Name: Wieloparametrowy pomiar przepuszczalności otworu porów przejściowych w izolowanych mitochondriach serca myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Poznaj metodę spektrofluorymetryczną pomiaru otwierania się przejściowego otworu porów w izolowanych mitochondriach serca myszy. Technika umożliwia jednoczesne badanie transportu jonów wapnia, potencjału błonowego i objętości mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant HL094536 (B.J.H.).

1. Izolacja mitochondriów z serca myszy
<ol>
 <li>Aby wyizolować mitochondria serca, znieczulić i uśmiercić myszy zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez lokalną Komisję ds. Dobrostanu i Opieki nad Zwierzętami (Institutional Animal Care and Use Committee).</li>
</ol>
Uwaga: Wszystkie kroki protokołu izolacji mitochondriów muszą być wykonywane w lodzie. Należy używać lodowatych buforów oraz schłodzonych wcześniej szalek Petriego, probówek Falcona i probówek Eppendorfa. Podane w protokole objętości dotyczą próbki zawierającej 2 serca mysie.
<ol start="2">
 <li>Wyjąć serca, umieścić je w zimnym buforze do izolacji mitochondriów (300 mM sucrose, 10 mM Na-HEPES, 200 μM EDTA, pH 7.4) i wypłukać krew.</li>
</ol>
Uwaga: Aby uzyskać optymalne wyniki, pH buforów mitochondrialnych należy dostosować za pomocą KOH i kwasu octowego.
<ol start="3">
 <li>Umieścić serca na chłodnej płytce Petriego, usunąć tłuszcz oraz przedsionki, a następnie drobno posiekać żarquivo do uzyskania homogenicznego produktu.</li>
 <li>Przenieść posiekane serca do probówki Falcon o pojemności 50 ml, dodać 10 ml buforu do izolacji mitochondriów z dodatkiem 0,1 mg/ml trypsyny i inkubować próbkę na lodzie przez 10 min w celu trawienia.</li>
</ol>
Uwaga: Trypsyna stosowana podczas procedury izolacji zwiększa wydajność izolowanych mitochondriów i jej stężenie powinno pozostać stałe pomiędzy preparatami mitochondrialnymi. Zalecamy badanie funkcji mitochondriów na preparatach izolowanych bez użycia trypsyny, aby upewnić się, że enzym ten nie wpływa na ich funkcjonalność.
<ol start="5">
 <li>Dodać 10 ml Buforu do Izolacji Mitochondriów z 0,1% BSA wolnym od kwasów tłuszczowych i 5 mg inhibitora trypsyny (sojowego), a następnie wymieszać, kilkukrotnie odwracając probówkę, aby zneutralizować trypsynę.</li>
</ol>
Uwaga: Bufor do izolacji mitochondriów można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu należy sprawdzić pH. Trypsynę, inhibitor trypsyny lub BSA należy dodać do buforu do izolacji mitochondriów w dniu przeprowadzenia eksperymentu.
<ol start="6">
 <li>Odzyskaj trawioną tkankę poprzez wirowanie z niską lub średnią prędkością przez 1 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Resuspenduj tkankę w 8 ml buforu do izolacji mitochondriów (Mitochondria Isolation Buffer) z dodatkiem 0,1% BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i homogenizuj za pomocą zmotoryzowanego homogenizatora Dounce z teflonowym tłokiem (4-6 przejść przy prędkości 1 200-14 000 rpm). Podczas homogenizacji utrzymuj próbkę w lodzie.</li>
 <li>Przenieś homogenizat do probówki typu Falcon o pojemności 15 ml i wiruj przy 800xg przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby wytrącić jądra komórkowe i resztki tkanki.</li>
 <li>Odbierz supernatant zawierający mitochondria do probówek Eppendorf i wiruj przy 8 000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie usuń górną białą warstwę i przemyj pozostały ciemniejszy osad zawierający mitochondria w 1 ml buforu do izolacji mitochondriów (Mitochondria Isolation Buffer).</li>
 <li>Wiruj przy 8000xg przez 15 min w temperaturze 4 °C. Odrzuć supernatant i resuspenduj osad mitochondrialny w 150 μl buforu do izolacji mitochondriów (Mitochondrial Isolation Buffer). Przechowuj mitochondria w lodzie do dalszych analiz.</li>
</ol>
Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki podczas testów funkcjonalnych, należy wykorzystać mitochondria w ciągu 4 hr od ich izolacji.
