Name: Zubożenie i rekonstytucja makrofagów u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę zubożenia i rekonstytucji makrofagów u myszy w badaniach immunologicznych. Technika ta umożliwia szybsze niż tradycyjne krzyżowanie badanie roli spolaryzowanych makrofagów w zapaleniu i chorobach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była wspierana przez „Grant in Aid of Research” przyznany przez Crohn's and Colitis Foundation of Canada dla LMS, który jest wspierany przez New Investigator Award przyznane przez Canadian Association of Gastroenterology/Canadian Association of Health Research/Crohn's and Colitis Foundation of Canada.

1. Usuwanie makrofagów przy użyciu liposomów zawierających klodronian
<ol>
 <li>Liposomy przechowuje się w temperaturze 4 °C. Na dwie godziny przed wstrzyknięciem należy wyjąć z lodówki liposomy zawierające klodronian, liposomy zawierające PBS lub sterylny PBS (kontrola wstrzyknięcia), aby osiągnęły temperaturę pokojową (18 °C).</li>
 <li>Probówki zawierające liposomy należy odwrócić 8-10 razy w celu zapewnienia równomiernego rozłożenia zawiesiny, a następnie nabić 200 μl do strzykawki o pojemności 1 ml. Do końcówki strzykawki należy przymocować igłę o rozmiarze 26 G.</li>
 <li>Lewą ręką należy chwycić mysz za kark tuż poniżej uszu, trzymając wystarczającą ilość skóry, aby unieruchomić głowę i kończyny zwierzęcia.</li>
 <li>Należy przechylić mysz tak, aby jej głowa była skierowana lekko ku dołowi, co spowoduje przemieszczenie organów wewnętrznych z miejsca wstrzyknięcia, które znajduje się w prawym dolnym kwadrancie brzucha.</li>
 <li>Przed wstrzyknięciem należy potoczyć strzykawkę między dłońmi i odwrócić ją 6 razy, aby równomiernie rozprowadzić roztwór liposomów.</li>
 <li>Igłę należy wprowadzić w prawą dolną stronę brzucha myszy pod kątem 30-40 stopni. Należy wstrzyknąć 200 μl roztworu liposomów lub PBS.</li>
 <li>W przypadku modelu zapalenia indukowanego, np. colitis indukowanego przez DSS, wstrzyknięcia należy wykonać 4 dni przed wystąpieniem stanu zapalnego, aby zapewnić usunięcie makrofagów rezydujących, oraz powtarzać co 2 dni w trakcie trwania protokołu w celu usunięcia nowo naciekających makrofagów.</li>
 <li>Na koniec eksperymentu, wraz z planowanymi analizami, należy pobrać tkanki z obszaru zainteresowania i utrwalić je paraformaldehydem, aby potwierdzić usunięcie makrofagów za pomocą barwienia immunohistochemicznego.</li>
</ol>
2. Uzyskiwanie spolaryzowanych makrofagów z aspiratów szpiku kostnego
<ol>
 <li>Szpik kostny myszy w wieku od 8 do 12 tygodni zapewnia najwyższą wydajność makrofagów pochodzenia szpikowego. Uśmierć mysz, połóż ją na plecach i unieruchom łapy, rozciągając kończyny tak daleko, jak to możliwe.</li>
 <li>Pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, wyjmij kości udowe i piszczelowe, odcinając jak największą ilość mięśni.</li>
 <li>Wypłucz szpik z kości, używając IMDM z 10% FCS umieszczonego w strzykawce 5 ml z igłą 26 G.</li>
 <li>Rozcieńcz aspiraty szpiku kostnego do 40 ml w IMDM z 10% FCS, umieść komórki w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 75 cm2 i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 4 godziny. Krok ten usuwa adherentne komórki mezenchymalne lub dojrzałe makrofagi z progenitorów hematopoetycznych.</li>
 <li>Przenieś supernatant hodowli zawierający nieadherentne progenitory do stożkowej probówki Falcon 50 ml i wiruj przez 5 min przy 1200 rpm.</li>
 <li>Resuspenduj osad komórkowy w 5 ml IMDM, 10% FCS i policz komórki jądrowe, rozcieńczając zawiesinę komórkową 1:20 w kwasie octowym. Procedura ta lizuje wszystkie komórki, w tym erytrocyty, a pozostałe jądra można policzyć za pomocą komory liczniczej (hemocytometru).</li>
