Name: Neuronalne kultury eksplantatów z Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę hodowli eksplantatów neuronalnych z Xenopus laevis do analizy dynamiki cytoszkieletu w stożkach wzrostu. Technika fluorescencyjna umożliwia obserwację zmian lokalizacji białek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Bobowi Freemanowi za szkolenie, laboratorium Kirschnera za możliwość korzystania z zaplecza dla płazów oraz członkom laboratorium Van Vactora za wsparcie. Dziękujemy Nikon Imaging Center w Harvard Medical School za pomoc w przeprowadzeniu mikroskopii świetlnej dla obrazów przedstawionych na Rysunku 1. Praca ta była finansowana z następujących środków: stypendium NRSA NIH oraz stypendium NIH K99 dla L.A.L, funduszy Basic Science Partnership (<a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a>) dla AEF oraz grantu NIH RO1 NS035909 dla D.V.V.

Uwaga: Kroki opisane w dwóch pierwszych sekcjach przedstawiamy jedynie w skrócie, ponieważ w innych publikacjach opublikowano doskonałe protokoły z dokładnymi informacjami, które koncentrują się bardziej szczegółowo na tych etapach (np.8-12). Ponadto ogólny protokół pracy z neuronami rdzenia kręgowego Xenopus w hodowli żywych komórek został wcześniej opublikowany w szczegółowym artykule dotyczącym metod8. Gorąco zalecamy zapoznanie się z tym artykułem jako uzupełnienie do niniejszego filmu, choć tutaj dostarczamy wystarczających informacji, aby pomyślnie przeprowadzić i rozwiązać problemy związane z protokołem wycinania rurki neuralnej i wysiewania w kroku 3.
1. In vitro Zapłodnienie Xenopus Jaja
<ol>
 <li>Pozyskać jaja od samic żab, którym 12-18 h przed pobraniem jaj wstrzyknięto gonadotropinę kosmotropową (400 units/frog). Jaja zbierać w 1X roztworze Marc's Modified Ringer (MMR) (0.1 M NaCl, 2.0 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 2.0 mM CaCl2, 5.0 mM HEPES, pH 7.49).</li>
 <li>Zapłodnić jaja in vitro za pomocą rozdrobnionych jąder, zgodnie z wcześniejszym opisem9.</li>
 <li>Po co najmniej 20 min usunąć galaretowatą otoczkę embrionów poprzez inkubację w 2% cysteinie w 1X MMR (doprowadzonym do pH 7.8 za pomocą NaOH) przez 3-5 min. Przemyć 0.1X MMR (lub 0.1X MBS (Modified Barth's Saline, przepis 1X: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 2.5 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, pH 7.8)) 3-5 razy i przechowywać embriony w temperaturze pokojowej do momentu iniekcji lub, jeśli jest to pożądane, umieścić embriony w temperaturze 14-18 °C w celu spowolnienia rozwoju.</li>
</ol>
2. Mikroiniekcja RNA
Uwaga: choć w niniejszym przypadku wykorzystujemy iniekcję RNA, techniki te nie są ograniczone wyłącznie do RNA; do manipulacji genetycznych można również stosować DNA, białka lub zmodyfikowane kwasy nukleinowe, co zostało opisane we wcześniejszych publikacjach12.
