Name: Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju metodą real-time PCR w prawidłowym OUN i podczas zapalenia nerwów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Poznaj metodę izolacji mikroRNA z mikrogleju OUN za pomocą real-time PCR. Technika ta umożliwia badanie ekspresji mikroRNA w komórkach odpornościowych układu nerwowego w warunkach fizjologicznych i zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez grant badawczy NIH R01 NS071039-01A1.

<ol><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+the+Healthy+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in the Healthy Brain.</a> J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).</li>
<li>Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+CNS+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in CNS inflammation.</a> FEBS Lett. , (2011).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs+stem+cell+reprogramming+for+neuronal+induction+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation.</a> Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).</li>
<li>McCoy, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+miRNAs+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">The role of miRNAs in cytokine signaling.</a> Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).</li>
<li>He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+tumor-associated+macrophages+via+targeting+C%2FEBPbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta.</a> Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+promotes+microglia+quiescence+and+suppresses+EAE+by+deactivating+macrophages+via+the+C%2FEBP-alpha-PU.1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway.</a> Nat. Med. 17, 64-70 (2011).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).</li>
<li>Gabriely, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+21+promotes+glioma+invasion+by+targeting+matrix+metalloproteinase+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators.</a> Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).</li>
<li>Caffarelli, E., Filetici, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in cancer development.</a> Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).</li>
<li>Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Throughput+MicroRNA+Profiling%3A+Optimized+Multiplex+qRT-PCR+at+Nanoliter+Scale+on+the+Fluidigm+Dynamic+ArrayTM+IFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs.</a> J. Vis. Exp. (54), e2552(2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

W ostatnim czasie odnotowano znaczne zainteresowanie mikroglejem oraz udziałem tych komórek w wielu patologiach związanych z neurozapaleniem i neurodegeneracją. Ponadto w ciągu ostatnich kilku lat gwałtownie wzrosło znaczenie roli mikroRNA w różnicowaniu komórek odpornościowych i nowotworowych5,10. Wcześniej zgłaszaliśmy rolę miR-124 w utrzymaniu fenotypu nieaktywnego lub spoczynkowego mikrogleju w prawidłowym OUN7, jednak rola innych typów mikroRNA w fenotypie i stanie aktywacji mikrogleju wciąż po...

<table><tbody><tr><td> 1X PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190</td><td>Może być przygotowany z komponentów sypkich w laboratorium, pH: 7.2-7.4</td></tr><tr><td> 10X PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30258.02</td><td>Może być przygotowany z komponentów sypkich w laboratorium, pH: 7.2-7.4</td></tr><tr><td>DMEM; FBS</td><td>GBCO</td><td>11965; 10438</td><td></td></tr><tr><td>zestaw miRVana</td><td>Invitrogen</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td> Percoll</td><td>Sigma</td><td>P4937-500 ml</td><td>100 ml 100% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 10 ml 10X PBS i 90 ml Percollu z firmy Sigma. 50 ml 70% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 35 ml 100% Percollu i 15 ml DMEM; 50 ml 40% Percollu przygotowuje się poprzez zmieszanie 20 ml 100% Percollu i 30 ml 1X PBS</td></tr><tr><td>peptyd MOG&lt;sub&gt;35-55&lt;/sub&gt;</td><td>AnaSpec Inc</td><td>60130-5</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>DIFCO</td><td>263810</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna krztuśca</td><td>Sigma</td><td>P7208</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała blokujące FcR</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Klon 2.4G2</td></tr><tr><td> mAb przeciwko CD11b&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553311</td><td>Można stosować z różnymi fluoroforami (np. AF488)</td></tr><tr><td>mAB przeciwko CD45-APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>Można stosować z różnymi fluoroforami (np. APC)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16%)</td><td>EMS Inc</td><td>15710</td><td>Rozcieńczyć 1:15 w 1X PBS</td></tr><tr><td>Żel 15% TBE-mocznikowy</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>EC68855BOX</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Testy TaqMan MicroRNA mmu-miR-124a</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4427975 ID 001182</td><td></td></tr><tr><td>Testy TaqMan MicroRNA snoRNA-55</td><td>Life Technologies Inc</td><td>4427975 ID 001228</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Life Technologies Inc</td><td>AM9937</td><td>Woda wolna od nukleaz</td></tr><tr><td> Przezroczysta optyczna płytka reakcyjna 384-dołkowa</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>4309849</td><td>Można zastąpić innymi płytkami (np. płytką 96-dołkową) w różnych instrumentach do Real-time PCR</td></tr><tr><td>Homogenizator Dounce'a (15 ml)</td><td>Wheaton Science Products.</td><td>358044</td><td> Teflon/szkło</td></tr><tr><td>Nylonowe sitko do komórek 40 &amp;mu;</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Duża wirówka</td><td>Sorval</td><td>RT 6000B</td><td>Średnica rotora 18.5 cm</td></tr><tr><td>Mała wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td>Średnica rotora 6.5 cm</td></tr><tr><td>Instrument do Real-time PCR</td><td>Life Technologies Inc.</td><td>AB 7900 HT</td><td>Można zastąpić innymi instrumentami</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciencess</td><td>LSR II</td><td>Można zastąpić innymi instrumentami</td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria</td><td>Można zastąpić innymi instrumentami</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 1000</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie mikrorna w mikrogleju za pomocą pcr w czasie rzeczywistym w prawidłowym oun oraz podczas neurostanu zapalnego

