Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero
26 lipca 2012
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.
Celem niniejszej procedury jest wykorzystanie elektroporacji in utero do wizualizacji oraz genetycznej manipulacji dendrytami i kolcami w korze mózgowej oraz hipokampie myszy. Jest to realizowane poprzez wstrzyknięcie odpowiedniego roztworu DNA plazmidowego do komory bocznej embrionów in utero, a następnie zastosowanie elektrod Palo w różnych pozycjach.
Zgodnie z procedurą iniekcji DNA, poddawana electroporacji jest kora mózgowa lub hipokamp, a następnie oczekuje się na osiągnięcie pożądanego stadium postnatalnego lub dorosłego. Myszy są perfuzowane, a następnie pobierane są mózgi. Na koniec mózgi są cięte przy użyciu wibrotomu.
Ostatecznie dendryty i kolce mogą być wizualizowane przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika jednostkowej elektroporacji oferuje kilka zalet w porównaniu z metodami badania dendrytów i kolców. W rzeczywistości technika ta umożliwia przede wszystkim badanie tego aspektu bezpośrednio in vivo.
Ponadto, w porównaniu z tworzeniem myszy z nokautem, elektroporacja jest szybką metodą badania efektów supresji genu lub ekspresji genu w obrębie dendrytów i kolców, nie tylko w konkretnych strukturach komórkowych, ale także w określonym punkcie rozwoju. Wykorzystanie systemu indukowalnego w elektroporacji jest również użytecznym narzędziem do identyfikacji funkcjonalnych interakcji między genami zaangażowanymi w rozwój dendrytów i kolców. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do wirusów, łatwiej jest nam połączyć wiele cząsteczek RNA lub wielu genów w tej samej populacji komórek. Aby rozpocząć, należy rozcieńczyć DNA do pożądanych stężeń w wodzie i dodać barwnik Fast Green do stężenia końcowego 0,05%. Użyj mikro-wyciągacza do przygotowania szklanych igieł do iniekcji.
Umieść ciężarną mysz w komorze do indukcji znieczulenia z użyciem izofluranu i ustaw przepływ tlenu na dwa litry na minutę. Gdy zwierzę straci odruch mrugania, przenieś je pod maskę przedoperacyjną. Na każde oko nanieś kroplę IGEL, a następnie za pomocą golarki elektrycznej usuń owłosienie z brzucha.
Oczyść raz ogoloną okolicę chlorheksydyną, aby zebrać luźne włosy. Przenieś zwierzę do drugiej maski w obszarze chirurgicznym, kładąc je grzbietem na podkładce grzewczej. Rozpocznij operację, gdy ustąpi odruch z powiek.
Załóż maseczkę oraz sterylne rękawiczki i przykryj zwierzę sterylnym obłożeniem. Oczyść ogoloną okolicę co najmniej trzykrotnie chlorheksydyną. Za pomocą skalpela wykonaj pionowe nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej.
Używając nożyczek, wykonaj podobne nacięcie na mięśniu brzucha wzdłuż linii łokcia. Wybierz najlepiej dostępne embriony.
Umieść kleszczyki pierścieniowe pomiędzy dwoma embrionami i ostrożnie wyciągnij łańcuch embrionalny z jamy brzusznej. Od tego momentu utrzymuj nawilżenie embrionów, używając sterylnego, podgrzanego wcześniej PBS. Użyj kleszczyków pierścieniowych.
Delikatnie zmień położenie zarodka wewnątrz pęcherza owodniowego i ustabilizuj głowę pomiędzy pierścieniami. Ściśnij lekko, aby przesunąć zarodek w górę, bliżej ściany macicy. Drugą ręką weź uchwyt kapilary i ostrożnie wprowadź igłę w środek półkuli, celując w komorę boczną.
