Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów z komórek odpornościowych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego myszy przez przeszczep szpiku kostnego

Ogólnym celem eksperymentu pokazanego w tym filmie jest ocena, czy przeciwdrobnoustrojowy peptyd lyina odgrywa rolę w łagodzeniu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem dekstranu u myszy. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie szpiku kostnego od myszy typu dzikiego do napromieniowanych myszy legalnych i nokautujących oraz szpiku kostnego od myszy z nokautem do napromieniowanych myszy typu dzikiego. Przeszczepiony szpik kostny wytworzy nowe komórki krwi u biorcy genotypu dawcy.

Myszy biorcy są następnie wystawiane na działanie siarczanu dekstranu w celu wywołania zapalenia jelita grubego po czterech tygodniach. Udany przeszczep jest weryfikowany za pomocą cytometrii przepływowej, a uszkodzenie tkanki okrężnicy ocenia się za pomocą histologii. Uzyskano wyniki, które pokazują, że zapalenie jelita grubego ulega złagodzeniu, gdy szpik kostny typu dzikiego jest przeszczepiany myszom z nokautem.

I odwrotnie, zapalenie jelita grubego pogarsza się, gdy szpik kostny z nokautem jest przeszczepiany myszom typu dzikiego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w określaniu ekspresji genów z komórek pochodzących ze szpiku kostnego lub komórek niepochodzących ze szpiku kostnego w stanie zapalnym lub infekcji. Do tego eksperymentu zaleca się C 57, czarną szóstkę, typ dziki i myszy z nokautem wywołane C, aby umożliwić śledzenie myszy typu dzikiego i myszy z nokautem.

Komórki dawcy po przeszczepie szpiku kostnego. Użyj myszy CD 45.1 do reprezentowania myszy typu dzikiego i CD 45.2 do myszy z nokautem. Pokazany tutaj wykres przedstawia konfigurację eksperymentalną: do każdej grupy przypisano pięć myszy dawców i 10 myszy biorców.

W przypadku grup A i B szpik kostny zostanie przeszczepiony od myszy typu dzikiego do myszy z nokautem. Zapalenie jelita grubego zostanie wywołane w grupie A, ale nie w grupie B. Dla grupy C i D. Szpik kostny zostanie przeszczepiony od myszy z nokautem do typu dzikiego, a zapalenie jelita grubego zostanie wywołane w grupie C tylko dla E i F. Przeszczep będzie prowadzony z typu dzikiego do typu dzikiego oraz dla grup G i H, Przeszczep będzie trwał od nokautu do nokautu. Aby przygotować szpik kostny dawcy do transferu do napromieniowanych myszy, należy rozpocząć od ekstrakcji szpiku kostnego z kości myszy ofiarowanych w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Użyj sterylnych narzędzi preparacyjnych, aby odsłonić kość ramienną, udową, piszczelową i strzałkową wolną od przyczepiania mięśni i więzadeł i przenieś je na szalkę Petriego. Rozetnij oba końce kości, aby pokazać czerwony szpik kostny. Następnie chwytanie jednej z kości kleszczami.

Wypłucz czerwony szpik kostny zimnym PBS za pomocą trzymililitrowej strzykawki i igieł o rozmiarze 25 na inną szalkę Petriego. Następnie przepłucz kość z drugiego końca, aby uzyskać więcej komórek szpiku kostnego. Powtórz ten proces z każdą z kości.

Połącz szpik kostny typu dzikiego i osobno znokautuj myszy. Użyj sześciomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 18 i średnicy 18 cali, aby rozbić czerwone zatyczki szpiku kostnego przez wielokrotne zasysanie i wyrzucanie. Następnie za pomocą pipety serologicznej przenieś pobrany szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Po przeniesieniu całego szpiku kostnego obracaj szpik kostny w dół przy 740 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad, wirując przez pięć do 10 sekund. Do osadu dodać pięć mililitrów jednego buforu do lizy XRBC na wir myszy dawcy ponownie przez pięć sekund i inkubować dokładnie trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Po trzech minutach dodaj 20 mililitrów zimnego PBS do każdej probówki i wymieszaj przez odwrócenie, aby zatrzymać lizę. Następnie przelej zawartość przez sitko o średnicy 40 mikronów do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz oryginalną probówkę pięcioma mililitrami PBS i przenieś roztwór do sitka komórkowego.

Kontynuując zbieranie przepływu w stożkowej rurce. Następnie zwiększ objętość do 50 mililitrów za pomocą PBS i wymieszaj przez odwrócenie. Następnie określ liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trianowego za pomocą hemocytometru.

Po ustaleniu liczby komórek wiruj komórki szpiku kostnego w temperaturze 913 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu usuń supernatant na podstawie całkowitej liczby komórek. Resus zawiesić osad w PBS jednorazowo od 10 do ośmiu komórek na mililitr.

Komórki szpiku kostnego są teraz gotowe do transferu do napromieniowanych myszy biorców. Myszy typu dzikiego i biorcę z nokautem do tego eksperymentu zostały napromieniowane 1000 radami, jak opisano w dokumencie towarzyszącym, myszy są hodowane i trzymane w obiekcie wolnym od patogenów od czterech do 24 godzin po napromieniowaniu ogrzaniu myszy biorcy na poduszce grzewczej pod lampą grzewczą w celu wstrzyknięcia szpiku kostnego dawcy. Umieść mysz biorcy w unieruchomieniu, przetrzyj ogon 70% etanolem, aby wysterylizować miejsce wstrzyknięcia i pobudzić miejscowe rozszerzenie naczyń krwionośnych w celu łatwego wstrzyknięcia.

Za pomocą strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 28 i pół wstrzyknąć, wstrzyknąć jeden razy 10 do siódmych komórek w jednym do 200 mikrolitrów do żyły ogonowej każdej myszy po wstrzyknięciu. Umieść mysz w klatce z maksymalnie trzema innymi myszami, którym wstrzyknięto zastrzyk, przez pierwsze cztery tygodnie po wstrzyknięciu. Utrzymuj wstrzyknięte myszy biorców w klatkach autoklawu z wodą zawierającą antybiotyk sulfonamidowy.

Daje to zwierzętom czas na odzyskanie odporności, zmianę klatek, wody i karmy poddanej antybiotykom co cztery dni w celu utrzymania higieny. Cztery tygodnie po napromienianiu i przeszczepie szpiku kostnego należy przestawić się na zwykłą wodę bez antybiotyków i utrzymywać myszy przez kolejne dwa tygodnie, aby odzyskały normalną mikroflorę jelitową. Sześć tygodni po wstrzyknięciu szpiku kostnego zmierz początkową masę ciała, aby wywołać zapalenie jelita grubego.

Podaj myszom z grupy eksperymentalnej zapalenia jelita grubego 5% siarczanu dekstranu w wodzie pitnej. Pięć dni później zbierz krew obwodową od czterech myszy w probówkach pokrytych heparyną próżniową i umieść ją na lodzie. Następnie w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra połącz 300 mikrolitrów krwi z 300 mikrolitrami barwienia komórek, buforuj i podajedź krew do pięciu probówek do cytometrii przepływowej oznaczonych od jednej do pięciu każda po 100 mikrolitrów na lodzie.

Po złożeniu myszy w ofierze ponownie zmierz masę ciała i oblicz zmianę. Wypreparuj tkanki okrężnicy i umieść je w formalinie w celu barwienia h i d. Następnie uzyskaj komórki szpiku kostnego jak poprzednio.

Podziel zawieszony szpik kostny na pięć mikroprobówek wirówkowych oznaczonych od jednej do pięciu każda po 100 mililitrów. Przygotowując się do analizy metodą cytometrii przepływowej, należy przygotować mieszaninę przeciwciał dla każdej odpowiedniej probówki w ciemności, jak opisano w dokumencie towarzyszącym, próbki krwi i szpiku kostnego oznaczone numerem jeden będą służyć jako kontrole i nie będą barwionymi próbkami krwi i szpiku kostnego. Oznaczony numerem dwa zostanie wybarwiony fitzy isotype control PE i roztworem blokującym CD 16 slash 32.

Te kontrole izotypów służą do potwierdzenia swoistości pierwotnych próbek wiążących przeciwciała. Oznaczone numerem trzy będą poplamione płytami FZ CD 45.1 i CD 16 z ukośnikiem 32. Próbki roztworu blokującego oznaczone numerem cztery zostaną wybarwione płytami CD 45.2 i CD 16 z ukośnikiem 32.

Rozwiązanie blokujące. Jednokolorowe oznakowanie może ujawnić obecność komórek dawcy lub biorcy we krwi lub szpiku kostnym. Wyraźnie próbki oznaczone numerem pięć zostaną wybarwione dla CD 45.1, CD 45.2 i CD 16 z ukośnikiem 32.

Blokowanie w tym przypadku dwukolorowego oznakowania pokazuje względny stosunek komórek dawcy i biorcy we krwi lub szpiku kostnym. Dodaj pięć mikrolitrów mieszaniny przeciwciał dwa i pięć do odpowiednich probówek z próbkami. Następnie dodaj trzy mikrolitry mieszaniny przeciwciał trzy i cztery do odpowiednich probówek z próbkami.

Inkubuj wszystkie probówki na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji dodać dwa mililitry, jeden bufor do lizy XRBC do każdej probówki. Następnie inkubować próbki przez kolejne 15 minut na lodzie w ciemności.

Zawiruj komórki w temperaturze 350 razy G, pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Po wirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą buforu do barwienia komórek o pojemności 500 mikrolitrów w ciemności. Następnie krótko wiruj.

Następnie wykonaj cytometrię przepływową na próbkach krwi i szpiku kostnego z barwienia immunologicznego. Wybierz FZ, aby reprezentować dziki typ CD 45.1 i PE, aby reprezentować nokautowany CD 45.2. Przeanalizuj wyniki cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania Flo Joe.

Obliczyć stosunek dopasowania E do stosunku PE lub stosunek PE do dopasowania e, aby określić, czy genotyp dawcy jest genotypem dominującym we krwi i szpiku kostnym. Ten obraz przedstawia przykładowe obrazy h i e okrężnicy z prawidłową histologią i zapaleniem jelita grubego DSS. Obrazy histologiczne są oceniane na podstawie uszkodzenia tkanki błony śluzowej i naciekania neutrofili do tkanek błony śluzowej i podśluzówkowej.

W związku z tym wyższy wynik histologiczny wskazuje na cięższe zapalenie jelita grubego, aby sprawdzić, czy liina odgrywa rolę w zapobieganiu zapaleniu jelita grubego. Szpik kostny został wymieniony między myszami typu dzikiego i nokautującym, jak opisano w tym filmie. Histologia została następnie oceniona i oceniona, jak pokazano tutaj.

Wyniki histologiczne były znacznie wyższe, gdy szpik kostny myszy z nokautem został wprowadzony do napromieniowanych myszy typu dzikiego. I odwrotnie, wyniki zostały znacznie obniżone, gdy szpik kostny typu dzikiego został wprowadzony do myszy z nokautem. Dane te wskazują, że endogenne C z komórek pochodzących ze szpiku kostnego ma działanie przeciwzapalne i łagodzi zapalenie jelita grubego, aby sprawdzić, czy przeszczep powiódł się u tych myszy.

Cytometrię przepływową wykonano również na szpiku kostnym i krwi myszy po przeszczepie. Szpik kostny typu dzikiego silnie barwi się na Fitz CD 45.1, ale nie pe, CD 45.2, jak pokazano tutaj, szpik kostny z nokautem silnie plami, ale nie Fitz, jak pokazano tutaj. Jednak po przeszczepie zarówno szpik kostny, jak i krew myszy typu dzikiego, które otrzymały szpik kostny z nokautem, silnie wybarwione na PE, ale nie na Fitza, co wskazuje, że dominująca populacja barwionych komórek pochodziła od dawcy.

Podobnie, szpik kostny i krew myszy z nokautem, które otrzymały szpik kostny typu dzikiego, silnie wybarwione na fitzy, ale nie pe, ponownie potwierdzając, że dominujące barwione populacje pochodziły od dawców. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić eksperyment przeszczepu szpiku kostnego i powinieneś być w stanie zmodyfikować zapalenie jelita grubego za pomocą komórek pochodzących ze szpiku kostnego.