Name: Nowatorskie podejście chirurgiczne do dotchawiczego podawania środków bioaktywnych w modelu płodu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj nową technikę chirurgiczną dotchawicznego podawania środków bioaktywnych w płodach myszy. Ta metoda zwiększa skuteczność dostarczania substancji do płuc płodu w porównaniu z tradycyjnym wstrzyknięciem do worka owodniowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.C. i A.V.d.P. są doktorantami wspieranymi z grantów Instytutu Promocji Innowacji poprzez Naukę i Technologię w Flandrii (IWT-Vlaanderen). J.T. posiada niepełny etat stypendialny w ramach Clinical Research Fellowship (KOOR) z UZ Leuven. D.V. jest doktorantem wspieranym z grantu KU Leuven, DBOF/10/062. M.M.d.C jest doktorantem wspieranym z grantu Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) oraz Erasmus Mundus. Badania zostały sfinansowane przez IWT-Vlaanderen, grant EC DIMI (LSHB-CT-2005-512146) oraz grupę badawczą In vivo Molecular Imaging Research (IMIR) z KU Leuven. Chcielibyśmy podziękować UPenn Vector Core, założonemu przez Jamesa M. Wilsona, za uprzejme przekazanie plazmidu pakującego AAV6.2 do produkcji wektora rAAV.

<ol><li>Willson, D. F., Notter, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+exogenous+surfactant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Care%22%5BJournal%5D)">The future of exogenous surfactant therapy.</a> Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).</li>
<li>Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+Clara+cell+secretory+protein+%28CCSP%29+administration+in+preterm+infants+with+or+at+risk+of+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst.+Rev%22%5BJournal%5D)">Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome.</a> Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).</li>
<li>Thebaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+gene+therapy+increases+survival%2C+promotes+lung+angiogenesis%2C+and+prevents+alveolar+damage+in+hyperoxia-induced+lung+injury%3A+evidence+that+angiogenesis+participates+in+alveolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization.</a> Circulation. 112, 2477-2486 (2005).</li>
<li>Griesenbach, U., Alton, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+the+lung%3A+lessons+learned+from+more+than+2+decades+of+CF+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).</li>
<li>Aneja, M. K., Rudolph, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+of+surfactant+protein+B+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy of surfactant protein B deficiency.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).</li>
<li>Flotte, T. R., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+alpha-1+antitrypsin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency.</a> Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).</li>
<li>Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+and+genetic+therapies+for+the+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Fetal+Neonatal+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell and genetic therapies for the fetus.</a> Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).</li>
<li>Peebles, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+marker+gene+expression+in+the+airway+epithelia+of+fetal+sheep+after+minimally+invasive+tracheal+application+of+recombinant+adenovirus+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero.</a> Gene Ther. 11, 70-708 (2004).</li>
<li>Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetoscopic+tracheal+occlusion+%28FETO%29+for+severe+congenital+diaphragmatic+hernia%3A+evolution+of+a+technique+and+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results.</a> Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).</li>
<li>Buckley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-amniotic+delivery+of+CFTR-expressing+adenovirus+does+not+reverse+cystic+fibrosis+phenotype+in+inbred+CFTR-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice.</a> Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).</li>
<li>Davies, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+expression+of+CFTR+does+not+improve+survival+of+CFTR+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice.</a> Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).</li>
<li>Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+transfer+to+mouse+fetuses+with+recombinant+adenovirus+and+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors.</a> Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).</li>
<li>Henriques-Coelho, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+transfer+to+fetal+rat+lung+interstitium+by+ultrasound-guided+intrapulmonary+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection.</a> Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).</li>
<li>Toelen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+gene+transfer+with+lentiviral+vectors%3A+long-term+in+vivo+follow-up+evaluation+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model.</a> Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+phenotypic+correction+of+hemophilia+B+in+immunocompetent+mice+by+prenatal+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy.</a> Blood. 104, 2714-2721 (2004).</li>
<li>Senoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+gene+transfer+in+mice+and+guinea+pigs%3A+tissue+distribution+of+recombinant+adenovirus+determined+by+quantitative+TaqMan-polymerase+chain+reaction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay.</a> Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).</li>
<li>Carlon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+mouse+lung+by+fetal+intratracheal+injection+of+rAAV2%2F6.2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2.</a> Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Schmiedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+injury+is+more+pronounced+in+fetal+transgenic+ErbB4-deleted+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).</li>
<li>Buckley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+adenovirus-mediated+airway+transduction+in+fetal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice.</a> Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Kluczowe etapy
 <ul>
 <li>Wybraną przez nas linią myszy do pracy są myszy NMRI, ponieważ dają one liczne mioty (średnia wielkość miotu 14,4 ± 1,8, dane własne), dobrze tolerują interwencje i wykazują dobre cechy macierzyńskie.</li>
 <li>Przeciągnięcie sznurka zaciskowego przez ścianę macicy i błony płodowe jest krytycznym krokiem, ponieważ celem jest odsłonięcie wyłącznie głowy płodu, a nie barków; w przeciwnym razie repozycjonowanie jest niemal niemożliwe bez spowodowania urazu.</li>
 <li>Optymalne ustawienie ...

