Name: Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju metodą real-time PCR w prawidłowym OUN i podczas zapalenia nerwów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Poznaj metodę izolacji mikroRNA z mikrogleju OUN za pomocą real-time PCR. Technika ta umożliwia badanie ekspresji mikroRNA w komórkach odpornościowych układu nerwowego w warunkach fizjologicznych i zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez grant badawczy NIH R01 NS071039-01A1.

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

W ostatnim czasie odnotowano znaczne zainteresowanie mikroglejem oraz udziałem tych komórek w wielu patologiach związanych z neurozapaleniem i neurodegeneracją. Ponadto w ciągu ostatnich kilku lat gwałtownie wzrosło znaczenie roli mikroRNA w różnicowaniu komórek odpornościowych i nowotworowych5,10. Wcześniej zgłaszaliśmy rolę miR-124 w utrzymaniu fenotypu nieaktywnego lub spoczynkowego mikrogleju w prawidłowym OUN7, jednak rola innych typów mikroRNA w fenotypie i stanie aktywacji mikrogleju wciąż po...

<table><tbody><tr><td> 1X PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190</td><td>Może być przygotowany z komponentów sypkich w laboratorium, pH: 7.2-7.4</td></tr><tr><td> 10X PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30258.02</td><td>Może być przygotowany z komponentów sypkich w laboratorium, pH: 7.2-7.4</td></tr><tr><td>DMEM; FBS</td><td>GBCO</td><td>11965; 10438</td><td></td></tr><tr><td>zestaw miRVana</td><td>Invitrogen</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td> Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500 ml</td><td>100 ml 100% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 10 ml 10X PBS i 90 ml Percollu z firmy Sigma. 50 ml 70% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 35 ml 100% Percollu i 15 ml DMEM; 50 ml 40% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 20 ml 100% Percollu i 30 ml 1X PBS</td></tr><tr><td>peptyd MOG&lt;sub&gt;35-55&lt;/sub&gt;</td><td>AnaSpec Inc</td><td>60130-5</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>DIFCO</td><td>263810</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna krztuśca</td><td>Sigma</td><td>P7208</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała blokujące FcR</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Klon 2.4G2</td></tr><tr><td> mAb przeciwko CD11b&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553311</td><td>Można stosować z różnymi fluoroforami (np. AF488)</td></tr><tr><td>mAB przeciwko CD45-APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>Można stosować z różnymi fluoroforami (np. APC)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16%)</td><td>EMS Inc</td><td>15710</td><td>Rozcieńczyć 1:15 w 1X PBS</td></tr><tr><td>Żel 15% TBE-mocznikowy</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>EC68855BOX</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Testy TaqMan MicroRNA mmu-miR-124a</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4427975 ID 001182</td><td></td></tr><tr><td>Testy TaqMan MicroRNA snoRNA-55</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4427975 ID 001228</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Life Technologies Inc</td><td>AM9937</td><td>Woda wolna od nukleaz</td></tr><tr><td> Przezroczysta optyczna płytka reakcyjna 384-dołkowa</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>4309849</td><td>Można zastąpić innymi płytkami (np. płytką 96-dołkową) w różnych instrumentach do Real-time PCR</td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce'a (15 ml)</td><td>Wheaton Science Products.