Name: Wysokoprzepustowe oczyszczanie białek rekombinowanych znakowanych powinowactwem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę oczyszczania białek His-tagged z E. coli przy użyciu robotyki laboratoryjnej. Technika zapewnia wysoką powtarzalność i minimalizuje błąd ludzki w biochemicznej analizie białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu Wellcome Project Grant (078043/Z/05/Z) przyznanego R.O.J.W.

CZĘŚĆ A: Wysokoprzepustowa hodowla kultur bakteryjnych.
1. Hodowla bakterii przez noc w 2 ml pożywki autoindukcyjnej z użyciem płytek 24-dołkowych
<ol>
 <li>Sterylizuj płytki 24-dołkowe w mikrofalówce.</li>
 <li>Zaszczep 1,5 ml pożywki do autoindukcji (Overnight Express Medium) świeżo wyhodowanymi koloniami bakterii lub zamrożonymi stokami w glicerolu. Zwyczajowo szczepimy trzy dołki na jeden mutant, używając trzech oddzielnych sklonowanych kolonii. Zarezerwuj sześć dołków na kontrole pozytywne i negatywne. Dla kontroli pozytywnych hodujemy trzy klony typu dzikiego, a dla kontroli negatywnych dwa klony transformowane nieekspresyjnym plazmidem. Aby sprawdzić skuteczność sterylizacji płytki, pozostaw jeden dołek pusty jako kontrolę zawierającą samą pożywkę.</li>
 <li>Hoduj komórki przez 18 hr w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm. Używamy komórek BL21 (DE3) Rosetta 2 indukowalnych laktozą. Pożywka do autoindukcji zawiera mieszaninę glukozy i laktozy. Bakterie początkowo wykorzystują glukozę, a następnie zaczynają zużywać laktozę, która jednocześnie indukuje ekspresję białek rekombinowanych.</li>
 <li>Zdejmij pokrywkę i umieść płytkę na platformie robotycznej.</li>
</ol>
CZĘŚĆ B: Robotyczna puryfikacja białek rekombinowanych.
2. Przygotowanie platformy robotycznej
<ol>
 <li>Przygotować bufor do płukania składający się z 20 mM imidazolu, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM octanu Trisu, pH 7,9, 10 mM MgOAc2, 0,7 mM ZnOAc2, 10% glicerolu oraz bufor do elucji składający się z 0,5 M imidazolu, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM octanu Trisu, pH 7,9, 10 mM MgOAc2, 0,7 mM ZnOAc2, 10% glicerolu. Bufory te będą odpowiednio wykorzystywane do płukania kulek po związaniu z nimi białek z tagiem lub do elucji białek z kulek.</li>
 <li>Przygotować rozcieńczalnik bakteryjny (100 ml wody destylowanej z 15 μl odczynu odpieniającego). Roztwór ten będzie służył do rozcieńczania nocnych kultur bakterii w celu pomiaru gęstości optycznej (A600). Obecność środka odpieniającego w rozcieńczalniku zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza, które zakłócałyby pomiary w czytniku płytek.</li>
 <li>Przygotować roztwór do lizy składający się z 10x odczynnika FastBreak, 2 μl lyzonazy na próbkę i 15 mM MgOAc2. FastBreak zawiera mieszankę detergentów i soli, które rozbijają ściany komórkowe bakterii i ułatwiają uwalnianie białek wewnątrzkomórkowych. Lysonaza jest zastrzeżoną mieszaniną lizozymu i nukleazy. Lizozym wspomaga rozrywanie ściany komórkowej, a nukleaza trawi uwolnione kwasy nukleinowe bakterii.</li>
 <li>Opcjonalnie: Przygotować 6 M roztwór chlorku guanydyny. Niektóre białka rekombinowane mają tendencję do przylegania do igieł pipetujących powlekanych teflonem. Roztwór chlorku guanydyny denaturuje białka i usuwa je skuteczniej niż woda, która jest rutynowo stosowana do płukania zmywalnych końcówek pipetujących robota po każdym kroku.</li>
 <li>Przygotować odczynik do ilościowego oznaczania białek BCA (kwasu bicinchoniningowego) poprzez zmieszanie roztworu kwasu bicinchoniningowego (odczynnik A) i roztworu siarczanu miedzi (odczynnik B): Wiązania peptydowe redukują Cu2+ z komponentu CuSO4 obecnego w odczynniku BCA do Cu1+, przy czym ilość Cu1+ jest proporcjonalna do liczby wiązań peptydowych obecnych w roztworze. W drugim kroku dwie cząsteczki kwasu bicinchoniningowego chelatują Cu1+, co powoduje przesunięcie absorbancji do 562 nm i nadaje roztworowi fioletowy kolor. Reakcja barwna jest zależna od czasu i zazwyczaj wymaga kilku godzin, aby stać się definitywna. Po tym czasie kolor pozostaje stabilny przez kilka godzin.</li>