Dbając o zminimalizowanie ruchu igły na powierzchni ściany macicy i unikając przebijania naczyń krwionośnych, naciśnij pedał, aby wstrzyknąć około 0,5 µl zielonego roztworu DNA. Umieść elektrody po bokach głowy embrionu, przy czym pedał dodatni powinien znajdować się po tej samej stronie co wstrzyknięta komora w przypadku elektroporacji kory, lub po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory w przypadku elektroporacji hipokampa. Następnie przyłóż pięć impulsów elektrycznych o napięciu 30 V i czasie trwania 50 ms w odstępach jednej sekundy.
Należy unikać przepływu prądu przez łożysko, ponieważ spowoduje to śmierć embrionu. Aby zwiększyć szanse na przeżycie, należy wstrzyknąć substancje i przeprowadzić elektroporację wszystkich embrionów w czasie krótszym niż 30 minut. Po zakończeniu procedury należy przepłukać miejsce PBS, jamę brzuszną, a następnie za pomocą kleszczyków pierścieniowych umieścić róg macicy w pierwotnej lokalizacji. Do zamknięcia ściany brzucha i skóry należy użyć wchłanialnych szwów Vicryl. Zwierzę należy umieścić w komorze rekonwalescencyjnej aż do wybudzenia.
Następnie przenieś zwierzę do klatki umieszczonej na podkładce grzewczej 24 i 48 godzin po operacji. Obserwuj zachowanie myszy w celu oceny bólu, cierpienia lub stresu oraz zważ zwierzę przed analizą mózgów. W etapach postnatalnych użyj wibrotomu do sekcjonowania uprzednio perfundowanych i postutrwalonych mózgów, a następnie zamocuj przekroje w medium aqua poly mount w celu obrazowania dendrytów i kolców.
Rycina ta przedstawia przykłady elektroporowanych komórek w korze mózgowej, ciele komorowym oraz zakręcie zębatym hipokampa u myszy, u których przeprowadzono elektroporację w dniu E 14.5, wprowadzając konstrukt GFP, a mózgi pobrano w 14. dniu po urodzeniu. Poprzez wstrzyknięcie małej objętości roztworu DNA znakowanych jest tylko kilka komórek, co umożliwia wizualizację arboryzacji dendrytycznej izolowanych komórek GFP-dodatnich, a także ich kolców przy większym powiększeniu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wstrzyknięciu małej objętości DNA, aby objąć jedynie kilka komórek, co pozwoli na wizualizację i kwantyfikację kolców dendrytycznych lub neuronów elektroporowanych.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowej i hipokampa u myszy w stadium E14.5. Metoda ta jest cenna w badaniach nad dendrytami i kolcami w tych obszarach mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwojowa
- Manipulacje genetyczne
Wstęp
- Elektroporacja umożliwia wizualizację i manipulację genetyczną neuronów.
- Technika ta jest skierowana do konkretnych obszarów mózgu podczas rozwoju embrionalnego.
- Zapewnia ona korzyści w porównaniu z tradycyjnymi modelami myszy z nokautem genowym.
- Badania in vivo mogą ujawnić interakcje genów wpływające na rozwój dendrytów i kolców dendrytycznych.
Cel badania
- Wizualizacja i manipulacja dendrytami oraz kolcami w mózgu myszy.
- Ocena efektów ekspresji i supresji genów.
- Opracowanie szybkiej metody badania struktur neuronalnych.
Zastosowane metody
- Iniekcja plazmidowego DNA do komory bocznej zarodków.
- Elektroporacja z wykorzystaniem elektrod w celu dostarczenia impulsów elektrycznych.
- Poporodowa ocena struktury i funkcji mózgu.
- Wizualizacja dendrytów i kolców przy użyciu mikroskopii konfokalnej.
Główne wyniki
- Skuteczna elektroporacja kory mózgowia i hipokampa.
- Wizualizacja arboryzacji dendrytycznej i kolców w komórkach GFP-dodatnich.
- Wykazanie skuteczności techniki w badaniach in vivo.
- Identyfikacja interakcji genowych zaangażowanych w rozwój neuronów.
