Name: Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgowej myszy i hipokampie za pomocą elektroporacji in utero (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in utero do wizualizacji i manipulacji genetycznej dendrytów oraz kolców w korze mózgowej i hipokampie myszy. Technika ta umożliwia szybkie badanie rozwoju neuronów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować dr Kathleen Mathers, dr. Jean-Philippe'owi Mocho oraz dr Yolandzie Saavedra Torres za pomoc w przeprowadzeniu elektroporacji in utero w warunkach aseptycznych, a także Hayley Wood za pomoc w przygotowaniu rysunków.
E.P. otrzymał wsparcie w ramach długoterminowego stypendium Federation of European Biochemical Societies (FEBS) oraz stypendium rozwojowego dla pracowników naukowych Medical Research Council (MRC), M.A.H. dzięki grantowi Wellcome Trust przyznanemu Elizabeth Fisher i Victorowi Tybulewiczowi (080174/B/06/Z), H.W. poprzez długoterminowe stypendium EMBO, a R.A. dzięki stypendium doktorskiemu MRC. Praca ta była finansowana z grantu projektowego Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) oraz z grantu Medical Research Council (U117570528) przyznanego F.G.

W Wielkiej Brytanii myszy są utrzymywane, hodowane i traktowane zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Home Office na podstawie ustawy Animal (Scientific Procedures) Act 1986.
1. Przygotowanie: roztwór DNA i igły
<ol>
	<li>Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do Maxi-prep wolnego od endotoksyn. Przygotuj roztwór plazmidowego DNA do wstrzykiwania o pożądanych stężeniach w wodzie i dodaj Fast Green (stężenie końcowe 0,05%), aby umożliwić wizualizację wstrzyknięć. Wydajność elektroporacji jest silnie zależna od stężenia DNA. Zazwyczaj stosuje się stężenie 1 μg/μl. Stężenie to jest wystarczające do wizualizacji elektroporowanych neuronów bez wpływu na ich rozwój. Jednakże, w zależności od promotora zastosowanego w wektorze plazmidowym (niski poziom ekspresji przy promotorze/enhancerze cytomegalowirusowym, wysoki poziom ekspresji przy promotorze będącym fuzją wczesnego enhancera cytomegalowirusowego i promotora β-aktyny kurczaka (CAG)) oraz wielkości i stabilności ekspresjonowanego białka, stężenie to można dostosować (od 0,25 μg/μl do 5 μg/μl).</li>
	<li>Wyciągnij szklane igły za pomocą wyciągarki do mikropipet.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do zabiegu
<ol>
	<li>Zautoklawuj narzędzia chirurgiczne oraz roztwór soli fosforanowej (PBS).</li>
	<li>Przygotuj roztwór przeciwbólowy w PBS (Buprenorphine, Vetergesic, stężenie końcowe 30 μg/ml). Zważ ciężarną mysz i wstrzyknij podskórnie 0,1 mg/kg Vetergesic co najmniej 30 minut przed operacją. W tym czasie przygotuj pole operacyjne. Włącz podkładki grzewcze oraz komorę rekonwalescencyjną. Umieść sterylny PBS w ciepłej łaźni wodnej, a wszystkie sterylne narzędzia i materiały na sterylnych obrusach. Umieść elektrody platynowe w zlewce wypełnionej PBS i podłącz je do elektroporatora. Napełnij igłę roztworem DNA za pomocą końcówki mikrodozownika, podłącz igłę do uchwytu kapilarnego i odciśnij końcówkę igły pęsetą.</li>
</ol>
3. Operacja poprzedzająca wstrzyknięcie DNA i elektroporację
<ol>
	<li>Zanurz ciężarną mysz (E14.5-E15.5) w izofluranie w nośniku tlenowym (tlen 2 l/min), korzystając z komory indukcyjnej do znieczulania. Odczekaj, aż zwierzę straci odruch prostowania ciała.</li>
