Wieloparametrowy pomiar przepuszczalności otworu porów przejściowych w izolowanych mitochondriach serca myszy

Celem tego filmu jest opisanie procedury charakteryzowania przejścia przepuszczalności mitochondriów. Słabe otwarcie w mitochondriach, odizolowane od serca myszy. Po pierwsze, mitochondria są izolowane od serc myszy.

Stosując metodę wirowania różnicowego, jakość izolowanych mitochondriów jest następnie oceniana za pomocą tlenowo-termicznej elektrody tlenowej podłączonej do komputera w celu pomiaru współczynnika kontroli oddechowej i oceny integralności błony mitochondrialnej. Następnie, za pomocą oprzyrządowania spektrofluorometrycznego, wykorzystuje się jednoczesny pomiar obsługi wapnia, potencjału błony mitochondrialnej i objętości mitochondriów w celu określenia przejścia przepuszczalności. Słabe otwarcie.

Uzyskane dane wykazały różnice w zdolności zatrzymywania wapnia i przejściu przepuszczalności mitochondriów. Słaba wrażliwość izolowanych mitochondriów, Otwarcie przejścia przepuszczalności mitochondriów. Pory to złożone zjawisko, które obejmuje zmiany na kilku poziomach fizjologii i anatomii mitochondriów.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że pomiar wielu parametrów jednocześnie daje pełniejszy obraz zjawiska niż sam pomiar pojedynczych parametrów, takich jak wapń, mobilizacja czy pęcznienie Przed rozpoczęciem zabiegu należy rozmrozić mitochondrialny bufor izolacyjny i sprawdzić pH, które powinno wynosić 7,4. Następnie umieść wszystkie, naczynia i rurki, które będą używane na lodzie. Należy pamiętać, że wszystkie etapy protokołu izolacji mitochondriów muszą być wykonywane na lodzie.

Umieść serca myszy poddanych eutanazji na szalce Petriego i spłucz krew zimnymi mitochondriami. Bufor izolacyjny. Następnie przenieś serca na nową szalkę Petriego za pomocą ostrza, usuń tłuszcz i przedsionki, a następnie zmiel serca, aż do uzyskania jednorodnego produktu.

Przełóż mielone serca do 50-mililitrowej stożkowej tuby. Dodaj 10 mililitrów buforu izolacyjnego mitochondriów z 0,1 miligrama na mililitr trypiny i pozwól próbce strawić się na lodzie przez 10 minut. Należy pamiętać, że stosowanie trypsyny zwiększa wydajność izolowanych mitochondriów i powinno być utrzymywane na stałym poziomie między przygotowaniami mitochondrialnymi.

Zalecamy jednak przetestowanie funkcjonalności izolowanych mitochondriów na preparatach otrzymanych przy braku trypsyny, aby upewnić się, że enzym nie ingeruje w ich jony. Po inkubacji dodaj 10 mililitrów bufora izolacyjnego mitochondriów zawierającego 0,1% wolnego od kwasów tłuszczowych, BS, a i pięć miligramów inhibitora trypsyny i wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę Aby zneutralizować trypsynę, odzyskaj strawioną tkankę z niską lub średnią prędkością. Wirowanie przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po wirowaniu Resus zawiesić tkankę w ośmiu mililitrach buforu izolacyjnego mitochondriów z 0,1% BSA wolnym od kwasów tłuszczowych, trzymając próbkę na lodzie. Użyj zmotoryzowanego homogenizatora tanecznego z tłuczkiem teflonowym do homogenizacji próbki za pomocą czterech do sześciu przejść przy 1 200 do 1 400 obr./min. Przenieść homogenat do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwirować w temperaturze 800 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Do granulowania jąder i szczątków tkankowych. Po wirowaniu odzyskaj supinat zawierający mitochondria do mikroprobówek wirówkowych i odwiruj je w temperaturze 8 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zawirowaniu pellet będzie miał na wierzchu białą warstwę.

Użyj systemu próżniowego, aby ostrożnie zassać i usunąć białą warstwę na wierzchu mitochondrialnego osadu. Następnie ponownie zawieś pozostałą ciemniejszą osadkę, która zawiera mitochondria w jednym mililitrze mitochondriów. Bufor izolacyjny.

Następnie odwiruj mitochondria w temperaturze 8 000 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Wyrzuć supinat i ponownie zawieś osad mitochondrialny. W 150 mikrolitrach mitochondriów, bufor izolacyjny, utrzymuj mitochondria na lodzie.

Oddychanie izolowanych mitochondriów mierzy się za pomocą tlenowej elektrody tlenowej podłączonej do komputera i kontrolowanej przez tleno. Plus oprogramowanie, elektroda tlenowa powinna być skalibrowana w dniu eksperymentu. Dodaj dwumililitrowy bufor do oddychania mitochondriów zawierający końcowe stężenie jednego mikromolowego rotenonu do komory tlenowej , uszczelnij komorę i rozpocznij rejestrację sygnału tlenu.

Sygnał rejestrowany przez system i wyświetlany na ekranie komputera jest proporcjonalny do stężenia tlenu w komorze tlenowo-termicznej. Gdy sygnał tlenowy się ustabilizuje, dodaj mitochondria o wielkości 250 mikrogramów i rejestruj oddychanie podstawowe przez jedną minutę. Oddychanie w tym momencie powinno być bardzo niskie, ponieważ mitochondria aspirują do substratów endogennych.

To jest pierwszy stan oddychania. Dodaj bursztynian do końcowego stężenia pięciu milimolowców, aby zainicjować oddychanie mitochondrialne w kompleksie drugim i rejestruj sygnał przez jedną minutę. Zużycie tlenu powinno wzrosnąć podczas drugiego stanu oddychania.

Aby wywołać oddychanie w stanie, dodaj DP do końcowego stężenia 150 mikromolów. W tym momencie zużycie tlenu powinno wzrosnąć z powodu syntezy TP poprzez fosforylację oksydacyjną. Nagrywaj sygnał, aż oddech zwolni, wskazując zużycie DP i przejście do stanu czwartego zapisu oddychania.

Stan czwarty, oddychanie przez co najmniej jedną minutę. Dodać CCCP do końcowego stężenia jednego mikromola i rejestrować sygnał przez jedną minutę. W tym momencie oddychanie odsprzężone powinno być maksymalne.

Oblicz współczynnik kontroli oddechowej, dzieląc wskaźnik zużycia tlenu w stanie trzecim. Oddychanie według wskaźnika zużycia tlenu w stanie czwartym, oddychanie docelowego RCR powinno być większe niż cztery. Następnie, aby ocenić integralność błony mitochondrialnej, wywołaj oddychanie w stanie trzecim w nowej próbce mitochondriów, dodając DP do końcowego stężenia jednego milimola.

Następnie rejestruj zużycie tlenu przez jedną minutę, dodaj 10 mikromolowych cytochromu C i rejestruj zużycie tlenu przez dwie do trzech minut. Ponieważ cytochrom C jest nieprzepuszczalny dla nienaruszonych błon mitochondrialnych w dobrym preparacie mitochondrialnym, nie nastąpi wzrost lub bardzo mały wzrost oddychania. Zwiększenie oddychania wskazuje na pęknięte lub uszkodzone błony mitochondrialne.

Oprzyrządowanie do wieloparametrowego pomiaru otworu portu przejściowego przepuszczalności mitochondriów składa się z komputera fluorymetru z podwójnym spektrometrem emisyjnym Quantum Master sterowanego przez program Felix GX. Korzystając z programu Felix GX, utwórz protokół akwizycji multidi i wprowadź parametry do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej wapnia i pęcznienia dla barwników metrycznych stosunku, Forer i JC jeden generują pochodne ślady dla stosunku i JC jeden stosunek w jednorazowym czterostronnym mieszance metamfetaminy ACRL vete jeden mililitrowy bufor do oznaczania mitochondriów o końcowym stężeniu jednego mikromolowego rotenonu, pięć milimolowych bursztynianów i 800 nanomolowych. W przypadku FF dodać 250 mikrogramów mitochondriów i umieścić próbkę w komorze na próbkę spektrofluorymetru.

Rozpocznij nagrywanie sygnałów fluorescencyjnych po jednej minucie, wstrzymaj akwizycję, dodaj 500 nanomolowych JC jeden, a następnie uruchom ponownie akwizycję. Sygnał JC o jednym stosunku powinien wzrosnąć, wskazując na wychwyt śmierci przez aktywne mitochondria. Kontynuuj nagrywanie, aż sygnał JC one osiągnie plateau.

