Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza ekspresji mikroRNA w mikrogleju. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mózgu i rdzenia kręgowego, a następnie homogenizację tkanki ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W drugim kroku komórki jednojądrowe z OUN są izolowane za pomocą gradientu Percoll, a następnie populacja mikrogleju jest identyfikowana metodą FACS.

Następnie izoluje się RNA z mikrogleju i analizuje jakość próbki. W końcowym etapie przeprowadza się reakcję PCR w czasie rzeczywistym dla konkretnego, badanego mikroRNA. Ostatecznie można zastosować metodę delta delta CT, aby wykazać względny poziom ekspresji konkretnego mikroRNA w mikrogleju.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z powodu niewystarczającej liczby wyizolowanych komórek mononuklearnych z OUN lub z powodu zanieczyszczenia próbki mieliną i debris komórkowym. Oba te przypadki prowadzą do niskiej jakości preparatu, skutkując odpowiednio niskim stężeniem RNA lub zanieczyszczeniem białkiem. Procedurę zaprezentują me i vir.

Po perfuzji wszystkich myszy należy wypreparować mózgi i rdzenie kręgowe. Następnie do homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml należy umieścić pojedynczo jeden mózg i jeden rdzeń kręgowy, dodając do tkanek za każdym razem 5 ml PBS. Po wykonaniu od 10 do 20 delikatnych uderzeń, homogenizat należy przefiltrować przez sita komórkowe o oczkach 70 µm do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml, a następnie wirować probówki przez 5 do 7 minut przy 834 ×g i 4 °C.

Po odlaniu supernatantu zawiesić homogenat mózgu i rdzenia kręgowego od dwóch do trzech myszy w 5-7 ml 70% Percoll. Następnie nałożyć 7 ml 40% Percoll i wirować roztwór Percoll z komórkami przez 30 minut przy 850 ×g w temperaturze 20 °C bez hamowania. Odrzucić uszkodzone komórki, mielinę i debris znajdujące się nad warstwą 70% Percoll.

Następnie należy zebrać komórki mononuklearne z granicy rozdzielenia roztworów Percoll 70% i 40% i rozcieńczyć zebrane komórki w PBS, w stosunku co najmniej jeden do jednego. Po odwirowaniu komórek należy resuspendować osad w 0,5 mL PBS i przenieść je do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,7 mL. Należy rozpocząć od przeniesienia 50 µL komórek posortowanych gradientem gęstości do nowej probówki typu Eppendorf 1,7 mL i dodać do probówki 350 µL buforu FACS.

Następnie, po dodaniu od 5 do 10 µL przeciwciał anty-FCR do probówki, inkubować komórki przez 10 do 15 minut w lodzie. Rozdzielić próbkę komórek do dwóch probówek typu Eppendorf; do jednej z nich dodać 1 µL przeciwciał anty-CD 11 B oraz 2 µL przeciwciał anty-CD 45.

Inkubowanie komórek przez kolejne 10 do 15 minut na lodzie. Drugą probówkę należy oznaczyć jako kontrolę negatywną i umieścić na lodzie. Po inkubacji z przeciwciałami barwiącymi, do obu probówek należy dodać 1 mL buforu FACS i odwirować komórki w mikrowirowce przez 5 minut przy 1200 ×g.

G. Następnie utrwal osady w 400 µL 1% paraformaldehydu w PBS i wymieszaj probówki na wirówce typu vortex, aby zapobiec zbrylaniu. Na koniec przeanalizuj komórki metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując próbkę kontrolną negatywną oraz kuleczki BD com beads. Rozpocznij od podskórnego uodpornienia grupy od pięciu do 10 myszy C 57 black six w wieku od ośmiu do 12 tygodni za pomocą 150 mg peptydu MOG 35-55 w 4 mg/mL kompletnego adiuwantu Freunda w celu indukcji EAE. Następnie podaj toksynę pertussis drogą dosytrawniczą w dniu zerowym oraz w drugim dniu po immunizacji.

Po wyizolowaniu i zabarwieniu komórek, zgodnie z wcześniejszą prezentacją, bezpośrednio przed sortowaniem zawiesić osady w 400 µL PBS zamiast utrwalacza. Następnie napełnić dwie probówki typu eppendorf o pojemności 1,7 ml ilością 300 µL PBS uzupełnionego o 10% FBS w celu zebrania próbek. Na koniec posortować populacje mikrogleju i makrofagów do uzyskania wysokiej czystości, stosując strategię bramkowania przedstawioną na tym reprezentatywnym wykresie gęstości.

Po sortowaniu ponownie przeanalizuj populacje mikrogleju i makrofagów, aby określić czystość wyizolowanych próbek komórek. Po odwirowaniu posortowanych populacji komórek z prędkością 1200 ×g przez pięć do siedmiu minut w mikrowirówce, ostrożnie usuń nadsącz i zamroź osady komórkowe na suchym lodzie. Następnie przenieś zamrożone osady komórkowe na zwykły lód.

W celu rozmrożenia należy dodać 300 µL buforu do lizy z zestawu Nirvana, a następnie delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując roztwór od pięciu do siedmiu razy. Następnie dodaje się 30 µL dodatku do homogenatu, miesza zawiesinę komórkową na wortexie przez 30 sekund i pozostawia probówki na lodzie przez 10 minut. Teraz należy dodać 300 µL mieszaniny kwasowego fenolu i chloroformu, a następnie ponownie mieszać probówkę na wortexie przez kolejne 30 sekund.

Następnie, po odwirowaniu komórek przez pięć minut przy 9 500 ×g, ostrożnie przenieś górne 300 µL supernatantu zawierającego fazę wodną do nowej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,7 mL. Wymieszaj roztwór z 375 µL 100% etanolu. Przenieś całą zawartość probówki do wkładu filtrującego z zestawu Nirvana i wiruj wkład przez jedną minutę przy 9 500 ×g. Następnie odrzuć przefiltrat.

Do opłukanego kartridża dodaj 700 µL roztworu piorącego 1 (wash solution one) z zestawu Nirvana i wiruj przez kolejną minutę przy 9 500 ×g. Powtórz czynność jeszcze dwukrotnie, używając 500 µL roztworu piorącego 2 (wash solution two) z zestawu Nirvana. Eluuj RNA z kartridża, używając 60 µL podgrzanej wody wolnej od nukleaz.

Na koniec należy użyć spektrofotometru NanoDrop, aby ocenić czystość i ilość RNA po przeprowadzeniu qRT-PCR w celu wykrycia mikroRNA w próbkach mikrogleju i makrofagów. Krzywe PCR dla produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie dla miR-124 i snoRNA 55 można wygenerować, jak pokazano tutaj na pierwszym wykresie. Przedstawiono typowe krzywe ilości specyficznych produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie dla kontrolnych próbek snoRNA 55 wyizolowanych z mikrogleju lub makrofagów pochodzących z szpiku kostnego w zależności od liczby cykli PCR.

Zwróć uwagę, że wartości CT dla analizy ekspresji snow RNA 55 w różnych populacjach komórek są wyznaczane w punkcie przecięcia linii bazowej z dolną częścią zakresu liniowego krzywych Q-R-T-P-C-R, co zaznaczono na wykresie zielonymi i niebieskimi liniami pionowymi. Na tym drugim wykresie przedstawiono ilość fluorescencyjnie znakowanych specyficznych produktów PCR dla eksperymentalnych próbek mere 1 24 RNA pochodzących z mikrogleju lub makrofagów pochodzenia szpikowego w zależności od liczby cykli PCR. Zwróć uwagę, że wartości CT dla analizy ekspresji mere 1 24 w różnych populacjach komórek są ponownie wyznaczane w punkcie przecięcia linii bazowej z dolną częścią zakresu liniowego krzywych Q-R-T-P-C-R, co zaznaczono na wykresie zielonymi i niebieskimi liniami pionowymi.

Po wyznaczeniu wartości CT dla każdej z próbek, zgodnie z ekspresją snow RNA 55 i mere 1 24 w mikrogleju oraz BM dms od myszy zdrowych i z EAE przedstawioną w tej tabeli, należy odjąć wartość CT dla kontrolnej próbki snow RNA 55 od wartości CT dla eksperymentalnej próbki mere 1 24, aby obliczyć wartości delta CT dla każdego duplikatu każdej próbki. Następnie od wartości delta CT próbek eksperymentalnych należy odjąć wartość delta CT próbki referencyjnej, aby obliczyć wartości delta delta CT. Na koniec oblicza się względny poziom ekspresji dla każdej próbki jako dwa do potęgi minus delta delta CT, co przedstawiono na tym wykresie gęstości.

W przypadku prawidłowej izolacji mikrogleju z normalnego OUN od 95 do 98% komórek będą stanowić mikroglej CD 11 B pozytywny i CD 45 niski, podczas gdy od 2 do 5% zawiesiny komórkowej będą tworzyć makrofagi okołonaczyniowe CD 11 B pozytywne i CD 45 wysokie, a mniej niż 1% będą stanowić limfocyty CD 11 B negatywne i CD 45 wysokie lub astroglej bądź komórki gleju oligodendrocytarnego CD 11 B negatywne i CD 45 negatywne, bądź fragmenty komórek. W przypadku nieprawidłowego przygotowania występuje znaczna kontaminacja komórkami CD 11 B negatywnymi i CD 45 negatywnymi lub fragmentami komórek, takimi jak astroglej lub cząsteczki mieliny, co czyni komórki nieprzydatnymi do izolacji RNA i dalszych analiz. Dodatkowo mogą wystąpić komórki CD 11 B negatywne i CD 45 wysokie, co wskazuje na zanieczyszczenie limfocytami krwi na skutek niewystarczającej perfuzji. Na tym wykresie gęstości przedstawiono trzy populacje komórek obecnych w OUN podczas neurostanu zapalnego: mikroglej CD 11 B pozytywny i CD 45 niski, makrofagi CD 11 B pozytywne i CD 45 wysokie oraz limfocyty CD 11 B negatywne i CD 45 wysokie.

Przedstawiono jakość RNA określoną za pomocą elektroforezy żelowej po prawidłowej oraz nieprawidłowej izolacji. W przypadku czystej izolacji RNA widoczna jest drabinka RNA oraz RNA rybosomalne; natomiast gdy proces izolacji zostanie przeprowadzony wadliwie, widoczne jest rozmycie oraz produkty degradacji o niskiej masie cząsteczkowej. Te końcowe dane wykazują ekspresję mere 1 24 w prawidłowych mikroglejach dorosłych, mikroglejach myszy z EAE oraz mikroglejach wyizolowanych z myszy we wczesnych etapach rozwoju.

Na tym pierwszym wykresie słupkowym względna ekspresja mere 1 24 jest znacznie wyższa w mikrogleju z prawidłowego OUN w porównaniu do wartości zaobserwowanych dla makrofagów pochodzących z szpiku kostnego. Podobnie, mimo wzrostu poziomu RNA mere 1 24 w makrofagach z OUN myszy z EAE, mikroglej nadal wykazuje pięciokrotnie większą ilość RNA mere 1 24. Ten ostatni wykres słupkowy pokazuje, w jaki sposób za pomocą tej metody można również ocenić zmiany poziomu ekspresji mere 1 24 w mikrogleju podczas rozwoju myszy w wieku jednego, dwóch i czterech tygodni w porównaniu z dorosłymi myszami ośmiotygodniowymi podczas wykonywania procedury.

Należy pamiętać o zapewnieniu odpowiedniej ilości i wysokiej jakości wyizolowanych komórek, co zagwarantuje pomyślne wyniki całego eksperymentu.