Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Celem niniejszego filmu jest opis procedury charakteryzacji przejścia przepuszczalności mitochondrialnej. Słabe otwarcie w mitochondriach wyizolowanych z serca myszy. W pierwszej kolejności mitochondria są izolowane z serc myszy.

Przy zastosowaniu metody wirowania różnicowego oceniono następnie jakość wyizolowanych mitochondriów, wykorzystując elektrodę tlenową typu oxy thermal podłączoną do komputera w celu pomiaru współczynnika kontroli oddychania oraz oceny integralności błony mitochondrialnej. Następnie, z wykorzystaniem aparatury spektrofluorometrycznej, przeprowadzono jednoczesny pomiar gospodarki wapniowej, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów, aby określić otwarcie porów przejścia przepuszczalności.

Otrzymane dane wykazały różnice w zdolności do zatrzymywania wapnia oraz w mitochondrialnym przejściu przepuszczalności. Słaba wrażliwość izolowanych mitochondriów oraz otwarcie poru mitochondrialnego przejścia przepuszczalności to złożone zjawiska obejmujące zmiany na kilku poziomach fizjologii i anatomii mitochondriów.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że jednoczesny pomiar wielu parametrów daje bardziej kompleksowy obraz zjawiska niż pomiar samych poszczególnych parametrów, takich jak poziom wapnia, mobilizacja czy pęcznienie. Przed rozpoczęciem procedury rozmrozić bufor do izolacji mitochondriów i sprawdzić pH, które powinno wynosić 7.4. Następnie umieścić na lodzie wszystkie bufory, szalki i probówki, które będą wykorzystywane. Należy pamiętać, że wszystkie etapy protokołu izolacji mitochondriów muszą być wykonywane na lodzie.

Umieść serca uśpionych myszy na szalce Petriego i wypłucz krew, używając zimnego buforu do izolacji mitochondriów. Następnie przenieś serca do nowej szalki Petriego za pomocą skalpela, usuń tkankę tłuszczową oraz przedsionki, a następnie posiekaj serca, aż do uzyskania homogenicznego produktu.

Przenieść posiekane serca do stożkowatej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodać 10 mililitrów buforu do izolacji mitochondriów z dodatkiem 0,1 miligrama na mililitr trypsyny i pozostawić próbkę do trawienia na lodzie przez 10 minut. Należy pamiętać, że zastosowanie trypsyny zwiększa wydajność izolacji mitochondriów i powinno być utrzymywane na stałym poziomie pomiędzy poszczególnymi preparacjami mitochondrialnymi.

Zalecamy jednak sprawdzenie funkcjonalności wyizolowanych mitochondriów na preparatach otrzymanych bez użycia trypsyny, aby upewnić się, że enzym ten nie zakłóca ich funkcji. Po inkubacji należy dodać 10 ml buforu do izolacji mitochondriów zawierającego 0,1% BSA bez kwasów tłuszczowych oraz pięć mg inhibitora trypsyny, a następnie wymieszać, kilkukrotnie odwracając probówkę. Aby zneutralizować trypsynę, należy odzyskać strawioną tkankę poprzez wirowanie przy niskiej lub średniej prędkości przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsius.

Po wirowaniu resuspendeć tkankę w 8 ml buforu do izolacji mitochondriów z dodatkiem 0,1% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych, utrzymując próbkę w lodzie. Użyć zautomatyzowanego homogenizatora z teflonowym tłuczkiem, aby zhomogenizować próbkę, wykonując od czterech do sześciu przejść przy prędkości od 1200 do 1400 obr./min. Przenieść homogenat do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 800 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Aby odwirować jądra komórkowe i resztki tkankowe. Po wirowaniu przenieść nadsącz zawierający mitochondria do probówek do mikrocentryfugi i wirować je z prędkością 8,000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu na powierzchni osadu pojawi się biała warstwa.

Użyj systemu próżniowego, aby ostrożnie odessać i usunąć białą warstwę znajdującą się nad osadem mitochondrialnym. Następnie ponownie zawieś pozostały, ciemniejszy osad zawierający mitochondria w 1 ml buforu do izolacji mitochondriów.

Następnie odwiruj mitochondria przy 8 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odlej nadsącz i resuspenduj osad mitochondrialny w 150 µL buforu do izolacji mitochondriów; przechowuj mitochondria w lodzie.