<ol start="12">
 <li>Oznaczyć ilość białka mitochondrialnego za pomocą metody Bradforda.</li>
</ol>
2. Kontrola jakości wyizolowanych mitochondriów
2.1. Pomiar współczynnika kontroli oddechowej (RCR)
<ol>
 <li>Przeskalibrować elektrodę tlenową Oxytherm za pomocą wody nasyconej powietrzem, aby wyznaczyć linię maksymalnego stężenia tlenu. Po uzyskaniu stabilnego poziomu tlenu dodać 100 μl świeżo przygotowanego 10 mM roztworu hydrosiarczynu sodu w celu wyznaczenia linii zerowej tlenu. Pomiary przeprowadzić w temperaturze 30 °C.</li>
 <li>Do komory Oxytherm dodać 2 ml buforu do respiracji mitochondriów (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 400 μM EGTA, 300 μM DTT, 5 mM KH2PO4, pH 7.2) z dodatkiem 1 μM rotenonu, zamknąć komorę i rozpocząć pomiar.</li>
 <li>Po ustabilizowaniu się sygnału tlenowego dodać 250 μg mitochondriów i rejestrować respirację podstawową przez 1 min. Respiracja na tym etapie powinna być bardzo niska, ponieważ mitochondria oddychają na substratach endogennych (respiracja stanu 1).</li>
 <li>Dodać 5 mM bursztynianu i rejestrować sygnał przez 1 min. Zużycie tlenu powinno wzrosnąć podczas respiracji stanu 2.</li>
 <li>Indukować respirację stanu 3 poprzez dodanie 150 μM ADP. Na tym etapie zużycie tlenu powinno wzrosnąć z powodu syntezy ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Rejestrować sygnał do momentu spowolnienia respiracji, co wskazuje na zużycie ADP i przejście do respiracji stanu 4. Rejestrować respirację stanu 4 przez co najmniej 1 min.</li>
 <li>Dodać 1 μM CCCP i rejestrować sygnał przez 1 min. Respiracja odsprzężona powinna osiągnąć wartość maksymalną.</li>
</ol>
Uwaga: Wpływ CCCP na oddychanie mitochondrialne jest zależny od dawki: wysokie stężenia CCCP mogą hamować zużycie tlenu i dlatego powinny być starannie mianowane.
<ol start="7">
 <li>Oblicz współczynnik kontroli oddychania (RCR), dzieląc szybkość zużycia tlenu podczas oddychania w stanie 3 przez szybkość zużycia tlenu podczas oddychania w stanie 4. Docelowa wartość RCR powinna wynosić ≥ 4.</li>
</ol>
2.2. Ocena integralności błony mitochondrialnej (test cytochromu c)
<ol>
 <li>Dokładnie przemyj komorę Oxytherm 70% etanolem i wodą, a następnie powtórz kroki 2.1.2 – 2.1.4.</li>
 <li>Dodaj 1 mM ADP i zarejestruj zużycie tlenu przez 1 min.</li>
 <li>Dodaj 10 μM cytochromu c. Ponieważ cytochrom c nie przenika przez nienaruszone błony mitochondrialne, wzrost respiracji wskazuje na przerwane lub uszkodzone błony mitochondrialne.</li>
</ol>
3. Pomiar otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności
<ol>
 <li>Skonfiguruj spektrofluorymetr do wieloparametrycznego pomiaru otwarcia mtPTP. Używając programu FelixGx, utwórz nową konfigurację sprzętową (Quanta master steady state) obejmującą źródło światła, monochromator wzbudzenia, komorę próbki oraz dwa detektory ustawione pod kątem 90° i 270° względem monochromatora wzbudzenia (Rycina 4). Aby uzyskać maksymalną rozdzielczość czasową, oba monochromatory emisji (90° i 270°) muszą zostać wyłączone, a filtry emisji przy 90° i 270° w komorze próbki włączone w menu konfiguracji sprzętowej. Ten krok wyłączy sterowanie silnikiem dla długości fal emisji i ustawi każdy monochromator na określonej długości fali. Jeśli monochromatory emisji nie zostaną wyłączone, każdy detektor będzie przełączać się między obiema długościami fal i zostaną zarejestrowane pomiary powielone.</li>
 <li>Utwórz nowy protokół akwizycji, korzystając z typu Multi Dye, i wprowadź następujące barwniki:
 <ul>
 <li>Fura (wysoki poziom Ca++): wzbudzenie 340 nm, emisja 525 nm (detektor 1)</li>
 <li>Fura (niski poziom Ca++): wzbudzenie 380 nm, emisja 525 nm (detektor 1)</li>
 <li>JC1 (agregat): wzbudzenie 543 nm, emisja 595 nm (detektor 2)</li>
 <li>JC1 (monomer): wzbudzenie 498 nm, emisja 525 nm (detektor 1)</li>
 <li>Pęcznienie: wzbudzenie 525 nm, emisja 525 nm (detektor 1)</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Ustaw szczeliny wzbudzenia i emisji na 1 nm oraz temperaturę na 37 °C.</li>