	<li>Przenieś zwierzę pod maskę „przedoperacyjną”. Na każde oko nanieś kroplę żelu do oczu, aby zapobiec owrzodzeniu rogówki podczas znieczulenia ogólnego matki. Użyj golarki elektrycznej, aby ogolić włosy z brzucha. Przetrzyj ogolony obszar raz chloreksydyną, aby usunąć luźne włosy.</li>
	<li>Przenieś zwierzę pod drugą maskę w obszarze chirurgicznym. Połóż mysz grzbietem na podkładce grzewczej. Rozpocznij operację po ustąpieniu odruchu łapy.</li>
	<li>Załóż maseczkę i sterylne rękawiczki. Przykryj zwierzę sterylnym polem operacyjnym (z małym otworem nad brzuchem), aby zapobiec zanieczyszczeniu tkanek i instrumentów przez obszary skóry, które nie zostały ogolone i zdezynfekowane. Oczyść ogolony obszar co najmniej 3 razy chloreksydyną. Za każdym razem używaj innego sterylnego patyczka bawełnianego. Za pomocą skalpela wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej (długością ok. 1 cala) przez skórę. Za pomocą nożyczek wykonaj podobne nacięcie mięśni brzucha wzdłuż linea alba (białej linii składającej się głównie z kolagenowej tkanki łącznej).</li>
	<li>Wybierz najbardziej dostępne embriony, umieść kleszczyki pierścieniowe między dwoma embrionami i ostrożnie wyciągnij łańcuch embrionalny z jamy brzusznej. Od tego momentu utrzymuj nawilżenie embrionów, używając sterylnego, wstępnie podgrzanego PBS.</li>
</ol>
Do wizualizacji nie jest wymagany mikroskop.
4. Iniekcja DNA i elektroporacja
<ol>
	<li>Zacznij od jednego z najbardziej bocznych zarodków, co ułatwi monitorowanie tego, które zarodki zostały poddane elektroporacji. Nie ciągnij zbyt mocno zarodków, ponieważ zwiększy to ryzyko krwotoku. Manipuluj pozycją zarodka wewnątrz pęcherzyka owodniowego za pomocą kleszczyków pierścieniowych i ustabilizuj głowę zarodka między pierścieniami. Ściśnij delikatnie, aby przesunąć zarodek bliżej ściany macicy.</li>
	<li>Drugą ręką chwyć uchwyt kapilary i ostrożnie wprowadź igłę w środek półkuli, celując w komorę boczną. Naciśnij pedał, aby wstrzyknąć około 1 μl roztworu DNA zmieszanego z Fast Green (mniej niż 1 μl w przypadku badań dendrytów). Powinieneś zaobserwować wypełnianie komory bocznej zielonym barwnikiem. Kroki krytyczne: - Ostrość igły jest kluczowa dla prawidłowego przebicia ściany macicy. Ważne jest, aby zminimalizować ruch igły na powierzchni ściany macicy oraz po wprowadzeniu do komory, ponieważ powiększenie otworu spowoduje wyciek płynu owodniowego i śmierć zarodka. Unikaj przebijania naczyń krwionośnych w ścianie macicy, gdyż doprowadzi to do krwawienia i śmierci zarodka. 
	- Ważne jest, aby nie wstrzyknąć zbyt dużej objętości DNA do komory bocznej, ponieważ wywoła to wodogłowie (nie przekraczać 2 μl w stadium E14.5). Objętość DNA jest dostosowywana do celu eksperymentu. O ile w większości eksperymentów stosuje się zazwyczaj 1 μl, o tyle do analizy dendrytów i kolców wymagana jest mniejsza objętość DNA (około 0,5 μl). Rzeczywiście, należy celować w kilka wyizolowanych komórek, aby móc zwizualizować i zmierzyć drzewko dendrytyczne elektroporowanych neuronów.</li>
	<li>Umieść elektrody po bokach głowy zarodka, z elektrodą dodatnią (+) po tej samej stronie co wstrzyknięta komora w przypadku elektroporacji kory lub po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory w przypadku elektroporacji hipokampa (Rycina 2). Następnie przyłóż pięć impulsów elektrycznych 30 V (czas trwania 50 msec) w odstępach 1 sec. Krok krytyczny: Unikaj przepuszczania prądu przez łożysko, ponieważ spowoduje to śmierć zarodka. 
	Wszystkie zarodki u ciężarnej myszy mogą zostać poddane elektroporacji, zazwyczaj z użyciem tego samego konstruktu DNA, aby uniknąć pomyłek. Jednak długi czas trwania zabiegu zmniejsza przeżywalność zarodków. Jama brzuszna nie powinna pozostawać otwarta dłużej niż 30 min.</li>
</ol>
5. Operacja po elektroporacji
<ol>
	<li>Po przeprowadzeniu elektroporacji zarodków, wstrzyknij PBS do jamy brzusznej i za pomocą kleszczy pierścieniowych umieść róg macicy w jego pierwotnym położeniu. Zaszyj ścianę brzucha oraz skórę, używając wchłanialnych nici Vicryl.</li>
	<li>Umieść zwierzę w komorze wybudzeniowej do czasu odzyskania przytomności (zazwyczaj 5-10 min), a następnie przenieś je do klatki ustawionej na macie grzewczej.</li>
</ol>
6. Po operacji
Należy monitorować zachowanie myszy w celu oceny bólu, cierpienia lub stresu oraz zważyć zwierzęta 24 h i 48 h po operacji. W razie potrzeby można podać leki przeciwbólowe, aby zminimalizować ból i dyskomfort.
7. Obróbka tkanki
Zabierz elektroporowane zarodki lub pisklęta w stadiach embrionalnych lub postnatalnych wymaganych dla danego eksperymentu.
- Do analizy na etapach embrionalnych (na przykład w celu zbadania proliferacji lub migracji komórek): 
Uśmierć matkę poprzez zwichnięcie szyi i pobierz embriony. Po oddzieleniu głowy wybierz mózgi, które zostały prawidłowo poddane elektroporacji, co można stwierdzić na podstawie ilości i lokalizacji sygnału fluorescencyjnego, wizualizowanego przez czaszkę za pomocą binokularu fluorescencyjnego. Wypreparuj mózg z czaszki i utrwal go przez noc w 4% PFA, a następnie umieść na noc w 20% sacharozie / PBS. Zatop w związku OCT, zamroź w temperaturze -80 °C i wykonaj przekroje za pomocą kriotomu.
- Do analizy w etapach postnatalnych (na przykład w celu badania dendrytów i kolców): 
Uśpić szczenięta lub dorosłe myszy poprzez dostrzyk peritonealny pentobarbitalu (40-60 mg/kg), a następnie przeprowadzić perfuzję transkardialną z użyciem PBS, a następnie 4% PFA w PBS. Wyjąć mózgi z czaszki i przeprowadzić postfiksację w 4% PFA przez noc. Po przemyciu w PBS, wykonać skrawki mózgu za pomocą wibratomu (skrawki o grubości 100 μm do analizy dendrytów). Zamontować skrawki w Aqua Poly/mount, używając szkiełek nakrywkowych o grubości 0.16-0.19 mm, aby obrazować dendryty i kolce.
8. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 3 przedstawia przykłady komórek poddanych elektroporacji w korze mózgowej (Rysunki 3A, B), w obszarze CA1 (Rysunki 3C, D) oraz w zakręcie zębatym hipokampa (Rysunki 3E, F). Myszy typu dzikiego poddano elektroporacji w dniu E14.5 z zastosowaniem konstruktu GFP (pCA-b-EGFPm5 silencer 3), a mózgi pobrano w 14. dniu po urodzeniu (P14). Poprzez wstrzyknięcie niewielkiej objętości roztworu DNA (0,5 μl lub mniej roztworu o stężeniu 1 μg/μl) oznakowano kilka komórek, co pozwala na wizualizację arboryzacji dendrytycznej pojedynczych komórek GFP+ (Rysunek 3), a także ich kolców przy większym powiększeniu (Rysunek 4).
<img alt="Schemat porównania morfologii neuronalnej, konstrukt GFP, elektroporacja shRNA X, indukcja tamoksyfenem." src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie protokołów elektroporacji, które mogą być wykorzystane do badania dendrytów i kolców dendrytycznych. (A) Elektroporacja konstruktu GFP w celu porównania dendrytów i kolców u myszy typu dzikiego oraz mutantów. (B) Elektroporacja GFP-shRNA (GFP jest ekspresowany z tego samego konstruktu) w celu porównania dendrytów i kolców u myszy poddanych elektroporacji konstruktem shRNA specyficznym dla badanego genu (X) lub kontrolnym shRNA. (C) Metodę IUE można stosować wraz z systemem indukowalnym Cre, aby ograniczyć ekspresję shRNA do pożądanego okresu czasu. W tym doświadczeniu wektor wykazujący formę rekombinazy Cre, która może być aktywowana przez 4-hydroksytamoksyfen (CAG-ERT2CreERT2; 1 μg/μl) 10, jest elektroporowany wraz z wektorem wykazującym specyficzne shRNA w sposób zależny od Cre (1 μg/μl) oraz wskaźnikiem rekombinacji (konstrukt CALNL-GFP, ekspresja GFP indukowana przez Cre; 1 μg/μl) 10. Efektywność knockdownu można poprawić poprzez zwiększenie stężenia shRNA, a także zwiększenie stężenia CAG-ERT2CreERT2.
<img alt="Schemat techniki wstrzykiwania do mózgu, widoki czołowy i od góry, z naciskiem na korę mózgową i hipokamp." src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kontrola przestrzenna elektroporacji. Na tym rysunku przedstawiono, w których miejscach należy umieścić elektrody płytkowe w zależności od miejsca wstrzyknięcia DNA, aby skierować działanie na korę mózgową lub hipokamp.
<img alt="Struktura neuronalna w korze i hipokampie; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza sieci neuronów." src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wizualizacja drzewa dendrytycznego komórek poddanych elektroporacji in utero w korze mózgowej i hipokampie. (A, B) Przekroje czołowe ukazujące komórki piramidalne GFP+ w korze mózgowej, (C-D) komórki piramidalne w obszarze CA1 hipokampa oraz (E, F) komórki ziarniste w zakręcie zębatym w dniu P14. Konstrukt GFP (pCA-b-EGFPm5 silencer 3) został wprowadzony metodą elektroporacji w dniu E14.5. Zdjęcia przy większym powiększeniu (B, D, F) wykazują, że IUE jest wydajną metodą wizualizacji dendrytów. Paski skali oznaczają 50 μm (B, D i F) oraz 150 μm (A, C, E).
<img alt="Mikroskopia obrazowania dendrytów neuronalnych, analiza struktury fluorescencyjnej, obserwacja synaps." src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wizualizacja kolców dendrytycznych w neuronach P14, które zostały poddane elektroporacji in utero w stadium E14.5 konstruktem wykazującym ekspresję GFP. (A, B) Obrazy kolców o dużym powiększeniu z dendrytów bazalnych neuronów piramidalnych hipokampa. Paski skali reprezentują 5 μm (A) oraz 2 μm (B).

<ol><li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37(2011).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li>
<li>Castro, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+the+proneural+factor+Ascl1+in+progenitor+proliferation+identified+by+genome-wide+characterization+of+its+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets.</a> Genes Dev. 25, 930-945 (2011).</li>
<li>Pacary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69, 1069-1084 (2011).</li>
<li>Marteau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2+regulates+cortical+neurogenesis+in+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon.</a> Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).</li>
<li>Ramon Moliner, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamon+Moliner%2C+E+%22Comparative+Methods+in+Neuroanatomy%22">Comparative Methods in Neuroanatomy</a>. , Springer. New york. (1970).</li>
<li>Banks, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+other+phenotypes+in+a+cytoplasmic+Dynein+light+intermediate+chain+1+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse.</a> J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).</li>
<li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. ong-term <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li>
<li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

IUE (elektroporacja in utero) jest potężnym narzędziem do manipulowania ekspresją genów nie tylko w przestrzeni, ale także w czasie. Wykazujemy tutaj, że technikę tę można wykorzystać do wizualizacji i genetycznej manipulacji dendrytami oraz kolcami dendrytycznymi w korze mózgowej i hipokampie myszy. Poza wcześniej wymienionymi zaletami warto zauważyć, że IUE, w przeciwieństwie do metody Golgiego, może być łączona z immunohistochemią lub hybrydyzacją in situ, co pozwala na przykład na fenotypowanie elektroporowanych komórek. Należy również wspomnieć, że procedura ta nie wywołuje wyraźnych malformacji mózgu pomimo swojej względnej inwazyjności. Ponadto, na poziomie komórkowym, IUE nie modyfikuje właściwości elektrofizjologicznych elektroporowanych neuronów13. Choć nasza demonstracja koncentruje się na wizualizacji morfologii dendrytycznej i kolców, IUE neuronów korowych lub hipokampalnych w dniu E14.5 mogłaby być również wykorzystana do badania innych zdarzeń rozwojowych, takich jak formowanie i prowadzenie aksonów. Co więcej, ten sam rodzaj protokołu można wdrożyć w innych etapach rozwoju embrionalnego w celu ukierunkowania na różne populacje. Na przykład, w dniu E18.5 można przeprowadzić bardzo późny paradygmat elektroporacji kory w celu wywołania ekspresji w progenitorach astrocytarnych 1. Podobnie, podczas gdy elektroporacja hipokampa w dniu E14.5 pozwala na jednoczesne ukierunkowanie na progenitory neuronów piramidalnych CA1-CA3 oraz progenitory komórek ziarnistych zakrętu zębatego, późna elektroporacja hipokampa (E18.5 lub wczesny okres postnatalny) pozwoliłaby na ukierunkowanie na inne progenitory komórek ziarnistych zakrętu zębatego 14. W takim przypadku można zwiększyć zarówno wstrzykniętą objętość DNA, jak i natężenie prądu. 
Transgeny wprowadzone za pomocą IUE wydają się pozostawać episomalne, w związku z czym są tracone przez komórki w wyniku kolejnych podziałów komórkowych. Jednak w komórkach postmitotycznych, takich jak neurony, episomalne transgeny pozostają aktywne przez wiele miesięcy po elektroporacji, co umożliwia prowadzenie długoterminowych badań 13,15. W naszym badaniu zaobserwowano jasno świecące komórki GFP+ do 7 tygodnia po urodzeniu (ostatni analizowany punkt czasowy), co wskazuje, że embrjonalne targetowanie prekursorów neuronów korowych lub hipokampalnych przy użyciu IUE skutkuje trwałą ekspresją transgenu od wczesnych etapów rozwoju aż do wieku dorosłego.
Obecnym ograniczeniem tej techniki jest trudność w precyzyjnej kontroli całkowitej liczby elektroporowanych komórek. Wykazaliśmy jednak, że poprzez zmniejszenie objętości wstrzykiwanego roztworu DNA możliwe jest oznakowanie zaledwie kilku komórek oraz wizualizacja arboryzacji dendrytycznej wyizolowanych komórek GFP+, a także ich kolców dendrytycznych. Wymiary obszaru transfekcji można również dostosować poprzez modyfikację parametrów elektroporacji, takich jak natężenie prądu i liczba impulsów lub średnica elektrod do elektroporacji.
