Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów w komórkach immunologicznych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego u myszy za pomocą transplantacji szpiku kostnego

Ogólnym celem eksperymentu przedstawionego w tym filmie jest ocena, czy peptyd przeciwdrobnoustrojowy lyzin odgrywa rolę w łagodzeniu zapalenia jelita grubego indukowanego siarczanem dekstranu u myszy. Osiąga się to poprzez wstrzykiwanie szpiku kostnego od myszy typu dzikiego do napromieniowanych myszy typu dzikiego i knockout oraz szpiku kostnego od myszy knockout do napromieniowanych myszy typu dzikiego. Przeszczepiony szpik kostny wygeneruje nowe komórki krwi o genotypie dawcy w organizmie biorcy.

Myszy biorcy są następnie eksponowane na siarczan dekstranu w celu indukcji zapalenia jelita grubego po czterech tygodniach. Pomyślny przebieg transplantacji jest potwierdzany za pomocą cytometrii przepływowej, a uszkodzenia tkanki jelita grubego są oceniane histologicznie. Uzyskane wyniki wykazują, że zapalenie jelita grubego ulega złagodzeniu po przeszczepieniu szpiku kostnego typu dzikiego do myszy z nokautem.

I odwrotnie, zapalenie jelita grubego ulega zaostrzeniu, gdy szpik kostny myszy z nokautem genu zostaje przeszczepiony myszom typu dzikiego. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące ekspresji genów w komórkach pochodzących ze szpiku kostnego lub komórkach niepochodzących ze szpiku kostnego w stanach zapalnych lub infekcjach. Do tego eksperymentu zaleca się użycie myszy C 57, black six, typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu, aby umożliwić odróżnienie myszy typu dzikiego od myszy z nokautem.

Komórki donora po przeszczepie szpiku kostnego. W celu reprezentacji myszy typu dzikiego należy użyć myszy CD 45.1, a w celu reprezentacji myszy z nokautem – myszy CD 45.2. Przedstawiony tutaj schemat opisuje układ doświadczalny, w którym do każdej grupy przypisano pięć myszy donora i 10 myszy biorców.

W grupach A i B szpik kostny zostanie przeszczepiony z myszy typu dzikiego do myszy z nokautem. W grupie A zostanie wywołane zapalenie jelita grubego, natomiast w grupie B nie. W grupach C i D szpik kostny zostanie przeszczepiony z myszy z nokautem do myszy typu dzikiego, a zapalenie jelita grubego zostanie wywołane wyłącznie w grupie C. W grupach E i F przeszczep zostanie wykonany z myszy typu dzikiego do myszy typu dzikiego, a w grupach G i H z myszy z nokautem do myszy z nokautem. Aby przygotować szpik kostny dawcy do przeniesienia do napromieniowanych myszy, należy rozpocząć od wyekstrahowania szpiku kostnego z kości uśmierconych myszy w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Używając sterylnych narzędzi do sekcji, odsłoń kość ramienną, udową, piszczelową i strzałkową, uwalniając je od przyczepionych mięśni i więzadeł, a następnie przenieś je do szalki Petriego. Przetnij oba końce kości, aby odsłonić czerwony szpik kostny. Następnie chwyć jedną z kości pęsetą.

Wypłucz czerwony szpik kostny zimnym PBS do innego naczynia Petriego, używając strzykawki o pojemności 3 ml i igieł o rozmiarze 25 G. Następnie wypłucz kość z drugiego końca, aby uzyskać więcej komórek szpiku kostnego. Powtórz ten proces dla każdej z kości.

Połącz oddzielnie szpiki kostne myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem. Użyj strzykawki o pojemności 6 ml z igłą o rozmiarze 18 G i długości 1/2 cala, aby rozbić zatory czerwonego szpiku kostnego poprzez wielokrotną aspirację i wypychanie treści. Następnie za pomocą pipety serologicznej przenieś zebrany szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.

Po przeniesieniu całego szpiku kostnego, odwiruj go z prędkością 740 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu odlej nadsącz i resuspenduj osad, mieszając go na wirówce typu vortex przez pięć do 10 sekund. Do osadu dodaj pięć mililitrów buforu do lizy XRBC na jedną mysz dawcę, ponownie wymieszaj na vortexie przez pięć sekund i inkubuj przez dokładnie trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Po trzech minutach do każdej probówki należy dodać 20 ml zimnego PBS i wymieszać przez odwracanie, aby zatrzymać lizę. Następnie zawartość należy przelać przez sitko do oddzielania komórek o rozmiarze oczek 40 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Oryginalną probówkę należy wypłukać 5 ml PBS, a otrzymany roztwór przenieść przez sitko do oddzielania komórek.