 <li>Aby uzyskać sygnał ratiometryczny dla Fura i JC-1, wygeneruj dwa pochodne ślady: Fura (wysoki poziom Ca++)/Fura (niski poziom Ca++) oraz JC1 (agregat)/JC1 (monomer).</li>
 <li>Ręcznie ustaw długość fali emisji detektorów 1 i 2 odpowiednio na 525 nm i 595 nm.</li>
 <li>W jednorazowej 4-ściennej kuwecie z metakrylanu wymieszaj 1 ml buforu do analizy mitochondriów (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH2PO4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7.2) z 1 μM rotenonu, 5 mM bursztynianu i 800 nM Fura FF. Dodaj 250 μg mitochondriów i umieść próbkę w komorze pomiarowej. Upewnij się, że mieszadło magnetyczne jest włączone.</li>
 <li>Rozpocznij rejestrację. Po 1 min wstrzymaj akwizycję, dodaj 500 nM JC-1, a następnie wznowij akwizycję. Sygnał stosunku JC-1 powinien wzrosnąć, co wskazuje na pobieranie barwnika przez aktywne mitochondria. Kontynuuj rejestrację, aż sygnał JC-1 osiągnie plateau (zazwyczaj w ciągu 5 min).</li>
 <li>Dodaj 20 μM CaCl2. Należy zaobserwować natychmiastowy wzrost sygnału stosunku Fura FF ze względu na zwiększoną obecność Ca2+ w buforze do analizy, a następnie stopniowy spadek wynikający z poboru Ca2+ przez mitochondria. Sygnał stosunku JC-1 powinien wykazać krótki, przejściowy spadek wskazujący na lekką depolaryzację błony mitochondrialnej.</li>
 <li>Odczekaj, aż sygnał stosunku Fura FF powróci do poziomu bazowego przed dodaniem kolejnej porcji CaCl2 (1-1,5 min). Kontynuuj dodawanie porcji w stałych odstępach czasu, aż mitochondria przestaną akumulować Ca2+ i zaczną uwalniać Ca2+ do buforu do analizy. Otwarcie mtPTP objawia się jednoczesnym wzrostem sygnału stosunku Fura FF z powodu uwalniania Ca2+, spadkiem sygnału stosunku JC-1 z powodu załamania potencjału błonowego oraz spadkiem rozpraszania światła z powodu pęcznienia mitochondriów (Rycina 5).</li>
 <li>Po aktywacji mtPTP zweryfikuj specyficzność sygnałów Fura FF, JC-1 i pęcznienia odpowiednio za pomocą 1 mM EGTA, 1 μM CCCP i 5 μg/ml alametycyny.</li>
 <li>Aby zweryfikować specyficzność otwarcia mtPTP, powtórz kroki 3.6 - 3.9 w obecności 1 μM cyklosporyny A, inhibitora cyklofiliny D (cyklofilina D jest składnikiem mtPTP). W obecności cyklosporyny A otwarcie mtPTP wymaga znacznie większej liczby porcji CaCl2 niż w próbkach kontrolnych (Rycina 6).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2 przedstawia typową kontrolę oddechową wyizolowanych mitochondriów serca myszy. Stan 3 oddychania uzyskuje się poprzez dodanie ADP do mitochondriów oddychających na bursztynianic, co charakteryzuje się znacznym wzrostem zużycia tlenu w porównaniu do sytuacji, gdy obecny jest sam substrat. Wyczerpanie dodanego ADP inicjuje stan 4 oddychania, podczas którego zużycie tlenu spowalnia i staje się porównywalne do szybkości osiągniętych przed dodaniem ADP. RCR oblicza się, dzieląc szybkość zużycia tlenu w stanie 3 oddychania przez szybkość zużycia tlenu w stanie 4 oddychania. Test cytochromu c jest stosowany do oceny integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej: gdy cytochrom c zostanie dodany do mitochondriów oddychających na bursztynianic i ADP, nie obserwuje się dalszego wzrostu oddychania, co wskazuje na nienaruszone zewnętrzne błony mitochondrialne (Rysunek 3).
Reprezentacyjny obraz otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca przedstawiono na Rysunku 4. W tym przypadku otwarcie mtPTP zostało wywołane poprzez dodanie 4 pulsów CaCl2 (każdy po 20 μM) w odstępach 1,5 min. Otwarcie mtPTP jest widoczne poprzez niemal jednoczesne uwalnianie mitochondrialnego Ca2+ (wzrost sygnału stosunku Fura FF), spadek potencjału błony mitochondrialnej (spadek sygnału stosunku JC-1) oraz zwiększenie objętości mitochondriów (spadek sygnału pęcznienia). Po dodaniu cyklosporyny A, która wiąże się z komponentem cyklofiliny D mtPTP, do otwarcia mtPTP wymagane jest 7 pulsów CaCl2 zamiast 4 (Rysunek 5).
<img alt="Schemat procesu izolacji mitochondriów; obejmuje wirowanie różnicowe i metody polaroograficzne." src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat protokołu wieloparametrycznego pomiaru otwierania porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej w izolowanych mitochondriach serca. Serce pobierane jest od myszy, a mitochondria są izolowane poprzez wirowanie różnicowe. Przygotowana zawiesina mitochondriów jest następnie jakościowo oceniana za pomocą pomiaru polaroograficznego współczynnika kontroli oddechowej oraz szczelności błony mitochondrialnej w obecności cytochromu c. Otwarcie porów przejścia przepuszczalności mitochondrialnej w izolowanych mitochondriach jest wyzwalane przez sekwencyjne dodawanie CaCl2 i mierzone za pomocą spektrofluorometru poprzez monitorowanie uwalniania Ca2+ z mitochondriów, spadku potencjału błonowego oraz obrzęku macierzy mitochondrialnej.
<img alt="Wykres oddychania mitochondrialnego; zużycie O2 w funkcji czasu; wpływ ADP, bursztynianu i CCCP na strumień." src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Pomiar wskaźnika kontroli oddychania (RCR) izolowanych mitochondriów serca. Zużycie tlenu przez izolowane mitochondria serca mierzy się podczas oddychania w stanie 3 w obecności bursztynianu i ADP oraz podczas oddychania w stanie 4 po zużyciu ADP. Reakcję izolowanych mitochondriów na odsprzęgacze mierzy się poprzez dodanie CCCP. Liczby na wykresie oznaczają tempo zużycia tlenu przez izolowane mitochondria w nmol/min/mg białka.
<img alt="Wykres zużycia tlenu; funkcja mitochondriów; czas vs. O₂ nmol/ml; wynik analizy metabolicznej." src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Pomiar integralności błony izolowanych mitochondriów serca. Integralność błony mitochondrialnej określono poprzez pomiar zużycia tlenu w izolowanych mitochondriach w obecności bursztynianu i ADP oraz po dodaniu cytochromu c. Liczby na wykresie przedstawiają szybkość zużycia tlenu przez izolowane mitochondria w nmol/min/mg białka.
<img alt='"Schemat ustawienia spektroskopii fluorescencyjnej do analizy poziomów Ca2+ z użyciem wskaźników Fura i JC-1."' src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Konfiguracja sprzętowa spektrofluorometru do wieloparametrycznego pomiaru otwarcia mtPTP. Konfiguracja sprzętowa spektrofluorometru obejmuje źródło światła, monochromator wzbudzenia, komorę na próbkę oraz dwa detektory ze stałymi długościami fal emisji wynoszącymi 525 nm i 595 nm. Detektor 1 służy do detekcji sygnału wysokiego i niskiego poziomu Ca2+ dla Fura FF, monomeru JC-1 oraz sygnału pęcznienia. Detektor 2 mierzy sygnał agregatów JC-1.
<img alt="Wykres stosunku fluorescencji dla obrzęku mitochondriów z efektem Ca²⁺ oraz analizą barwnika JC-1 w czasie." src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Wieloparametryczny pomiar otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca. Otwarcie mtPTP zostało wywołane sekwencyjnym dodawaniem 20 μM CaCl2 i charakteryzowało się uwalnianiem Ca2+ z mitochondriów, zapadnięciem potencjału błonowego mitochondriów oraz zwiększeniem objętości macierzy mitochondrialnej (obrzękiem). Pozamitochondrialny poziom Ca2+ oraz potencjał błonowy mierzono za pomocą wskaźników ratiometrycznych Fura FF (ślad zielony) i JC-1 (ślad czerwony). Obrzęk mitochondriów mierzono poprzez rejestrację rozpraszania światła przy 525 nm (ślad czarny). Specyficzność sygnałów JC-1 i obrzęku przetestowano z użyciem 1 μM CCCP oraz 5 μg/ml alametycyny (toksyny mikrobiologicznej).
<img alt="Wykres zmian mitochondrialnych indukowanych przez Ca²⁺; stosunek fluorescencji, obrzęk, JC-1, Fura FF." src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Wieloparametryczny pomiar otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca w obecności cyklosporyny A. Cyklosporyna A (1 μM) zwiększa liczbę impulsów CaCl2 wymaganych do otwarcia mtPTP w izolowanych mitochondriach serca.

<ol><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Permeabilization+in+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li>
<li>Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophilin+D+controls+mitochondrial+pore-dependent+Ca2%2B+exchange%2C+metabolic+flexibility%2C+and+propensity+for+heart+failure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice.</a> J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).</li>
<li>Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li>
<li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li>
<li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria%3A+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li>
<li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li>
<li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Heart%22%5BJournal%5D)">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li>
<li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li>
<li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria%3A+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li>
<li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+filroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje niezbędne kroki eksperymentalne służące do oceny otwierania porów przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca (Rysunek 1 oraz Rysunek 4): procedurę izolacji mitochondriów serca myszy, kontrole oddechowe zapewniające ich integralność i funkcjonalność, parametry mitochondrialne monitorowane podczas otwierania mtPTP oraz barwniki wykorzystywane do ich pomiaru, konfigurację aparatury spektrofluorometrycznej oraz charakterystykę otwieran...

<table><tbody><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3030</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny (sojowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9128</td><td></td></tr><tr><td> hydrosiarczyn sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71699</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom &lt;em&gt;c&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Alametycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4665</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>Calbiochem</td><td>239835</td><td></td></tr><tr><td>Fura FF</td><td>Invitrogen</td><td>F14180</td><td></td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Invitrogen</td><td>T3168</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkanek Pottera-Elvehjema z teflonowym tłuczkiem 15 ml</td><td>Wheaton Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło z napędem górnym</td><td>Wheaton Industries</td><td>903475</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm (elektroda tlenowa z kontrolą temperatury)</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometr z podwójną emisją QuantaMaster 80</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Mitochondrialny por przejścia przepuszczalności (mtPTP) jest niespecyficznym kanałem tworzącym się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, służącym do transportu substancji o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa. Chociaż ostateczna tożsamość molekularna poru jest wciąż przedmiotem dyskusji, w jego tworzeniu uczestniczą białka takie jak cyklofilina D, VDAC i ANT. Podczas gdy zaangażowanie otwarcia mtPTP w śmierć komórek jest dobrze udokumentowane1, narastające dowody wskazują, że mtPTP pełni funkcję fizjologiczną podczas homeostazy Ca2+ w mitochondriach2, bioenergetyki oraz sygnalizacji redoks 3.
Otwarcie mtPTP jest wyzwalane przez Ca2+ w macierzy, lecz jego aktywność może być modulowana przez szereg innych czynników, takich jak stres oksydacyjny, wyczerpanie nukleotydów adeninowych, wysokie stężenia Pi, depolaryzacja lub rozprzęganie błony mitochondrialnej oraz długołańcuchowe kwasy tłuszczowe4. In vitro otwarcie mtPTP można osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia Ca2+ wewnątrz macierzy mitochondrialnej za pomocą egzogennego dodawania Ca2+ (pojemność zatrzymywania wapnia). Gdy poziomy Ca2+ w mitochondriach osiągną określony próg, mtPTP otwiera się, co ułatwia uwalnianie Ca2+, rozproszenie siły protonomotorycznej, zapadnięcie się potencjału błonowego oraz zwiększenie objętości macierzy mitochondrialnej (obrzęk), co w konsekwencji prowadzi do przerwania zewnętrznej błony mitochondrialnej i nieodwracalnej utraty funkcji organellum.
W niniejszym opracowaniu opisujemy test fluorometryczny, który umożliwia kompleksową charakterystykę otwierania mtPTP w izolowanych mitochondriach serca myszy. Test polega na jednoczesnym pomiarze 3 parametrów mitochondrialnych, które ulegają zmianie podczas otwierania mtPTP: gospodarki mitochondrialnej Ca2+ (wychwytu i uwalniania, mierzonego na podstawie stężenia Ca2+ w medium testowym), potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Barwnikami zastosowanymi do pomiaru Ca2+ w medium testowym oraz potencjału błony mitochondrialnej są Fura FF, nieprzenikający przez błony ratiometryczny wskaźnik, u którego w obecności Ca2+ następuje przesunięcie długości fali wzbudzenia, oraz JC-1, kationowy wskaźnik ratiometryczny, który tworzy zielone monomery lub czerwone agregaty odpowiednio przy niskim i wysokim potencjale błonowym. Zmiany objętości mitochondriów mierzy się poprzez rejestrację rozpraszania światła przez zawiesinę mitochondrialną. Ponieważ do testu otwierania mtPTP wymagane są wysokiej jakości, funkcjonalne mitochondria, opisujemy również kroki niezbędne do uzyskania nienaruszonych, silnie sprzężonych i funkcjonalnych izolowanych mitochondriów serca.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Mitochondrialny por przejścia przepuszczalności (mtPTP) jest niespecyficznym kanałem tworzącym się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej w celu transportu substancji rozpuszczonych o...

Celem niniejszego filmu jest opis procedury charakterystyki przejścia przepuszczalności mitochondrialnej. Słabe otwieranie w mitochondriach wyizolowanych z serca myszy. W pierwszej kolejności mitochondria są izolowane z serc myszy.Przy użyciu metody wirowania różnicowego oceniono jakość wyizolowanych mitochondriów, wykorzystując elektrodę tlenową typu oxy thermal podłączoną do komputera w celu pomiaru wskaźnika kontroli oddychania oraz oceny integralności błony mitochondrialnej. Następnie, z wykorzystaniem aparatury spektrofluorometrycznej, przeprowadzono jednoczesny pomiar gospodarki wapniowej, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów w celu określenia przejścia przepuszczalności (pore opening).Otrzymane dane wykazały różnice w zdolności do zatrzymywania wapnia oraz w mitochondrialnym przejściu przepuszczalności. Niska wrażliwość izolowanych mitochondriów oraz otwarcie porów mitochondrialnego przejścia przepuszczalności to złożone zjawiska, które obejmują zmiany na kilku poziomach fizjologii i anatomii mitochondriów.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest fakt, że jednoczesny pomiar wielu parametrów daje bardziej kompleksowy obraz zja

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wielowymiarowe pomiary otwarcia porów przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca mysiego

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.

Test oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji

W tej pracy opisujemy zmodyfikowany protokół badania strumienia mitochondrialnego substratu oddechowego za pomocą rekombinowanej perfringolizyny O w połączeniu z respirometrią opartą na mikropłytkach. Dzięki temu protokołowi pokazujemy, jak metformina wpływa na oddychanie mitochondrialne dwóch różnych linii komórek nowotworowych.

Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

Opisujemy eksperymentalny układ do podawania hiperspolaryzowanych metabolitów znakowanych 13znakowanymi C w trybie ciągłej perfuzji do izolowanego perfundowanego serca myszy. Dedykowane podejście do akwizycji 13C-NMR umożliwiło ilościowe określenie aktywności enzymów metabolicznych w czasie rzeczywistym, a wieloparametryczna analiza 31P-NMR umożliwiła określenie zawartości ATP i pH w tkankach.

Badanie metabolizmu serca w izolowanym perfundowanym sercu myszy za pomocą hiperspolaryzowanej [1-13C] pirogronianu i spektroskopii 13C/31P NMR

Ta metoda wykorzystuje udział porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów do wycieku protonów o niskiej przewodności, aby określić próg napięcia dla otwarcia porów u noworodków z zespołem łamliwego chromosomu X o zwiększonej zawartości kardiomiocytów mitochondrialnego koenzymu Q w porównaniu do kontroli typu dzikiego.

Ocena otwartego prawdopodobieństwa porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów w warunkach nadmiaru koenzymu q

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Poznaj metodę spektrofluorymetryczną pomiaru otwierania się przejściowego otworu porów w izolowanych mitochondriach serca myszy. Technika umożliwia jednoczesne badanie transportu jonów wapnia, potencjału błonowego i objętości mitochondriów.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Przeglądaj więcej filmów