<ol>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu cząsteczki RNA służące do znakowania cytoszkieletu lub innych struktur są transkrybowane z linearyzowanych matryc DNA przy użyciu zestawu mMessage mMachine (Ambion). mRNA wymagają czapeczki 5' oraz ogona poli(A) 3', aby promować translację i zapobiegać degradacji w embrionach. W tym celu powszechnie stosowanym wektorem jest pCS2+, a zestaw do transkrypcji zawiera analog czapeczki stosowany podczas reakcji syntezy. Przetranskrybowane mRNA resuspendujemy w nuclease-free ddH20 do stężenia zapasowego od 500 do 2 000 ng/μl, a następnie bezzwłocznie przechowujemy w temperaturze -80 °C. Przed iniekcją RNA należy rozcieńczyć w ddH20 do odpowiedniego stężenia iniekcyjnego. Ponieważ do embrionów wstrzykuje się jedynie niewielką objętość, resuspensja w buforze nie jest konieczna. Nasze końcowe stężenie iniekcyjne wynosi zazwyczaj 50-200 pg/nl, w zależności od konstruktu; zazwyczaj wstrzykujemy do 4 nl na embrion, choć wiele laboratoriów tradycyjnie wstrzykuje do 10 nl, co stanowi około 1% całkowitej objętości embrionu. RNA może być toksyczne w wysokich dawkach, a dawka na embrion zazwyczaj mieści się w zakresie od 10 pg do 1 ng, choć w zależności od konkretnego genu i czystości tolerowane może być do 5 ng. Jednakże w celu obrazowania lokalizacji białek należy wstrzyknąć jak najniższą ilość, aby uniknąć artefaktów wynikających z nadekspresji. RNA dla EB1-GFP w tym protokole jest stosowane w końcowej ilości 250 pg na embrion.</li>
 <li>Igły do iniekcji przygotowuje się poprzez wyciąganie kapilar za pomocą wyciągarki do igieł9 do średnicy końcówki ok. 0,2 μm. Korzystając z wyciągarki Sutter P-87, stosujemy następujące ustawienia: heat 644, pull 125, velocity 70, time 250, jednak parametry te różnią się w zależności od urządzenia i muszą zostać ponownie dostosowane po wymianie włókna (obecnie używamy kwadratowego włókna 2,5 mm o szerokości 2,5 mm). Pod mikroskopem końcówkę igły należy odłamać pęsetą pod kątem, aby uzyskać kształt przypominający pióro. Istnieją inne metody łamania i napełniania igieł iniekcyjnych (np.11,12), jednak my napełniamy igłę RNA, nakładając małą kroplę (0,5 - 1 μl) na tylny koniec igły. Do mikroiniekcji w embrionach dostępnych jest wiele komercyjnych systemów iniekcyjnych, z których dwa najpopularniejsze to Pico-injector (Medical Systems) oraz Nanoject (Drummond Scientific) (więcej informacji w11). Używamy urządzenia Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, które wykorzystuje sprężony gaz przez cyfrowo ustawiony czas w celu podania stałych objętości nanolitrowych. Objętość iniekcji musi być skalibrowana dla każdej nowej mikropipety przy użyciu mikrometru przedmiotowego, a czas iniekcji należy dostosować, aby uzyskać pożądaną ilość wstrzykniętego RNA.</li>
 <li>Zapłodnione embriony w stadium od 1 do 4 komórek umieszcza się w plastikowej płytce zawierającej 5% Ficoll w 0,1X MMR. Unieruchamiając embrion pęsetą lub umieszczając go na platformie stabilizującej (plastikowa siatka o oczkach ok. 1 mm, przyklejona do dna płytki plasteliną lub woskiem dentystycznym), wstrzykuje się pożądaną objętość do blastomerów zwierzęcych (szczegóły dotyczące objętości iniekcji znajdują się w kroku 2.1). Substancję należy rozdzielić w kilku miejscach w obrębie embrionu, wykonując co najmniej jedną iniekcję do każdego z blastomerów zwierzęcych, aby uzyskać bardziej jednorodne rozprzestrzenienie (na przykład w przypadku embrionu w stadium 4 komórek zazwyczaj wstrzykujemy 1-2 razy do każdego blastomeru, natomiast w stadium 2 komórek wstrzykujemy 2-4 razy