Name: Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien z grupami funkcyjnymi do wiązania białek IgE. Technika obejmuje polimeryzację anionową, elektroprzędzenie i mikroskopię konfokalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana przez NSF HRD-0630456, program NSF CREST oraz NSF DMR-0934142.

1. Synteza polimeru α,ω-dihydroksylowego [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]
<ol>
 <li>Zmontować reaktor polimeryzacyjny zgodnie z Rysunkiem 1. Reaktor do tego doświadczenia składa się ze 100 ml kolby okrągło dna dwuszyjnej ze standardowym szlifem zewnętrznym (Chemglass), dwóch adapterów sterujących przepływem z kurkami (Chemglass) oraz jednej teflonowej prętowej mieszadła. Adapter A (Rysunek 1) służył do zapewnienia przepływu azotu o ultra wysokiej czystości (UHP) przez system w celu zapobiegania przedostawaniu się powietrza i wilgoci do układu obojętnego. Adapter B (Rysunek 1) służył do wprowadzania rozpuszczalnika, monomeru i inicjatora do kolby reakcyjnej.</li>
 <li>Osuszyć 200 ml tetrahydrofuranu (THF) nad metalicznym Na, używając benzofenonu jako wskaźnika, przez minimum 6 hr w strumieniu suchego azotu.</li>
 <li>Osuszyć 10 ml 2-metoksystyrenu nad wodorkiem wapnia przez 24 hr.</li>
 <li>Przygotować kąpiel niskotemperaturową utrzymującą temperaturę -78 °C, używając zawiesiny izopropanolu i ciekłego azotu.</li>
 <li>Wlać 25 ml THF do kolby reakcyjnej do polimeryzacji (patrz Rysunek 1) w atmosferze azotu i utrzymywać reaktor w strumieniu azotu przez cały proces polimeryzacji.</li>
 <li>Umieścić kolbę okrągło dna o pojemności 100 ml w zawiesinie.</li>
 <li>Dodać 2 ml (0,27 mmol/ ml) roztworu inicjatora do kolby reakcyjnej.</li>
 <li>Wprowadzić pierwszy monomer, 2-metoksystyren (4 ml), do kolby reakcyjnej.</li>
 <li>Pozostawić reakcję na 40 min.</li>
 <li>Dodać 1 ml drugiego monomeru, tlenku etylenu.</li>
 <li>Kontynuować polimeryzację w temperaturze pokojowej przez dwa dni.</li>
 <li>Zakończyć polimeryzację za pomocą HCl (6 M)/metanolu (1/20, obj/obj).</li>
 <li>Oczyścić polimer poprzez wytrącenie w heksanach i wysuszyć polimer w suszarce próżniowej.</li>
 <li>Przeprowadzić charakterystykę polimeru za pomocą NMR.</li>
</ol>
2. Funkcjonalizacja polimeru α,ω-dihydroksylowego kwasem N-2,4-DNP-ε-aminokapronowym w celu otrzymania funkcjonalnego polimeru CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP
<ol>
 <li>Do kolby trójszyjnej wprowadzić polimer α,ω-dihydroksylowy (0,05 mmol), kwas N-2,4-DNP-E-aminokapronowy (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) oraz DMAP (0,005 mmol), a następnie suszyć na linii próżniowej przez 4 hr.</li>
 <li>Do kolby wlać przez destylację suchy dichlorometan (10 ml).</li>
 <li>Zwolnić próżnię w atmosferze azotu i mieszać mieszaninę reakcyjną przez 12 hr w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przefiltrować mieszaninę reakcyjną i odzyskać polimer poprzez dwukrotne wytrącenie w heksanach i metanolu.</li>
 <li>Wysuszyć wytrącony polimer w suszarce próżniowej w temperaturze 40 °C.</li>
 <li>Określić strukturę i funkcjonalność polimeru za pomocą FT-IR oraz 1H NMR.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworu CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT do elektrowprzędania
<ol>
 <li>Rozpuścić 20 w % CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP w chlorobenzenie.</li>
 <li>Rozpuścić 20 w % oraz 40 w % polistyrenu (MW 800,000) w chlorobenzenie w celu przygotowania dwóch roztworów. Polistyren o wyższej masie cząsteczkowej jest stosowany w celu zwiększenia splątania łańcuchów polimerowych i uzyskania optymalnej lepkości wymaganej do elektroprzędzenia.</li>
 <li>Zmieszać roztwory polimerów przygotowane w punktach 3.1 i 3.2 w proporcjach 1:1 oraz 1:2, dodać do mieszaniny 1 w % jednościennych nanorurek węglowych (SWCNT) i mieszać przez noc w celu równomiernego rozprzestrzenienia CNT.</li>
</ol>
4. Elektroprzędzenie kompozytu polimerowo-CNT
<ol>
 <li>Zmontuj zestaw do elektroprzędzenia zgodnie z Rysunkiem 2. Po prawej stronie rysunku znajduje się źródło wysokiego napięcia Glassman. Obok niego znajduje się statyw laboratoryjny, do którego przymocowany jest wafelek krzemowy. Po lewej stronie znajduje się kolejny statyw laboratoryjny, na którym zamontowano strzykawkę, a za nim lampa umożliwiająca wizualizację przebiegu procedury.</li>
 <li>Za pomocą strzykawki podskórnej pobierz niewielką ilość mieszaniny CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polistyren/SWCNT (około 1 ml) i zamontuj strzykawkę na statywie laboratoryjnym.</li>
 <li>Wafelek krzemowy zamocuj naprzeciwko strzykawki w bezpiecznej odległości 10 cm, a do niego przyczep zacisk uziemiający źródła wysokiego napięcia.</li>
 <li>Przymocuj zacisk doprowadzający wysokie napięcie do igły strzykawki, lekko wciśnij tłok (aby na końcówce igły zawisła kropla) – w tym momencie układ do elektroprzędzenia jest gotowy.</li>
 <li>Włącz źródło wysokiego napięcia i ustaw woltomierz na 10 kV. W zależności od rodzaju polimerów w kompozycie może być wymagane zastosowanie wyższych napięć, zwłaszcza jeśli pożądane są nanowłókna o średnicy poniżej stu nanometrów.</li>
 <li>Zdejmij wafelek krzemowy i umieść go w eksykatore na noc, aby całkowicie go wysuszyć.</li>
</ol>
5. Charakterystyka nanowłókien
<ol>
 <li>Wstępne obrazowanie nanowłókien wykonuje się za pomocą mikroskopu optycznego, aby przeanalizować ogólną strukturę włókien.</li>
 <li>Wykorzystaj skaningowy mikroskop elektronowy do obserwacji szczegółów, takich jak morfologia, średnica, średnia wielkość porów itp.</li>
 <li>Przeprowadź dalsze obrazowanie za pomocą mikroskopu sił atomowych w celu obserwacji topografii 3D włókien itp.</li>
</ol>
6. Specyficzność wiązania nanowłókien z białkiem anty-DNP IgE
<ol>
 <li>Przygotować roztwór FITC-IgE (izocytjanian fluoresceiny-immunoglobulina E) o stężeniu 4 ug/l w roztworze PBS-BSA (bufor srolowy z fosforanem i albuminą surowiczą bydlęcą).</li>
 <li>Umieścić niewielki fragment wafla krzemowego z nanowłóknami na szkiełku przykrywkowym do dołków MatTek. Inkubować nanowłókna w tym roztworze przez jedną godzinę. Inkubację przeprowadza się poprzez delikatne naniesienie pipetą 10 ul roztworu IgE na wafel krzemowy.</li>
 <li>Po inkubacji usunąć niezwiązaną IgE, trzykrotnie płucząc próbkę roztworem buforu PBS-BSA. Roztwór PBS należy wlewać delikatnie na ściankę naczynia MatTek, aby uniknąć bezpośredniego strumieniowania buforu na nanowłókna. Delikatnie zakręcić naczyniem ręcznie, aby rozprowadzić roztwór buforu na nanowłóknach. Ostrożnie usunąć bufor pipetą i powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy.</li>
 <li>W celu wykonania próby kontrolnej inkubować nanowłókna w znakowanej fluorescencyjnie IgG (nieswoistej dla DNP) w tych samych warunkach.</li>
 <li>Zwizualizować związane włókna za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby zaobserwować wiązanie z IgE. W naszym badaniu użyto mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP2 z obiektywem 63x.</li>
</ol>
7. Charakterystyka prądowo-napięciowa nanowłókien
 
