Name: Transfekcja przeciwciał do neuronów jako narzędzie do badania patogenezy choroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj szybką metodę transfekcji przeciwciał do neuronów w celu badania patogenezy chorób neurologicznych. Technika fluorescencyjna umożliwia wizualizację interakcji auto-przeciwciał z komórkami nerwowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest wspierana przez Office of Research and Development, Medical Research Service, Department of Veterans Affairs. Badanie to zostało sfinansowane z grantu VA Merit Review Award (przyznanego MCL) oraz z funduszu Multiple Sclerosis Research Fund Uniwersytetu Tennessee Health Science Center.

1. Znakowanie przeciwciał (Rysunek 1)
<ol>
 <li>Przygotować bufor NaHCO3 0,1 M:
 <ul type="circle">
 <li>8,4 g NaHCO3</li>
 <li>29,2 g NaCl</li>
 <li>1 liter H2O</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Dostosować pH buforu do wartości 8,4 za pomocą tego roztworu (10,6 g Na2CO3, 29,2 g NaCl, 1 liter H20).</li>
 <li>Dodać 35 μl Atto550 NHS do 70 μl przeciwciał anti-hnRNPA1 oraz 500 μl buforu NaHCO3 i inkubować w rotatorze przez 1 h w temperaturze pokojowej. Po godzinnej rotacji wprowadzić mieszaninę do dializatora i dializować w 2 litrach PBS przez noc.</li>
 <li>Następnego dnia skoncentrować zdializowane przeciwciała anti-hnRNPA1 znakowane Atto550 NHS, wykorzystując kolumnę wirową (Amicon Ultra 0,5).</li>
 <li>Po skoncentrowaniu przeciwciał anti-hnRNPA1 znakowanych Atto550 NHS, zmierzyć stężenie próbki za pomocą nanodropu.</li>
</ol>
2. Transfekcja przeciwciał (Rysunek 2)
<ol>
 <li>24 godziny przed transfekcją wysiać 105 komórek/dołka w 500 μl pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM/F12+10% FBS+1% antybiotyku) na szkiełko z 8 dołkami. Konfluencja komórek powinna wynosić co najmniej 70%.</li>
 <li>Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu dodać 2 μl odczynnika Ab-DeliverIN do probówki Eppendorfa.</li>
 <li>Następnie do tej samej probówki Eppendorfa dodać 2 μg przeciwciała anty-hnRNPA1 znakowanego Atto550 NHS (0,5 μg/μl) i inkubować przez 10-15 min w RT.</li>
 <li>Podczas inkubacji odessać pożywkę i dodać do komórek 394 μl świeżej pożywki DMEM.</li>
</ol>
Uwaga: Do jednej komory z nienaruszonymi komórkami dodaj 500 μl DMEM, aby służyła ona jako kontrola.
<ol start="5">
 <li>Po inkubacji do mieszaniny przeciwciał należy dodać 100 μl DMEM, wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie dodać do komórek w DMEM, tak aby uzyskać całkowitą objętość 500 μl.</li>
 <li>Po 48 godz. od podania przeciwciał należy wymienić medium.</li>
</ol>
Uwaga: Protokół powtórzono z użyciem rIgG znakowanych FITC jako kontroli pozytywnej.
3. Obrazowanie żywych i utrwalonych komórek w celu określenia wydajności
<ol>
 <li>Obrazuj żywe komórki po 48 h, używając filtra Cy3 w mikroskopie fluorescencyjnym, aby zobrazować przeciwciała znakowane Atto550 NHS po transfekcji.</li>
 <li>Po zakończeniu obrazowania na żywo odessaj medium i utrwal komórki.</li>
 <li>Po odessaniu medium potraktuj komórki 0,4% Paraformaldehydem przez 15 min w temperaturze pokojowej. Przemyj komórki 4 x 5 min roztworem PBS. Następnie zamknij preparaty w medium montażowym zawierającym odczynik DAPI i przymocuj szkiełko nakrywkę. Zmierz wydajność transfekcji utrwalonych komórek za pomocą oprogramowania Axiovision. Jeśli oprogramowanie Axiovision nie jest dostępne, po prostu policz ręcznie zdarzenia na obrazie i wprowadź wyniki do obliczeń w punkcie 3.7. Alternatywnie do tych obliczeń można wykorzystać oprogramowanie ImageJ.</li>
 <li>Najpierw użyj pomiaru „Events”, aby policzyć całkowitą liczbę komórek na wybranym obrazie przy powiększeniu 20x.</li>
 <li>Następnie użyj pomiaru „Events”, aby policzyć komórki, które nie zostały pomyślnie przetransfekowane przeciwciałami na tym samym obrazie przy powiększeniu 20x.</li>
 <li>Aby uzyskać dostęp do zmierzonych „Events” w formacie przypominającym arkusz Excel, kliknij „Properties”, wybierz zakładkę „Measurement” i kliknij „As Table”, aby wyświetlić wyniki w formie tabeli.</li>