 <li>Napełnić korytka lub płytki o odpowiedniej wielkości i umieścić je w przypisanych pozycjach na platformie robotycznej.</li>
 <li>Umieścić w odpowiednich pozycjach na platformie jedną płytkę 24-dołkową na odpady chlorku guanydyny, dwie przezroczyste płytki 96-dołkowe do pomiarów OD600 i absorbancji oraz jedną niebieską płytkę 96-dołkową na oczyszczone białka. Umieścić jedną płytkę 96-głębokodołkową na statywie magnetycznym.</li>
 <li>Rozcieńczyć 5-krotnie w wodzie destylowanej cząsteczki MagneHis Ni, które wiążą białka poprzez tworzenie chelatów z ich tagami His, i przelać je do jednostki mieszającej kuleczki. Włączyć mieszadło, aby utrzymać kuleczki w zawiesinie.</li>
 <li>Włączyć platformę robotyczną i płukać igły pipetujące przez kilka minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które w przeciwnym razie wpływałyby na dokładność pipetowania. Wielorazowe igły pipetujące są płukane pomiędzy poszczególnymi krokami pipetowania. Alternatywnie można zastosować jednorazowe końcówki. Wszystkie kolejne kroki są wykonywane robotycznie. Protokół robotyczny jest dostępny na żądanie.</li>
</ol>
3. Kontrola wzrostu komórek poprzez pomiar OD600
<ol>
 <li>10 μl hodowli nocnej rozcieńcza się w 90 μl roztworu rozcieńczającego.</li>
 <li>Zmierz OD600, aby upewnić się, że bakterie osiągnęły podobną gęstość (Rysunek 1).</li>
</ol>
4. Rozbicie komórek w celu uwolnienia białek i umożliwienia wiązania z kuleczkami
<ol>
 <li>Do każdego dołka drugiej płytki 24-dołkowej nanosi się 100 μl zawiesiny magnetycznych kulek niklowych (Ni-beads).</li>
 <li>Do płytki 24-dołkowej zawierającej kulki przenosi się 900 μl każdej z małoscale'owych kultur bakteryjnych. Następnie dodaje się 100 μl mieszaniny 10x FastBreak/lysonase.</li>
 <li>Płytkę 24-dołkową przenosi się na platformę wytrząsową w celu intensywnego mieszania (800 rpm) przez 30 min w temperaturze pokojowej. Ściany komórkowe bakterii zostają rozbite poprzez kombinację sił mechanicznych i działania chemicznego, a rekombinacyjnie produkowane białka zostają uwolnione do roztworu. Dzięki znacznikom powinowactwa natychmiast wiążą one paramagnetyczne chelujące kulki niklowe.</li>
</ol>
5. Płukanie kulek
<ol>
 <li>Lizaty komórkowe zawierające resuspendowane kuleczki magnetyczne przenosi się do płytki 96-dołkowej typu deep-well, umieszczonej na statywie z prętami magnetycznymi, które wsuwają się pomiędzy dołki. Płytki 96-dołkowe posiadają kwadratowe dno w kształcie stożka, co ułatwia usuwanie nadsączu. Dołki mogą pomieścić objętości do 2,1 ml, lecz są wypełniane znacznie mniejszymi objętościami. Pozwala to na przeprowadzenie etapów intensywnego mieszania bez ryzyka kontaminacji krzyżowej próbek poprzez rozpryskiwanie.</li>
 <li>Końcówki pipet są płukane pomiędzy poszczególnymi krokami pipetowania 6 M guanidyną-HCl. Krok ten jest kluczowy dla oczyszczania białka TFIIB oraz innych białek „lepkich” w celu uniknięcia kontaminacji krzyżowej. W przypadku innych białek wystarczy obfite płukanie igieł wodą pomiędzy etapami pipetowania.</li>
 <li>Pręty magnetyczne statywu przyciągają kuleczki paramagnetyczne, odciągając je od centrów dołków i zapewniając igłom pipetujący swobodny dostęp do nadsączu. Nadsącz zostaje usunięty.</li>
 <li>Najpierw do płytki 24-dołkowej dodaje się 500 μl buforu do płukania, a następnie przenosi go do płytki 96-dołkowej, aby zapewnić całkowity transfer kuleczek. Płytkę 24-dołkową zdejmuje się z wytrząsarki.</li>