<ol>
 <li class="jove_content">Podłącz dwa mikropozycjonery do źródła bardzo niskiego prądu, takiego jak czuły miernik źródłowy Keithley 6430. Układ do wyznaczania zależności prądowo-napięciowej przedstawiono na Rysunku 3. Rysunek ten pokazuje stację sondy wykorzystaną do wyznaczenia początkowych charakterystyk I-V nanowłókien. Składa się ona z mikroskopu Bausch and Lomb MicroZoom, stołu z uchwytem próżniowym oraz czterech mikropozycjonerów używanych do sondowania. W prawym górnym rogu znajduje się cyfrowy multimetr Agilent 34405A służący do pomiaru napięcia, a poniżej niego miernik źródłowy Keithley 6430 Sub-Femtoamp Remote Source Meter, służący do generowania niskich prądów wprowadzanych do włókien.</li>
 <li class="jove_content">Zamocuj ramiona sond mikropozycjonerów nad matą z włókien po przeciwnych stronach, tak aby końcówki dotykały włókien.</li>
 <li class="jove_content">Podłącz kolejne dwa mikropozycjonery do cyfrowego multimetru, zamocuj ramiona sond pomiędzy pozostałymi dwoma i oprzyj końcówki o matę z włókien. Upewnij się, że wszystkie cztery końcówki są w jak największym stopniu współliniowe.</li>
 <li class="jove_content">Wprowadź zmienne wartości prądu z urządzenia Keithley (zazwyczaj z zakresu nanoamperów).</li>
 <li class="jove_content">Dla każdej wartości dostarczonego prądu zmierz spadek napięcia między zewnętrznymi końcówkami.</li>
 <li class="jove_content">Wykreślenie tych wartości pozwoli określić, jakiego typu urządzeniem jest mata z włókien.</li>
</ol>
 