 <li>Na koniec wykonaj poniższe obliczenia, aby określić wydajność transfekcji poprzez porównanie dwóch wcześniej zmierzonych wartości: ((Całkowita liczba komórek - Komórki nietransfekowane) / Całkowita liczba komórek) x 100 = Wydajność transfekcji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Obrazy na żywo neuronów niezatransfekowanych (Rysunek 3A) w porównaniu do neuronów zatransfekowanych (Rysunek 3B) wykazują, że znakowanie przeciwciałami (kolor czerwony lub zielony na każdym rysunku) jest wyraźnie widoczne wewnątrz komórek (Rysunek 3B, C, D). Po odessaniu i przemyciu medium w celu usunięcia przeciwciał znajdujących się między komórkami lub przylegających do ich powierzchni, znakowane przeciwciała nadal pozostają wewnątrz neuronów (Rysunek 3C, D). Aby obliczyć wydajność transfekcji, należy użyć oprogramowania Axiovision do wyznaczenia całkowitej liczby komórek w porównaniu do komórek, które nie zostały pomyślnie zatransfekowane. Wartości te wprowadzono do wzoru na wydajność transfekcji, aby uzyskać wydajność transfekcji jako procent całkowitej liczby komórek (Rysunek 4).
<img alt="Proces znakowania przeciwciał; schemat reakcji Atto 550 NHS, dializy i ustawienia wirowania." src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat blokowy procedur stosowanych do znakowania przeciwciał za pomocą estru Atto 550 NHS, a następnie kroków niezbędnych do zagęszczenia znakowanych przeciwciał. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Proces inkubacji komórek; wysiew komórek, odczynniki, przeciwciała; odsysanie medium; przygotowanie mieszaniny odczynników." src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2. Schemat procedur wykorzystywanych do transfekcji znakowanych przeciwciał do żywych komórek w hodowli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<img alt="Obrazy mikroskopowe morfologii komórek; kontrast i markery fluorescencyjne na hodowlanych komórkach, skala 20 μm." src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Obrazy żywych neuronów po 48 h od transfekcji.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, wyróżnione struktury komórkowe, schemat, skala 20 µm, analiza naukowa." src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obrazy po utrwaleniu i przemyciu z policzonymi zdarzeniami w celu określenia wydajności transfekcji.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li>
<li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA%2C+DNA-binding+proteins%2C+and+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Rheum.+Dis.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li>
<li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li>
<li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry%3A+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li>
<li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons%3A+implications+for+molecular+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li>
<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
<li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li>
<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+%27passive+transfer%27+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li>
<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W celu weryfikacji hipotez dotyczących konkretnych cząsteczek i ich ekspresji, do komórek powszechnie transfekuje się geny i inne wektory. Unikalnym aspektem tej procedury jest możliwość łatwej transfekcji przeciwciał do komórek docelowych. Przeprowadziliśmy tę metodę w pięciu oddzielnych eksperymentach, każdy w dwóch powtórzeniach. Wyniki wydajności transfekcji były podobne we wszystkich eksperymentach. Co istotne, metoda ta umożliwia wprowadzenie przeciwciał do komórki bez zmiany ich struktury lub funkcji. Ponadto, dzi...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny AxioObserver A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision wersja 4.2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-rhnRNPA1</td><td>Abcam</td><td>Ab4791</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-rIgG znakowane FITC</td><td>OZ Biosciences</td><td>AI20100</td><td></td></tr><tr><td>Atto550 NHS ester</td><td>Sigma</td><td>92835</td><td></td></tr><tr><td>Ab-DeliverIN</td><td>OZ Biosciences</td><td>AI20100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 +10% FBS+1% antybiotyków</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy hodowlane 8-dołkowe z poli-D-lizyną</td><td>BD</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Rotator wielofunkcyjny</td><td>Scientific Industries Inc</td><td>Model 151</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe z DAPI</td><td>Millipore</td><td>S7113</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Ambion</td><td>9626</td><td></td></tr><tr><td>Dializator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (roztwór 4%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transfekcja przeciwciał do neuronów jako narzędzie do badania patogenezy chorób