</td><td>358044</td><td> Teflon/szkło</td></tr><tr><td>Nylonowe sitko do komórek 40 &amp;mu;</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Duża wirówka</td><td>Sorval</td><td>RT 6000B</td><td>Średnica rotora 18.5 cm</td></tr><tr><td>Mała wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td>Średnica rotora 6.5 cm</td></tr><tr><td>Instrument do Real-time PCR</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>AB 7900 HT</td><td>Można zastąpić innymi instrumentami</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciencess</td><td>LSR II</td><td>Można zastąpić innymi instrumentami</td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria</td><td>Można zastąpić innymi instrumentami</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 1000</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie mikrorna w mikrogleju za pomocą pcr w czasie rzeczywistym w prawidłowym oun oraz podczas neurostanu zapalnego

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Mikroglej to komórki linii mieloidalnej bytujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1. Komórki te odgrywają istotną rolę w patogenezie wielu chorób związanych z neurozapaleniem, takich jak stwardnienie rozsiane (MS)2. Mikroglej w prawidłowym OUN wykazuje ekspresję markera makrofagicznego CD11b i przejawia fenotyp spoczynkowy, charakteryzujący się niskim poziomem markerów aktywacji, takich jak CD45. Podczas zdarzeń patologicznych w OUN mikroglej ulega aktywacji, co potwierdza wzrost ekspresji CD45 oraz innych markerów3. Czynniki wpływające na fenotyp i funkcje mikrogleju w OUN nie są jeszcze dobrze poznane. MikroRNA (miRNA) to stale rosnąca rodzina konserwatywnych cząsteczek (o długości ok. 22 nukleotydów), które uczestniczą w wielu prawidłowych procesach fizjologicznych, takich jak wzrost i różnicowanie komórek4, a także w procesach patologicznych, takich jak zapalenie5. MiRNA obniżają ekspresję określonych genów docelowych poprzez wiązanie sekwencji komplementarnych do ich mRNA i odgrywają ważną rolę w aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych, w tym makrofagów6 i mikrogleju7. Aby zbadać zależne od miRNA szlaki określające fenotyp i funkcję biologiczną mikrogleju oraz odróżnić mikroglej od innych typów makrofagów, istotna jest ilościowa ocena ekspresji konkretnych mikroRNA w odrębnych podgrupach mikrogleju bytującego w OUN. Powszechne metody pomiaru ekspresji miRNA w OUN obejmują ilościowe PCR z całej tkanki neuronalnej oraz hybrydyzację in situ. Jednak ilościowe PCR z homogenatu całej tkanki nie pozwala na ocenę ekspresji miRNA w samym mikrogleju, który stanowi jedynie 5-15% komórek tkanki neuronalnej. Hybrydyzacja in situ umożliwia ocenę ekspresji mikroRNA w konkretnych typach komórek w przekrojach tkankowych, lecz metoda ta nie jest w pełni ilościowa. W niniejszym opracowaniu opisujemy ilościową i czułą metodę detekcji miRNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w mikrogleju izolowanym z prawidłowego OUN lub podczas neurozapalenia z wykorzystaniem eksperymentalnego autoimmunizacyjnego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), będącego modelem mysim stwardnienia rozsianego. Opisana metoda będzie użyteczna do pomiaru poziomu ekspresji mikroRNA w mikrogleju w prawidłowym OUN lub podczas neurozapalenia związanego z różnymi patologiami, w tym stwardnieniem rozsianym, udarem, urazami mechanicznymi, chorobą Alzheimera oraz guzami mózgu.