<table><tbody><tr><td>myszy NMRI</td><td>Janvier, Le Genest St Isle, Francja</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Izofluran </td><td>Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 5-0</td><td>Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;strzykawka szklana Hamilton, model 1710.5 TLLX SYR</td><td>Hamilton, Reno, NV, USA</td><td>5495-20</td><td></td></tr><tr><td>ostra igła 30G</td><td>Hamilton, Reno, NV, USA</td><td>7762-03</td><td></td></tr><tr><td>2% ksylokaina </td><td>AstraZeneca, Zoetermeer, Holandia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorskie podejście chirurgiczne do wewnątrztrachealnego podawania substancji bioaktywnych w płodowym modelu mysim

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Przedszczepowe podanie do płuc komórek, genów lub środków farmakologicznych mogłoby stanowić podstawę nowych strategii terapeutycznych w leczeniu wielu chorób genetycznych i nabytych. Poza wadami wrodzonymi lub dziedzicznymi, wymagającymi długotrwałej ekspresji dostarczonego genu, potencjalnymi przyszłymi wskazaniami do tego rodzaju podejścia są również kilka niedziedzicznych stanów okołoporodowych, w których do osiągnięcia efektów terapeutycznych wystarczająca jest krótkotrwała ekspresja genu lub interwencja farmakologiczna. Chorobami kwalifikującymi się do zastosowania krótkotrwałej terapii przedszczepowej mogą być przejściowy noworodkowy niedobór białka surfaktantu B powodujący zespół niewydolności oddechowej noworodka1,2 lub uszkodzenia hiperoksygenacyjne płuc noworodka3. Chorobami kwalifikującymi się do trwałej korekty terapeutycznej są mukowiscydoza (CF)4, genetyczne warianty niedoborów surfaktantu5 oraz niedobór α1-antytrypsyny6.
Zasadniczo istotną zaletą prenatalnej terapii genowej jest możliwość wczesnego rozpoczęcia interwencji terapeutycznej w rozwoju, w momencie lub nawet przed wystąpieniem objawów klinicznych u pacjenta, co pozwala zapobiec nieodwracalnym uszkodzeniom organizmu. Ponadto organy płodowe charakteryzują się zwiększonym tempem proliferacji komórek w porównaniu z organami osób dorosłych, co może umożliwić bardziej efektywny transfer genów lub komórek macierzystych do płodu. Co więcej, dostarczanie genów in utero odbywa się w czasie, gdy układ odpornościowy osobnika nie jest jeszcze w pełni dojrzały. W związku z tym transplantacja komórek heterologicznych lub suplementacja brakującego lub niefunkcjonalnego białka jego poprawną wersją nie powinna powodować uczulenia immunologicznego na komórkę, wektor lub produkt transgenu, co zostało niedawno potwierdzone zarówno w przypadku terapii komórkowych, jak i genetycznych7.
W niniejszym badaniu zbadaliśmy możliwość bezpośredniego celowania w tchawicę płodu w modelu mysim. Procedura ta jest stosowana w modelach większych zwierząt, takich jak króliki i owce8, a nawet w warunkach klinicznych9, lecz do tej pory nie była przeprowadzana w modelu mysim. Przy badaniu potencjału płodowej terapii genowej w chorobach genetycznych, takich jak CF, model mysi jest bardzo użyteczny jako pierwszy dowód koncepcji ze względu na szeroką dostępność różnych transgenicznych szczepów myszy, dobrze udokumentowany proces embriogenezy i rozwoju płodu, mniej rygorystyczne regulacje etyczne, krótki okres gestation oraz liczne mioty.
Opisano różne drogi dostępu w celu celowania w płuca płodu gryzonia, w tym wstrzyknięcia do jamniowej10-12, wstrzyknięcia dopłucne (pod kontrolą USG)13,14 oraz podanie dożylne do naczyń pęcherzyka żółtkowego15,16 lub żyły pępkowej17. Nasza nowa procedura chirurgiczna umożliwia badaczom wstrzykiwanie wybranego środka bezpośrednio do tchawicy płodu myszy, co pozwala na wydajniejsze dostarczenie substancji do dróg oddechowych niż w przypadku istniejących technik18.