Oddychanie wyizolowanych mitochondriów mierzy się za pomocą termicznej elektrody tlenowej podłączonej do komputera i sterowanej oprogramowaniem oxy. The plus; elektrodę tlenową należy skalibrować w dniu przeprowadzenia eksperymentu. Do komory oxy należy dodać 2 mL buforu do oddychania mitochondriów zawierającego końcowe stężenie 1 µM rotenonu, szczelnie zamknąć komorę i rozpocząć rejestrację sygnału tlenowego.

Sygnał rejestrowany przez system i wyświetlany na ekranie komputera jest proporcjonalny do stężenia tlenu w komorze oxy therm. Po ustabilizowaniu się sygnału tlenowego należy dodać 250 µg mitochondriów i rejestrować oddychanie podstawowe przez jedną minutę. Oddychanie w tym momencie powinno być bardzo niskie, ponieważ mitochondria oddychają na substratach endogennych.

Jest to oddychanie w stanie 1. Należy dodać bursztynian do stężenia końcowego 5 mM, aby zainicjować oddychanie mitochondrialne w kompleksie II, a następnie rejestrować sygnał przez jedną minutę. Zużycie tlenu powinno wzrosnąć podczas oddychania w stanie 2.

Aby wywołać oddychanie w stanie 3, należy dodać DP do stężenia końcowego 150 micromolar. W tym momencie zużycie tlenu powinno wzrosnąć ze względu na syntezę TP poprzez fosforylację oksydacyjną. Należy rejestrować sygnał do momentu spowolnienia oddychania, co wskazuje na zużycie DP i przejście do rejestracji oddychania w stanie 4.

Stan czwarty, oddychanie przez co najmniej jedną minutę. Dodać CCCP do stężenia końcowego 1 µM i rejestrować sygnał przez jedną minutę. W tym momencie oddychanie rozprzężone powinno osiągnąć wartość maksymalną.

Oblicz współczynnik kontroli oddychania (RCR), dzieląc szybkość zużycia tlenu podczas oddychania w stanie trzy przez szybkość zużycia tlenu podczas oddychania w stanie cztery; docelowy RCR powinien być większy niż cztery. Następnie, aby ocenić integralność błony mitochondrialnej, wywołaj oddychanie w stanie trzy w nowej próbce mitochondriów, dodając DP do stężenia końcowego 1 mM.

Następnie należy zarejestrować zużycie tlenu przez jedną minutę, dodać 10 µM cytochromu C i rejestrować zużycie tlenu przez dwie do trzech minut. Ponieważ cytochrom C nie przenika przez nienaruszone błony mitochondrialne w dobrej jakości preparacie mitochondriów, nie nastąpi wzrost lub pojawi się bardzo niewielki wzrost oddychania. Wzrost oddychania wskazuje na przerwane lub uszkodzone błony mitochondrialne.

Aparatura do wieloparametrycznego pomiaru otwarcia porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej składa się ze spektrofluorometru z podwójną emisją Quantum Master, sterowanego komputerowo za pomocą programu Felix GX. Używając programu Felix GX, należy utworzyć protokół akwizycji wielokanałowej i wprowadzić parametry pomiaru potencjału błony mitochondrialnej oraz obrzęku dla barwników ratiometrycznych Forer i JC-1; wygenerować ślady pochodne dla stosunku Forer oraz stosunku JC-1 w jednorazowej czterostronnej płytce z meth ACRL. Wymieszać 1 ml buforu do analizy mitochondriów z końcowym stężeniem 1 µM rotenonu, 5 mM bursztynianu i 800 nM Forer. Następnie dodać 250 µg mitochondriów i umieścić próbkę w komorze pomiarowej spektrofluorometru.

Rozpocznij rejestrację sygnałów fluorescencyjnych po jednej minucie, wstrzymaj akwizycję, dodaj 500 nanomolar JC-1, a następnie wznowij akwizycję. Sygnał stosunku JC-1 powinien wzrosnąć, co wskazuje na pobieranie barwnika przez aktywne mitochondria. Kontynuuj rejestrację, aż sygnał JC-1 osiągnie plateau.