Podsumowując, IUE jest metodą łatwą w implementacji, szybką i wydajną, służącą do badania dendrytów i kolców in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Przygotowanie igieł i roztworu DNA do wstrzyknięcia&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Endofree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F-7258</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary z borokrzemowego szkła&lt;br/&gt; 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D.</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikroloaderów</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Do pipet Eppendorf 0.5 &amp;mu;l-10 &amp;mu;l / 2-20 &amp;mu;l</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materiały chirurgiczne&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ekstra cienkie nożyczki irydowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta zakrzywiona</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta pierścieniowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Igłotrzymacz</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Wchłanialna nić chirurgiczna Vicryl</td><td>Ethicon Inc (Johnson Johnson)</td><td>W9074</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne obłożenia 30cm x 45 cm</td><td>Buster</td><td>141765</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne tampony</td><td>Shermond</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Patyczki bawełniane</td><td>Clean Cross Co., Ltd</td><td>1860</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Vetergesic)</td><td>Alstoe Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorheksydyna</td><td>Vetasept</td><td>XHG007</td><td></td></tr><tr><td>Żel do oczu Viscotears</td><td>Novartis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Abbott Laboratories</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Pentoject, pentobarbital sodu 20%</td><td>Animalcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Elektroporacja&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa elektroda Tweezertrode 5mm</td><td>BTX, Harvard Apparatus</td><td>45-0489</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinkektor Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>5247000030</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik nożny do mikroinkektora Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>5247623002</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt kapilarny</td><td>Eppendorf</td><td>5176190002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Obróbka tkanek&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>VWR (Prolabo)</td><td>27480.294</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka przedmiotowe</td><td>ThermoScientific (Menzel-Gl&amp;#228;ser)</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Menzel-Gl&amp;#228;ser</td><td></td><td>22 x 50 mm #1,5</td></tr><tr><td>Aqua Poly/mount</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18606</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Elektroporacja in utero (IUE) stała się potężną techniką badania rozwoju różnych obszarów embrionalnego układu nerwowego 1-5. Do tej pory narzędzie to było szeroko wykorzystywane do badania regulacji proliferacji komórkowej, różnicowania oraz migracji neuronalnej, szczególnie w rozwijającej się korze mózgu 6-8. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisujemy protokół elektroporacji in utero kory mózgu oraz hipokampa i przedstawiamy dowody na to, że podejście to może być wykorzystane do badania dendrytów i kolców w tych dwóch regionach mózgowia.
Wizualizacja i manipulacja neuronami w kulturach pierwotnych przyczyniły się do lepszego zrozumienia procesów zaangażowanych w rozwój dendrytów, kolców i synaps. Jednak neurony hodowane in vitro nie są narażone na wszystkie sygnały fizjologiczne, które mogą wpływać na tworzenie i utrzymanie dendrytów i/lub kolców podczas normalnego rozwoju. Nasza wiedza na temat struktur dendrytów i kolców in vivo u myszy typu dzikiego lub mutantów pochodzi głównie z obserwacji z wykorzystaniem metody Golgiego-Coxa 9. Jednakże barwienie metodą Golgiego uznaje się za nieprzewidywalne. Rzeczywiście, grupy komórek nerwowych i pęczki włókien są znakowane w sposób losowy, przy czym niektóre obszary często wydają się całkowicie zabarwione, podczas gdy obszary sąsiadujące są pozbawione barwienia. Niedawne badania wykazały, że IUE konstruktów fluorescencyjnych stanowi atrakcyjną alternatywną metodę badania dendrytów, kolców, a także synaps u myszy mutantów / typu dzikiego 10-11 (Rycina 1A). Ponadto w porównaniu z generowaniem myszy z nokautem, IUE reprezentuje szybkie podejście do przeprowadzania badań nad uzyskaniem i utratą funkcji w specyficznej populacji komórek w określonym oknie czasowym. Dodatkowo IUE było z sukcesem stosowane w podejściach z indukowalną ekspresją genów lub indukowalnym RNAi w celu doprecyzowania kontroli czasowej nad ekspresją genu lub shRNA 12. Zalety IUE otworzyły tym samym nowe możliwości badania wpływu ekspresji/supresji genów na dendryty i kolce nie tylko w specyficznych strukturach mózgowych (Rycina 1B), ale także w konkretnym punkcie czasowym rozwoju (Rycina 1C).
Wreszcie, metoda IUE stanowi użyteczne narzędzie do identyfikacji funkcjonalnych interakcji między genami zaangażowanymi w rozwój dendrytów, kolców dendrytycznych i/lub synaps. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do innych metod transferu genów, takich jak wektory wirusowe, pozwala ona na łatwe łączenie wielu cząsteczek RNAi lub transgenów w tej samej populacji komórek.
Podsumowując, IUE jest potężną metodą, która przyczyniła się już do charakterystyki mechanizmów molekularnych leżących u podstaw funkcjonowania mózgu i rozwoju chorób, a powinna być również użyteczna w badaniach nad dendrytami i kolcami.

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Elektroporacja in utero (IUE) stała się potężną techniką badania rozwoju różnych obszarów embrionalnego układu nerwowego 1-5. Do tej pory...

Celem niniejszej procedury jest wykorzystanie elektroporacji in utero do wizualizacji oraz genetycznej manipulacji dendrytami i kolcami w korze mózgowej oraz hipokampie myszy. Jest to realizowane poprzez wstrzyknięcie odpowiedniego roztworu DNA plazmidowego do komory bocznej embrionów in utero, a następnie zastosowanie elektrod Palo w różnych pozycjach.Zgodnie z procedurą iniekcji DNA, poddawana electroporacji jest kora mózgowa lub hipokamp, a następnie oczekuje się na osiągnięcie pożądanego stadium postnatalnego lub dorosłego. Myszy są perfuzowane, a następnie pobierane są mózgi. Na koniec mózgi są cięte przy użyciu wibrotomu.Ostatecznie dendryty i kolce mogą być wizualizowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika jednostkowej elektroporacji oferuje kilka zalet w porównaniu z metodami badania dendrytów i kolców. W rzeczywistości technika ta umożliwia przede wszystkim badanie tego aspektu bezpośrednio in vivo.Ponadto, w porównaniu z tworzeniem myszy z nokautem, elektroporacja jest szybką metodą badania efektów supresji genu lub ekspresji genu w obrębie dendrytów i kolców, nie tylko w konkretnych strukturach komórkowych, ale także w określonym punkcie rozwoju. Wykorzystanie systemu indukowalnego w elektroporacji jest również użytecznym narzędziem do identyfikacji funkcjonalnych interakcji między genami zaangażowanymi w rozwój dendrytów i kolców. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do wirusów, łatwiej jest nam połączyć wiele cząsteczek RNA lub wielu genów w tej samej populacji komórek. Aby rozpocząć, należy rozcieńczyć DNA do pożądanych stężeń w wodzie i dodać barwnik Fast Green do stężenia końcowego 0,05%. Użyj mikro-wyciągacza do przygotowania szklanych igieł do iniekcji.Umieść ciężarną mysz w komorze do indukcji znieczulenia z użyciem izofluranu i ustaw przepływ tlenu na dwa litry na minutę. Gdy zwierzę straci odruch mrugania, przenieś je pod maskę przedoperacyjną. Na każde oko nanieś kroplę IGEL, a następnie za pomocą golarki elektrycznej usuń owłosienie z brzucha.Oczyść raz ogoloną okolicę chlorheksydyną, aby zebrać luźne włosy. Przenieś zwierzę do drugiej maski w obszarze chirurgicznym, kładąc je grzbietem na podkładce grzewczej. Rozpocznij operację, gdy ustąpi odruch z powiek.Załóż maseczkę oraz sterylne rękawiczki i przykryj zwierzę sterylnym obłożeniem. Oczyść ogoloną okolicę co najmniej trzykrotnie chlorheksydyną. Za pomocą skalpela wykonaj pionowe nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej.Używając nożyczek, wykonaj podobne nacięcie na mięśniu brzucha wzdłuż linii łokcia. Wybierz najlepiej dostępne embriony.Umieść kleszczyki pierścieniowe pomiędzy dwoma embrionami i ostrożnie wyciągnij łańcuch embrionalny z jamy brzusznej. Od tego