do każdego blastomeru). Korzyścią z oczekiwania do stadium 2-4 komórek jest pewność, że embrion rozpoczął prawidłowe podziały. Jednakże, jeśli czas jest kluczowy, można rozpocząć w stadium 1 komórki, co daje niemal identyczny wynik końcowy, z tą różnicą, że konieczne jest wstrzyknięcie większej liczby embrionów. Można również stosować embriony w starszych stadiach, co jest szczególnie przydatne, jeśli celem iniekcji są specyficzne typy komórek, jednak ponieważ zazwyczaj preferujemy szerszą ekspresję, wstrzykujemy w młodsze embriony, aby zmniejszyć liczbę potrzebnych iniekcji.</li>
 <li>Wstrzyknięte embriony przenosi się do plastikowej płytki zawierającej 0,1X MMR i pozostawia do rozwoju do stadium 20-2313. Embriony inkubuje się w temperaturze od 14 do 22 °C, w zależności od pożądanej szybkości rozwoju. (W przypadku preparowania cewek nerwowych następnego dnia należy stosować temp. ok. 22 °C. W przypadku preparowania dzień później – ok. 14 °C).</li>
</ol>
3. Disekcja i wysiew cewy nerwowej
<ol>
 <li>Przed przystąpieniem do sekcji należy przygotować naczynia hodowlane14. Najpierw pokryć szkiełka podstawowe ilością roztworu 200 μg/ml poli-lizyny w PBS wystarczającą do całkowitego pokrycia powierzchni szkiełka (stosując naczynia hodowlane Mattek lub Lab-Tek) i inkubować przez jedną godzinę (alternatywnie można użyć szkiełek podstawkowych luźno umieszczonych w szalce Petriego, aby później przenieść je na szkiełka przedmiotowe do obrazowania i immunocytochemii). Odessać płyn i wypłukać nadmiarem PBS 3 razy, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Następnie pokryć naczynia roztworem 10 μg/ml lamininy w PBS (zazwyczaj stosujemy 500 μl na szkiełko, co wystarcza do pokrycia powierzchni) i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni. Odessać roztwór lamininy i wypłukać 3 razy nadmiarem PBS, dbając o to, aby powierzchnie pokryte lamininą nie miały kontaktu z powietrzem. Zastąpić PBS pożywką hodowlaną (50% roztwór Ringera, 49% pożywka L-15, 1% surowicy plodowej cielęcej, dodatkowo 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny i gentamycyny, pH 7.4, sterylizowana filtracyjnie). (Pożywka Ringera: 115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes pH 7.4, 0.5 mM EDTA). Choć w naszym protokole zastosowano tę pożywkę, należy zaznaczyć, że jest to pożywka wzbogacona, powszechnie stosowana w starszych kulturach zwojów siatkówki Xenopus, gdzie neurony mają ograniczone zapasy energii. Młode kultury rdzenia kręgowego przeżyją i będą rosnąć przez ponad 24 hr w czystej pożywce Ringera bez dodatkowych czynników wzrostu, co jest istotną zaletą tego systemu. Opcjonalnie: dodać NT3 i BDNF (do stężeń końcowych 25 ng/μl każdego z nich) do pożywki hodowlanej, aby zwiększyć wyrastanie aksonów.</li>
 <li>Ze względu na zmienność ekspresji wstrzykniętego mRNA, embriony mogą wykazywać fluorescencję mozaikową. Przed przystąpieniem do sekcji należy przesiewić embriony pod kątem obecności fluorescencji, aby zidentyfikować te, które wykazują ekspresję fluorescencyjnego białka fuzyjnego w rurce neuralnej. Fluorescencyjne embriony w stadium 20-23 umieścić w plastikowym naczyniu pokrytym agarozą, wypełnionym pożywką Steinberga (58 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 0.44 mM Ca(NO3)2, 1.3 mM MgSO4, 4.6 mM Tris, pH ustawione na 7.8, a następnie autoklawowane)5. Aby przygotować naczynie pokryte agarozą, należy pokryć dno plastikowego naczynia stopioną 1% agarozą w 0.1X MMR i pozostawić do zastygnięcia. Zapewnia to miękką powierzchnię, dzięki czemu nie dochodzi do uszkodzeń drobnych pęset i igieł wolframowych używanych podczas kolejnych etapów sekcji. Sekcja embrionów powyżej stadium 23 jest możliwa, ale trudniejsza, ponieważ tkanki przylegają do siebie silniej i wymagają tym samym dłuższego traktowania kolagenazą.</li>