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Mikroglej to komórki linii mieloidalnej bytujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1. Komórki te odgrywają istotną rolę w patogenezie wielu chorób związanych z neurozapaleniem, takich jak stwardnienie rozsiane (MS)2. Mikroglej w prawidłowym OUN wykazuje ekspresję markera makrofagicznego CD11b i przejawia fenotyp spoczynkowy, charakteryzujący się niskim poziomem markerów aktywacji, takich jak CD45. Podczas zdarzeń patologicznych w OUN mikroglej ulega aktywacji, co potwierdza wzrost ekspresji CD45 oraz innych markerów3. Czynniki wpływające na fenotyp i funkcje mikrogleju w OUN nie są jeszcze dobrze poznane. MikroRNA (miRNA) to stale rosnąca rodzina konserwatywnych cząsteczek (o długości ok. 22 nukleotydów), które uczestniczą w wielu prawidłowych procesach fizjologicznych, takich jak wzrost i różnicowanie komórek4, a także w procesach patologicznych, takich jak zapalenie5. MiRNA obniżają ekspresję określonych genów docelowych poprzez wiązanie sekwencji komplementarnych do ich mRNA i odgrywają ważną rolę w aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych, w tym makrofagów6 i mikrogleju7. Aby zbadać zależne od miRNA szlaki określające fenotyp i funkcję biologiczną mikrogleju oraz odróżnić mikroglej od innych typów makrofagów, istotna jest ilościowa ocena ekspresji konkretnych mikroRNA w odrębnych podgrupach mikrogleju bytującego w OUN. Powszechne metody pomiaru ekspresji miRNA w OUN obejmują ilościowe PCR z całej tkanki neuronalnej oraz hybrydyzację in situ. Jednak ilościowe PCR z homogenatu całej tkanki nie pozwala na ocenę ekspresji miRNA w samym mikrogleju, który stanowi jedynie 5-15% komórek tkanki neuronalnej. Hybrydyzacja in situ umożliwia ocenę ekspresji mikroRNA w konkretnych typach komórek w przekrojach tkankowych, lecz metoda ta nie jest w pełni ilościowa. W niniejszym opracowaniu opisujemy ilościową i czułą metodę detekcji miRNA za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w mikrogleju izolowanym z prawidłowego OUN lub podczas neurozapalenia z wykorzystaniem eksperymentalnego autoimmunizacyjnego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), będącego modelem mysim stwardnienia rozsianego. Opisana metoda będzie użyteczna do pomiaru poziomu ekspresji mikroRNA w mikrogleju w prawidłowym OUN lub podczas neurozapalenia związanego z różnymi patologiami, w tym stwardnieniem rozsianym, udarem, urazami mechanicznymi, chorobą Alzheimera oraz guzami mózgu.

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Mikroglej to komórki linii mieloidalnej bytujące w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)1. Komórki te odgrywają istotną rolę w patologiach wielu...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza ekspresji mikroRNA w mikrogleju. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mózgu i rdzenia kręgowego, a następnie homogenizację tkanki ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W drugim kroku komórki jednojądrowe z OUN są izolowane za pomocą gradientu Percoll, a następnie populacja mikrogleju jest identyfikowana metodą FACS.Następnie izoluje się RNA z mikrogleju i analizuje jakość próbki. W końcowym etapie przeprowadza się reakcję PCR w czasie rzeczywistym dla konkretnego, badanego mikroRNA. Ostatecznie można zastosować metodę delta delta CT, aby wykazać względny poziom ekspresji konkretnego mikroRNA w mikrogleju.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z powodu niewystarczającej liczby wyizolowanych komórek mononuklearnych z OUN lub z powodu zanieczyszczenia próbki mieliną i debris komórkowym. Oba te przypadki prowadzą do niskiej jakości preparatu, skutkując odpowiednio niskim stężeniem RNA lub zanieczyszczeniem białkiem. Procedurę zaprezentują me i vir.Po perfuzji wszystkich myszy należy wypreparować mózgi i rdzenie kręgowe. Następnie do homogenizatora Dounce o pojemności 15 ml należy umieścić pojedynczo j

detection-micrornas-microglia-real-time-pcr-normal-cns-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie mikroRNA w mikrogliach przez qPCR w normalnym OUN i podczas neurozapalenia

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Mikroglej (komórki odpornościowe mózgu), są używane jako zastępczy bioczujnik do określenia, jak nanocząsteczki wpływają na neurotoksyczność. Opisujemy serię eksperymentów mających na celu zbadanie odpowiedzi mikrogleju na nanocząstki i narażenie neuronów podwzgórza na supernatant z aktywowanego mikrogleju w celu określenia neurotoksyczności.

Mikroglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS) to przyjazny dla użytkownika system analityczny, który nie wymaga znajomości kodowania i półautomatycznie analizuje morfologię pojedynczych komórek mikrogleju na obrazach immunofluorescencyjnych. MMPS, zweryfikowane w modelu neurozapalenia wywołanego lipopolisacharydem u gryzoni, w sposób powtarzalny wykrywa zmiany morfologiczne związane z aktywacją i umożliwia standaryzowane, skalowalne fenotypowanie mikrogleju.

Oprogramowanie do mapowania parametrów mikrogleju (MMPS): Otwarte, przyjazne dla użytkownika narzędzie do ilościowej analizy morfologii mikrogleju

Poznaj metodę izolacji mikroRNA z mikrogleju OUN za pomocą real-time PCR. Technika ta umożliwia badanie ekspresji mikroRNA w komórkach odpornościowych układu nerwowego w warunkach fizjologicznych i zapalnych.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Przeglądaj więcej filmów