8. Reprezentatywne wyniki
Polimer funkcyjny
Metoda syntezy α,ω-bi[2,4-dinitrophenylo-kapronianu][poli(tlenku etylenu)-b-poli(2-metoksystyrenu)-b-poli(tlenku etylenu)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP) przedstawiona jest na Rysunku 4.1 Strukturę funkcjonalnego polimeru potwierdzono za pomocą spektroskopii FT-IR (Rysunek 5) oraz spektroskopii 1H NMR 500 MHz (Rysunek 6). Widmo FT-IR wykazuje całkowity zanik szerokiego pasma absorpcji grup -OH w okolicach 3,500 cm-1, co wskazuje na ilościową funkcjonalizację grupami CDNP. Potwierdza to również widmo NMR przedstawione na Rysunku 6. Na podstawie całkowania pików w widmie NMR ustalono, że polimery CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP zostały sfunkcjonalizowane ilościowo.
Nanowłókna
Na Rysunku 7 przedstawiono matę przewodzących nanowłókien otrzymanych poprzez elektroprzędzenie CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyrenu/SWCNT z chlorobenzenu. Uzyskane obrazy konfokalne wykazały, że białko IgE wiąże się z DNP na powierzchni włókna.3 Świadczy to o specyficzności wiązania elektroprzędzonych polimerów DNP względem przeciwciała IgE. Natężenie światła jest wskaźnikiem obecności IgE na nanowłóknach, ponieważ białko to jest znakowane fluorescencyjnie.
Rysunek 8a przedstawia obraz AFM (mikroskopii sił atomowych) jednego z nanowłókien otrzymanych tą metodą, a Rysunek 8b pokazuje, że średnica tego konkretnego nanowłókna wynosi około 150 nm. Dzięki temu procesowi otrzymuje się włókna o średnicy od 100 do 700 nm. Obecnie przygotowanie włókien o ściśle określonych wymiarach jest trudne. Jest to zgodne z obserwacjami innych grup badawczych.4 Rysunek 9 przedstawia obrazy SEM nanowłókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polistyren/SWCNT, których średnica wynosiła od 200 nm do 300 nm. Przedstawiono trzy obrazy SEM nanowłókien przy różnych powiększeniach. Analiza tych trzech obrazów wykazuje, że morfologia włókien jest liniowa lub kropelkowata. Głównym celem jest przygotowanie włókien, które są w przeważającej mierze liniowe. Rysunek 10 przedstawia charakterystykę prądowo-napięciową (I-V) mat nanowłókien przygotowanych z CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polistyren/SWCNT. Wykres wskazuje zachowanie rezystora (omowe). Po związaniu antygenu z nanowłóknami spodziewamy się zmiany charakterystyki I-V maty włókien, ponieważ taka zmiana rezystancji jest cechą sugerującą, że funkcjonalne włókna mogą znaleźć zastosowanie jako aktywny komponent w sensorach do detekcji pojedynczych cząsteczek.
<img alt="Schemat układu filtracji próżniowej ze strzykawką i kurkiem do rozdzielania próbek." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reaktor polimeryzacji do syntezy polimeru α,ω-dihydroksylowego. A) Punkt wtrysku dla przepływu gazowego azotu UHP. B.) Punkt wtrysku rozpuszczalnika, monomeru i inicjatora. C) Naczynie reakcyjne.
<img alt="Układ laboratoryjny z wagą precyzyjną i sprzętem elektronicznym do pomiaru masy." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Układ wykorzystany do elektroprzędzenia z zastosowaniem źródła wysokiego napięcia firmy Glassman.
<img alt="Konfiguracja mikroskopu MicroZoom II do badań fotonicznych z urządzeniem do pomiarów optycznych." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Układ wykorzystany do pomiaru charakterystyk prądowo-napięciowych (I-V) przy użyciu zdalnego miernika źródłowego Sub-femtoamp (Keithley).
<img alt="Schemat syntezy polimeru przedstawiający żyjącą polimeryzację anionową w celu tworzenia kopolimeru z odczynnikami." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. A). Podejście syntetyczne do otrzymywania polimerów OH-PEO-P2MS-PEO-OH. B) Funkcjonalizacja α,ω-dihydroksy[poli(tlenku etylenu)-b-poli(2-metoksystryrenu)-b-poli(tlenku etylenu)].
<img alt="Wykres spektroskopii podczerwonej, absorpcja grupy OH, transmitancja w funkcji liczby falowej, analiza widmowa." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Widma FT-IR (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, prekursora CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP oraz (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
<img alt="Diagram widma NMR, szczegóły struktury chemicznej, analiza związku aromatycznego, przypisania protonów." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Widmo protonowego NMR 500 MHz dla CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
<img alt="Sieć neuronalna, mikroskopia fluorescencyjna; pokazuje połączenia neuronów, analiza wzbudzenia optycznego." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. A) Obraz wiązania FITC- IgE z włóknami CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP elektroprząśniętymi z chlorobenzenu. B) Obraz z mikroskopu konfokalnego dla kontroli (nanowłókna z IgG).
<img alt="Obraz z mikroskopii sił atomowych z analizą filamentów w nanoskali; poniżej wykres profilu wysokości." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. A) Obraz AFM włókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP wytworzonych metodą elektroprzędzenia z chlorobenzenu oraz B) profil AFM, t.j. wymiar jednego włókna przedstawionego na Rysunku 5a.
<img alt="Mikrografia z scanning electron microscopy sieci nanowłókien; analiza strukturalna, badanie materiałowe, mikroskopia." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Obrazy SEM nanowłókien CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyren/SWCNT.
<img alt="Wykres liniowej charakterystyki I-V, przedstawiający napięcie względem natężenia prądu, ilustrujący przewodność elektryczną." src="/files/ftp_upload/4135/4135fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Wykres I-V mat z nanowłókien przygotowanych z CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP /polistyrenu/SWCNT.