Należy kontynuować zbieranie przelychania do probówki stożkowej. Następnie uzupełnić objętość do 50 milliliters za pomocą PBS i wymieszać poprzez odwracanie. W dalszej kolejności określić liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu przy użyciu hemocytometru.

Po określeniu liczby komórek, odwiruj komórki szpiku kostnego z prędkością 913 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu usuń nadsącz w zależności od całkowitej liczby komórek. Ponownie zawieś osad w PBS w stężeniu 1 × 10⁸ komórek/mL.

Komórki szpiku kostnego są teraz gotowe do transferu do napromieniowanych myszy biorców. Myszy biorcy typu dzikiego oraz knockout użyte w tym eksperymencie zostały napromieniowane dawką 1000 rad zgodnie z opisem w załączonym dokumencie; myszy są hodowane i utrzymywane w placówce wolnej od patogenów. Od czterech do 24 godzin po napromieniowaniu ogrzano myszy biorców na podgrzewaczu pod lampą grzewczą przed wstrzyknięciem szpiku kostnego od dawcy. Umieść mysz biorcę w stabilizatorze, przemyj ogon 70% etanolem, aby wysterylizować miejsce wstrzyknięcia i wywołać miejscowe rozszerzenie naczyń krwionośnych w celu ułatwienia iniekcji.

Używając strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 28,5 G, wstrzyknij 1 × 10⁷ komórek w 1–200 µL do żyły ogonowej każdej myszy. Przez pierwsze cztery tygodnie po iniekcji umieść mysz w klatce z maksymalnie trzema innymi wstrzykniętymi myszami. Utrzymuj myszy biorców w klatkach autoklawowanych, zapewniając wodę zawierającą antybiotyk sulfa trim.

Daje to zwierzętom czas na odzyskanie odporności; należy zmieniać klatki oraz wodę i pokarm z dodatkiem antybiotyków co cztery dni w celu zachowania higieny. Cztery tygodnie po napromieniowaniu i przeszczepie szpiku kostnego należy przejść na zwykłą wodę bez antybiotyków i utrzymywać myszy przez kolejne dwa tygodnie, aby odzyskały prawidłową mikroflorę jelitową. Sześć tygodni po wstrzyknięciu szpiku kostnego należy zmierzyć początkową masę ciała przed indukcją zapalenia jelita grubego.

Myszom w grupie eksperymentalnej z zapaleniem jelita grubego podaj 5% dekstranu siarczanu w wodzie pitnej. Po pięciu dniach pobierz krew obwodową od czterech myszy do probówek vacutainer powlekanych heparyną i umieść ją w lodzie. Następnie w 1,5 mililitrowej probówce do mikrocentryfugi połącz 300 µL krwi z 300 µL buforu do barwienia komórek, a następnie rozdziel krew do pięciu probówek do cytometrii przepływowej, ponumerowanych od jeden do pięciu, dozując po 100 µL do każdej, w lodzie.

Po uśmierceniu myszy ponownie zmierz masę ciała i oblicz zmianę. Pobierz tkanki okrężnicy i umieść je w formalinie w celu barwienia h oraz d. Następnie wyizoluj komórki szpiku kostnego w sposób opisany wcześniej.

Rozdziel resuspendowany szpik kostny do pięciu probówek do mikrowirówki oznaczonych od jeden do pięć, wlewając do każdej 100 ml. W przygotowaniu do analizy metodą cytometrii przepływowej, przygotuj w ciemności mieszaninę przeciwciał do każdej z probówek zgodnie z opisem w załączonym dokumencie; próbki krwi i szpiku kostnego oznaczone numerem jeden będą służyć jako kontrole i nie zostaną zabarwione. Próbki krwi i szpiku kostnego oznaczone numerem dwa zostaną zabarwione kontrolą izotypową FITC, kontrolą izotypową PE oraz roztworem blokującym CD16/32.

Te kontrole izotypowe są stosowane w celu potwierdzenia swoistości wiązania przeciwciał pierwszorzędowych z próbkami. Próbka oznaczona numerem trzy zostanie zbarwiona przy użyciu FZ CD 45.1 oraz CD 16/32. Próbki w roztworze blokującym oznaczone numerem cztery zostaną zbarwione przy użyciu CD 45.2 oraz CD 16/32.

Roztwór blokujący. Znakowanie jednym kolorem może ujawnić obecność komórek donora lub biorcy we krwi lub szpiku kostnym. Wyraźnie próbki oznaczone numerem pięć zostaną zabarwione pod kątem CD 45.1, CD 45.2 oraz CD 16/32.

Blokowanie w tym miejscu dwukolorowego znakowania pokazuje względny stosunek komórek dawcy i biorcy we krwi lub szpiku kostnym. Dodaj 5 µL mieszaniny przeciwciał dwa i pięć do odpowiednich probówek z próbkami. Następnie dodaj 3 µL mieszaniny przeciwciał trzy i cztery do odpowiednich probówek z próbkami.

Inkubować wszystkie probówki na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji dodać do każdej probówki 2 mL buforu do lizy XRBC. Następnie inkubować próbki przez kolejne 15 minut na lodzie w ciemności.

Odwirować komórki przy 350 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu usunąć nadsącz i zawiesić osad w 500 µL buforu do barwienia komórek w ciemności. Następnie krótko wymieszać na wortexie.

Następnie przeprowadź cytometrię przepływową próbek krwi i szpiku kostnego poddanych barwieniu immunologicznemu. Wybierz FZ dla reprezentacji typu dzikiego CD 45.1 oraz PE dla reprezentacji nokautu CD 45.2. Wyniki cytometrii przepływowej przeanalizuj przy użyciu oprogramowania FloJoe.

Oblicz stosunek fit E do wskaźnika PE lub wskaźnika PE do fit e, aby określić, czy genotyp donora jest genotypem dominującym we krwi i szpiku kostnym. Na tym obrazie przedstawiono przykładowe obrazy barwienia H&E okrężnic z prawidłową histologią oraz zapaleniem okrężnicy wywołanym DSS. Obrazy histologiczne są oceniane na podstawie uszkodzeń tkanki śluzowej oraz infiltracji neutrofili do tkanek śluzowych i podśluzowych.

Zatem wyższy wynik histologiczny wskazuje na cięższy przebieg zapalenia jelita grubego, co pozwoliło sprawdzić, czy lyin odgrywa rolę w zapobieganiu temu procesowi. Przeszczepiono szpik kostny między myszy typu dzikiego a myszy z nokautem, zgodnie z opisem w tym filmie. Następnie oceniono i punktowano obraz histologiczny, jak pokazano tutaj.

Wskaźniki histologiczne uległy znacznemu zwiększeniu po wprowadzeniu szpiku kostnego myszy z nokautem do napromieniowanych myszy typu dzikiego. Odwrotnie, wskaźniki te znacząco spadły, gdy szpik kostny myszy typu dzikiego został wprowadzony do myszy z nokautem. Dane te wskazują, że endogenne C z komórek pochodzących ze szpiku kostnego wykazuje działanie przeciwzapalne i łagodzi zapalenie jelita grubego, co potwierdza sukces transplantacji u tych myszy.

Po transplantacji przeprowadzono również analizę cytometryczną szpiku kostnego i krwi myszy. Szpik kostny typu dzikiego wykazuje silne barwienie dla Fitz CD 45.1, ale nie dla PE CD 45.2, jak pokazano tutaj; szpik kostny myszy z nokautem wykazuje silne barwienie dla PE, ale nie dla Fitz, jak pokazano tutaj. Jednak po transplantacji zarówno szpik kostny, jak i krew myszy typu dzikiego, które otrzymały szpik kostny myszy z nokautem, barwiły się silnie dla PE, a nie dla Fitz, co wskazuje, że dominująca populacja zabarwionych komórek pochodziła od dawcy.

Podobnie, szpik kostny i krew z myszy z nokautem, które otrzymały szpik kostny typu dzikiego, wykazały silne barwienie dla fitzy, ale nie dla pe, co ponownie potwierdziło, że dominujące barwione populacje pochodziły od donora. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić eksperyment transplantacji szpiku kostnego oraz modyfikować przebieg zapalenia jelita grubego za pomocą komórek pochodzących ze szpiku kostnego.