Opracowaliśmy nową metodę chirurgiczną podawania czynników bioaktywnych drogą wewnątrz tchawiczną do płodu myszy. Ta droga podania jest bardziej efektywna w celowaniu w płuca płodu myszy niż powszechnie stosowane wstrzyknięcia do jamniówki. Procedura ta nie była dotychczas opisana w modelu mysim.

Nowatorskie podejście chirurgiczne do wewnątrztrachealnego podawania substancji bioaktywnych w płodowym modelu mysim

Prenatal podawanie komórek, genów lub czynników farmakologicznych do płuc może stanowić podstawę nowych strategii terapeutycznych w leczeniu wielu schorzeń genetycznych i...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest umożliwienie wstrzyknięcia wybranego preparatu bezpośrednio do tchawicy płodu myszy, co pozwala na bardziej efektywne dostarczenie substancji do dróg oddechowych niż w przypadku istniejących technik. Osiąga się to poprzez zewnętrznienie głowy płodu za pomocą hysterotomii i uzyskanie dostępu do tchawicy płodu. Następnie wykonuje się pionowe nacięcie szyi w celu uwidocznienia tchawicy, a następnie pod kontrolą wizualną wprowadza się igłę.Następnie do tchawicy wstrzykuje się fluorescencyjne kuleczki lub wektor wirusowy, aby efektywnie dostarczyć wybraną substancję do dróg oddechowych płodu. Analiza mikroskopowa przekrojów tkanek z potraktowanych płuc wykazuje, że wstrzyknięcie dotchawicze skutkuje bardziej efektywnym dostarczeniem cząsteczek fluorescencyjnych lub wektorów wirusowych do dróg oddechowych płodu w porównaniu do najczęściej stosowanej drogi podania do jamki wodnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wewnątrzowodniowy wtrysk płodowy, jest uniknięcie rozcieńczenia wstrzykniętej substancji w płynie owodniowym.Maksymalizuje to efekt ilości cząsteczek obecnych w płucach myszy płodowej. Generalnie osoby początkujące w tej technologii uznają wykonanie idealnego wstrzyknięcia endotrachealnego za niezwykle trudne. Wynika to z faktu, że tchawica płodu jest niezwykle delikatna i w związku z tym może zostać bardzo łatwo przebita.Wykonując tę czynność, przeprowadzą Państwo wstrzyknięcie przez tchawicę, w związku z czym nie uda się skierować preparatu do płuc płodu. Jednak, jak zawsze, praktyka czyni mistrza. W ramach przygotowań do wstrzyknięcia wewnątrztchawiczego lub dożylnego należy przygotować ciężarne myszy szczepu MRI. W momencie operacji myszy powinny być w 18. dniu ciąży przed operacją i po niej.Myszki są utrzymywane w klatkach z filtrem w temperaturze pokojowej i przy normalnym świetle dziennym z nielimitowanym dostępem do wody i paszy. Po znieczuleniu myszy izofluranem, należy umieścić ją na macie grzewczej w temperaturze 37 °C w celu utrzymania temperatury ciała i sprawdzić głębokość znieczulenia, wykonując test uszczyśnięcia palca. Następnie należy zdezynfekować brzuch jodkiem powidonie i przeprowadzić laparotomię pośrodkową, aby odsłonić macicę w stanie ciąży, wyewaginować oba rogi macicy i policzyć liczbę worków płodowych.W każdym rogu macicy operuje się jeden płód, opierając się na optymalnej pozycji dla eksternalizacji głowy płodu. Aby unieruchomić płód wewnątrz macicy, przez ścianę macicy i błony płodowe, w obszarze, w którym odsłonięta zostanie głowa płodu, przeprowadza się szew purse-string z nici Prolene 6-0 o średnicy około jednego centymetra. Następnie, używając małych nożyczek z ostrym końcem, wykonuje się w ścianie macicy nacięcie o długości około 0,8 cm wewnątrz szwu purse-string.Następnie delikatnie przeciągnij głowę i szyję płodu przez cięcie macicy. Potem delikatnie zaciągnij szew typu „torebka” wokół szyi i użyj dwóch mikro-kleszczyków typu mosquito. Aby ustabilizować go w tej pozycji, użyj pięciu szwów z polyactin.Za pomocą dwóch pincet umieść dziewięć szwów 10 w jamie ustnej wokół górnej szczęki, aby utrzymać głowę płodu w maksymalnym wyproście pod mikroskopem stereoskopowym. Zlokalizuj tchawicę, stosując ostrą i tępą dyssekcję; wykonaj pionowe nacięcie szyi, a następnie dalej rozdzielcie tkanki podskórne, aby dotrzeć do tchawicy. Używając szklanej strzykawki Hamiltona o pojemności 50 µL z ostrą igłą 30G, wstrzyknij całkowitą objętość 30 µL substancji.Minimalny odpływ wstrzykniętego płynu po wyjęciu igły potwierdza prawidłowe wykonanie iniekcji. Aby zawrócić głowę do macicy, należy delikatnie nacisnąć nos. Najpierw do macicy powraca szyja, a następnie głowa.I na koniec nos. Wprowadź igłę z solą fizjologiczną do nacięcia wewnątrz