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Przeciwciała umożliwiają uzyskanie nowej wiedzy na temat różnych zjawisk zachodzących w układach żywych. Zdolność do produkcji wysoce specyficznych przeciwciał przeciwko białkom docelowym pozwoliła na rozstrzygnięcie bardzo precyzyjnych pytań biologicznych. Co istotne, przeciwciała są zaangażowane w patogenezę szeregu chorób ludzkich, w tym tocznia rumieniowatego układowego (SLE), reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), zespołów paraneoplastycznych, stwardnienia rozsianego (MS) oraz mielopatii towarzyszącej ludzkiemu limfotropowemu wirusowi T typu 1 (HTLV-1)/tropikalnej spastycznej paraparezy (HAM/TSP) 1-9. Sposób, w jaki przeciwciała wywołują chorobę, jest przedmiotem trwałych badań, a dane sugerują, że oddziaływania między przeciwciałami a różnymi cząsteczkami wewnątrzkomórkowymi prowadzą do stanu zapalnego, zaburzeń przekazywania sygnałów komórkowych oraz apoptozy 10. Wykazano, że pacjenci z MS i HAM/TSP wytwarzają autoprzeciwciała przeciwko wewnątrzkomórkowemu białku wiążącemu RNA, heterogennemu białku rybonukleoproteinowemu A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Niedawne dane wskazują, że przeciwciała przeciwko antygenom zarówno wewnątrzneuronalnym, jak i powierzchniowym są patogenne 3, 5-9, 11. Zatem procedura umożliwiająca badanie wewnątrzkomórkowych oddziaływań przeciwciało:białko dostarczyłaby cennych informacji na temat patogenezy chorób.
Geny są powszechnie transfekowane do pierwotnych komórek i linii komórkowych w kulturze, jednak transfekcja przeciwciał do komórek była utrudniona przez zmiany w strukturze przeciwciał lub niską wydajność transfekcji 12. Inne metody transfekcji obejmują transfekcję przeciwciał opartą na liposomach kationowych (składających się z DOTAP/DOPE) oraz polietylenoiminach (PEI); obie metody te doprowadziły do dziesięciokrotnego spadku transfekcji przeciwciał w porównaniu z grupami kontrolnymi 12. Metoda zastosowana w naszym badaniu jest podobna do metod opartych na lipidach kationowych i wykorzystuje mechanizm lipidowy do tworzenia kompleksów niekowalencyjnych z przeciwciałami poprzez oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe 13. Wykorzystaliśmy odczynnik Ab-DeliverIN, który jest formulacją lipidową zdolną do wychwytywania przeciwciał poprzez niekowalencyjne oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe oraz dostarczania ich do wnętrza komórek. W związku z tym wiązania chemiczne i genetyczne nie są konieczne do dostarczenia funkcjonalnych przeciwciał do żywych komórek. Metoda ta umożliwiła nam przeprowadzenie różnych eksperymentów z tropieniem przeciwciał i lokalizacją białek, a także analizy molekularnych następstw wewnątrzkomórkowych oddziaływań przeciwciało:białko 9.
W niniejszym protokole przedstawimy sposób szybkiej i powtarzalnej transfekcji przeciwciał do neuronów z wysoką wydajnością. Jako przykład wykorzystamy przeciwciała anty-hnRNP A1 oraz anty-IgG. W celu łatwej kwantyfikacji wydajności transfekcji zastosowano przeciwciała anty-hnRNP A1 znakowane Atto-550-NHS oraz IgG znakowane FITC. Atto550 NHS to nowy znacznik o wysokiej absorpcji molekularnej i wydajności kwantowej. Źródło wzbudzenia i filtry fluorescencyjne dla Atto550 są zbliżone do tych dla Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Dodatkowo Atto550 charakteryzuje się wysoką fotostabilnością. IgG znakowane FITC posłużyło jako kontrola, aby wykazać, że metoda ta jest uniwersalna i niezależna od rodzaju barwnika. Podejście to oraz generowane za jego pomocą dane pomogą w zrozumieniu roli, jaką przeciwciała skierowane przeciwko wewnątrzkomórkowym antygenom docelowym mogą odgrywać w patogenezie ludzkich chorób.

Opisano szybką metodę badania interakcji oraz wpływu na mechanizmy molekularne związane z obecnością przeciwciał w środowisku wewnątrzkomórkowym. Metoda ta polega na transfekcji przeciwciał do żywych komórek przy użyciu tworzenia kompleksów niekowalencyjnych w oparciu o formulację lipidową. Technika ta jest możliwa do zastosowania w unieśmiertelnionych liniach komórkowych oraz komórkach pierwotnych.