 <li>Resuspenduj komórki do stężenia 0,5×106 komórek/ml w pożywce kompletnej: IMDM, 10% FCS, 150 μM monotio glicerolu (MTG) oraz 10 ng/ml MCSF, GM-CSF lub IL-3. Makrofagi pochodzące z MCSF są makrofagami klasycznie aktywowanymi, natomiast makrofagi pochodzące z GM-CSF lub IL-3 są alternatywnie aktywowane.</li>
 <li>Wymień pożywkę w 4. dniu, odwirowując komórki nieadherentne i przenosząc je z powrotem do kolby, oraz w 7. dniu, usuwając komórki nieadherentne.</li>
 <li>Dodatkowo, w 7. dniu do kolb zawierających komórki pochodzące z MCSF można dodać IFNγ (10 ng/ml) lub IL-4 (10 ng/ml), aby odpowiednio skierować makrofagi w stronę fenotypu klasycznie aktywowanego lub alternatywnie aktywowanego. Inkubuj komórki przez kolejne 3 dni.</li>
 <li>W 10. dniu usuń pożywkę i ododerwij komórki od ścianek kolby do hodowli tkankowej, używając buforu do dysocjacji komórek (Cell Dissociation Buffer, Gibco-BRL). Nałóż 5 ml buforu na komórki na 5 min w temperaturze pokojowej (18 °C), a następnie kilkukrotnie mocno uderz piętą dłoni w bok kolby. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki oddzieliły się od ścianek kolby. Przenieś resuspendowane komórki pipetą do stożkowej probówki Falcon 15 ml i wypłucz kolbę dodatkowymi 10 ml IMDM, 10% FBS. Połącz i odwiruj komórki przez 5 min przy 300×g.</li>
 <li>Policz żywe komórki za pomocą komory liczniczej i resuspenduj do stężenia 107 komórek/ml w sterylnym PBS pH 7,4. Makrofagi są gotowe do wstrzyknięcia myszom.</li>
 <li>Zarezerwuj 1,0×106 makrofagów do oceny fenotypu makrofagów. Makrofagi klasycznie aktywowane, stymulowane lipopolisacharydem, wydzielają wysokie poziomy tlenku azotku i IL-12p70 oraz niskie poziomy IL-10 w porównaniu do makrofagów alternatywnie aktywowanych. Makrofagi alternatywnie aktywowane konstytutywnie wykazują ekspresję YM1 i arginazy I (ArgI), co można wykryć za pomocą immunoblotingu Western.</li>
</ol>
3. Transfer makrofagów do myszy
<ol>
 <li>Resuspenduj makrofagi w sterylnym PBS do stężenia 107 komórek/ml. Pozwala to na dożylną iniekcję 106 makrofagów w całkowitej objętości 100 μl, która może być bezpiecznie i bezproblemowo wstrzyknięta myszom do żyły ogonowej.</li>
 <li>Ogrzewaj myszy za pomocą podkładki grzewczej lub podgrzewacza przez 5-10 min, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Przez cały czas monitoruj mysz pod kątem objawów hipertermii.</li>
 <li>Przenieś mysz do urządzenia stabilizującego, które umożliwia dostęp do żył ogonowych.</li>
 <li>Obróć ogon o 90°, tak aby żyła była skierowana ku górze. Żyły przebiegają bocznie po obu stronach ogona i można wykorzystać dowolną z nich.</li>
 <li>Oczyść miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem i powoli wstrzyknij 100 μl (106 makrofagów) za pomocą strzykawki 1 ml z igłą o rozmiarze 26 lub 28 G. Wprowadź igłę ściętym końcem do góry i pod lekkim kątem, niemal równolegle do żyły.</li>
 <li>Jeśli igła zostanie wprowadzona prawidłowo, nie powinno być odczuwalnego oporu, a żyła powinna stać się przejrzysta po wstrzyknięciu. Jeśli igła nie znajduje się w żyle, ogon spuchnie. W takim przypadku wyjmij igłę i spróbuj ponownie bliżej nasady ogona niż podczas poprzedniej próby lub w drugiej żyle. Przy każdej iniekcji należy użyć nowej igły, ponieważ skóra ogona jest twarda i igły szybko tępią się podczas wstrzykiwania do żyły ogonowej.</li>
 <li>Po iniekcji wyjmij igłę, lekko uciśnij miejsce wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie, i monitoruj mysz przez kolejne 5 min, aby upewnić się, że krwawienie całkowicie przestało.</li>