szwu typu „torebka”. Zamknij hysterotomię, zaciągając szew typu „torebka”, i wstrzyknij łącznie około 500 µL soli fizjologicznej do jamniowej, aby zapobiec oligohydramniosowi.Po wprowadzeniu macicy z powrotem do jamy brzusznej, należy zastosować szew ciągły nici Vicryl 5-0 w dwóch oddzielnych warstwach. Aby zamknąć ścianę brzuszną matki, miejsce ncięcia należy przefiltrować 0,2% ksylokainą w celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego. Myszkę należy trzymać na podgrzewaczu aż do pełnego wybudzenia, aby przeprowadzić wewnątrzowodniowy (IA) zastrzyk płodu.Po znieczuleniu ciężarnej myszy, należy zdezynfekować brzuch za pomocą povidonu jodowego i wykonać laparotomię pośrodkową, aby odsłonić ciężarną macicę, wyciągnąć dwa rogi macicy i policzyć liczbę worków owodniowych. Używając szklanej strzykawki Hamiltona o pojemności 50 µL z ostrą igłą o rozmiarze 30 G, należy wprowadzić igłę do worka, w pobliżu pyszczka płodu, nie dopuszczając do kontaktu z nim, a następnie wstrzyknąć 30 µL roztworu do płynu owodniowego.Po wstrzyknięciu wszystkich płodów, umieść macicę z powrotem w jamie brzusznej i zszyj ścianę brzuszną oraz skórę szwem 5-0 Vicryl. Po uśmierceniu samicy, 36 godzin po interwencji płodowej, wyjmij płody poprzez cięcie cesarskie i oceń ich żywotność, sprawdzając obecność bicia serca, różowy kolor skóry oraz ruchy spontaniczne. Umieść młode w pobliżu źródła tlenu, aby pobudzić oddychanie i wysycenie tlenem.Następnie oznacz szczenięta u nasady ogona. Przy użyciu tuszu chińskiego skuteczność wstrzyknięcia można ocenić poprzez eutanazję zoperowanego płodu i sekcję płuc, aby makroskopowo ocenić obecność widocznego barwnika w płucach w porównaniu z niezatrzymanymi płucami kontrolnymi. Następnie zabezpiecz pozostałe szczenięta spełniające kryteria żywotności.Podłoże zawierające odchody i mocz matki zastępczej z jednodniowymi pisklętami i umieść pisklęta w lęgu matki zastępczej. W lęgu matki zastępczej powinno pozostać łącznie nie więcej niż 10 piskląt. Następnie umieść klatkę w cichym, niezakłóconym środowisku na 12 h i oceń przeżywalność w celu ustalenia optymalnej objętości dla tej procedury.Empirycznie wybrano objętości wstrzykiwania wynoszące 10, 20 i 30 µL cząsteczek czerwonego fluorescencyjnego barwnika o rozmiarze 100 nm. Przedstawione tutaj obrazy konfokalne ukazują utrwalone przekroje płuc z barwieniem jąder komórkowych. Chociaż w czasie operacji płodu cofnięcie się płynu stwierdzono dopiero po wstrzyknięciu 30 µL, co wskazywało na nadmiar podanych płynów, to właśnie objętość 30 µL zapewniła najwyższy sygnał fluorescencyjny w miąższu płuc, co określono poprzez pomiar względnej fluorescencji pokazany tutaj; wstrzyknięcie to doprowadziło do znacznie większego dostarczenia fluorosfer do płuc płodu w porównaniu z drogą IA.Przewód pokarmowy był również dodatni u zwierząt po wtryskach IT oraz IA. Nie zaobserwowano czerwonej fluorescencji w innych tkankach leczonych płodów ani u zwierząt kontrolnych ujemnych. Aby ocenić skuteczność transdukcji wirusowej po wtrysku, wykonano wstrzyknięcia IT oraz IA z użyciem wektorów rAAV ENC kodujących lucyferazę świetlikową pod kontrolą promotora kurzej beta-aktyny w pierwszym tygodniu życia. Całkowity strumień fotonów dla grupy IT był znacząco wyższy niż dla szczeniąt z grupy IA oraz grupy kontrolnej ujemnej.Aby odróżnić prawidłową od nieprawidłowej iniekcję przezskórną (IT), zastosowano kombinację obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) oraz obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) w celu uzyskania obrazu nałożonego, który łączy sygnał BLI z powierzchni z wizualizacją głębszych struktur anatomicznych z obrazowania MR, co przedstawiono tutaj. W pierwszym tygodniu życia obrazowanie BL wykazało sygnał pochodzący z obszaru szyi i klatki piersiowej.Współrejestracja obrazowania MRI z BLI wykazała ekspresję genu lucyferazy w obszarze płuc po prawidłowym wstrzyknięciu, natomiast w obrębie szyi i jamy brzusznej po nieprawidłowym wstrzyknięciu. Analiza histologiczna z użyciem barwienia ex gal potwierdziła współrejestrację in vivo. Po opanowaniu całej procedury, wstrzyknięcie do wnętrza organizmu może zostać wykonane w ciągu pół godziny, od nacięcia do zamknięcia rany u zwierzęcia matki.Krótszy czas trwania operacji zapewni lepszą przeżywalność płodów oraz zwiększy liczbę zwierząt, które będą mogły zostać poddane badaniom po urodzeniu.

a-novel-surgical-approach-for-intratracheal-administration-bioactive

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Nowe chirurgiczne podejście do podawania czynnych biologicznie substancji przez tchawiczną u fetusu myszy

Ten film opisuje podejście dooskrzelowe polegające na selektywnym podawaniu eksperymentalnego środka do dystalnego prawego i lewego płuca. W przedstawionym protokole będziemy podawać bleomycynę dooskrzelowo myszy, aby uzyskać lepszy model zwłóknienia płuc.

Podawanie dooskrzelowe: technika selektywnego podawania eksperymentalnego środka do płuc myszy

Źródło: Venuprasad, K., et al. Dotchawicze podawanie Haemophilus influenzae w modelach mysich w celu zbadania stanu zapalnego dróg oddechowych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje dotchawicze podawanie patogennego dla płuc inokulum bakteryjnego do znieczulonej myszy w celu modelowania infekcji dolnych dróg oddechowych.

Przeprowadzanie dotchawiczego podawania bakterii w modelu mysim

Ten film pokazuje procedurę przezmacicznego zamknięcia tchawicy u płodu myszy u ciężarnej myszy. Model ten można wykorzystać do badania wpływu niedrożnej tchawicy na rozwój płuc.

Modelowanie przezmacicznej niedrożności tchawicy płodu w modelu mysim: zabieg chirurgiczny podwiązania tchawicy płodu u ciężarnej myszy

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy.

Nieinwazyjna intubacja dotchawicza w celu zbadania patologii i fizjologii płuc myszy

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Ta technika bezpośredniego wstrzykiwania leków do tchawicy noworodków gryzoni jest ważna w badaniu wpływu lokalnie podawanych leków lub leków biologicznych na choroby płuc u noworodków. Dodatkowo metoda ta może być również stosowana do wywoływania uszkodzenia płuc w modelach zwierzęcych.

Minimalnie inwazyjna metoda dotchawniczego wkraplania leków u nowonarodzonych gryzoni w leczeniu chorób płuc

Różne modele zwierzęce wrodzonej przepukliny przeponowej i niedrożności tchawicy płodu prezentują zalety i wady dotyczące kwestii etycznych, kosztów, trudności chirurgicznych, rozmiaru, wskaźników przeżycia i dostępności narzędzi genetycznych. Model ten zapewnia nowe narzędzie do badania wpływu zarówno niedrożności tchawicy, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.

Przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

Ten protokół pokazuje, jak optymalne ustawienie myszy i transoralne wprowadzenie otoskopu opartego na kamerze umożliwia wizualizację głośni, szybką intubację przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i stałe dostarczanie płynu do płuc.

Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego

Poznaj nową technikę chirurgiczną dotchawicznego podawania środków bioaktywnych w płodach myszy. Ta metoda zwiększa skuteczność dostarczania substancji do płuc płodu w porównaniu z tradycyjnym wstrzyknięciem do worka owodniowego.

Nowatorskie podejście chirurgiczne do wewnątrztrachealnego podawania substancji bioaktywnych w płodowym modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów