Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgowej myszy i hipokampie za pomocą elektroporacji in utero
26 lipca 2012
Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji w macicy kory mózgowej i hipokampa przy E14.5 u myszy. Pokazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców w tych dwóch regionach mózgu.
Celem tej procedury jest zastosowanie in utero, elektroporacji, do wizualizacji i genetycznej manipulacji dendrytami i kolcami w korze mózgowej myszy i hipokampie. Osiąga się to poprzez uprzednie wstrzyknięcie pożądanego plazmidu, roztworu DNA do bocznej komory zarodków w macicy. Następnie, używając różnych pozycji elektrod Palo.
Zgodnie z wstrzyknięciem DNA, kora mózgowa lub hipokamp jest elektroporowany, a następnie pożądane stadium pourodzeniowe lub dorosłe. Myszy są perfundowane, a mózgi są zbierane. Na koniec mózgi są dzielone za pomocą vibramu.
Ostatecznie dendryty i kolce można uwidocznić za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika unitarnej elektroporacji ma kilka zalet w porównaniu z metodami badania kręgosłupa i kręgosłupa. Rzeczywiście, technika ta pozwala najpierw zbadać ten aspekt bezpośrednio in vivo.
Co więcej, w porównaniu z generacją myszy z nokautem w operacji elektrycznej jest to szybkie podejście do badania wpływu supresji genów lub ekspresji genów i zakładania bieli i kręgosłupa, nie tylko w określonej strukturze komórki, ale także w określonym momencie rozwoju. Wykorzystanie systemu indukowalnego w operacjach międzyelektrycznych jest również użytecznym narzędziem do identyfikacji funkcjonalnej interakcji między genami zaangażowanymi w zapis don a rozwój kręgosłupa. Rzeczywiście, w przeciwieństwie na przykład do wirusów, trudno jest nam połączyć wiele genów HNA lub wiele ton w tej samej populacji komórek Aby rozpocząć rozcieńczanie DNA do pożądanych stężeń w wodzie i dodawanie szybkiego zielonego barwnika do końcowego stężenia 0,05%Użyj ściągacza do mikro perpet, aby wyciągnąć szklane igły do wstrzykiwań.
Umieść ciężarną mysz w anestezjologicznej komorze indukcyjnej za pomocą izofluoru i otwórz tlen do dwóch litrów na minutę. Kiedy zwierzę straci odruch pisania, przenieś go do maski przedoperacyjnej. Umieść kroplę IGEL na każdym oku i użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby zgolić włosy na brzuchu.
Oczyść ogolony obszar raz chlorheksydyną, aby zebrać latające włosy. Przenieś zwierzę do drugiej maski w obszarze operacyjnym tak, aby opierało się plecami na poduszce grzewczej. Rozpocznij operację, gdy odruch płatkowy został utracony.
Załóż maskę i sterylne rękawiczki i przykryj zwierzę sterylnym serwetem. Oczyść ogolony obszar co najmniej trzy razy chlorheksydyną. Użyj skalpela, aby wykonać pionowe nacięcie wzdłuż linii środkowej przez skórę.
Za pomocą nożyczek. Wykonaj podobne nacięcie na mięśniu brzucha wzdłuż liniowego łokcia. Wybór najbardziej dostępnych zarodków.
Umieść kleszcze pierścieniowe między dwoma zarodkami i ostrożnie wyciągnij łańcuch zarodkowy z jamy brzusznej. Od tego momentu utrzymuj zarodki nawodnione sterylnym, wstępnie podgrzanym PBS. Za pomocą kleszczy pierścieniowych.
Delikatnie manipuluj pozycją zarodka wewnątrz worka owodniowego i ustabilizuj głowę między pierścieniami. Ściśnij delikatnie, aby popchnąć zarodek bliżej ściany macicy. Drugą ręką weź uchwyt na naczynia włosowate i ostrożnie włóż igłę w środek półkuli, aby celować w komorę boczną.
Uważając, aby zminimalizować ruch igły na powierzchni ściany macicy i unikając przekłuwania naczyń krwionośnych, naciśnij pedał, aby wstrzyknąć około 0,5 mikrolitra roztworu zielonego DNA. Umieść elektrody po bokach głowy zarodka z dodatnim pedałem po tej samej stronie, co wstrzyknięta komora do elektroporacji kory lub po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory, elektroporacja hipokampa. Następnie zastosuj pięć impulsów elektrycznych o napięciu 30 V i czasie trwania 50 milisekund w odstępach jednosekundowych.
Unikaj stosowania prądu przez łożysko, ponieważ spowoduje to śmierć zarodka Aby zwiększyć szanse na przeżycie, wstrzyknij i wykonaj elektrooperację wszystkich zarodków w czasie krótszym niż 30 minut po zakończeniu w PBS, jamie brzusznej, i użyj kleszczy pierścieniowych, aby zastąpić róg macicy w jego pierwotnym miejscu. Użyj wchłanialnych szwów vicryl, aby zamknąć brzuch, ścianę i skórę. Umieść zwierzę w komorze rekonwalescencji, aż się obudzi.