 <li>Kolejne 500 μl buforu do płukania dodaje się bezpośrednio do płytki 96-dołkowej, następnie płytkę przenosi się na wytrząsarkę i intensywnie miesza przez 1 min. Płytkę przenosi się z powrotem na statyw magnetyczny i usuwa bufor do płukania.</li>
 <li>Krok ten powtarza się dwukrotnie, a procedurę płukania kończy się poprzez usunięcie wszelkich pozostałości buforu z płytki.</li>
</ol>
6. Elucja białek w buforze elucyjnym
<ol>
 <li>Do kulek dodaje się 100 μl buforu elucyjnego, a następnie płytkę przenosi się na wytrząsarkę i intensywnie wytrząsa przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Płytkę przenosi się z powrotem na wytrząsarkę, a eluat zawierający oczyszczone białko rekombinowane przenosi się do nowej płytki.</li>
</ol>
7. Pomiar stężeń oczyszczonych białek
<ol>
 <li>190 μl mieszaniny odczynnika BCA przenosi się do przezroczystej płytki 96-dołkowej i dodaje 10 μl roztworu białka.</li>
 <li>Po kilku godzinach inkubacji (zazwyczaj 5-6 lub przez noc), mierzy się absorbancję i porównuje ją ze standardami BSA, aby określić stężenia każdego z oczyszczonych preparatów białek (Rysunek 2).</li>
 <li>Oczyszczone białka mogą teraz zostać wykorzystane w dalszych zastosowaniach w odpowiednich stężeniach (Rysunek 3).</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Protokół oczyszczania obejmuje dwa etapy kontroli jakości, których przykłady zostały przedstawione. Jesteśmy w stanie zidentyfikować i udokumentować potencjalne problemy na etapie wzrostu bakterii (Rycina 1) oraz później, podczas oceny wydajności oczyszczania białek (Rycina 2). Zazwyczaj oczyszczamy białka i testujemy je w trzech powtórzeniach. To, w połączeniu z dwoma krokami kontroli jakości, daje nam pewność, że wszelkie obserwowane zmienności w testach funkcjonalnych wynikają z fenotypu mutantów (Rycina 3), a nie z błędów eksperymentalnych lub nieudanych procesów oczyszczania. Uzyskane wydajności zazwyczaj mieszczą się w zakresie 50-200 μg i są w pełni wystarczające dla różnych testów funkcjonalnych.
<img alt="Efekt substytucji reszt A81-C91 mjTFIIB; wykres słupkowy; pomiar OD600; sekwencje eukariotyczne." src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Histogram pomiarów OD w płytce 24-dołkowej z kulturami nocnymi. Hodowano trzy klony sześciu wariantów mutantów TFIIB oraz TFIIB typu dzikiego. Jako kontrole negatywne posłużyły dwa klony zawierające nieekspresyjny plazmid oraz dołek zawierający samą pożywkę. Pomiary OD wykazują niewielkie różnice w tempach wzrostu pomiędzy poszczególnymi kulturami.
<img alt="Stężenie białka; wykres słupkowy; żel SDS-PAGE; elektroforeza; analiza białek; dane badawcze." src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Wydajność białka uzyskana z tych kultur, określona za pomocą testu BCA i potwierdzona metodą SDS-PAGE. Jeden z wariantów nie jest wyrażany na wysokim poziomie. W połączeniu z Rysunkiem 1 można wywnioskować, że nie wynikało to z różnic w tempie wzrostu komórek, lecz z faktu, że ekspresja białka nie została prawidłowo indukowana.
<img alt="Wpływ podstawienia aminokwasów na aktywność białka; wykres słupkowy, poniżej wyniki elektroforezy żelowej." src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Reprezentatywny wynik analizy transkrypcyjnej. Zmierzono aktywność stymulującą wariantów TFIIB w produkcji krótkich transkryptów abortywnych przez RNAP. Przedstawiono tutaj efekty stymulacji dla pełnej biblioteki pojedynczych podstawień aminokwasowych w pozycji K87 TFIIB. Wysoki stopień powtarzalności potwierdzają niskie wartości błędów. Poniżej przedstawiono przykładowy żel obrazujący wydajność trzech mutantów w porównaniu z typem dzikim (wt), kontrolami negatywnymi (NC) oraz kontrolami zawierającymi wyłącznie bufor elucyjny.

