację wszczepionych guzów, co skutkuje brakiem wzrostu wykrytego sygnału bioluminescencyjnego, podczas gdy sygnał znacznie wzrasta w kontrolnych guzach poddanych pozornej irradiacji z powodu niekontrolowanej proliferacji komórek nowotworowych.
Rycina 1 (Wideo). Koronalne przekroje MRI mózgu myszy zawierającego guz glejaka wielopostaciowego U251 z wyznaczeniem konturu objętości guza (na różowo). Skanowanie przeprowadzono przy użyciu protokołu T2-zależnego echa spinowego na skanerze 9.4 Tesla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
<img alt="Wykres bioluminescencji; grupa kontrolna vs. radioterapia w czasie; analiza pomiaru wzrostu." src="/files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. 10 myszy z stereotaktycznie wszczepionymi guzami wielopostaciowego glejaka otrzymało albo zewnętrzną radioterapię wiązką do dawki 16 Gy w 4 frakcjach, albo nie otrzymało żadnego leczenia. Obrazowanie bioluminescencyjne myszy wykonano przed rozpoczęciem leczenia oraz w odstępach tygodniowych po jego rozpoczęciu. Wykres przedstawia względną bioluminescencję obliczoną jako medianową krotność zmiany, gdzie krotność zmiany definiuje się jako stosunek aktualnej maksymalnej wartości BLI do maksymalnej wartości BLI sprzed leczenia.

<ol><li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li>
<li>Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+review+of+in+vivo+GBM+rodent+models%3A+emphasis+on+the+CNS-1+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22ASN+Neuro%22%5BJournal%5D)">Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model.</a> ASN Neuro. 3, e00063(2011).</li>
<li>Shelton, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pre-clinical+in+vivo+mouse+model+for+malignant+brain+tumor+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion.</a> J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).</li>
<li>Brehar, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+xenograft+glioblastoma+implants+in+nude+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Life%22%5BJournal%5D)">The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain.</a> J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).</li>
<li>Radaelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistopathological+and+neuroimaging+characterization+of+murine+orthotopic+xenograft+models+of+glioblastoma+multiforme+recapitulating+the+most+salient+features+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease.</a> Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).</li>
<li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+efficacy+of+drug-loaded+nanocarriers+against+brain+tumors+by+targeted+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Baumann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+method+for+reproducible+and+accurate+image-guided+stereotactic+cranial+irradiation+of+brain+tumors+using+the+Small+Animal+Radiation+Research+Platform+%28SARRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP).</a> Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Park, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPET%2FCT+imaging+of+an+orthotopic+model+of+human+glioblastoma+multiforme+and+evaluation+of+pulsed+low-dose+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Oncol.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation.</a> Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).</li>
<li>Szentirmai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+luciferase+expressing+intracranial+U87+xenografts%3A+correlation+with+magnetic+resonance+imaging+determined+tumor+volume+and+longitudinal+use+in+assessing+tumor+growth+and+antiangiogenic+treatment+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect.</a> Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).</li>
<li>Dinca, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+monitoring+of+intracranial+glioblastoma+xenograft%3A+response+to+primary+and+salvage+temozolomide+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda stereotaktycznej implantacji komórek nowotworowych u myszy opisana w niniejszej pracy pozwala na powtarzalne generowanie guzów, które w sposób wiarygodny odzwierciedlają infiltracyjny i szybki wzrost charakterystyczny dla klinicznego glejaka wielopostaciowego 2, 6-8. Technika ta jest szczególnie odpowiednia do eksperymentów wymagających równomiernego przydzielenia myszy do różnych grup terapeutycznych, w których pożądane jest uzyskanie powtarzalnych guzów o zbliżonej wielkości i właściwościach biologicz...

<table><tbody><tr><td>Cyfrowy aparat stereotaktyczny do myszy</td><td>Stoelting</td><td>51730D</td><td>Platforma stereotaktyczna do implantacji u myszy</td></tr><tr><td>Ketamina/ksylazyna</td><td></td><td></td><td>Anestetyk do iniekcji</td></tr><tr><td>Maść Puralube Vet (oftalmologiczna)</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>Do zapobiegania wysychaniu oczu myszy</td></tr><tr><td>uchwyt wiertła do platformy stereotaktycznej</td><td>Stoelting</td><td>51681</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczny wiertarka mikromotorowa</td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td>Do wiercenia w czaszce</td></tr><tr><td>Wiertło węglikowe 0,45 mm</td><td>Stoelting</td><td>514551</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne patyczki bawełniane</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator suchy z kuleczkami szklanymi (Germinator 500)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER-5287</td><td>Do sterylizacji metalowych narzędzi chirurgicznych</td></tr><tr><td>Sonda rektalna do myszy</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET-3-ISO</td><td>Kompatybilna z kontrolerem temperatury</td></tr><tr><td>Kontroler temperatury (TCAT-2DF)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>727561</td><td>Kontroler temperatury do utrzymania temperatury ciała zwierzęcia podczas operacji</td></tr><tr><td>Mała płyta grzewcza</td><td>Harvard Apparatus</td><td>727617</td><td>Do stosowania z kontrolerem temperatury w celu ogrzewania myszy podczas operacji. Płyta grzewcza jest umieszczana pod myszą na platformie stereotaktycznej.</td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe</td><td>BD Bard-Parker</td><td>2015-11</td><td>skalpel nr 10</td></tr><tr><td>Strzykawka 10 μl</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td>Do iniekcji komórek nowotworowych</td></tr><tr><td>Igły 30 G, długość 1&quot;, z płaskim czubkiem</td><td>Hamilton</td><td>Różne</td><td>Muszą być kompatybilne ze strzykawką 10 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>Programowalna pompa strzykawkowa Nanomite</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704507</td><td>Cyfrowy zmotoryzowany wstrzykiwacz strzykawkowy do urządzenia stereotaktycznego</td></tr><tr><td>Sterylne celulozowe gąbki chirurgiczne</td><td>Ultracell</td><td>40410</td><td>Do osuszania pola operacyjnego</td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>Ethicon</td><td>W31</td><td>Do uszczelnienia otworu trepanacyjnego</td></tr><tr><td>Syntetyczny wchłanialny klej tkankowy Tissumend II</td><td>Veterinary Products Laboratories</td><td>3002931</td><td>Do uszczelnienia nacięcia</td></tr><tr><td>Pompa ciepłej wody z matą grzewczą</td><td>Gaymar</td><td>TP-650</td><td>Ogrzewa myszy w okresie pooperacyjnym</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td>Obrazownik bioluminescencyjny</td></tr><tr><td>Sól potasowa D-lucyferyny</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td>Lucyferyna do obrazowania bioluminescencyjnego</td></tr></tbody></table>

stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) to wysokozłośliwy pierwotny nowotwór mózgu, w którym mediana przeżycia u ludzi wynosi zaledwie 14,6 miesięcy, mimo standardowego leczenia trójskładnikowego, obejmującego resekcję chirurgiczną, pooperacyjną radioterapię oraz chemioterapię temozolomidem 1. Niezbędne jest opracowanie nowych podejść terapeutycznych w celu poprawy przeżywalności i jakości życia pacjentów. Rozwój bardziej skutecznych strategii leczenia wspierałyby modele zwierzęce GBM, które odzwierciedlają przebieg choroby u ludzi, a jednocześnie umożliwiają seryjne obrazowanie w celu monitorowania wzrostu guza i odpowiedzi na leczenie. W niniejszym artykule opisujemy technikę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej komórek nowotworowych GBM z możliwością obrazowania biologicznego do mózgów myszy nago, co prowadzi do powstania ksenoprzeszczepów guzów odzwierciedlających kluczowe cechy kliniczne GBM 2. Metoda ta pozwala na uzyskanie powtarzalnych guzów zlokalizowanych w precyzyjnych miejscach anatomicznych, umożliwiając jednocześnie obrazowanie bioluminescencyjne in vivo do seryjnego monitorowania wzrostu wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów oraz ich odpowiedzi na leczenie 3-5. Metoda ta jest również dobrze tolerowana przez zwierzęta, przy niskiej śmiertelności i zachorowalności okołooperacyjnej.

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) to złośliwy pierwotny nowotwór mózgu o wysokim stopniu złośliwości; mimo zastosowania standardowej terapii trójmodalnej, mediana przeżycia u ludzi wynosi zaledwie 14,6 miesiąca...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie precyzyjnej implantacji stereotaktycznej komórek raka glejaka wielopostaciowego, możliwych do obrazowania biologicznego, do mózgów myszy nago w celu wytworzenia ksenoprzeszczepów nowotworowych, które odzwierciedlają kluczowe cechy kliniczne glejaka wielopostaciowego. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego do stabilnej ekspresji lucyferazy w celu seryjnego nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego. Drugim krokiem jest znieczulenie myszy i umieszczenie jej w stabilizatorze stereotaktycznym.Następnie wykonuje się nacięcie skóry i wierci otwór trepanacyjny w precyzyjnych współrzędnych wyznaczonych względem B bgma. Ostatnim krokiem jest powolna implantacja komórek nowotworowych do mózgu z wykorzystaniem technik stereotaktycznych, a następnie usunięcie igły i zamknięcie nacięcia. W dalszej kolejności wykorzystuje się obrazowanie bioluminescencyjne oraz obrazowanie rezonansem magnetycznym do przeprowadzenia seryjnego obrazowania nieinwazyjnego w celu monitorowania wzrostu guza oraz odpowiedzi na badane metody leczenia.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, ta

stereotactic-intracranial-implantation-vivo-bioluminescent-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Steryotatyczna implantacja wewnątrkczaszkowa i in vivo obrazowanie bioluminescencyjne ksenotransplantat nowotworów w modelu mysim wielookształtnego mięsaka różnokształtnego

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Źródło: Clark, A.J., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia progresji glejaka w immunokompetentnym modelu myszy, przy użyciu komórek nowotworowych eksprymujących lucyferazy i lucyferyny do nieinwazyjnego ilościowego określenia wzrostu guza.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego mysiego modelu glejaka

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj stereotaktyczną implantację komórek glejaka wielopostaciowego do mózgu myszy nude oraz bioluminescencyjne obrazowanie in vivo. Ta metoda umożliwia precyzyjne monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na leczenie.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i bioluminescencyjne obrazowanie in vivo ksenoprzeszczepów nowotworowych w mysim modelu glejaka wielopostaciowego (Wideo) | JoVE Journal

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Przeglądaj więcej filmów