 <li>Pod mikroskopem stereoskopowym usunąć błonę witelinową za pomocą drobnej pęsety, a następnie wyizolować całą część grzbietową embrionu, wykonując serię nacięć. Podczas gdy jedna pęseta utrzymuje embrion w miejscu, drugą należy wykonać nacięcie z boku embrionu, aby odsłonić jego wnętrze. Następnie, używając obu pęset, należy ucisnąć tkankę między połową grzbietową a brzuszną embrionu, przecinając go w ten sposób na pół, aby wyizolować część grzbietową zawierającą rurkę neuralną.</li>
 <li>Eksplant grzbietowy umieścić w probówce Eppendorf z 2 mg/ml kolagenazy w pożywce Steinberga na 15-20 min na rotatorze, aby rozluźnić tkanki, a następnie przenieść eksplant pipetą do plastikowego naczynia pokrytego agarozą ze świeżym roztworem Steinberga. Alternatywnie, eksplant można umieścić w szalce Petriego zawierającej roztwór kolagenazy na 15 min, gdzie następnie można przeprowadzić całą sekcję.</li>
 <li>Za pomocą pęsety delikatnie oddzielić rurkę neuralną od nabłonka grzbietowego i brzusznej struny grzbietowej. Wsunąć końcówkę pęsety między nabłonek a leżącą pod nim tkankę i powoli odciągnąć nabłonek, odsłaniając znajdującą się pod nim rurkę neuralną. Następnie jedną pęsetą przytrzymać tkankę, a drugą wsunąć końcówkę między rurkę neuralną a strunę grzbietową. Na koniec za pomocą pęsety usunąć somity po obu stronach rurki.</li>
 <li>Przenieść rurkę neuralną do naczynia pokrytego agarozą wypełnionego pożywką hodowlaną, zgodnie z opisem w kroku 3.1.</li>
 <li>Po zebraniu kilku rurek neuralnych, pociąć je na liczne fragmenty (około 20, jeśli wyizolowano całą rurkę) za pomocą zaostrzonych igieł wolframowych lub pęsety, a następnie wysiać fragmenty w naczyniach hodowlanych wypełnionych pożywką (przygotowaną w kroku 3.1), rozkładając eksplanty równomiernie w rzędach.</li>
 <li>Po wysianiu nie przesuwać naczyń, ponieważ mogłoby to zakłócić przywieranie komórek. Inkubować wysiane eksplanty rurki neuralnej w temperaturze około 20-22 °C. Zazwyczaj pozostawiamy naczynie z komórkami na blacie w temperaturze pokojowej przez noc. Jedną z zalet neuronów Xenopus laevis jest to, że nie jest wymagany specjalny inkubator do hodowli komórkowej regulujący poziom CO2 lub temperaturę. Neuryty i stożki wzrostu można obserwować i obrazować w temperaturze pokojowej 12-24 hr po wysianiu, choć wyrastanie można przyspieszyć poprzez dodanie czynników wzrostu. Generalnie ekspresja produktu RNA lub plazmidu skutkuje zmienną ekspresją między komórkami, w związku z czym poziomy ekspresji fluorescencji między stożkami wzrostu mogą być zróżnicowane. Zaobserwowaliśmy, że ekspresja białek fluorescencyjnych z RNA utrzymuje się powyżej 48 hr po wysianiu, choć zależy to od konkretnej konstrukcji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Po zastosowaniu protokołu, którego streszczenie przedstawiono na Rysunku 1A, zdrowe, prawidłowo wypreparowane i hodowlane eksplanty neuronalne będą emitować liczne aksony lub neuryty we wszystkich kierunkach na podłożu z lamininy/poli-lizyny, co pokazano na Rysunku 1B. Stożki wzrostu na końcach aksonów można obrazować za pomocą optyki DIC, jak widać na Rysunku 1C, w celu zobrazowania ogólnej dynamiki ruchliwości, lub za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, aby zbadać lokalizację fluorescencyjnie znakowanych białek cytoszkieletu; na przykład EB1-GFP przedstawiono na Rysunku 1D.