<ol><li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+polymerase+factory%3A+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li>
<li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40(2008).</li>
<li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li>
<li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+Function+of+TFIIB%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li>
<li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li>
<li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li>
<li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li>
<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li>
<li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li>
<li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj zautomatyzowana metoda oczyszczania białek rekombinowanych umożliwia produkcję i oczyszczanie licznych białek mutantów w małej skali, w wysoce powtarzalnych warunkach i przy minimalnej ingerencji człowieka. Rysunki 1 i 2 przedstawiają wyniki systematycznej kontroli jakości oraz przykłady oczyszczonych białek. Rysunek 3 wykazuje, że oczyszczone czynniki transkrypcyjne wykorzystane w tym przykładzie wykazują wysoką powtarzalność w testach funkcjonalnych.
Mimo że procedura została opracowana w celu oczyszczania archaeal TFIIB, ma ona szerokie zastosowanie w oczyszczaniu białek z znacznikami powinowactwa. Wykorzystanie takich zautomatyzowanych protokołów oczyszczania znacznie ułatwi analizę biochemiczną białek rekombinowanych i przyczyni się do pogłębienia wiedzy na temat oddziaływań białko-białko w skali trudnej do osiągnięcia przy manualnym wykonywaniu tych procesów.

<table><tbody><tr><td>Pożywka Overnight Express Instant TB Medium</td><td>Merck Chemicals Ltd</td><td>71491-4</td><td></td></tr><tr><td>FastBreak</td><td>Promega Ltd.</td><td>V8573</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do bioprocesingu Lysonase/ 1 ml </td><td>Merck Chemicals Ltd</td><td>71230</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam 204</td><td>Sigma-Aldrich Company Ltd</td><td>A6426</td><td></td></tr><tr><td>Cząstki MagneHis Ni-Particles</td><td>Promega</td><td>V8565</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich Company Ltd</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich Company Ltd.</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek kwasem bicinchoninowym (BCA)</td><td>Sigma-Aldrich Company Ltd</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Płyta głębok 것owa (deep well plate) 2,2 ml, dołki kwadratowe, PP, op. 10 szt.</td><td>Anachem Ltd</td><td>1810-00</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka MicroWell 96-dołkowa, płaskie dno, polistyren niepowlekany, 12 opakowań po 5 płytek, przezroczyste, objętość dołka 0,4 ml, 128 mm x 86 mm, Thermo Scientific Nunc</td><td>Fisher Scientific Ltd.</td><td>DIS-984-090M</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka Blue</td><td>VWR</td><td>NUNC367001</td><td></td></tr><tr><td>Bloki 24-dołkowe RB (24)</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>VWR</td><td>ALFAA13543.0B</td><td></td></tr><tr><td>Igła zmywalna do systemu TheOnyx</td><td>Aviso GmbH</td><td>8152-317001</td><td></td></tr><tr><td>Statyw na odczynniki do kulek magnetycznych</td><td>Aviso GmbH</td><td>8152-035003</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>4200-000043</td><td></td></tr><tr><td>Platforma robotyczna TheOnyx 44OH/150/100</td><td>Aviso GmbH</td><td>8145-050046</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka do mikropłytek Variomag Teleshaker</td><td>Inheco</td><td>3800047</td><td></td></tr><tr><td>Magnes do płytek 96-dołkowych typ A</td><td>Qiagen</td><td>36915</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Krystalografia rentgenowska jest preferowaną metodą uzyskiwania szczegółowego obrazu struktury białek. Badania te muszą być uzupełnione o dalsze analizy biochemiczne w celu uzyskania szczegółowego wglądu w zależności między strukturą a funkcją. Postępy w technologii syntezy oligonukleotydów i genów sprawiają, że wielkoskalowe strategie mutagenezy stają się coraz bardziej wykonalne, w tym zastępowanie reszt docelowych wszystkimi 19 pozostałymi aminokwasami. Fenotypy związane z nabyciem lub utratą funkcji pozwalają wówczas na wyciągnięcie systematycznych wniosków, takich jak wkład konkretnych reszt w aktywność katalityczną, stabilność białka i/lub specyficzność oddziaływań białko-białko.
Aby przypisać różne fenotypy naturze mutacji, a nie wahaniom warunków eksperymentalnych, kluczowe jest oczyszczanie i analiza białek w sposób kontrolowany i powtarzalny. Strategie wysokoprzepustowe oraz automatyzacja protokołów manualnych na robotycznych platformach do obsługi cieczy stworzyły możliwości przeprowadzania tak złożonych procedur biologii molekularnej przy niewielkiej interwencji człowieka i minimalnym poziomie błędów1-5.
Przedstawiamy tutaj ogólną metodę wysokoprzepustowego oczyszczania białek rekombinowanych z tagiem His. W niedawnym badaniu zastosowaliśmy tę metodę do szczegółowego badania zależności struktura-funkcja TFIIB, komponentu podstawowego aparatu transkrypcyjnego. TFIIB jest niezbędny do transkrypcji kierowanej promotorem in vitro oraz kluczowy dla rekrutacji polimerazy RNA do kompleksu preinicjacyjnego6-8. TFIIB zawiera elastyczną domenę łącznika, która wnika w szczelinę centrum aktywnego polimerazy RNA9-11. Domena łącznika ta nadaje TFIIB dwie biochemicznie mierzalne aktywności, mianowicie (i) stymulację aktywności katalitycznej podczas „abortywnego” etapu inicjacji transkrypcji oraz (ii) dodatkowy wkład w specyficzną rekrutację polimerazy RNA do kompleksu preinicjacyjnego4,5,12. Wykorzystaliśmy metodę wysokoprzepustowego oczyszczania do wytworzenia pojedynczych, podwójnych i potrójnych mutacji substytucyjnych oraz delecji w łączniku TFIIB, a następnie poddaliśmy je analizie w testach funkcjonalnych w celu zbadania ich efektu stymulującego na aktywność katalityczną polimerazy RNA4. Łącznie wytworzyliśmy, oczyściliśmy i przeanalizowaliśmy 381 mutantów – zadanie, którego wykonanie ręczne byłoby czasochłonne i żmudne. Białka otrzymano i przebadano w powtórzeniach, co pozwoliło nam ocenić wszelkie wariacje eksperymentalne i dało jasny obraz powtarzalności naszych wyników.
Niniejsza metoda służy jako ogólny protokół oczyszczania białek z dodatkiem znacznika His i została z sukcesem zastosowana do oczyszczania innych białek rekombinowanych. Obecnie jest zoptymalizowana pod kątem oczyszczania 24 białek, lecz może zostać dostosowana do oczyszczania do 96 białek.

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Krystalografia rentgenowska jest preferowaną metodą uzyskiwania szczegółowego obrazu struktury białek. Badania te muszą być uzupełnione o dalsze...

Celem niniejszej procedury jest wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z tagiem histydynowym przy użyciu zautomatyzowanego protokołu na platformie robotycznej. Osiąga się to poprzez nadmierną ekspresję białek w e coli z wykorzystaniem kultur o małej objętości. Następnie komórki są poddawane lizie chemicznej w celu uwolnienia białek, które następnie wiążą się z magnetycznymi kulkami niklowymi.Następnie kulki są płukane w celu usunięcia zanieczyszczających białek i zwiększenia czystości pożądanych białek. Na koniec białka są oczyszczane z kulek magnetycznych. Ostatecznie można uzyskać wyniki wskazujące na stężenie i czystość białek poprzez testy BCA i elektroforezę SDS-PAGE, a także dodatkowe testy funkcjonalne w celu określenia aktywności białek.Główną zaletą tej techniki jest możliwość oczyszczenia dużej liczby białek w identycznych warunkach przy minimalnej interwencji. Pozwala to na uzyskanie wysokiego stopnia powtarzalności i minimalizuje ryzyko błędów ludzkich. Metoda ta jest szczególnie przydatna przy badaniu dużej liczby mutantów punktowych konkretnego białka, ponieważ daje pewność, że zmienność jego aktywności wynika rzeczywiście z mutacji, a nie z różnic w przygotowaniu próbek.Aby przygotować nocne hodowle bakteryjne, należy najpierw napełnić płytki 24-dołkowe wodą i podgrzewać je w kuchence mikrofalowej przez dwie minuty w celu sterylizacji. Odlać wodę i ponownie podgrzewać płytki przez dwie minuty w kuchence mikrofalowej. Następnie, używając świeżo wyhodowanych kolonii bakterii BL 21 Rosetta 2 w wersji nieindukowalnej lub zamrożonych stoków glicerolowych, zaszczepić 1,5 ml podłoża autoindukcyjnego zawierającego mieszaninę glukozy i laktozy. Zarezerwować po trzy dołki dla kontroli pozytywnej i negatywnej oraz jeden dołek jako kontrolę zawierającą samo podłoże.Hoduj komórki przy 250 RPM przez 18 godzin w temperaturze 37 °C. Zdejmij pokrywkę i umieść płytkę na platformie robotycznej. Platforma wyposażona jest w ramię chwytające do przenoszenia obiektów z jednej pozycji do drugiej, ramię pipetujące oraz różne pozycje dla płytek i korytek, w tym platformę wytrząsową, mieszadło z kulkami magnetycznymi oraz platformę magnetyczną.W przypadku płytek 96-dołkowych należy przygotować bufory do płukania i rozcieńczania na potrzeby procedury oczyszczania zgodnie z protokołem pisemnym, wykorzystując 100 mililitrów wody destylowanej oraz 15 mikrolitrów odczynnika przeciwpiennego. Należy przygotować roztwór do rozcieńczania kultur inkubowanych przez noc w celu pomiaru gęstości optycznej. Należy sporządzić roztwór do lizy zawierający odczynnik lyase fast break oraz octan magnezu oraz przygotować roztwór do analizy białek metodą BCA.Ponieważ TF dwa B ma tendencję do przyklejania się do końcówek pipetujących, należy przygotować roztwór chlorku guanidyny o stężeniu sześć M do ich przemywania. Napełnić korytka lub płytki o odpowiednim rozmiarze właściwymi buforami i umieścić je w wyznaczonych pozycjach na platformie robotycznej. Umieścić jedną płytkę 24-dołkową na odpady chlorku guanidyny, dwie przezroczyste płytki 96-dołkowe do pomiarów OD 600 i absorbancji oraz jedną niebieską płytkę 96-dołkową dla oczyszczonych białek.Umieść jedną płytkę 96-dołkową z głębokimi dołkami na statywie magnetycznym. Użyj wody do rozcieńczenia niklowych cząstek magna hair i dodaj je do urządzenia do mieszania kulek. Włącz mieszanie, aby utrzymać kulki w zawiesinie.Włącz platformę robotyczną i płucz igły pipetujące przez kilka minut. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieść płytkę na platformie wytrząsającej w celu sprawdzenia wzrostu nocnych kultur komórkowych. Rozcieńcz 10 µL kultury w 90 µL roztworu rozcieńczającego, płucząc pipety pomiędzy kolejnymi dodaniami.Następnie zmierz gęstość przy OD 600, gdy hodowle osiągną podobną gęstość. Przenieś 100 µL zawiesiny magnetycznych kulek niklowych do studzienek płytki 24-dołkowej, a następnie przenieś 900 µL każdej hodowli do studzienek, myjąc pipety pomiędzy poszczególnymi krokami. Następnie dodaj 100 µL mieszaniny Fast Break Lyase.Umieść płytkę na platformie wytrząsowej przy 800 RPM przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić lizę komórek i wiązanie białek z tagiem His do kulek w celu ich przemycia. Przenieś je do płytki 96-dołkowej na stojaku z prętami magnetycznymi, które odciągają kulki od środków dołków, odlej nadsącz i użyj sześciu mo iGuide hydrochloride do przemycia końcówek pipet. Następnie dodaj 500 µL buforu piorącego do dołków 24.Płytka do analiz oraz przeniesienie próbek do płytki 96-dołkowej. Następnie usunąć nadlew. Dodać 500 µL buforu myjącego do 96-dołkowej płytki.Płytka do mikroprób. Przenieś płytkę na potrząsarkę i intensywnie wstrząsaj przez jedną minutę. Następnie przenieś płytkę z powrotem na statyw magnetyczny i usuń bufor płuczący.Po ostatnim przemyciu do kulek należy dodać 100 µL buforu elucyjnego i intensywnie wstrząsać przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie eluat należy przenieść na nową płytkę. W celu ilościowego oznaczenia próbek białek do dołków przezroczystej płytki 96-dołkowej należy dodać 190 µL odczynnika BCA, a następnie dodać do dołków 10 µL próbek białek.Próbki inkubować przez co najmniej pięć godzin i zmierzyć absorbancję przy użyciu zestawu wzorców BSA. Następnie białka przechowywać w temperaturze -80 °C. Protokół oczyszczania przewiduje dwa etapy kontroli jakości.Najpierw na etapie wzrostu bakterii, a później podczas oceny wydajności białek. Dzięki oczyszczaniu białek w trzech powtórzeniach można ustalić, że wszelkie różnice w testach funkcjonalnych wynikają z fenotypów mutantów, a nie z różnic eksperymentalnych lub nieudanych oczyszczeń. Wydajność zazwyczaj mieści się w zakresie od 50 do 200 mikrogramów, co jest w pełni wystarczające do przeprowadzenia testów funkcjonalnych. Po opanowaniu techniki cały proces zajmuje około trzech godzin i poza przygotowaniem platformy, zaszczepieniem kultur i późniejszym odzyskanym oczyszczonych białek, nie wymaga żadnych dodatkowych działań.Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać testy funkcjonalne. W naszym przypadku będą to szereg analiz transkrypcji w celu zbadania, w jaki sposób mutacja TF dwa B zmienia jej wpływ na aktywność katalityczną polimerazy ar.

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokowydajne oczyszczanie rekombinowanych białek z metką afinicyjną

Opracowano i szczegółowo opisano nowatorski i wysoce wydajny dwuetapowy protokół chromatografii powinowactwa. Metoda ta opiera się na niewielkim znaczniku oczyszczającym o dwóch wrodzonych powinowactwach i jest możliwa do zastosowania w odniesieniu do szerokiego zakresu białek docelowych o różnych właściwościach.<br...

Ortogonalne oczyszczanie białek wspomagane przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą...

 Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii powinowactwa niklu do oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną z bakterii Clostridium difficile.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

W obecnym protokole demonstrujemy wysoce efektywną i opłacalną metodę oczyszczania białek na małą skalę, która pozwala na oczyszczanie rekombinowanych białek poprzez unikalne połączenie rozszczepialnego znacznika GST i małego znacznika His.

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Protokół ilościowego, wysokoprzepustowego badania ekspresji i analitycznego oczyszczania białek fuzyjnych z małych kultur Escherichia coli jest opisany i zastosowany do ekspresji bogatych w dwusiarczki białek jadu zwierzęcego.

Wysokoprzepustowe ilościowe badania przesiewowe i oczyszczanie stosowane do rekombinowanych, bogatych w dwusiarczki białek jadowych wytwarzanych w E. coli

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Adapter do płytek wielokolumnowych pozwala na połączenie kolumn chromatograficznych z wielodołkowymi płytkami do równoległego powinowactwa lub oczyszczania jonowymiennego, zapewniając ekonomiczną metodę oczyszczania białek o wysokiej przepustowości. Może być stosowany w warunkach grawitacji lub próżni, uzyskując miligramowe ilości białka za pomocą niedrogiego oprzyrządowania.

Ekonomiczny i wszechstronny wysokowydajny system oczyszczania białek za pomocą wielokolumnowego adaptera płytowego

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Poznaj zautomatyzowaną metodę oczyszczania białek His-tagged z E. coli przy użyciu robotyki laboratoryjnej. Technika zapewnia wysoką powtarzalność i minimalizuje błąd ludzki w biochemicznej analizie białek.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Przeglądaj więcej filmów