<ol><li>Sannigrahi, B., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Characterization+of+%CE%B1%2C%CF%89-bi%5B2%2C4-dinitrophenyl+%28DNP%29%5D+poly%282-methoxystyrene%29+Functional+Polymers.+Preliminary+Evaluation+of+the+Interaction+of+the+Functional+Polymers+with+RBL+Mast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Macromolecular+Science%2C+Part+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).</li>
<li>Gordon, K., Sannigrahi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Optically+Active+Helical+Poly%282-methoxystyrene%29.+Enhancement+of+HeLa+and+Osteoblast+Cell+Growth+on+Optically+Active+Helical+Poly%282-methoxystyrene%29+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).</li>
<li>Baird, E. J., Holowka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Effective+Poly%28Ethylene+Glycol%29+Architectures+for+Specific+Inhibition+of+Immune+Receptor+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation.</a> Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).</li>
<li>Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamakrisna%2C+S+%22Introductions+to+Electrospinning+and+Nanofibers%22">Introductions to Electrospinning and Nanofibers</a>. , World Sceintific. (2005).</li>
<li>Kameoka, J., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Oriented+Polymeric+Nanofibers+on+Planar+Surfaces+by+Electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning.</a> Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).</li>
<li>Ramakrishna, S., Lala, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Nanofibers+for+Biosensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Polymer Nanofibers for Biosensor Applications.</a> Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).</li>
<li>Reuven, D., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archetypical+Conductive+Polymer+Structure+for+Specific+Interaction+with+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Macromolecular+Science+Part+A%3A+Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins.</a> Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Ogunro, O., Karunwi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+Asymmetry+of+Helical+Polymer+Nanowire%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym raporcie przedstawiliśmy skuteczne podejście do przygotowywania biofunkcjonalnych nanowłókien. Nanowłókna są dekorowane grupą funkcyjną specyficzną dla białka modelowego. Procedura i podejście opisane w tej komunikacji mają charakter ogólny i mogą być wykorzystane do przygotowania nanowłókien dekorowanych dowolną pożądaną grupą funkcyjną. Anionowa polimeryzacja żyjąca jest potężną metodą syntezy kontrolowanych struktur polimerowych kowalencyjnie połączonych z dowolną liczbą interesujących grup funkcyjnych lu...