<img alt="Proces regeneracji neuronów żaby, iniekcja mRNA, schemat i obrazy mikroskopowe wzrostu komórek." src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Podsumowanie protokołu eksperymentalnego i oczekiwanego wyniku. A) Schemat blokowy protokołu. Szczegóły dotyczące sekcji w dniu 3 znajdują się w filmie. Całą cewkę neuralną należy pociąć na około 20 równych części i rozłożyć równomiernie w rzędach na szkiełku nakrywkowym. Na tym rysunku nożyczki symbolizują cięcie tkanki za pomocą precyzyjnej pęsety. CG gonadotropina kosmórkowa B) Obraz DIC aksonów lub neurytów wyrastających z eksplantu (eksplant w lewym górnym rogu). C) Obraz w większym powiększeniu stożka wzrostu na końcówce rosnącego aksonu. D) Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej EB1-GFP w stożku wzrostu. Pasek skali 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.

<ol><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li>
<li>Buck, K. B., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+turning+induced+by+direct+local+modification+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.</a> J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).</li>
<li>Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. 42, 913-926 (2004).</li>
<li>Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+adhesion+and+signaling+dynamics+in+Xenopus+laevis+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones.</a> Dev. Neurobiol. , (2011).</li>
<li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).</li>
<li>Tanaka, E., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+growth+cone+turning+at+substrate+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries.</a> J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).</li>
<li>Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubule+dynamics+in+growth+cone+motility+and+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth.</a> J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).</li>
<li>Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+Xenopus+spinal+neurons+in+live+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture.</a> Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual+2010%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+Eggs+from+Xenopus+laevis+Females%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890(2008).</li>
<li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).</li>
<li>Lavery, D. L., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+and+loss-of-function+strategies+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+Laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).</li>
<li>Guirland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cAMP+signaling+through+G-protein-coupled+receptors+mediates+growth+cone+attraction+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).</li>
<li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).</li>
<li>Turney, S. G., Bridgman, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+stimulates+and+guides+axonal+outgrowth+via+growth+cone+myosin+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).</li>
<li>Weinl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+turning+of+Xenopus+retinal+axons+induced+by+ephrin-A5%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5.</a> Development. 130, 1635-1643 (2003).</li>
<li>Knoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).</li>
<li>Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+expression+in+transgenic+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos.</a> Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Xenopus laevis eksplanty neuronalne emitują neuryty w bardzo intensywny sposób w ciągu 24 hr po wysianiu na podłożu z lamininy/poli-lizyny, jeśli panują odpowiednie warunki. Na tym podłożu stożki wzrostu są bardzo ruchliwe i mogą osiągać długość aksonów do 1 mm, rozrastając się we wszystkich kierunkach na zewnątrz z eksplantu, choć typowe długości wynoszą 100 μm lub więcej. Jeśli neuryty nie wyrosną, przyczyn takiego stanu jest ograniczona liczba. Jedną z możliwości jest to, że eksplanty neuronalne nie przytwier...