Transfekcja przeciwciał do neuronów jako narzędzie do badania patogenezy chorób

Przeciwciała umożliwiają uzyskanie nowej wiedzy na temat różnych zdarzeń zachodzących w systemach żywych. Zdolność do produkcji wysoko specyficznych...

Celem niniejszej procedury jest zapewnienie szybkiego i powtarzalnego podejścia do badania przeciwciał oraz molekularnych mechanizmów auto związanych z funkcją neuronów i patogenezą chorób neurologicznych. W pierwszej kolejności przeciwciała są znakowane fluorescencyjną etykietą ATO five 50 NHS. Następnie przeciwciała są mieszane z odczynnikiem do transfekcji, a następnie transfektowane do komórek neuronalnych.W hodowli, 48 godzin po transfekcji, neurony są utrwalane i montowane w medium DPI, a następnie wizualizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wydajność transfekcji można obliczyć przy użyciu oprogramowania do analizy obrazów. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki i neuroimmunologii, takie jak wpływ autoprzeciwciał na mechanizmy molekularne związane z funkcją neuronów oraz patogenezę neurologicznych chorób o podłożu immunologicznym.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy przetestować hipotezę, że przeciwciała przeciwko hRPA1 oraz białko wiążące RNA nadekspresjonowane w neuronach przyczyniają się do mechanizmu neurodegeneracji; procedurę tę demonstruje Josh Douglas, student studiów doktoranckich. Przed rozpoczęciem procedury należy upewnić się, że dzień przed eksperymentami dostępne są wysokiej jakości, nienaruszone komórki neuronalne wysiane w zagęszczeniu 100 000 komórek na dołek, o konfluencji co najmniej 80%. W dniu przeprowadzenia analizy należy zaobserwować komórki, aby upewnić się, że są zdrowe.Zacznij od przygotowania 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu poprzez zmieszanie 8,4 g wodorowęglanu sodu i 29,2 g chlorku sodu w jednym litrze wody. Następnie dostosuj pH buforu do wartości 8,4 w 500 µL buforu. Dodaj 70 µL przeciwciała do transfekcji, w tym przypadku anty-H-N-R-N-P-A1, oraz 35 µL odczynnika znakującego, tutaj NHS-NHS-O50.Roztwór inkubować w rotatorze w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie wprowadzić do dializatora i dializować w dwóch litrach PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia użyć kolumny wirowej, aby skoncentrować zdializowane znakowane przeciwciało. Na koniec oznaczyć stężenie przeciwciała za pomocą spektrofotometru NanoDrop.Na szkiełku z ośmioma dołkami wysiej 10 000 komórek na dołek w objętości 500 µL kompletnego DMEM. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez noc lub do momentu, aż konfluencja komórek osiągnie co najmniej 70%. Po osiągnięciu 70% konfluencji rozpocznij procedurę, mieszając w probówce Eppendorf 2 µL przeciwciała, odczynniki do transfekcji oraz 2 µg znakowanego przeciwciała o stężeniu 0,5 µg/µL, a następnie inkubuj roztwór przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej.W tym czasie należy usunąć SUP natum z dołków hodowli komórkowej i zastąpić go dokładnie 394 µL świeżego medium na każdy dołek. Po przygotowaniu roztworu do transfekcji należy dodać 100 µL DMEM i wymieszać, pipetując roztwór w górę i w dół. Następnie do każdego dołka z komórkami należy dodać dokładnie 106 µL mieszaniny do transfekcji, aby uzyskać końcową objętość 500 µL na dołek.Należy pamiętać o uwzględnieniu studzienki kontrolnej negatywnej z komórkami NIETRANSFEKTOWANYMI, w której zamiast przeciwciała dodaje się DMEM. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po tej inkubacji wymienić pożywkę na świeży DMEM, a następnie przeprowadzić obrazowanie na żywo przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego 48 godzin po znakowaniu.Aby zwizualizować pięć przeciwciał znakowanych ATO 50 NHS, należy użyć filtra SI 3; po obrazowaniu na żywo odessać medium i utrwalić komórki, dodając 4%paraldehyd i inkubując preparat przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu komórek przemyć je cztery razy w PBS, zachowując pięciominutowy czas inkubacji w PBS podczas każdego płukania. Następnie usunąć PBS i dodać kroplę medium montażowego zawierającego DPI.Do każdej studzienki delikatnie połóż szkiełko nakrywające na komórki, korzystając z mikroskopu fluorescencyjnego. Rozpocznij obrazowanie komórek. W tym eksperymencie przeprowadzono fluorescencyjne obrazowanie żywych neuronów pomyślnie przetransfekowanych przeciwciałami anty-H-N-R-N-P-A one znakowanymi ATO five 50 NHS.Na tym obrazie widoczne są przeciwciała wewnątrz komórek neuronalnych, w tym w cytoplazmie i wypustkach neuronalnych, a także utrwalenie i barwienie jądra komórkowego. Zastosowanie DPI, widocznego tutaj na niebiesko, pozwala na określenie wydajności transfekcji poprzez podzielenie liczby komórek transfektowanych przez całkowitą liczbę komórek. W tym przypadku, po zastosowaniu tej procedury, wydajność wynosi 50%.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak kolokalizacja przeciwciał w organellach komórkowych, a także zmiany w funkcji i integralności neuronów związane ze specyficznością przeciwciała względem antygenu docelowego, można zastosować inne metody, takie jak immunocytochemia, ekstrakcja RNA, analiza mikromacierzy oraz western blot. W tym filmie pokazaliśmy, jak znakować przeciwciała znacznikiem fluorescencyjnym, przygotowywać kompleks odczynnika do transfekcji z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami, przeprowadzać transfekcję neuronów oraz obliczać wydajność transfekcji. Metoda ta jest przydatna w ocenie wpływu autoprzeciwciał na funkcje komórkowe, takie jak żywotność, apoptoza, transport neuronalny, a także w badaniu mechanizmów molekularnych związanych z funkcją neuronów i patogenezą chorób neurologicznych.

antibody-transfection-into-neurons-as-tool-to-study-disease

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje proces transdukcji ludzkich komórek nerwowych za pomocą lentiwirusa kodującego zmutowane ludzkie białko tau oznaczone żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP) w celu zbadania agregacji białek. Przedstawia etapy od wniknięcia wirusa do ekspresji zmutowanego tau, których kulminacją jest tworzenie widocznych cytoplazmatycznych agregatów tau w neuronach.

Transdukcja ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa do analizy agregacji białka Tau

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Kontrolowanie ekspresji białek jest nie tylko niezbędne dla każdego żyjącego organizmu, ale także stanowi ważną strategię badania funkcji białek w modelach komórkowych. Przedstawiony protokół przedstawia zastosowanie interferencji przeciwciał w komórkach ssaków, w tym w pierwotnych neuronach hipokampa, a także demonstruje zastosowanie trójwymiarowych rekonstrukcji w badaniu funkcji białek.

Badanie funkcji białek i roli zmienionej ekspresji białek przez interferencję przeciwciał i rekonstrukcje trójwymiarowe

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób lokalne dostarczanie genów za pośrednictwem wektorów wirusowych zapewnia atrakcyjny sposób ekspresji transgenów w ośrodkowym układzie nerwowym.  Protokół określa wszystkie kluczowe kroki w celu wykonania wstrzyknięcia wektora wirusowego w istotę czarną szczura w celu opracowania opartego na wektorze wirusowym modelu zwierzęcego dla choroby Parkinsona.

Opracowanie szczurzego modelu choroby Parkinsona opartego na alfa-synukleinie poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie rekombinowanego wektora wirusowego związanego z adenowirusem

Wstrzyknięcie dordzeniowe rekombinowanego rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) może być użyte do manipulowania dowolnym genetycznie znakowanym typem komórki w rdzeniu kręgowym. Tutaj opisujemy, jak transdukować neurony w rogu grzbietowym lędźwiowego rdzenia kręgowego. Technika ta umożliwia funkcjonalne badanie zmanipulowanego podtypu neuronu.

Ekspresja transgenu za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem w genetycznie zdefiniowanych neuronach rdzenia kręgowego

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, w której ludzkie kultury neuronalne są transdukowane za pomocą lentiwirusowych konstruktów kodujących zmutowane ludzkie tau. Transdukowane kultury wykazują agregaty tau i związane z nimi patologie.

Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu to nowa kategoria chorób ośrodkowego układu nerwowego wywołanych przez przeciwciała. Neurony hipokampa mogą być wykorzystane do odkrycia i scharakteryzowania tych przeciwciał. W artykule przedstawiono protokół pierwotnej hodowli komórek i barwienia immunologicznego w celu określenia autoprzeciwciał w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów.

Hodowle neuronów hipokampa w celu wykrywania i badania nowych patogennych przeciwciał zaangażowanych w autoimmunologiczne zapalenie mózgu

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj szybką metodę transfekcji przeciwciał do neuronów w celu badania patogenezy chorób neurologicznych. Technika fluorescencyjna umożliwia wizualizację interakcji auto-przeciwciał z komórkami nerwowymi.

Transfekcja przeciwciał do neuronów jako narzędzie do badania patogenezy chorób

Przeglądaj więcej filmów