Wnioski
- Elektroporacja in utero jest potężnym narzędziem do badania struktur neuronalnych.
- Metoda ta umożliwia ukierunkowaną manipulację genetyczną w określonych obszarach mózgu.
- Stanowi ona szybką alternatywę dla tradycyjnych technik modyfikacji genetycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektroporacja in utero (IUE) umożliwia szybką manipulację genetyczną in vivo oraz wizualizację struktur neuronalnych w rozwijającym się mózgu myszy, co bezpośrednio odpowiada na zapotrzebowanie na modele istotne fizjologicznie w wczesnej fazie poszukiwania leków na schorzenia OUN. Podejście to wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego i walidację celów terapeutycznych, pozwalając na precyzyjną czasową i przestrzenną modulację genów w korze mózgowej i hipokampie. Elastyczność metody IUE przyspiesza testowanie hipotez i selekcję projektów w portfolio w odniesieniu do celów związanych z rozwojem neurologicznym i funkcją synaptyczną.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie funkcji genów w rozwoju neuronalnym w obrębie natywnych środowisk tkankowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez umożliwienie badań nad zwiększeniem i utratą funkcji w określonych obszarach mózgu i oknach rozwojowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki możliwości kombinatoryjnej manipulacji genami in vivo.
- Zwiększa pewność predykcyjną w procesie wyboru i selekcji celów w obrębie ośrodkowego układu nerwowego.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Przygotowuje fizjologicznie istotne systemy neuronalne do późniejszego screeningu fenotypowego i obrazowania ilościowego.
- Umożliwia powtarzalne znakowanie rzadkich populacji neuronów do wysokorozdzielczej analizy dendrytów i kolców dendrytycznych.
- Wspiera standaryzację testów poprzez zapewnienie spójnej dostawy genetycznej i ekspresji w docelowych obszarach mózgu.
- Poprawia gotowość do screeningu związków wpływających na strukturę lub funkcję synaptyczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica modele przedkliniczne z architekturą neuronalną i wzorcami ekspresji genów istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez wspieranie indukowalnej modulacji genów na określonych etapach rozwoju.
- Stanowi platformę do oceny translacyjnych biomarkerów integralności dendrytów i synaps.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzeń w późnych fazach badań dzięki modelowaniu funkcji genów in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
IUE integruje etapy wczesnego odkrywania i badań przedklinicznych, łącząc wyniki in vitro z walidacją in vivo dla celów terapeutycznych w OUN.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych dla genów regulujących rozwój dendrytów i kolców dendrytycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do analizy porównawczej interwencji genetycznych lub farmakologicznych.
- Analityka: Umożliwia wysokoprzepustowy pomiar arboryzacji dendrytycznej i gęstości kolców w genetycznie zdefiniowanych populacjach neuronów.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie modeli przedklinicznych do mechanizmów chorób ludzkich poprzez umożliwienie precyzyjnej modulacji genów w czasie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia platformę wielokrotnego użytku do szybkiej oceny wielu celów genowych lub ich kombinacji w tym samym systemie eksperymentalnym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w OUN.
- Wartość operacyjna: Oferuje szybką, skalowalną i zestandaryzowaną manipulację genetyczną w porównaniu do tradycyjnych modeli knockout.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej oceny funkcjonalnej in vivo.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących OUN w oparciu o rzetelne dane in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii embrionalnej, projektowaniu konstruktów genetycznych oraz obrazowaniu konfokalnym.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do mikroiniekcji, elektroporacji i mikroskopii wysokiej rozdzielczości.
- Konieczna jest standaryzacja dostarczania DNA, parametrów elektroporacji oraz protokołów obrazowania między zespołami.
- Może być wymagana adaptacja dla różnych szczepów myszy lub etapów rozwoju.
- Ograniczone do obszarów mózgu i okien rozwojowych dostępnych zgodnie z protokołem.