<table><tbody><tr><td>Gonadotropina kosmórkowa</td><td>Argent Labs</td><td>C-HCG-ON-10</td><td></td></tr><tr><td>Cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mMessage mMachine</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemowe 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID)</td><td>FHC, Inc.</td><td>30-31-0</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta biologiczna Dumont #5 Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Mattek</td><td>Mat Tek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1399</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>NT3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1905</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795</td><td></td></tr></tbody></table>

kultury eksplantów neuronalnych z xenopus laevis

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Złożony proces prowadzenia aksonów jest w dużej mierze sterowany przez stożek wzrostu, który jest dynamiczną, ruchomą strukturą znajdującą się na końcu rosnącego aksonu. Podczas wzrostu aksonu stożek wzrostu musi integrować informacje z wielu źródeł sygnałów prowadzących, aby modulować swój cytoszkielet w celu napędzania stożka naprzód i dokładnego nawigowania w poszukiwaniu konkretnych celów1. Sposób, w jaki ta integracja zachodzi na poziomie cytoszkieletu, jest wciąż przedmiotem badań, a analiza dynamiki białek cytoszkieletowych i efektorów wewnątrz stożka wzrostu pozwala na wyjaśnienie tych mechanizmów. Stożki wzrostu Xenopus laevis są wystarczająco duże (10-30 mikronów średnicy), aby przeprowadzać obrazowanie na żywo dynamiki cytoszkieletu w wysokiej rozdzielczości (np.2-4) i są łatwiejsze do izolacji oraz manipulacji w warunkach laboratoryjnych w porównaniu z innymi kręgowcami. Żaba jest klasycznym systemem modelowym dla badań nad neurobiologią rozwojową, a ważne, wczesne spostrzeżenia dotyczące dynamiki mikrotubul w stożku wzrostu zostały początkowo odkryte przy użyciu tego systemu5-7. W tej metodzie8 jaja są zbierane i zapładniane in vitro, wstrzykiwane RNA kodujące fluorescencyjnie znakowane białka fuzyjne cytoszkieletu lub inne konstrukty służące do manipulacji ekspresją genów, a następnie pozostawiane do rozwoju do etapu cewy nerwowej. Cewy nerwowe są izolowane poprzez dyssekcję, a następnie hodowane, po czym obrazowane są stożki wzrostu na wyrastających neurytach. W niniejszym artykule opisujemy, jak przeprowadzić tę metodę, której celem jest hodowla stożków wzrostu Xenopus laevis do późniejszej analizy obrazowej w wysokiej rozdzielczości. Choć przedstawiamy przykład białka fuzyjnego +TIP EB1-GFP, metodę tę można zastosować do dowolnej liczby białek w celu wyjaśnienia ich zachowania wewnątrz stożka wzrostu.

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Złożony proces prowadzenia aksonów jest w dużej mierze sterowany przez stożek wzrostu, który stanowi dynamiczną, ruchomą strukturę znajdującą się na szczycie rosnącego aksonu. Podczas...

Celem niniejszej procedury jest hodowla stożków wzrostu Xenopus Lavis w celu przeprowadzenia późniejszej analizy obrazu o wysokiej rozdzielczości. Osiąga się to najpierw poprzez wstrzyknięcie samicom żab hormonów stymulujących produkcję jaj. Drugim krokiem jest zebranie i zapłodnienie jaj, a następnie wstrzyknięcie do nich mRNA lub innych interesujących konstruktów.Następnego dnia embriony są preparowane, a cewki nerwowe zostają wyizolowane, pocięte i osadzone na szkiełkach nakrywkowych. Ostatnim krokiem jest obrazowanie wyrastających aksonów i stożków wzrostu. Ostatecznie można zastosować fluorescencyjną mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, aby wykazać zmiany w lokalizacji białek w stożkach wzrostu w czasie.