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Mikroglej to komórki linii mieloidalnej bytujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1. Komórki te odgrywają istotną rolę w patologiach wielu...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza ekspresji mikroRNA w mikrogleju. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mózgu i rdzenia kręgowego, a następnie homogenizację tkanki ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W drugim kroku komórki jednojądrowe z OUN są izolowane za pomocą gradientu Percoll, a następnie populacja mikrogleju jest identyfikowana metodą FACS.Następnie izoluje się RNA z mikrogleju i analizuje jakość próbki. W końcowym etapie przeprowadza się reakcję PCR w czasie rzeczywistym dla konkretnego, badanego mikroRNA. Ostatecznie można zastosować metodę delta delta CT, aby wykazać względny poziom ekspresji konkretnego mikroRNA w mikrogleju.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z powodu niewystarczającej liczby wyizolowanych komórek mononuklearnych z OUN lub z powodu zanieczyszczenia próbki mieliną i debris komórkowym. Oba te przypadki prowadzą do niskiej jakości preparatu, skutkując odpowiednio niskim stężeniem RNA lub zanieczyszczeniem białkiem. Procedurę zaprezentują me i vir.Po perfuzji wszystkich myszy należy wypreparować mózgi i rdzenie kręgowe. Następnie do homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml należy umieścić pojedynczo jeden mózg i jeden rdzeń kręgowy, dodając do tkanek za każdym razem 5 ml PBS. Po wykonaniu od 10 do 20 delikatnych uderzeń, homogenizat należy przefiltrować przez sita komórkowe o oczkach 70 µm do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml, a następnie wirować probówki przez 5 do 7 minut przy 834 ×g i 4 °C.Po odlaniu supernatantu zawiesić homogenat mózgu i rdzenia kręgowego od dwóch do trzech myszy w 5-7 ml 70% Percoll. Następnie nałożyć 7 ml 40% Percoll i wirować roztwór Percoll z komórkami przez 30 minut przy 850 ×g w temperaturze 20 °C bez hamowania. Odrzucić uszkodzone komórki, mielinę i debris znajdujące się nad warstwą 70% Percoll.Następnie należy zebrać komórki mononuklearne z granicy rozdzielenia roztworów Percoll 70% i 40% i rozcieńczyć zebrane komórki w PBS, w stosunku co najmniej jeden do jednego. Po odwirowaniu komórek należy resuspendować osad w 0,5 mL PBS i przenieść je do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,7 mL. Należy rozpocząć od przeniesienia 50 µL komórek posortowanych gradientem gęstości do nowej probówki typu Eppendorf 1,7 mL i dodać do probówki 350 µL buforu FACS.Następnie, po dodaniu od 5 do 10 µL przeciwciał anty-FCR do probówki, inkubować komórki przez 10 do 15 minut w lodzie. Rozdzielić próbkę komórek do dwóch probówek typu Eppendorf; do jednej z nich dodać 1 µL przeciwciał anty-CD 11 B oraz 2 µL przeciwciał anty-CD 45.Inkubowanie komórek przez kolejne 10 do 15 minut na lodzie. Drugą probówkę należy oznaczyć jako kontrolę negatywną i umieścić na lodzie. Po inkubacji z przeciwciałami barwiącymi, do obu probówek należy dodać 1 mL buforu FACS i odwirować komórki w mikrowirowce przez 5 minut przy 1200 ×g.G. Następnie utrwal osady w 400 µL 1% paraformaldehydu w PBS i wymieszaj probówki na wirówce typu vortex, aby zapobiec zbrylaniu. Na koniec przeanalizuj komórki metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując próbkę kontrolną negatywną oraz kuleczki BD com beads. Rozpocznij od podskórnego uodpornienia grupy od pięciu do 10 myszy C 57 black six w wieku od ośmiu do 12 tygodni za pomocą 150 mg peptydu MOG 35-55 w 4 mg/mL kompletnego adiuwantu Freunda w celu indukcji EAE. Następnie podaj toksynę pertussis drogą dosytrawniczą w dniu zerowym oraz w drugim dniu po immunizacji.Po wyizolowaniu i zabarwieniu komórek, zgodnie z wcześniejszą prezentacją, bezpośrednio przed sortowaniem zawiesić osady w 400 µL PBS zamiast utrwalacza. Następnie napełnić dwie probówki typu eppendorf o pojemności 1,7 ml ilością 300 µL PBS uzupełnionego o 10% FBS w celu zebrania próbek. Na koniec posortować populacje mikrogleju i makrofagów do uzyskania wysokiej czystości, stosując strategię bramkowania przedstawioną na tym reprezentatywnym wykresie gęstości.Po sortowaniu ponownie przeanalizuj populacje mikrogleju i makrofagów, aby określić czystość wyizolowanych próbek komórek. Po odwirowaniu posortowanych populacji komórek z prędkością 1200 ×g przez pięć do siedmiu minut w mikrowirówce, ostrożnie usuń nadsącz i zamroź osady komórkowe na suchym lodzie. Następnie przenieś zamrożone osady komórkowe na zwykły lód.W celu rozmrożenia należy dodać 300 µL buforu do lizy z zestawu Nirvana, a następnie delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując roztwór od pięciu do siedmiu razy. Następnie dodaje się 30 µL dodatku do homogenatu, miesza zawiesinę komórkową na wortexie przez 30 sekund i pozostawia probówki na lodzie przez 10 minut. Teraz należy dodać 300 µL mieszaniny kwasowego fenolu i chloroformu, a następnie ponownie mieszać probówkę na wortexie przez kolejne 30 sekund.Następnie, po odwirowaniu komórek przez pięć minut przy 9 500 ×g, ostrożnie przenieś górne 300 µL supernatantu zawierającego fazę wodną do nowej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,7 mL. Wymieszaj roztwór z 375 µL 100% etanolu. Przenieś całą zawartość probówki do wkładu filtrującego z zestawu Nirvana i wiruj wkład przez jedną minutę przy 9 500 ×g. Następnie odrzuć przefiltrat.Do opłukanego kartridża dodaj 700 µL roztworu piorącego 1 (wash solution one) z zestawu Nirvana i wiruj przez kolejną minutę przy 9 500 ×g. Powtórz czynność jeszcze dwukrotnie, używając 500 µL roztworu piorącego 2 (wash solution two) z zestawu Nirvana. Eluuj RNA z kartridża, używając 60 µL podgrzanej wody wolnej od nukleaz.Na koniec należy użyć spektrofotometru NanoDrop, aby ocenić czystość i ilość RNA po przeprowadzeniu qRT-PCR w celu wykrycia mikroRNA w próbkach mikrogleju i makrofagów. Krzywe PCR dla produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie dla miR-124 i snoRNA 55 można wygenerować, jak pokazano tutaj na pierwszym wykresie. Przedstawiono typowe krzywe ilości specyficznych produktów PCR znakowanych fluorescencyjnie dla kontrolnych próbek snoRNA 55 wyizolowanych z mikrogleju lub makrofagów pochodzących z szpiku kostnego w zależności od liczby cykli PCR.Zwróć uwagę, że wartości CT dla analizy ekspresji snow RNA 55 w różnych populacjach komórek są wyznaczane w punkcie przecięcia linii bazowej z dolną częścią zakresu liniowego krzywych Q-R-T-P-C-R, co zaznaczono na wykresie zielonymi i niebieskimi liniami pionowymi. Na tym drugim wykresie przedstawiono ilość fluorescencyjnie znakowanych specyficznych produktów PCR dla eksperymentalnych próbek mere 1 24 RNA pochodzących z mikrogleju lub makrofagów pochodzenia szpikowego w zależności od liczby cykli PCR. Zwróć uwagę, że wartości CT dla analizy ekspresji mere 1 24 w różnych populacjach komórek są ponownie wyznaczane w punkcie przecięcia linii bazowej z dolną częścią zakresu liniowego krzywych Q-R-T-P-C-R, co zaznaczono na wykresie zielonymi i niebieskimi liniami pionowymi.Po wyznaczeniu wartości CT dla każdej z próbek, zgodnie z ekspresją snow RNA 55 i mere 1 24 w mikrogleju oraz BM dms od myszy zdrowych i z EAE przedstawioną w tej tabeli, należy odjąć wartość CT dla kontrolnej próbki snow RNA 55 od wartości CT dla eksperymentalnej próbki mere 1 24, aby obliczyć