Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja zdrowych, nienaruszonych mięśni do badania funkcji skurczowej in vitro. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację nienaruszonego mięśnia prostownika długiego palców (EDL) oraz mięśnia płaszczowatego (soleus) z myszy. W drugim kroku więzadła i ścięgna mięśnia EDL oraz mięśnia płaszczowatego wiąże się nicią chirurgiczną.

Następnie zamocuj wyizolowane mięśnie do przetwornika siły w komorze skurczowej. Ostatnim krokiem jest stymulacja mięśnia impulsami elektrycznymi pola w celu wywołania skurczów. Ostatecznie powstałe siły są przekazywane do przetwornika siły i rejestrowane; można przeprowadzać różne manipulacje fizjologiczne i farmakologiczne, aby porównać ich wpływ na kurczliwość mięśni.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami oceny funkcji mięśni, takimi jak pomiar kurczliwości in situ, ocena wydolności samców i tym podobnymi, jest fakt, że metoda ta eliminuje komponenty neuronalne i naczyniowe z mięśnia szkieletowego, co umożliwia bezpośrednią ocenę wewnętrznych właściwości kurczącego się mięśnia. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ sekcja nienaruszonych mięśniami wymaga wykazania się znaczną zręcznością i cierpliwością. Procedurę tę przeprowadzi technik z mojego laboratorium oraz Keyhole Park, stażysta postdoc z laboratorium dr Jma.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ sekcja mięśnia i jego montaż w komorze skurczowej są trudne do przeprowadzenia. W związku z tym niniejszy film pomaga zrozumieć budowę anatomiczną mięśnia i docenić skalę wymaganą do zamocowania wyizolowanego mięśnia. W tej procedurze należy uśmiercić mysz typu dzikiego C 57 black six lub mysz będącą modelem choroby poprzez zwichnięcie stawów szyjnych i ułożyć ją w pozycji bocznej.

Aby wypreparować mięsień EDL, wykonaj powierzchowne nacięcie skóry. Przetnij powięź między piszczelami przednimi a tylną grupą mięśniową. Zlokalizuj przyczep proksymalny, w którym więzadło łączy się z kłykciem bocznym kości piszczelowej oraz z górnymi trzema czwartymi przedniej powierzchni kości strzałkowej.

Następnie przetnij więzadło delikatnymi nożyczkami oftalmologicznymi tak dystalnie od mięśnia, jak to tylko możliwe, aby uwolnić proksymalny przyczep mięśnia EDL. Po tym kroku chwyć więzadło pęsetą tępą i powoli go pociągnij, aby uwolnić EDL. Może być konieczne przecięcie części tkanki okołomięśniowej otaczającej EDL oraz innych mięśni znajdujących się w sąsiedztwie EDL.

Krok ten należy przeprowadzić ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia mięśnia EDL. Następnie, w obszarze przyczepu, gdzie cztery ścięgna dystalne przyczepiają się do paliczków środkowych i dalszych palców od drugiego do piątego, należy przeciąć ścięgna jak najdalej od mięśni. Wyizolowany mięsień EDL należy przenieść do naczynia sekcyjnego zawierającego izotoniczny roztwór Tyro bez jonów wapnia.

Mięsień EDL jest szybkim mięśniem glikolitycznym o bladoróżowo-białym kolorze, długości od około 10 do 13 mm i masie od 8 do 11 mg. Następnie, na obu końcach wyizolowanego mięśnia EDL, zawiąż ciasny węzeł chirurgiczny przy użyciu nici chirurgicznej rozmiaru 6-0, jak najdalej od brzuszca mięśnia i nieco powyżej środka długości więzadła lub ścięgna. Następnie przenieś mięsień EDL do komory z kąpielą tkankową nasyconą tlenem.

Zamocuj mięsień w rowku próbkowym przetwornika siły oraz na nieruchomym haczyku u dołu komory kąpieli. Powtórz proces izolacji i mocowania dla mięśnia EDL z drugiej nogi, preparując mięsień podeszwowy po boczno-tylnej stronie nogi. Odsuń mięsień brzuchaty łydki, który normalnie go przykrywa.

Mięsień podeszwowy jest wolnowłóknistym mięśniem utleniającym o ciemnoczerwonym kolorze, o około jeden milimetr krótszym od mięśnia EDL, lecz nieco cięższym od niego. W miejscu przyczepu proksymalnego należy przeciąć więzadło łączące się z proksymalną połową tylnej części kości piszczelowej wzdłuż linii podeszwowej oraz z proksymalną trzecią częścią tylnej części kości strzałkowej.

Następnie, w miejscu przyczepu dystalnego, przetnij ścięgno piętowe przyczepiające się do tylnej części kości piętowej. Po tym zabiegu ostrożnie uwolnij mięsień podeszwowy. Prawidłowo zamocuj mięsień podeszwowy w komorze kąpielowej.

Po zamocowaniu mięśni w oddzielnych komorach kąpieli tkankowej należy rozpocząć rejestrację danych. Pamiętaj o wyzerowaniu linii bazowej przetwornika siły. Ułatwi to obserwację zmian poziomu bazowego i uprości porównanie skurczów mięśni w różnych warunkach doświadczalnych.

Następnie stymuluj wyizolowane mięśnie impulsami prostokątnymi. Stosuj prądy elektryczne w zakresie od 60 do 300 mA, czas trwania pojedynczego impulsu prostokątnego od 0,3 do 1 ms oraz czas trwania serii stymulacyjnych wynoszący 350, 500 lub 1000 ms. Kolejnym krokiem jest wybór częstotliwości stymulacji zdolnej do wywołania maksymalnej siły tężcowej, gdy wyizolowany mięsień jest rozciągnięty do optymalnej długości w temperaturze pokojowej.

Częstotliwość ta wynosi zazwyczaj około 100 hertz dla EDL oraz 60 hertz. W przypadku mięśnia soleus, należy powoli rozciągnąć mięsień i odczekać 30 sekund, a następnie stymulować go z częstotliwością 100 hertz lub 60 hertz. Po tym zabiegu należy ponownie go rozciągnąć.

Odczekaj kolejne 30 sekund i ponownie pobudź mięsień podczas rozciągania. Jeśli siła nie wzrośnie bardziej, zazwyczaj oznacza to, że osiągnięto siłę maksymalną. Tymczasem w przypadku powtarzających się cykli rozciągania i pobudzania spadek siły sugeruje, że mięśnie zostały nadmiernie rozciągnięte. W takiej sytuacji rozluźnij mięsień do poprzedniego poziomu rozciągnięcia i pobudzaj go ponownie, aż do zaobserwowania siły maksymalnej.

Następnie należy wyznaczyć zależność siły od częstotliwości. Stymuluj mięsień częstotliwościami od 1 do 140 hertz, stosując przyrosty od 5 do 10 hertz oraz periodyczność od 30 do 60 sekund. W przypadku prowadzenia eksperymentów w temperaturze 25 stopni Celsiusjusza, a gdy eksperymenty są przeprowadzane w temperaturze 37 stopni Celsiusjusza, rozszerz zakres FF do wyższych częstotliwości: do 300 hertz dla mięśnia przepony, od 180 do 200 hertz dla mięśnia soleus oraz od 220 do 250 hertz dla EDL.

Następnie, porównując wartość siły generowanej przez każdą częstotliwość stymulacji, należy zidentyfikować częstotliwość, która generuje maksymalną siłę tetaniczną oraz częstotliwość generującą w przybliżeniu połowę maksymalnej siły tetanicznej. Tmax dostarcza istotnych informacji na temat modulacji mechanizmu kurczliwego, podczas gdy połowa Tmax dostarcza informacji bardziej istotnych dla regulacji wapnia oraz procesu ECC.

Następnie mięsień stymuluje się z częstotliwością tmax w odstępach jednej minuty przez 30 minut; proces ten nazywa się równoważeniem i służy do zbadania udziału siateczki sarkoplazmatycznej. Aby zmęczyć mięśnie w celu oceny wpływu uwalniania wapnia na kurczliwość mięśni po równoważeniu, stosuje się stymulację z częstotliwością połowy Tmax w odstępach dwóch sekund przez pięć minut. W tym przypadku zastosowano czas trwania serii wynoszący 500 ms, zatem cykl pracy wynosi 25%. Następnie mięsień poddaje się regeneracji przy połowie Tmax w odstępach jednej minuty.

Przez 30 minut lub do momentu stabilizacji siły można przeprowadzić dodatkowy protokół zmęczeniowy. Przyjmuje się, że zastosowanie zmęczenia tmax przy Tmax pozwala na precyzyjne przetestowanie stanu aparatu kurczliwego. Następnie należy powtórzyć procedury uzyskiwania FF, aby można było zaobserwować różnice fenotypowe między różnymi szczepami, modelami chorób lub efektami leczenia farmakologicznego.

Aby przeanalizować FF przed i po zmęczeniu w celu zbadania wpływu napływu wapnia z przestrzeni zewnątrzkomórkowej na kurczliwość mięśni, roztwór kąpieli można zastąpić roztworem pozbawionym wapnia, ale zawierającym 0,1 mM EGTA. Alternatywnie, w roztworze kąpieli można zastosować różne blokery kanałów operowanych przez zapasy. Na koniec eksperymentu zmierz długość eksperymentalną mięśni, a następnie zważ je pojedynczo na wadze analitycznej, zamroź mięśnie w ciekłym azocie metodą flash-freeze i przechowuj w temperaturze -80 °C do analiz biochemicznych.

Następnie należy skalibrować przetwornik siły. Przelicz zarejestrowaną siłę mięśniową z miliwoltów na gramy siły na podstawie wyników kalibracji. Następnie znormalizuj ją do fizjologicznego pola przekroju poprzecznego.

Rysunek ten przedstawia siły skurczowe indukowane częstotliwościami 5 Hz, 20 Hz oraz maksymalną siłę tężcową; tutaj pokazano zapis siły skurczowej uszkodzonego mięśnia. Przedstawiono reprezentatywny przykład ukazujący poszczególne skurcze w relacji siła-częstotliwość w mięśniu EDL oraz wykreśloną krzywą wynikającą z tej zależności. Jest to typowy profil szybkiego spadku zmęczeniowego mięśnia EDL oraz profil powolnego spadku zmęczeniowego mięśnia soleus.

Stymulacja prowadząca do zmęczenia wywołuje pojawienie się alternacji mechanicznych w mięśniu z nokautem, w którym zaburzone są właściwości gospodarki wapniowej. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin. Jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo, cały eksperyment potrwa dłużej i będzie zależny od liczby wykonanych interwencji. Podczas przeprowadzania tej procedury bardzo ważne jest, aby wyizolować i zamontować mięsień DL tak szybko, jak to możliwe, ponieważ środowisko in vitro o niskiej zawartości tlenu może spowodować nieodwracalne uszkodzenia szybkich włókien każdego mięśnia.

Po zastosowaniu tej procedury, na tych samych mięśniach eksperymentalnych można przeprowadzić analizę genów, western blotting, immunohistochemię oraz badania strukturalne w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania. Przykładowo, można zbadać poziom ekspresji i lokalizację konkretnego białka lub komponentów białek mięśniowych regulujących kurczliwość bądź sygnalizację wapniową, a także zmiany morfologiczne lub ultrastrukturalne w mięśniach wynikające z konkretnych warunków po ich rozwoju. Technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie fizjologii mięśni drogę do eksploracji defektów genetycznych wpływających na funkcję mięśni szkieletowych w różnych modelach, w tym u myszy, szczurów i chomików.