momentu utrzymuj nawilżenie embrionów, używając sterylnego, podgrzanego wcześniej PBS. Użyj kleszczyków pierścieniowych.Delikatnie zmień położenie zarodka wewnątrz pęcherza owodniowego i ustabilizuj głowę pomiędzy pierścieniami. Ściśnij lekko, aby przesunąć zarodek w górę, bliżej ściany macicy. Drugą ręką weź uchwyt kapilary i ostrożnie wprowadź igłę w środek półkuli, celując w komorę boczną.Dbając o zminimalizowanie ruchu igły na powierzchni ściany macicy i unikając przebijania naczyń krwionośnych, naciśnij pedał, aby wstrzyknąć około 0,5 µl zielonego roztworu DNA. Umieść elektrody po bokach głowy embrionu, przy czym pedał dodatni powinien znajdować się po tej samej stronie co wstrzyknięta komora w przypadku elektroporacji kory, lub po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory w przypadku elektroporacji hipokampa. Następnie przyłóż pięć impulsów elektrycznych o napięciu 30 V i czasie trwania 50 ms w odstępach jednej sekundy.Należy unikać przepływu prądu przez łożysko, ponieważ spowoduje to śmierć embrionu. Aby zwiększyć szanse na przeżycie, należy wstrzyknąć substancje i przeprowadzić elektroporację wszystkich embrionów w czasie krótszym niż 30 minut. Po zakończeniu procedury należy przepłukać miejsce PBS, jamę brzuszną, a następnie za pomocą kleszczyków pierścieniowych umieścić róg macicy w pierwotnej lokalizacji. Do zamknięcia ściany brzucha i skóry należy użyć wchłanialnych szwów Vicryl. Zwierzę należy umieścić w komorze rekonwalescencyjnej aż do wybudzenia.Następnie przenieś zwierzę do klatki umieszczonej na podkładce grzewczej 24 i 48 godzin po operacji. Obserwuj zachowanie myszy w celu oceny bólu, cierpienia lub stresu oraz zważ zwierzę przed analizą mózgów. W etapach postnatalnych użyj wibrotomu do sekcjonowania uprzednio perfundowanych i postutrwalonych mózgów, a następnie zamocuj przekroje w medium aqua poly mount w celu obrazowania dendrytów i kolców.Rycina ta przedstawia przykłady elektroporowanych komórek w korze mózgowej, ciele komorowym oraz zakręcie zębatym hipokampa u myszy, u których przeprowadzono elektroporację w dniu E 14.5, wprowadzając konstrukt GFP, a mózgi pobrano w 14. dniu po urodzeniu. Poprzez wstrzyknięcie małej objętości roztworu DNA znakowanych jest tylko kilka komórek, co umożliwia wizualizację arboryzacji dendrytycznej izolowanych komórek GFP-dodatnich, a także ich kolców przy większym powiększeniu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wstrzyknięciu małej objętości DNA, aby objąć jedynie kilka komórek, co pozwoli na wizualizację i kwantyfikację kolców dendrytycznych lub neuronów elektroporowanych.

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgowej i hipokampie myszy za pomocą elektroporacji in utero

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Astrocyty jednolicie układają korę mózgową, co utrudnia analizę ich złożonej morfologii na poziomie komórkowym. Dostarczony tutaj protokół wykorzystuje wielokolorowe znakowanie oparte na elektroporacji in utero w celu wyodrębnienia astrocytów korowych i przeanalizowania ich objętości i morfologii za pomocą przyjaznego dla użytkownika potoku analizy obrazu.

Elektroporacja in utero wieloadresowalnych markerów kolorystycznych integrujących genom (MAGIC) w celu indywidualizacji astrocytów korowych myszy

Poznaj metodę elektroporacji in utero do wizualizacji i manipulacji genetycznej dendrytów oraz kolców w korze mózgowej i hipokampie myszy. Technika ta umożliwia szybkie badanie rozwoju neuronów in vivo.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Przeglądaj więcej filmów