Ex vivo Ocena kurczliwości, wiotczości i przemian w izolowanych mięśniach szkieletowych

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, siły mięśniowej, kinetyki kurczliwości i męczliwości izolowanych mięśni szkieletowych w systemie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Cenne informacje na temat właściwości obchodzenia się z Ca²⁺ i maszynerii skurczowej mięśni można uzyskać przy użyciu różnych protokołów stymulacji.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie zdrowych, nienaruszonych mięśni w celu zbadania funkcji skurczu in vitro. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie nienaruszonego prostownika palca długiego lub EDL oraz mięśnia płaszczkowatego lub podeszwy od myszy. Drugim krokiem jest związanie więzadeł i ścięgien EDL oraz mięśni podeszwy za pomocą szwu chirurgicznego.

Następnie zamontuj izolowane mięśnie na przetworniku siły i w komorze skurczowej. Ostatnim krokiem jest stymulacja mięśnia za pomocą impulsów elektrycznych pola w celu wywołania skurczów. Ostatecznie powstałe siły są przenoszone do przetwornika siły i rejestrowane można wykonać różne manipulacje fizjologiczne i farmakologiczne w celu porównania ich wpływu na kurczliwość mięśni.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami oceny funkcji mięśni, takimi jak pomiar kurczliwości in situ, leczenie męskiej sprawności i tak dalej, jest to, że metoda ta usuwa składniki neuronalne i naczyniowe z mięśnia szkieletowego, umożliwiając bezpośrednią ocenę wewnętrznej właściwości kurczącego się mięśnia. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie, koło walczy, ponieważ rozwarstwienie nienaruszonych mięśni wdechowych wymaga rozłożonej zręczności i cierpliwości Wykazano. Ta procedura będzie jedna, technik w moim laboratorium i park dziurek od klucza, stażysta podoktorski w laboratorium Dr.Jma.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ rozwarstwienie mięśni i montaż na komorze kurczliwej są trudne do przeprowadzenia. W ten sposób ten film pomaga zrozumieć anatomiczną strukturę mięśnia i docenić skalę wymaganą do zamontowania izolowanego mięśnia. W tej procedurze należy złożyć w ofierze dziką czarną sześcioma mysz typu C 57 lub chory model myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i umieścić ją w pozycji bocznej.

Aby wyciąć EDL, wykonaj powierzchowne nacięcie skóry. Rozetnij powięź między przednimi piszczelami a tylną grupą mięśni. Zlokalizuj proksymalny początek, w którym więzadło jest połączone z kłykciem bocznym kości piszczelowej i z górnym, trzema czwartymi przedniej powierzchni strzałkowej.

Następnie przetnij więzadło delikatnymi nożyczkami okulistycznymi jak najdalej od mięśnia, aby uwolnić proksymalne pochodzenie mięśnia EDL. Następnie przytrzymaj więzadło parą kleszczy i pociągnij je powoli, aby uwolnić EDL. Może być konieczne przecięcie części pantofelka otaczającego EDL i innych mięśni wokół EDL.

Ten krok należy wykonać delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia mięśnia EDL. Następnie w obszarze przyczepu, w którym cztery dystalne ścięgna wsuwają się w środek i dystalne paliczki palców od dwóch do pięciu, przetnij ścięgna jak najdalej od mięśni. Przenieść wyizolowany mięsień EDL do naczynia rozwarstwiającego zawierającego bezwapniowy izotoniczny roztwór tyro.

Mięsień EDL jest szybkim mięśniem glikolitycznym o jasnoróżowo-białym kolorze, długości około 10 do 13 milimetrów i wadze od ośmiu do 11 miligramów. Następnie mocno zawiąż węzeł chirurgiczny na obu końcach izolowanego mięśnia EDL za pomocą sześciu gorących szwów jak najbardziej dystalnych od mięśnia i nieco powyżej punktu środkowego wzdłuż więzadła lub ścięgna. Następnie przenieś mięsień EDL do komory kąpieli tkankowej nasyconej tlenem.

Zamontuj mięsień na rowku próbki przetwornika siły i nieruchomym haku na dnie komory kąpielowej. Powtórz proces izolacji i montażu mięśnia EDL z drugiej nogi, aby rozciąć podeszwę po tylnej bocznej stronie nogi. Odsuń na bok mięsień żołądkowy, który normalnie go pokrywa.

Podeszwa to wolno utleniający się mięsień o ciemnoczerwonym kolorze, o około jeden milimetr krótszy niż EDL, ale waży nieco więcej niż EDL. W proksymalnym początku. Przetnij więzadło, które łączy się z bliższą połową tylnej kości piszczelowej wzdłuż jedynej linii i z bliższą trzecią częścią tylnej kości strzałkowej.

Następnie w dystalnym przyczepie przetnij ścięgno piętowe, które wstawia się do tylnej kości piętowej. Ostrożnie uwolnij potem duszę. Prawidłowo zamontuj mięsień podeszwy w komorze kąpielowej.

Po zamontowaniu mięśni w poszczególnych komorach kąpieli tkankowej rozpocznij rejestrowanie danych. Pamiętaj, aby wyzerować linię bazową przetwornika siły. Ułatwi to obserwację zmian wyjściowych i uprości porównywanie skurczów mięśni w różnych warunkach eksperymentalnych.

Następnie stymuluj izolowane mięśnie impulsami fali prostokątnej. Używaj prądów elektrycznych o natężeniu od 60 do 300 miliamperów, indywidualnych impulsów prostokątnych o czasie trwania od 0,3 do jednej milisekundy i czasu trwania ciągu stymulującego wynoszącego 350, 500 lub 1000 milisekund. Następnym krokiem jest wybór częstotliwości stymulacji zdolnej do wytworzenia maksymalnej tytanicznej siły, gdy izolowany mięsień jest rozciągany na optymalną długość w temperaturze pokojowej.

Częstotliwość ta wynosi zwykle około 100 Hz dla EDL i 60 Hz. Dla duszy rozciągnij mięsień powoli i odczekaj 30 sekund, a następnie stymuluj go z częstotliwością 100 Hz lub 60 Hz. Następnie ponownie go rozciągnij.

Odczekaj kolejne 30 sekund i ponownie stymuluj go po rozciągnięciu. Jeśli siła nie wzrasta dalej, zwykle oznacza to, że osiągnięto maksymalną siłę. Tymczasem po powtarzających się cyklach rozciągania i stymulacji spadek siły sugeruje, że mięśnie zostały nadmiernie rozciągnięte W takiej sytuacji zwolnij mięsień do poprzedniego poziomu rozciągnięcia i ponownie stymuluj mięsień, aż do zaobserwowania maksymalnej siły.

Teraz uzyskaj zależność siły w funkcji częstotliwości. Stymuluj mięsień częstotliwościami od jednego do 140 Hz z przyrostami od pięciu do 10 Hz i okresowością od 30 do 60 sekund. Wykonując eksperymenty w temperaturze 25 stopni Celsjusza, gdy eksperymenty są wykonywane w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozszerz FF do wyższych częstotliwości do 300 Hz dla mięśnia przepony, od 180 do 200 Hz dla duszy i od 220 do 250 Hz dla EDL.

Następnie, porównując ilość siły generowanej przez każdą częstotliwość stymulacji, zidentyfikuj częstotliwość, która generuje maksymalną siłę tytaniczną i około połowy maksymalnej siły tytanowej. Tmax dostarcza ważnych informacji na temat modulacji kurczliwości maszyn. Podczas gdy połowa Tmax dostarcza informacji bardziej istotnych dla regulacji wapnia i procesu ECC.

Mięsień jest następnie stymulowany z częstotliwością tmax w odstępie jednej minuty przez 30 minut, proces ten określa się mianem równowagi w celu zbadania udziału retikulum sarkoplazmatycznego. Uwalnianie wapnia do kurczliwości mięśni po równowadze powoduje zmęczenie mięśni, dostarczając jedną połowę stymulacji Tmax w odstępie dwóch sekund przez pięć minut. Zastosowaliśmy tutaj 500 milisekund czasu trwania treningu, a zatem cykl pracy wynosi 25%Następnie odzyskaj mięsień przy połowie Tmax w odstępie jednej minuty.

Przez 30 minut lub do momentu, gdy siła się ustabilizuje, można wykonać dodatkowy protokół męczenia. Obecnie uważa się, że stosowanie tmax męczenia przy Tmax dokładnie testuje stan kurczliwej maszynerii. Następnie powtórz procedury uzyskiwania FF, aby można było zaobserwować różnice fenotypowe między różnymi szczepami, modelami chorób lub leczeniem farmakologicznym.

Analizując FF przed i po zmęczeniu w celu zbadania udziału zewnątrzkomórkowego wnikania wapnia do kurczliwości mięśni, roztwór do kąpieli można zmienić na roztwór niezawierający wapnia, ale 0,1 milimola EGTA. Alternatywnie, w roztworze do kąpieli można zastosować różne blokady kanałów obsługiwanych przez sklep. Pod koniec eksperymentu zmierz eksperymentalną długość mięśni, a następnie zważ je pojedynczo za pomocą wagi analitycznej, flashuj, zamroź mięśnie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analiz biochemicznych.

Teraz skalibruj przetwornik siły. Przelicz zarejestrowaną siłę mięśni w miliwoltach na siłę w gramach na podstawie wyników kalibracji. Następnie znormalizuj go do fizjologicznego obszaru przekroju.

Rysunek ten pokazuje siły skurczu indukowane przez pięć herców, 20 herców, a maksymalna siła tytaniczna pokazuje tutaj ślad skurczu, siły uszkodzonego mięśnia. Oto reprezentatywny przykład pokazujący poszczególne skurcze zależności siły w stosunku do częstotliwości w EDL i wykreśloną krzywą wynikającą z ff. Jest to typowy szybko opadający profil męczący mięśnia EDL i powolny spadek profilu męczącego mięśnia podeszwy.

Męcząca stymulacja prowadzi do pojawienia się mechanicznych zamienników W sztuczce nokautujący mięsień o zaburzonych właściwościach obchodzenia się z wapniem Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin. Jeśli zostanie wykonany prawidłowo, cały eksperyment będzie trwał dłużej i będzie zależał od liczby wykonanych interwencji. Podczas próby wykonania tej procedury bardzo ważne jest, aby wyizolować i zamontować mięsień DL tak szybko, jak to możliwe, ponieważ środowisko o niskim poziomie tlenu in vitro może spowodować nieodwracalne uszkodzenie mięśnia poszczego.

Po tej procedurze można przeprowadzić analizę genów, immunohistochemię western blot i badania strukturalne na tych samych mięśniach eksperymentalnych w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania. Na przykład poziom ekspresji i lokalizacja określonego białka lub składników białek mięśniowych regulujących kurczliwość lub sygnalizację wapniową, a także zmiany morfologiczne lub ultrastrukturalne w mięśniach wynikające z określonych warunków po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się fizjologią mięśni do zbadania wad genetycznych wpływających na funkcjonowanie mięśni szkieletowych w różnych modelach, w tym u myszy, szczurów i chomików.