 <li>Powtarzaj iniekcje makrofagów co 4 dni, aby zapewnić ciągłe dostarczanie spolaryzowanych makrofagów podczas procedury eksperymentalnej.</li>
 <li>Na koniec eksperymentu, wraz z analizami badawczymi, pobierz tkanki z badanego miejsca i utrwal je paraformaldehydem lub formaliną, aby potwierdzić skuteczne dostarczenie spolaryzowanych makrofagów za pomocą barwienia immunohistochemicznego.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Liczba i fenotyp makrofagów rezydentnych w danej tkance zależą od badanej tkanki i zmieniają się podczas infekcji lub stanu zapalnego. Podobnie zdolność liposomów zawierających klodronian do usuwania makrofagów z tkanki zależy od drogi podania i efektywnego dostarczenia do tkanki docelowej. Podanie domięśniowe liposomów zawierających klodronian prowadzi do zmniejszenia liczby makrofagów F4/80+ w jelicie grubym myszy podczas zapalenia jelita wywołanego DSS, co jest widoczne w barwieniu immunohistochemicznym dla markera makrofagów F4/80 (Rycina 1A). Barwienie histologiczne może być również wykorzystane do określenia ilościowych różnic w liczbie i fenotypie makrofagów w przekrojach tkanek. Rycina 1B pokazuje, że średnio 55% makrofagów zostaje usuniętych przez liposomy zawierające klodronian, w porównaniu do braku wykrytej deplecji w jelitach grubych myszy w grupie kontrolnej, której wstrzyknięto sam PBS. Każdą wartość określono poprzez policzenie komórek wybarwionych dodatnio na F4/80 i ArgI w seryjnych przekrojach tkanek od 6 myszy w 3 punktach, w 3 przekrojach na mysz, przy czym liczenie było przeprowadzane przez dwie osoby nieznające warunków eksperymentalnych. Wyniki te dowodzą, że wewnątrzbrzuszne iniekcje liposomów z klodronianem usuwają makrofagi jelita grubego u myszy.
Wyprowadzenie makrofagów ze szpiku kostnego w obecności różnych czynników wzrostu pozwala uzyskać makrofagi klasycznie aktywowane (pochodzące z MCSF lub pochodzące z MCSF i traktowane IFNγ) lub alternatywnie aktywowane (pochodzące z GM-CSF lub IL-3 lub pochodzące z MCSF i traktowane IL-4). Płukanie szpiku kostnego z 2 kości udowych i 2 kości piszczelowych 8-tygodniowej myszy zazwyczaj daje 6×107 komórek jądrzastych na mysz i pozwala uzyskać 8×106 makrofagów pochodzących z MCSF, 10×106 makrofagów pochodzących z GM-CSF lub 12×106 makrofagów pochodzących z IL-3. Rysunek 2A przedstawia zawartość azotynów oraz stosunek IL-12p70/IL-10 w supernatantach makrofagów traktowanych lipopolisacharydem przez 24 godziny. Rysunek 2B przedstawia typową analizę Western blot 0,5×106 makrofagów z warunków wyprowadzenia MCSF +/- IL-4 z zastosowaniem przeciwciał przeciwko markerom alternatywnie aktywowanych makrofagów, ArgI, YM1, lub GAPDH jako kontroli ładunku. Dane te wykazują, że makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego mogą zostać ukierunkowane na spolaryzowany fenotyp podczas procesu wyprowadzania.
Skuteczny transfer spolaryzowanych makrofagów pochodzących ex vivo do tkanki zależy od drogi podania oraz dostępu do tej tkanki. Podczas colitis indukowanego DSS makrofagi wstrzyknięte dożylnie przemieszczają się do miejsca stanu zapalnego, a makrofagi alternatywnie aktywowane zmniejszają ciężkość choroby. Rycina 3A przedstawia całkowitą liczbę makrofagów oraz liczbę makrofagów ArgI+ (alternatywnie aktywowanych) policzonych w przekrojach histologicznych myszy, którym wstrzyknięto spolaryzowane makrofagi pochodzące z szpiku kostnego. Wpływ transferu spolaryzowanych makrofagów do jelita grubego podczas colitis indukowanego DSS przedstawiono za pomocą indeksu aktywności choroby, będącego sumaryczną punktacją opartą na utracie masy ciała, krwawieniu z odbytu i zmniejszonej konsystencji stolca (Rycina 3B). Wyniki te dowodzą, że makrofagi pochodzące ex vivo, przetransferowane adoptywnie, mogą migrować do jelita grubego i wpływać na indukowany stan zapalny. Makrofagi M1 nie wpływają na stan zapalny, podczas gdy makrofagi M2 znacząco obniżają indeks aktywności choroby.