<table><tbody><tr><td>Sód metaliczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>282065</td><td></td></tr><tr><td>Benzofenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239852</td><td></td></tr><tr><td>2-metoksystyren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563064</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>178810</td><td></td></tr><tr><td>Chlorobenzen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>Jednościenne CNT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>704113</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81416</td><td></td></tr><tr><td>Wafery krzemowe</td><td>Silicon Quest Int&amp;#8217;l</td><td>720200</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss FESEM</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td>Ultra 60</td><td></td></tr><tr><td>Stacja pomiarowa z mikroskopem wysokiej wydajności Bausch &amp;amp; Lomb MicroZoom II</td><td>Bausch and Lomb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skanujący system konfokalny Leica</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td>Zdalny miernik źródłowy sub-femtoamperowy</td><td>Keithley Instruments</td><td>6430</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy multimetr z autozakresem</td><td>Keithley Instruments</td><td>175A</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkową</td><td>Chemyx Inc.</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny Zeiss</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td>Zeiss/Axiotech</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

Elektroprzędzenie jest skuteczną metodą przetwarzania służącą do otrzymywania nanowłókien udekorowanych grupami funkcjonalnymi. Nanowłókna udekorowane grupami funkcjonalnymi mogą być wykorzystywane do badania oddziaływań między materiałem a biomarkerami, tj. pełnić rolę biosensorów z potencjałem do wykrywania pojedynczych cząsteczek. Opracowaliśmy skuteczne podejście do przygotowania polimerów funkcjonalnych, w których funkcjonalność umożliwia specyficzne wiązanie z białkiem modelowym. W naszym systemie modelowym grupą funkcjonalną jest 2,4-dinitrofenyl (DNP), a białkiem jest anty-DNP IgE (immunoglobulina E). Polimer funkcjonalny, α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl caproic][poly(ethylene oxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP), przygotowano w drodze anionowej polimeryzacji żyjącej. Difunkcyjny inicjator wykorzystany w polimeryzacji otrzymano w reakcji przeniesienia elektronu pomiędzy α-metylostyrenem a metalicznym potasem (lustrzanym). Do inicjatora dodano najpierw monomer 2-metoksystyrenu, następnie drugi monomer, tlenek etylenu, a na koniec polimer żyjący zakończono metanolem. Polimer α,ω-dihydroksylowy [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] poddano reakcji z kwasem N-2,4-DNP-∈-aminokapronowym za pomocą sprzęgania DCC, co doprowadziło do powstania α,ω-bi[2,4-dinitrophenylcaproic][poly(ethyleneoxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Polimery scharakteryzowano za pomocą FT-IR, 1H NMR oraz chromatografii żelowej (GPC). Rozkłady mas cząsteczkowych polimerów były wąskie (1,1-1,2), a w badaniu wykorzystano polimery o masach cząsteczkowych przekraczających 50 000. Polimery miały postać żółtych proszków i były rozpuszczalne w tetrahydrofuranie. Rozpuszczalny w wodzie kompleks CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/ DMEG (dimetoksyglikol etylenowy) wiąże się i osiąga stan równowagi wiązania z rozpuszczoną IgE w ciągu kilku sekund. Polimery CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP o wyższej masie cząsteczkowej (nierozpuszczalne w wodzie, tj. około 50 000), zawierające 1% jednościennych nanorurek węglowych (SWCNT), przetworzono na elektroaktywne nanowłókna (o średnicy od 100 nm do 500 nm) na podłożu krzemowym. Spektroskopia fluorescencyjna wykazuje, że anty-DNP IgE oddziałuje z nanowłóknami poprzez wiązanie się z grupami funkcjonalnymi DNP dekorującymi włókna. Obserwacje te sugerują, że odpowiednio funkcjonalizowane nanowłókna dają nadzieję na opracowanie urządzeń do wykrywania biomarkerów.