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ sekcje rurki nerwowej mogą być trudne do opanowania na podstawie samego opisu w sekcji metod bez bezpośredniej obserwacji techniki. Pobierz jaja od samic żab, którym uprzednio, od 12 do 14 godzin wcześniej, wstrzyknięto 400 jednostek gonadotropiny kosmórkowej. Zbierz jaja do roztworu Ringera zmodyfikowanego X marks.Następnie przeprowadź zapłodnienie zebranych X in vitro z rozdrobnionymi jądrami, zgodnie z wcześniejszym opisem, a po upływie co najmniej 20 minut dodaj 0,1 XMMR. Usuń medium i inkubuj zarodki w 2% cysteiny w jednym XMMR o pH 7,8 przez trzy do pięciu minut, aby usunąć otoczkę galaretowatą zarodka. Następnie przelej zarodki do zlewki.Następnie, po ostatnim płukaniu, przemyj embriony 0,1 XMMR lub 0,1 x zmodyfikowaną solą kąpielową od trzech do pięciu razy. Przechowuj embriony w 0,1 XMMR w temperaturze pokojowej do momentu wstrzyknięcia lub zgodnie z preferencjami. Aby spowolnić rozwój przed wstrzyknięciem, umieść embriony w temperaturze od 14 do 18 °C.Rozcieńczyć wcześniej przygotowany RNA z czapeczką do stężenia końcowego od 50 do 200 pg/mL za pomocą wody podwójnie destylowanej, a następnie przechowywać w lodzie do momentu mikroiniekcji. Następnie przygotować igłę do iniekcji, wyciągając kapilarę borokrzemianową za pomocą wyciągarki do kapilar lub podobnego urządzenia. Następnie pod mikroskopem, używając pęsety, przełamać końcówkę igły pod kątem, aby uzyskać kształt piórka, i napełnić igłę od tyłu od 0,5 do 1 µL rozcieńczonego roztworu RNA.Zamocuj igłę w mikromanipulatorze; w tym przypadku zastosowano wtryskiwacz PLI 100 PICO systemu A medical system. Następnie umieść zapłodnione embriony w stadium od jednego do czterech komórek w plastikowej płytce zawierającej 5% fol w 0,1 XMMR. Skalibruj objętość wstrzykiwania dla każdej nowej mikropipety, używając mikrometru przedmiotowego lub mikrometru cyklometru.Następnie ustaw pikowtryskiwacz tak, aby podawał pożądaną ilość RNA podczas każdego wstrzyknięcia. W tym przypadku zastosowano objętość wstrzykiwania wynoszącą 1 nl. Przytrzymaj zarodki pęsetą lub, jeśli jest to preferowane, umieść je na platformie stabilizującej i wstrzyknij odpowiednią objętość do komórek blastomerów.Rozdziel iniekcje w kilku miejscach w obrębie zarodka, aby uzyskać równomierny rozkład RNA. W przypadku zarodka w stadium czterech komórek wykonuje się od jednej do dwóch iniekcji w każdym blastomerze, natomiast w przypadku zarodka w stadium dwóch komórek wykonuje się od dwóch do czterech iniekcji. Po zakończeniu iniekcji przenieś wstrzyknięte zarodki do plastikowej płytki zawierającej 0.1 XMMR i pozostaw je do rozwoju aż do stadium 20-23.W zależności od pożądanej szybkości rozwoju zarodki inkubuje się w temperaturze od 14 do 22 °C. Naczynia hodowlane potraktowane PLL powleka się lamininą w stężeniu 10 µg/mL w PBS i pozostawia płytki w temperaturze 37 °C na jedną godzinę. Po upływie czasu inkubacji płytki płucze się trzy razy PBS, dbając o to, aby po ostatnim płukaniu powierzchnia powleczona lamininą nie była wystawiona na działanie powietrza. PBS zastępuje się pożywką hodowlaną.Na koniec przygotuj trzy szalki powlekane agarosem, pokrywając dno szalki hodowlanej 1% agarosem w 0,1 XMMR i pozostawiając go do stężenia. Po utwardzeniu napełnij jedną szalkę pożywką Steinberga; zmienność w ekspresji wstrzykniętego mRNA może spowodować, że embriony będą wykazywać mozaikową fluorescencję przed przeprowadzeniem sekcji. Przesiewaj embriony