<img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="Barwienie histologiczne i wykres słupkowy przedstawiający ekspresję F4/80 i Arg1 w grupie kontrolnej i po zastosowaniu klodronianu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Liposomy zawierające klodronian skutecznie usuwają komórki F4/80+ oraz F480+ArgI+ w jelitach grubych myszy in vivo. Myszy typu dzikiego z pokolenia F2 na zmieszanym tle genetycznym C57BL/6 ×129Sv otrzymywały 5% DSS przez 7 dni i były wstrzykiwane doprzewnywnie (IP) PBS (Kontrola) lub liposomami zawierającymi klodronian (Klodronian) 4 dni przed rozpoczęciem leczenia DSS oraz w dniach 0, 2, 4 i 6 podczas leczenia DSS. (A) Jelita grube zostały usunięte, utrwalone, a ich przekroje zabarwiono immunohistochemicznie w celu wykazania dojrzałych makrofagów (F4/80) oraz markera makrofagów M2, ArgI. (B) Ilościowe oznaczenie makrofagów F4/80+ i ArgI+. Komórki wykazujące pozytywne barwienie zostały policzone przez dwie osoby nieznające warunków eksperymentalnych przy powiększeniu 40× w 6 polach z 3 przekrojów na mysz i z 6 myszy na grupę. *P&lt;0.01.
<img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący stężenie azotynów, stosunek IL-12/IL-10 oraz analizę ekspresji białek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Makrofagi pochodzące z MCSF wykazują fenotyp klasycznie aktywowany, natomiast makrofagi pochodzące z MCSF traktowane IL-4 wykazują fenotyp makrofagów alternatywnie aktywowanych. (A) Zgodnie z fenotypem klasycznie aktywowanym, makrofagi pochodzące z MCSF produkują wyższe poziomy tlenku azotu w odpowiedzi na lipopolisacharyd, co można zmierzyć za pomocą testu Griessa, który wykrywa jego produkt metabolizmu, azotyny. Produkują one również wyższy stosunek IL-12p70/IL-10, który można zmierzyć za pomocą metody ELISA. *P&lt;0.01 dla n=3. (B) Zgodnie z fenotypem alternatywnie aktywowanym, makrofagi pochodzące z MCSF traktowane IL-4 konstytutywnie wykazują ekspresję YM1 i ArgI, co można wykryć za pomocą immunoblotingu Western. Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów o podobnych wynikach.
<img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="Wykresy słupkowe i liniowe: liczba komórek F4/80+ i Arg1+; Indeks Aktywności Choroby w czasie dla grup C, M1, M2." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Dożylnie wstrzyknięte, otrzymane ex vivo alternatywnie aktywowane makrofagi migrują do jelita grubego i redukują zapalenie jelit. Myszy drugiej generacji (F2) typu dzikiego na mieszanym tle C57BL/6 ×129Sv otrzymywały 5% DSS w wodzie pitnej przez sześć dni. Makrofagi M1 i M2 wstrzykiwano IV w dniach 0 i 4 podczas leczenia DSS. (A) Jelita grube zostały usunięte, utrwalone, a ich przekroje barwiono immunohistochemicznie w celu wykrycia dojrzałych makrofagów (F4/80) oraz markera makrofagów M2 (ArgI). Ilościowe oznaczenie makrofagów dla myszy kontrolnych wstrzykiwanych PBS (C), myszy wstrzykiwanych makrofagami M1 (+M1) i myszy wstrzykiwanych makrofagami M2 (+M2) przeprowadzono poprzez zliczanie komórek wybarwionych dodatnio przy powiększeniu 40× w 6 polach z 3 przekrojów/mysz i z 6 myszy/grupa. Zliczanie przeprowadzili dwie osoby nieznające warunków eksperymentalnych. (B) Aktywność choroby była monitorowana i oceniana codziennie podczas leczenia; jest to wynik sumaryczny oparty na utracie masy ciała, krwawieniu z odbytu i zmniejszonej konsystencji stolca. *P&lt;0.05 dla n= 6 myszy w 2 niezależnych eksperymentach.