Opisano wydajne podejście do przygotowania nanowłókien udekorowanych grupami funkcyjnymi zdolnymi do specyficznych oddziaływań z białkami. Podejście to wymaga w pierwszej kolejności przygotowania polimeru funkcjonalizowanego odpowiednią grupą funkcyjną. Funkcjonalny polimer jest przekształcany w nanowłókna za pomocą elektroprzędzenia. Efektywność wiązania nanowłókien z białkiem jest badana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Elektroprzędzenie jest skuteczną metodą przetwarzania pozwalającą na otrzymywanie nanowłókien funkcjonalizowanych grupami funkcyjnymi. Nanowłókna funkcjonalizowane grupami funkcyjnymi ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie nanowłókien udekorowanych grupami funkcyjnymi. Najpierw należy zsyntezować kopolimer blokowy z dwóch metoksystyrenu i tlenku etylenu za pomocą polimeryzacji anionowej, a następnie scharakteryzować go za pomocą spektroskopii NMR protonowego. Następnie należy poddać elektroprzędzeniu roztwór funkcjonalnego polimeru i jednościennych nanorurek w celu otrzymania kompozytowego nanowłókna.Następnie określ charakterystykę napięcia prądu nanowłókien po ich ekspozycji na białko IgE. W rezultacie połączenie ANI i polimeryzacji żyjącej z elektrowprzędzaniem pozwala na wytworzenie nanowłókien dekorowanych grupami funkcyjnymi zdolnymi do wiązania specyficznych białek. W tym podejściu do wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien, polimeryzacja żyjąca umożliwia łatwą syntezę biofunkcjonalnych polimerów o kontrolowanych masach cząsteczkowych. Ponadto technika elektrowprzędzania pozwala na przygotowanie nanowłókien dekorowanych grupami funkcyjnymi, które mogą specyficznie oddziaływać z białkami.Metoda ta może dostarczyć cennych informacji w diagnostyce medycznej. Można ją również zastosować w innych systemach, takich jak monitorowanie dowolnej wybranej pojedynczej cząsteczki w środowisku poprzez włączenie funkcjonalnych nanowłókien do odzieży, samochodów i innych przedmiotów. Synteza polimerów wymaga niezwykle rygorystycznych warunków. Ten film pomoże opanować manipulacje niezbędne do syntezy polimeru i jego późniejszego przetworzenia w nanowłókno. Używając benzofenonu jako wskaźnika, odwodnij 200 milliliters tetrahydrofuranu nad sodem metalicznym w suchym gazie azotowym.Osusz również 10 mililitrów styrenu dimetoksylowego nad wodorkiem wapnia przez 24 godziny. Do reaktora polimeryzacyjnego. Dla tej reakcji przygotuj kąpiel niskotemperaturową utrzymującą temperaturę -78 °C, wykorzystując zawiesinę izopropanolu i ciekłego azotu.Złożyć zestaw składający się ze sto mililitrowej kolby okrągło-dennej z jedną szyjką i szlifowanym wlotem. W układzie przepływowym reakcji należy umieścić dwa adaptery kontroli przepływu z kurkami oraz jedną prętkę mieszającą z Teflonu. Zastosować azot o ultrawysokiej czystości, aby zapewnić obojętność układu.Do kolby reakcyjnej do polimeryzacji należy dodać 25 µL THF. Następnie należy dodać dwa mililitry roztworu inicjatora. W kolejnym kroku należy wstrzyknąć cztery mililitry pierwszego monomeru i pozwolić reakcji przebiegać przez 40 minut.Następnie dodaj jeden mililitr drugiego monomeru w celu przeprowadzenia polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez dwa dni; reakcję zakończ za pomocą sześciomolarnego kwasu solnego i metanolu. Aby oczyścić polimer, wytrąć go w heksanach i wysusz w piecu próżniowym, a następnie przystąp do charakterystyki polimeru za pomocą NMR. Umieść odczynniki sprzęgające w kolbie trójszyjnej i susz na linii próżniowej przez cztery godziny.Następnie do kolby w atmosferze azotu wstrzyknij 10 ml suchego dichlorometanu. Pozostaw mieszaninę do mieszania przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.Przesączyć mieszaninę reakcyjną, aby dwukrotnie odzyskać osad polimeru, przemywając go heksanami oraz metanolem; osad polimeru wysuszyć w suszarce próżniowej w temperaturze 40 °C. Na koniec określić strukturę i funkcjonalność polimeru za pomocą FTIR i HNMR. Rozpuścić 20% funkcjonalnego polimeru w chlorobenzenie.Następnie należy przygotować dwa roztwory polistyrenu w chlorobenzenie. Polistyren o wyższej masie cząsteczkowej stosuje się w celu zwiększenia splątania łańcuchów polimerowych i uzyskania optymalnej lepkości wymaganej do elektroprzędzenia. Pomieszaj roztwory polimerów, aby uzyskać stosunki polimerów wynoszące jeden do jednego oraz jeden do dwóch.Następnie do mieszaniny należy dodać 1% jednościennych nanorurek węglowych i mieszać przez noc. Złożyć aparat do elektroprzędzenia, wykorzystując źródło wysokiego napięcia Glassman, wafelek krzemowy, strzykawkę lub pompę strzykawkową, a także lampę do wizualizacji procedury. W miarę postępów prac, pobrać niewielką ilość roztworu polimeru z nanorurkami węglowymi do strzykawki hipodermicznej i zamontować strzykawkę w urządzeniu.Następnie przymocuj zacisk doprowadzający wysokie napięcie do igły strzykawki. Aby rozpocząć elektroprzędzenie, włącz źródło wysokiego napięcia i ustaw woltomierz na 10 kV. Następnie zacznij powoli naciskać tłok strzykawki.W zależności od rodzaju polimerów w kompozycie może być wymagane zastosowanie wyższych napięć, zwłaszcza w przypadku, gdy pożądane są nanowłókna o średnicy poniżej 100 nanometrów. Zdejmij wafele krzemowy i wysusz całkowicie w eksyكاته przez noc. Aby uzyskać ogólny obraz nanowłókien, najpierw wykonaj zdjęcie za pomocą mikroskopu optycznego.Następnie należy wykorzystać skaningowy mikroskop elektronowy, aby zaobserwować szczegóły takie jak morfologia, średnica i średnia wielkość porów. Dalsze obrazowanie za pomocą mikroskopu sił atomowych pozwala na obserwację topografii 3D nanowłókien. Umieść niewielki fragment podłoża krzemowego z nanowłóknami na podkładce tech.Kapturka z szkiełka nakrywką. Należy dodać 10 µL znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała i inkubować przez godzinę, a następnie przemyć trzy razy roztworem P-B-S-B-S-A, delikatnie dozując roztwór na ściankę naczynia MatTek, lekko obracając naczyniem w dłoni, a następnie usuwając bufor pipetą, aby zaobserwować wiązanie z IgE. Włókna są wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej.Typowa stacja sondy używana do wyznaczania początkowych charakterystyk prądowo-napięciowych nanowłókien składa się z mikroskopu lo micro zoomo, uchwytu próżniowego dla mikro-pozycjonerów, multimetru do pomiarów napięcia oraz źródła prądowo-napięciowego (source meter) do podawania niskiego prądu do włókien. Najpierw podłącz dwa mikro-pozycjonery do źródła bardzo niskiego prądu, a następnie zamontuj ramiona sond mikro-pozycjonerów nad matą z włókien po przeciwnych stronach, tak aby końcówki dotykały włókien. Następnie podłącz kolejne dwa mikro-pozycjonery do cyfrowego multimetru.Zamontuj ramiona sondy pomiędzy dwoma pozostałymi i oprzyj ich końcówki na macie z włókien. Upewnij się, że cztery końcówki są w miarę możliwości w jednej linii. Podaj zmienne wartości natężenia prądu, zazwyczaj w zakresie nanoamperów.Następnie zmierz spadek napięcia na zewnętrznych końcówkach dla każdej wartości natężenia prądu. Następnie sporządź wykresy zależności napięcia od natężenia prądu i określ typ urządzenia charakteryzowanego przez matę z włókien. W tej metodzie funkcjonalny polimer DNP jest otrzymywany w drodze jonowej polimeryzacji żyjącej.Wykorzystany w polimeryzacji inicjator funkcjonalny D jest otrzymywany w reakcji przeniesienia elektronu. W procesie tym do inicjatora dodawany jest pierwszy monomer, styren metoksylowy, a następnie drugi monomer, tlenek etylenu. Na koniec żywy polimer jest terminowany za pomocą metanolu.Struktura polimeru funkcjonalnego została potwierdzona za pomocą spektroskopii FTIR i NMR. Widmo FTIR wykazuje całkowity zanik szerokiego pasma absorpcji grupy oh, co wskazuje na ilościową funkcjonalizację grupą CDNP. Integracja pików w widmie NMR potwierdza, że polimery zostały poddane funkcjonalizacji ilościowej.Następnie polimery są funkcjonalizowane za pomocą sprzęgania DCC w celu wprowadzenia funkcjonalnych grup DNP do tej maty z przewodzących nanowłókien; specyficzność wiązania polimerów DNP otrzymanych metodą elektroprzędzenia względem przeciwciał IgE wykazano za pomocą fluorescencji. Zazwyczaj obraz nanowłókna wykonany za pomocą mikroskopu sił atomowych pozwala na pomiar wymiarów nanowłókien. Obrazy SEM wskazują, że morfologia tych włókien jest liniowa lub koralikowa.Ogólnym celem jest przygotowanie włókien o strukturze głównie liniowej. Wykres zależności natężenia prądu od napięcia dla mat nanowłókien wykazuje zachowanie omowe rezystora w przypadku związania antygenu z nanowłóknami. Zmiana rezystancji sugeruje, że funkcjonalizowane włókna mają potencjał do zastosowania jako aktywny komponent w czujnikach do detekcji pojedynczych cząsteczek.Praca z rozpuszczalnikami takimi jak tetrahydrofuran, dichlorometan, chlorobenzen i dimetylosulfotlenek może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować odpowiednie środki ostrożności. Cały proces można przeprowadzić w ciągu pięciu dni. Obejmuje on syntezę i charakterystykę polimeru oraz wytwarzanie i charakterystykę nanowłókien.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że polimeryzacja anionowa jest wrażliwa na zanieczyszczenia produktów. Mam nadzieję, że wideo było dla Państwa przydatne i życzę powodzenia w eksperymentach.

procedure-for-fabricating-biofunctional-nanofibers

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy metody wytwarzania wzorowanych mikrostruktur z pionowo wyrównanych nanorurek węglowych (CNTs) oraz ich zastosowanie jako form macierzystych do produkcji polimerowych mikrostruktur z uporządkowaną nanostrukturą powierzchni. Las nanorurek CNT jest zagęszczany poprzez kondensację rozpuszczalnika na podłożu, co znacznie zwiększa ich gęstość upakowania i umożliwia samokierowane tworzenie kształtów 3D.

Wytwarzanie, zagęszczanie i odlewanie replik trójwymiarowych mikrostruktur z nanorurek węglowych

Dwa sąsiadujące ze sobą płyny przechodzące przez rowkowany kanał mikroprzepływowy mogą być skierowane tak, aby tworzyły osłonę wokół rdzenia prepolimerowego; określając w ten sposób zarówno kształt, jak i przekrój. Polimeryzacja inicjowana foto, taka jak chemia tiolowa, doskonale nadaje się do szybkiego zestalania płynu rdzeniowego w mikrofibrę o określonym rozmiarze i kształcie.

Mikroprzepływowa produkcja włókien polimerowych i biohybrydowych o wstępnie zaprojektowanym rozmiarze i kształcie

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania elektroprzędzonych rusztowań z nanowłókien o stopniowanej organizacji włókien i badamy ich zastosowania w regulacji morfologii/orientacji komórek. Gradienty w odniesieniu do właściwości fizycznych i chemicznych rusztowań z nanowłókien oferują szeroką gamę zastosowań w dziedzinie biomedycyny.

Rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych z gradacją w organizacji włókien

Dwu- i trójwymiarowe superhydrofobowe materiały polimerowe są przygotowywane przez elektroprzędzenie lub elektronatryskiwanie biodegradowalnych polimerów zmieszanych z polimerem o niższej energii powierzchniowej o podobnym składzie.

Wytwarzanie superhydrofobowych materiałów polimerowych do zastosowań biomedycznych

Elektroprzędzone nanowłókna mają wysoki stosunek powierzchni do masy, doskonałą integralność mechaniczną oraz wspierają wzrost i proliferację komórek. Te nanowłókna mają szeroki zakres zastosowań biomedycznych. Tutaj wytwarzamy nanowłókna keratynowe/PCL przy użyciu techniki elektroprzędzenia i charakteryzujemy włókna pod kątem możliwych zastosowań w inżynierii tkankowej.

Synteza nanowłókien na bazie keratyny w inżynierii biomedycznej

Przedstawiamy protokół wytwarzania wnęk kryształów fotonicznych 1D na włóknach krzemionkowych o średnicy podfalowej (nanowłókna optyczne) za pomocą ablacji indukowanej laserem femtosekundowym.

Wytwarzanie 1-D fotonicznej wnęki kryształu na nanowłóknie za pomocą ablacji indukowanej laserem femtosekundowym

Przedstawiono protokół mikroprzepływowego przędzenia i charakterystyki mikrostruktury regenerowanego jedwabnego włókna fibroinowego.

Mikroprzepływowe przędzenie na sucho i charakterystyka regenerowanych włókien fibroiny jedwabiu

Ten manuskrypt opisuje procedurę wytwarzania i charakteryzowania włókien elektroprzędzonych z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) modyfikowanych przez Griffithsin, które wykazują silne działanie adhezyjne i przeciwwirusowe przeciwko zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1 in vitro. Opisano metody stosowane do syntezy, modyfikacji powierzchni i charakterystyki wynikowej morfologii, koniugacji i desorpcji Griffithsiny z włókien modyfikowanych powierzchniowo.

Wytwarzanie i charakterystyka rusztowań z włókien modyfikowanych przez Griffithsin w celu zapobiegania infekcjom przenoszonym drogą płciową

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Poznaj metodę wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien z grupami funkcyjnymi do wiązania białek IgE. Technika obejmuje polimeryzację anionową, elektroprzędzenie i mikroskopię konfokalną.

Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Przeglądaj więcej filmów