wartości delta CT dla każdego duplikatu każdej próbki. Następnie od wartości delta CT próbek eksperymentalnych należy odjąć wartość delta CT próbki referencyjnej, aby obliczyć wartości delta delta CT. Na koniec oblicza się względny poziom ekspresji dla każdej próbki jako dwa do potęgi minus delta delta CT, co przedstawiono na tym wykresie gęstości.W przypadku prawidłowej izolacji mikrogleju z normalnego OUN od 95 do 98% komórek będą stanowić mikroglej CD 11 B pozytywny i CD 45 niski, podczas gdy od 2 do 5% zawiesiny komórkowej będą tworzyć makrofagi okołonaczyniowe CD 11 B pozytywne i CD 45 wysokie, a mniej niż 1% będą stanowić limfocyty CD 11 B negatywne i CD 45 wysokie lub astroglej bądź komórki gleju oligodendrocytarnego CD 11 B negatywne i CD 45 negatywne, bądź fragmenty komórek. W przypadku nieprawidłowego przygotowania występuje znaczna kontaminacja komórkami CD 11 B negatywnymi i CD 45 negatywnymi lub fragmentami komórek, takimi jak astroglej lub cząsteczki mieliny, co czyni komórki nieprzydatnymi do izolacji RNA i dalszych analiz. Dodatkowo mogą wystąpić komórki CD 11 B negatywne i CD 45 wysokie, co wskazuje na zanieczyszczenie limfocytami krwi na skutek niewystarczającej perfuzji. Na tym wykresie gęstości przedstawiono trzy populacje komórek obecnych w OUN podczas neurostanu zapalnego: mikroglej CD 11 B pozytywny i CD 45 niski, makrofagi CD 11 B pozytywne i CD 45 wysokie oraz limfocyty CD 11 B negatywne i CD 45 wysokie.Przedstawiono jakość RNA określoną za pomocą elektroforezy żelowej po prawidłowej oraz nieprawidłowej izolacji. W przypadku czystej izolacji RNA widoczna jest drabinka RNA oraz RNA rybosomalne; natomiast gdy proces izolacji zostanie przeprowadzony wadliwie, widoczne jest rozmycie oraz produkty degradacji o niskiej masie cząsteczkowej. Te końcowe dane wykazują ekspresję mere 1 24 w prawidłowych mikroglejach dorosłych, mikroglejach myszy z EAE oraz mikroglejach wyizolowanych z myszy we wczesnych etapach rozwoju.Na tym pierwszym wykresie słupkowym względna ekspresja mere 1 24 jest znacznie wyższa w mikrogleju z prawidłowego OUN w porównaniu do wartości zaobserwowanych dla makrofagów pochodzących z szpiku kostnego. Podobnie, mimo wzrostu poziomu RNA mere 1 24 w makrofagach z OUN myszy z EAE, mikroglej nadal wykazuje pięciokrotnie większą ilość RNA mere 1 24. Ten ostatni wykres słupkowy pokazuje, w jaki sposób za pomocą tej metody można również ocenić zmiany poziomu ekspresji mere 1 24 w mikrogleju podczas rozwoju myszy w wieku jednego, dwóch i czterech tygodni w porównaniu z dorosłymi myszami ośmiotygodniowymi podczas wykonywania procedury.Należy pamiętać o zapewnieniu odpowiedniej ilości i wysokiej jakości wyizolowanych komórek, co zagwarantuje pomyślne wyniki całego eksperymentu.

detection-micrornas-microglia-real-time-pcr-normal-cns-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie mikroRNA w mikrogliach przez qPCR w normalnym OUN i podczas neurozapalenia

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Mikroglej (komórki odpornościowe mózgu), są używane jako zastępczy bioczujnik do określenia, jak nanocząsteczki wpływają na neurotoksyczność. Opisujemy serię eksperymentów mających na celu zbadanie odpowiedzi mikrogleju na nanocząstki i narażenie neuronów podwzgórza na supernatant z aktywowanego mikrogleju w celu określenia neurotoksyczności.

Mikroglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Poznaj metodę izolacji mikroRNA z mikrogleju OUN za pomocą real-time PCR. Technika ta umożliwia badanie ekspresji mikroRNA w komórkach odpornościowych układu nerwowego w warunkach fizjologicznych i zapalnych.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Przeglądaj więcej filmów