<ol><li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+dendritic+cells%2C+macrophages%2C+and+epithelial+cells+in+the+gut%3A+implications+for+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).</li>
<li>Heinsbroek, S. E., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in inflammatory bowel diseases.</a> Expert Rev. Mol. Med. 11, e14(2009).</li>
<li>Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+putative+role+of+inflammation+in+the+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome.</a> Gut. 49, 743-745 (2001).</li>
<li>Maeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer-derived+factors+activate+NF-kappaB+in+myeloid+cells+via+TLR2+to+link+inflammation+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med.+Report%22%5BJournal%5D)">Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis.</a> Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).</li>
<li>van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes%3A+perspectives+in+research+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics.</a> J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).</li>
<li>Hunter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-derived+alternatively+activated+macrophages+reduce+colonic+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice.</a> Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).</li>
<li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP-deficient%2C+alternatively+activated+macrophages+protect+mice+during+DSS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis.</a> J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).</li>
<li>Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+colitis+by+intestinal+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).</li>
<li>Van Rooijen, N., Sanders, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+mediated+depletion+of+macrophages%3A+mechanism+of+action%2C+preparation+of+liposomes+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications.</a> J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).</li>
<li>Smith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+a+helminth+parasite+prevents+experimental+colitis+via+a+macrophage-mediated+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism.</a> J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).</li>
<li>van Rooijen, N., Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+for+specific+depletion+of+macrophages+from+organs+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).</li>
<li>Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+vitreal+macrophages+and+circulating+leukocytes+in+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).</li>
<li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages+by+IL-4+requires+SHIP+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation.</a> Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).</li>
<li>Cailhier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+macrophage+ablation+demonstrates+that+resident+macrophages+initiate+acute+peritoneal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation.</a> J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Makrofagi to komórki fagocytujące, które odgrywają istotną rolę w układzie odpornościowym. Odpowiadają one za inicjowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej oraz kierowanie nabytej odpowiedzi immunologicznej. Zazwyczaj makrofagi klasycznie aktywowane są pobudzane przez IFNγ lub LPS i odpowiadają za eliminację patogenów oraz wywołanie reakcji zapalnej1. Z kolei makrofagi alternatywnie aktywowane są pobudzane przez IL-4 lub IL-13 i uczestniczą w usuwaniu resztek komórkowych oraz przebudowie tkanek podczas ustę...