Następnie przenieś go do klatki na poduszce grzewczej 24 i 48 godzin po zabiegu. Sprawdź zachowanie myszy, aby ocenić ból, cierpienie lub niepokój, i zważ zwierzę, aby przeanalizować mózg. Na etapie poporodowym użyj wibratora, aby przeciąć wcześniej perfundowane, a mózgi postfix zamontuj sekcje w aqua poly mount, aby zobrazować dendryty i kolce.
Rysunek ten przedstawia przykłady elektroporowanych komórek w korze mózgowej, zakręcie ca i zakręcie zębatym hipokampa, podczas gdy myszy typu były elektroporowane w E 14,5, gdzie konstrukt GFP i mózgi zostały zebrane w 14 dniu po urodzeniu. Poprzez wstrzyknięcie niewielkiej objętości roztworu DNA, znakuje się kilka komórek, co pozwala na wizualizację arboryzacji dendrytycznej izolowanych komórek GFP, a także ich kolców w większym powiększeniu. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o wstrzyknięciu niewielkiej objętości DNA, aby celować tylko w kilka komórek i aby móc wizualizować i określać ilościowo to, czego nie należy pisać w kręgosłupie lub elektronerwicy.
Przegląd
Ten artykuł opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowej i hipokampu u myszy na E14.5. Ta metoda jest wartościowa dla badania dendrytów i kolców w tych częściach mózgu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Manipulacja genetyczna
Tło
- Elektroporacja pozwala na wizualizację i manipulację genetyczną neuronów.
- Technika kieruje się na określone obszary mózgu podczas rozwoju zarodkowego.
- Oferuje zalety w porównaniu z tradycyjnymi modelami myszy knock-out.
- Badania in vivo mogą ujawniać interakcje genów wpływające na rozwój dendrytów i kolców.
Cel badania
- Aby wizualizować i manipulować dendrytami i kolcami w mózgu myszy.
- Aby ocenić skutki ekspresji genów i supresji.
- Aby opracować szybkie podejście do badania struktur neuronowych.
Stosowane metody
- Wstrzyknięcie DNA plastydowego do bocznego komora zarodków.
- Elektroporacja za pomocą elektrod dostarczających impulsy elektryczne.
- Ocena pooperacyjna struktury i funkcji mózgu.
- Wizualizacja dendrytów i kolców za pomocą mikroskopu konfokalnego.
Główne wyniki
- Udana elektroporacja kory mózgowej i hipokampu.
- Wizualizacja arboryzacji dendrytów i kolców w komórkach GFP-dodatnich.
- Wykazanie skuteczności techniki dla badań in vivo.
- Identyfikacja interakcji genów zaangażowanych w rozwój neuronowy.
Konkluzje
- Elektroporacja in utero jest potężnym narzędziem do badania struktur neuronowych.
- Metoda pozwala na ukierunkowaną manipulację genetyczną w określonych obszarach mózgu.
- Oferuje szybką alternatywę dla tradycyjnych technik modyfikacji genetycznej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
In utero electroporation (IUE) enables rapid, in vivo genetic manipulation and visualization of neuronal structures in the developing mouse brain, directly addressing the need for physiologically relevant models in early CNS drug discovery. This approach supports mechanistic de-risking and target validation by allowing precise temporal and spatial gene modulation in the cerebral cortex and hippocampus. IUE's flexibility accelerates hypothesis testing and portfolio triage for neurodevelopmental and synaptic function targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in neuronal development within native tissue environments.
- Supports functional target validation by permitting gain- and loss-of-function studies in specific brain regions and developmental windows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing combinatorial gene manipulation in vivo.
- Accelerates predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares physiologically relevant neuronal systems for downstream phenotypic screening and quantitative imaging.
- Enables reproducible labeling of sparse neuronal populations for high-resolution dendrite and spine analysis.
- Supports assay standardization by providing consistent genetic delivery and expression in targeted brain regions.
- Improves screening readiness for compounds affecting synaptic structure or function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuronal architecture and gene expression patterns.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting inducible gene modulation at defined developmental stages.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of dendritic and synaptic integrity.
- Reduces risk of late-stage attrition by modeling gene function in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
IUE integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging in vitro findings with in vivo validation for CNS targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for genes regulating dendrite and spine development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of genetic or pharmacological interventions.
- Analytics: Enables high-content measurement of dendritic arborization and spine density in genetically defined neuronal populations.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical models with human disease mechanisms by enabling precise temporal gene modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for rapid evaluation of multiple gene targets or combinations in the same experimental system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Offers rapid, scalable, and standardized genetic manipulation compared to traditional knockout models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early in vivo functional assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs based on robust in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, genetic construct design, and confocal imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for microinjection, electroporation, and high-resolution microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of DNA delivery, electroporation parameters, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or developmental stages.
- Limited to accessible brain regions and developmental windows as supported by the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Preparation: DNA Solution and Needles
2:10
Preparation: Surgery Before DNA Injection and Electroporation
3:25
Surgery: DNA Injection and Electroporation
5:01
Surgery: Post-surgical Evaluation and Tissue Processing
5:28
Representative Results
6:06
Conclusion