Zwykle w ciągu pięciu minut dodaj chlorek wapnia do końcowego stężenia 20 mikromolów. Należy zaobserwować natychmiastowy wzrost sygnału stosunku Fluor FF oznaczający zwiększoną obecność wapnia w buforze testowym, po którym następuje stopniowy spadek spowodowany mitochondrialnym wychwytem wapnia. Sygnał JC o jednym stosunku powinien wykazywać krótki przejściowy spadek wskazujący na niewielką depolaryzację błony mitochondrialnej.

Gdy sygnał stosunku ER FF powróci do poziomu podstawowego, zwykle w ciągu jednej do 1,5 minuty przy kolejnych 20 mikromolach chlorku wapnia, kontynuuj pulsowanie w ustalonych odstępach czasu, aż mitochondria nie będą w stanie gromadzić wapnia i zaczną uwalniać wapń do buforu testowego. Otwarcie portu przejściowego przepuszczalności mitochondriów jest wizualizowane przez jednoczesny wzrost sygnału współczynnika URA FF spowodowany uwalnianiem wapnia. Spadek współczynnika sygnału JC jeden z powodu zapadnięcia się potencjału błonowego i spadek rozpraszania światła z powodu obrzęku mitochondriów mitochondrialnych podczas izolacji od C 56 czarnych sześciu myszy J.

Jak pokazano na tym filmie, zużycie tlenu mierzono następnie podczas oddychania w stanie trzecim w obecności bursztynianu i DP, a podczas oddychania w stanie czwartym po zużyciu DP, jak pokazano tutaj, dodatek DP zwiększa zużycie tlenu z powodu fosforylacji oksydacyjnej i zużycie tlenu spowalnia. Po zużyciu całego DP odpowiedź izolowanych mitochondriów na rozprzęganie mierzy się poprzez dodanie CCCP w obecności CCCP. Wskaźnik zużycia tlenu jest wyższy niż podczas oddychania w stanie trzecim w celu oceny integralności błony izolowanych mitochondriów.

Zużycie tlenu mierzono w obecności bursztynianu i DP, a po dodaniu C.As cytochromu obserwowanego tutaj, dodanie cytochromu C nie zwiększa znacząco zużycia tlenu w stosunku do DP i bursztynianu, co wskazuje, że nienaruszone błony mitochondrialne nie są przepuszczalne dla cytochromu C w celu oceny przejścia przepuszczalności mitochondriów, słabego otwarcia w izolowanych mitochondriach serca jako wskaźnika zdolności zatrzymywania wapnia w mitochondriach. Przejście przepuszczalności mitochondriów. Słabe otwarcie zostało wywołane przez sekwencyjne dodawanie 20 mikromolowców.

Chlorek wapnia, dodatkowy mitochondrialny wapń i potencjał błonowy mierzono za pomocą wskaźników metrycznych stosunku. URA FF pokazany jako zielony ślad i JC pokazany jako czerwony ślad obrzęku mitochondriów mierzono poprzez rejestrację rozpraszania światła na głębokości 525 nanometrów pokazanej przez ślad. Swoistość JC one i sygnałów obrzęku badano za pomocą jednego mikromola, CCCP i pięciu mikrogramów na mililitr toksyny mikrobiologicznej etyny, jak widać tutaj, wychwytowi wapnia przez mitochondria towarzyszy niewielka depolaryzacja błony mitochondrialnej.

Po czterech impulsach wapniowych otwarcie puli przejściowej przepuszczalności mitochondriów jest postrzegane jako wzrost URA FF wskazujący na uwalnianie wapnia. Spadek JC jeden wskazujący na załamanie potencjału błonowego i wzrost objętości macierzy mitochondrialnej, co jest postrzegane jako zmniejszenie rozpraszania światła jako marker obrzęku w celu sprawdzenia swoistości otwarcia portu przejściowego przepuszczalności mitochondriów. Te same pomiary przeprowadzono w obecności cyklosporyny A, która wiąże się ze składnikiem cyclofillin cyclofillin przejścia przepuszczalności mitochondriów PO, D.As pokazano na tym rysunku, obecność jednego cyklika mikromolowego wiercącego A zwiększa liczbę impulsów chlorku wapnia wymaganych do otwarcia przejścia przepuszczalności mitochondriów PO w porównaniu z próbką kontrolną.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić otwarcie portu przejściowego przepuszczalności mitochondriów w izolowanych mitochondriach serca. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie dobrej jakości wyizolowanych mitochondriów. Dlatego ważne jest, aby wykonać pomiary kontroli jakości przed użyciem mitochondriów do dalszych eksperymentów.