<table><tbody><tr><td>Liposomy zawierające klodronian</td><td>&lt;a href=&quot;http://Clodronateliposomes.org&quot; W tej procedurze przedstawiono metodę izolacji całkowitego RNA z tkanek roślinnych przy użyciu metody opartej na LIQC (Liquid-Phase Isothermal Concentration – izotermiczna koncentracja w fazie ciekłej). Wykorzystanie LIQC pozwala na efektywne zagęszczenie materiału genetycznego z dużych objętości roztworów, co znacząco zwiększa wydajność i czystość uzyskanego RNA, minimalizując jednocześnie ryzyko degradacji próbki. Metoda ta jest szczególnie przydatna w przypadku tkanek o wysokiej zawartości polisacharydów i polifenoli, które często utrudniają standardowe procesy ekstrakcji. Proces obejmuje homogenizację tkanki, lizie komórkową, a następnie etap koncentracji i oczyszczania RNA, zapewniając materiał wysokiej jakości do dalszych analiz, takich jak RT-qPCR lub sekwencjonowanie RNA.&quot;Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.&quot;&gt;Clodronateliposomes.org&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>liposomy zawierające PBS</td><td>&lt;a href=&quot;http://Clodronateliposomes.org&quot; cel=&quot;_puste&quot;&gt;Clodronateliposomes.org&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylny PBS pH 7,4 </td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Invitrogen</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>surowica z płodu cielęcego (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>BDH Aristar</td><td>BDH3092-500MLP</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>96-275</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi MCSF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>02951</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi GM-CSF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>02935</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-3</td><td>Stemcell Technologies</td><td>02903</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi IFN&amp;#947; </td><td>Stemcell Technologies</td><td>02746</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-4</td><td>Stemcell Technologies</td><td>02714</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do dysocjacji komórek </td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało szczurze anty-F4/80</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497GA</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko ArgI</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610708</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Użycie przeciwciała przeciwko białku p53 do wykrywania białka p53 w próbkach tkanek za pomocą immunohistochemii&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Odczynniki specyficzne wykorzystane w niniejszym protokole.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Makrofagi odgrywają kluczową rolę w nieswoistej odpowiedzi odpornościowej na zakażenia lub urazy, inicjując reakcję immunologiczną i kierując odpowiedź nabytą. Dysfunkcja makrofagów może prowadzić do niezdolności do wywołania odpowiedniej odpowiedzi immunologicznej i w związku z tym jest powiązana z wieloma procesami chorobowymi, w tym z nieswoistymi zapaleniami jelit. Makrofagi wykazują polaryzację fenotypową, którą szeroko dzieli się na dwie kategorie. Makrofagi aktywowane klasycznie, stymulowane przez IFNγ lub LPS, pełnią istotną rolę w odpowiedzi na zakażenia bakteryjne, natomiast makrofagi aktywowane alternatywnie, stymulowane przez IL-4 lub IL-13, uczestniczą w usuwaniu pozostałości komórkowych i przebudowie tkanek oraz są zaangażowane w fazę wygaszania stanu zapalnego. Podczas odpowiedzi zapalnej in vivo makrofagi znajdują się w złożonej mieszaninie naciekających komórek odpornościowych i mogą uczestniczyć w nasilaniu lub rozwiązywaniu stanu zapalnego. Aby zdefiniować rolę makrofagów in situ w modelu całego zwierzęcia, konieczne jest zbadanie efektu usunięcia makrofagów z tego złożonego środowiska. Aby postawić pytania dotyczące roli fenotypu makrofagów in situ, fenotypowo zdefiniowane makrofagi spolaryzowane można uzyskać ex vivo z aspiratów szpiku kostnego i ponownie wprowadzić do organizmów myszy, z wcześniejszym usunięciem makrofagów lub bez niego. W przedstawionym tutaj protokole zastosowano liposomy zawierające klodronian, w przeciwieństwie do kontroli wstrzykiwanych PBS, w celu usunięcia makrofagów okrężniczych podczas wywołanego dekstranem siarczanem sodu (DSS) zapalenia jelita grubego u myszy. Dodatkowo, makrofagi spolaryzowane uzyskano ex vivo i przeniesiono do myszy za pomocą wstrzyknięcia dożylnego. Ograniczeniem tego podejścia jest fakt, że liposomy zawierające klodronian usuwają wszystkie profesjonalne fagocyty, w tym zarówno komórki dendrytyczne, jak i makrofagi, dlatego aby upewnić się, że efekt zaobserwowany po deplecji jest specyficzny dla makrofagów, konieczna jest rekonstrukcja fenotypu poprzez adoptywny transfer makrofagów. Systemowe usuwanie makrofagów u myszy można również osiągnąć poprzez krzyżowanie zwrotne myszy na tło CD11b-DTR, co stanowi doskonałe podejście komplementarne. Zaletą deplecji za pomocą liposomów zawierających klodronian jest to, że nie wymaga ona czasu i nakładów finansowych związanych z krzyżowaniem zwrotnym myszy i może być stosowana u myszy niezależnie od ich tła genetycznego (C57BL/6, BALB/c lub tło mieszane).

Makrofagi odgrywają centralną rolę w homeostazie i patologii wielu tkanek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metody usuwania makrofagów in vivo, otrzymywania spolaryzowanych makrofagów z aspiratów szpiku kostnego oraz adoptywnego transferu makrofagów do myszy. Techniki te pozwalają na określenie roli, jaką spolaryzowane makrofagi odgrywają w zdrowiu i chorobie.

Wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

Makrofagi odgrywają kluczową rolę w nieswoistej odpowiedzi immunologicznej na zakażenia lub urazy, inicjując tę odpowiedź i kierując...

Celem poniższego eksperymentu jest określenie roli spolaryzowanych makrofagów w procesie biologicznym in vivo. Osiąga się to poprzez wstępne usunięcie makrofagów u myszy, a następnie wygenerowanie nowych makrofagów, które wykazują unikalne cechy i pełnią odrębne funkcje.Następnie spolaryzowane makrofagi są przenoszone adoptywnie do myszy, aby określić ich rolę w badanym procesie biologicznym. Ostatecznie można zmierzyć różnice w zapaleniu pośredniczonym przez makrofagi na podstawie obrazu klinicznego i histologicznego choroby. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak krzyżowanie myszy na tło CD 11 BDTR, jest to, że metoda ta jest szybsza niż hodowla myszy.Do eksperymentów. Metoda ta jest stosunkowo prosta i kosztowo efektywna i może być przeprowadzana na myszach o dowolnym tle genetycznym. Chociaż metoda ta pozwala uzyskać wgląd w rolę makrofagów w jelitach, można ją zastosować również w przypadku wielu innych narządów, w tym wątroby, śledziony i płuc.Na dwie godziny przed wstrzyknięciem wyjąć probówki z liposomami i PBS z przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy liposomy osiągną temperaturę pokojową, odwrócić probówki od 8 do

depletion-and-reconstitution-of-macrophages-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wyczerpanie i odnowienie makrofagów u myszy

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.

Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Prezentujemy metody oceny zdolności fagocytarnej pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny i wewnątrzkomórkowego barwienia kropelkami lipidów.

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Ilustrujemy prostą metodę pozyskiwania mysich pierwotnych makrofagów z komórek szpiku kostnego oraz prostą metodę przygotowania koniugatów BSA-kwasów tłuszczowych. Następnie wykazujemy, że nasycone kwasy tłuszczowe mogą indukować śmierć komórek makrofagów, a taka śmierć komórki jest pozytywnie związana z akumulacją komórek poziomu ceramidów.

Nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów związaną z ceramidami

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

To badanie demonstruje użycie cytometrii przepływowej do wykrywania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) wynikającej z aktywacji FcγR. Metoda ta może być stosowana do oceny zmian w funkcji sygnalizacji przeciwdrobnoustrojowej i redoks fagocytów w odpowiedzi na kompleksy immunologiczne, opsonizowane mikroorganizmy lub bezpośrednie sieciowanie FcγR.

Pomiar cytometryczny przepływu produkcji ROS w makrofagach w odpowiedzi na sieciowanie FcγR

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Poznaj metodę zubożenia i rekonstytucji makrofagów u myszy w badaniach immunologicznych. Technika ta umożliwia szybsze niż tradycyjne krzyżowanie badanie roli spolaryzowanych makrofagów w zapaleniu i chorobach.

Wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

Przeglądaj więcej filmów