Zazwyczaj w ciągu pięciu minut należy dodać chlorek wapnia do stężenia końcowego 20 µM. Powinien być widoczny natychmiastowy wzrost sygnału stosunku Fluor FF, reprezentujący zwiększoną obecność wapnia w buforze assay, a następnie stopniowy spadek wynikający z mitochondrialnego poboru wapnia. Sygnał stosunku JC-1 powinien wykazać krótki, przejściowy spadek wskazujący na lekką depolaryzację błony mitochondrialnej.

Gdy sygnał stosunku FF dla ER powróci do poziomu podstawowego, zazwyczaj w ciągu 1 do 1,5 minuty po dodaniu kolejnych 20 micromolar calcium chloride, należy kontynuować pulsowanie w stałych odstępach czasu, aż mitochondria przestaną akumulować wapń i zaczną uwalniać go do buforu testowego. Otwarcie mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności jest wizualizowane poprzez jednoczesny wzrost sygnału stosunku FF dla URA w wyniku uwalniania wapnia. Obserwuje się również spadek stosunku sygnału JC one w wyniku załamania potencjału błonowego oraz spadek rozpraszania światła z powodu obrzęku mitochondriów izolowanych z myszy C 56 black six J.

Jak pokazano na tym filmie, zmierzono następnie zużycie tlenu podczas oddychania w stanie trzech w obecności bursztynianu i ADP oraz podczas oddychania w stanie czterech po zużyciu ADP; jak tu widać, dodanie ADP zwiększa zużycie tlenu ze względu na fosforylację oksydacyjną, a następnie tempo zużycia tlenu spada. Po całkowitym zużyciu ADP mierzona jest odpowiedź izolowanych mitochondriów na rozprzęganie poprzez dodanie CCCP; w obecności CCCP szybkość zużycia tlenu jest wyższa niż podczas oddychania w stanie trzech, co służy do oceny integralności błony izolowanych mitochondriów.

Zużycie tlenu mierzono w obecności bursztynianu i DP, a następnie po dodaniu cytochromu C. Jak widać, dodatek cytochromu C nie zwiększa istotnie zużycia tlenu w stosunku do DP i bursztynianu, co wskazuje, że nienaruszone błony mitochondrialne są nieprzepuszczalne dla cytochromu C. Aby ocenić przejście przepuszczalności mitochondrialnej, badano otwarcie porów w izolowanych mitochondriach serca jako wskaźnik pojemności retencji wapnia w mitochondriach. Przejście przepuszczalności mitochondrialnej i otwarcie porów wywoływano poprzez sekwencyjne dodawanie 20 µM.

Chlorek wapnia, pozamitochondrialny poziom wapnia oraz potencjał błonowy zostały zmierzone za pomocą wskaźników ratiometrycznych. URA FF przedstawiono jako zieloną linię, a JC-1 jako czerwoną linię; obrzęk mitochondriów mierzono poprzez rejestrację rozpraszania światła przy 525 nm, co przedstawiono czarną linią. Specyficzność sygnałów JC-1 i obrzęku przetestowano z użyciem 1 µM CCCP oraz 5 µg/mL toksyny mikrobiologicznej etin; jak widać tutaj, pobór wapnia przez mitochondria któremu towarzyszy niewielka depolaryzacja błony mitochondrialnej.

Po czterech impulsach wapnia otwarcie porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej objawia się wzrostem URA FF, co wskazuje na uwalnianie wapnia. Spadek JC-1 wskazuje na załamanie potencjału błonowego oraz zwiększenie objętości macierzy mitochondrialnej, co objawia się redukcją rozpraszania światła jako markeru obrzęku, w celu weryfikacji swoistości otwarcia porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej. Te same pomiary przeprowadzono w obecności cyklosporyny A, która wiąże się z komponentem poru przejścia przepuszczalności mitochondrialnej – cyklofiliną D. Jak pokazano na tej rysunku, obecność 1 µM cyklosporyny A zwiększa liczbę impulsów chlorku wapnia wymaganych do otwarcia porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej w porównaniu z próbką kontrolną.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny otwarcia poru przejścia przepuszczalności mitochondrialnej w izolowanych mitochondriach serca. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie wysokiej jakości izolowanych mitochondriów. Dlatego ważne jest przeprowadzenie pomiarów kontroli jakości przed wykorzystaniem mitochondriów w dalszych eksperymentach.