pod kątem obecności fluorescencji i zidentyfikuj te, które wykazują ekspresję fluorescencyjnego białka fuzyjnego w rurce nerwowej.Następnie przenieś fluorescencyjne embriony w stadium od 20 do 23 do plastikowej szalki pokrytej agros zawierającej pożywkę Steinberga. Umieść szalkę pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą precyzyjnych pincet usuń błonę witelinową. Następnie, trzymając embrion w miejscu jedną pincetą, użyj drugiej, aby wykonać nacięcie z boku embrionu i odsłonić jego pusty środek.Następnie, używając obu zestawów pęset, uciśnij tkankę pomiędzy połową grzbietową a brzuszną zarodka, aby przeciąć go na pół i wyizolować część grzbietową zawierającą rurkę neuralną. Umieść eksplant grzbietowy w probówce do mikrocentryfugi zawierającej kolagenazę w stężeniu 2 mg/mL w pożywce Steinberga i pozostaw na rotatorze na 15 do 20 minut. Następnie przenieś eksplant grzbietowy do naczynia pokrytego agaro wypełnionego świeżą pożywką Steinberga.Podczas pracy pod mikroskopem oddziel rurkę neuralną od grzbietowego naskórka i brzusznej strony, wsuwając końcówkę pęsety pomiędzy naskórek a leżącą pod nim tkankę i powoli odciągając naskórek. Następnie jedną pęsetą przytrzymaj tkankę, a drugą usuń tkankę otaczającą rurkę neuralną. Następnie przenieś wypreparowaną rurkę neuralną do naczynia powleczonego agarozą, wypełnionego świeżą pożywką hodowlaną.Po zebraniu kilku cewek neuronalnych, zaostrz igły wolframowe lub pęsetę, aby pociąć każdą cewkę na około 20 fragmentów. Następnie umieść fragmenty na pokrytych lamininą szalkach hodowlanych, rozkładając materiał równomiernie w rzędach. Po wysianiu cewek neuronalnych nie należy przesuwać szalek, ponieważ może to zaburzyć adhezję komórek.Inkubuj wypreparowany fragment cewy nerwowej na płytce w temperaturze od 20 do 22 stopni Celsjusza. Do hodowli neuronów XUS lavis nie jest wymagany inkubator do hodowli komórkowych; 12 do 24 godzin po wysianiu obrazuj neurony i stożki wzrostu w temperaturze pokojowej. Pamiętaj, że zmienna ekspresja RNA może prowadzić do różnic w poziomach fluorescencji pomiędzy poszczególnymi stożkami wzrostu.Ten obraz DIC przedstawia aksony i neuryty wyrastające z eksplantu X w lewym górnym rogu pola widzenia. Pasek skali na tym oraz na kolejnych obrazach reprezentuje 10 mikronów. Ten film przy większym powiększeniu pokazuje stożek wzrostu na końcówce rosnącego aksonu.Na koniec, ten film z mikroskopii fluorescencyjnej pokazuje ekspresję EB1 GFP w stożku wzrostu. Przedstawiamy tutaj przykład obrazowania białka fuzyjnego końcówki plus EB1 GFP. Tę metodę eksplantacji neuronalnej można zastosować do dowolnej liczby białek, aby wyjaśnić ich zachowanie w obrębie stożka wzrostu podczas wypustkowania neurytów.

neural-explant-cultures-from-xenopus-laevis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Kultury eksplantatów nerwowych z Xenopus laevis

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Niniejszy protokół wideo demonstruje sposób rozróżniania i zliczania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego w mieszanej populacji komórek prekursorowych układu nerwowego z wykorzystaniem testu tworzenia kolonii neuronalnych.

Test tworzenia kolonii neuronalnych: metoda różnicowania rzeczywistych komórek macierzystych układu nerwowego od komórek progenitorowych układu nerwowego

Poznaj metodę hodowli eksplantatów neuronalnych z Xenopus laevis do analizy dynamiki cytoszkieletu w stożkach wzrostu. Technika fluorescencyjna umożliwia obserwację zmian lokalizacji białek w czasie rzeczywistym.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów