Praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomowego DNA z zestawów do pobierania krwi służących do konserwacji białek osocza

W niniejszym filmie opisana zostanie praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomicznego DNA z nowego systemu do konserwacji białek osocza BDP 100, zwanego probówkami P 100. Izolacja z probówek z surowicą lub osoczem była w przeszłości dość powszechną procedurą, jednak połączenie nowej probówki P 100 z zaprezentowaną tutaj metodą ekstrakcji oferuje nowatorskie i prostsze podejście do pozyskiwania DNA lepszej jakości przy znacznie mniejszym nakładzie pracy. Wnętrze probówki P 100 jest pokryte EDTA potasowym oraz inhibitorami proteaz.

Zapobiega to koagulacji i stabilizuje białka osocza. Krew jest zbierana do tych probówek w celu pozyskania osocza do badań po wirowaniu. Krew umieszczona w probówce P 100 rozdzieli się na warstwy w zależności od gęstości: osocze na górze, erytrocyty na dole oraz leukocyty pomiędzy nimi.

Warstwa Buffy coat znajduje się pomiędzy tymi dwiema warstwami. Głównym przeznaczeniem tych probówek jest zazwyczaj pozyskiwanie osocza. Wykorzystując to osocze, wykonuje się szereg pomiarów, takich jak oznaczenie poziomu przeciwciał i białek.

Warstwa leukocytarna (buffy coat) jest zazwyczaj odrzucana, jednak jak zostanie pokazane w tym filmie, zawiera ona wystarczającą ilość DNA do przeprowadzenia kilku analiz, w tym sekwencjonowania, genotypowania, identyfikacji biomarkerów i innych. Zestawy P one hundreds składają się z trzech głównych elementów: nakrętki, probówki i separatora. Separator mechaniczny przemieszcza się do poziomu tuż nad warstwą leukocytarną.

Aby uzyskać dostęp do warstwy leukocytarnej (buffy coat), konieczne jest zwiększenie odległości między separatorem a tą warstwą. Osiąga się to poprzez dodanie 17% sucrose. Warstwa leukocytarna jest zazwyczaj odrzucana wraz z P 102, jednak – jak zostanie pokazane w tym filmie – możliwe jest łatwe odzyskanie z tej warstwy wystarczającej ilości DNA do przeprowadzenia kilku testów analitycznych przed wyjęciem probówek P 100 z zamrażarki do -80°C.

Podgrzać łaźnię wodną do 37°C, umieścić każdą probówkę P 100 w łaźni i inkubować przez około pięć minut, aby rozmrozić wszystkie próbki. Po całkowitym rozmrożeniu próbek należy usunąć wszelkie pozostałości surowicy znajdujące się powyżej separatora. Następnie powyżej separatora dodaje się 5 mL 17% sacharozy. Po dodaniu sacharozy wszystkie probówki wiruje się przez 20 minut przy 2 500 ×g. Gdy separator znajdzie się u góry probówki i zostanie oddzielony od warstwy leukocytarnej, można go łatwo usunąć.

Nanieś 70% ethanol na chusteczkę laboratoryjną i wysterylizuj haczyk z klipsa do papieru, dokładnie przecierając jego całą powierzchnię. Trzymając probówkę P 100 pod kątem 45 stopni, użyj sterylnego klipsa. Zacznij wysuwać separator z probówki, delikatnie pociągając za jego krawędź i prowadząc go do worka na odpady biologiczne.

Po wyjęciu separatora należy usunąć jak największą ilość warstwy 17% sacharozy, uważając, aby nie naruszyć warstwy leukocytowej (buffy coat) ani warstwy erytrocytów; warstwa leukocytowa powinna teraz znajdować się na samym wierzchu w probówce. Przenieś tę warstwę do nowej, opisanej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Objętość pobranej warstwy leukocytowej będzie różnić się dla każdej probówki, ale powinna być mniejsza niż trzy mililitry.

Aby znormalizować objętość wszystkich probówek, należy dodać odpowiednią ilość PBS (soli fizjologicznej z buforem fosforanowym), aby objętość w każdej probówce wyniosła 3 mL. Po zawieszeniu wszystkich warstw białkowych (buffy coats) w jednakowej objętości, wszelkie pozostałe erytrocy należy usunąć poprzez dodanie 9 mL roztworu do lizy RBC (erytrocytów).

Następnie kilkukrotnie odwróć probówki podczas 10 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, aby oddzielić lizowane krwinki czerwone od warstwy leukocytarnej. Wiruj przez pięć minut przy 2 500 G; wirowanie spowoduje powstanie osadu, z którego zostanie wyekstrahowany DNA. Odlej pozostałą ciecz z każdej probówki do pojemnika na odpady biologiczne, pozostawiając niewielką objętość, w której osad zostanie ponownie zawieszony. Wymieszaj probówkę na wortexie, aby odczepić i resuspenderować osad.

Dodaj 3 ml roztworu do lizy komórek i energicznie wymieszaj na vortexu przez co najmniej 10 sekund. Po zlizowaniu komórek białka i DNA znajdują się w zawiesinie w roztworze i muszą zostać rozdzielone; należy rozpocząć od wytrącenia białek za pomocą 1 ml roztworu do wytrącania białek, a następnie mieszać na vortexu z dużą prędkością przez co najmniej 15 sekund. Następnie wiruj próbki w wirówce przez 5 minut przy 2 500 G, aby wytrącić białka w formie osadu podczas wirowania.

Postępuj zgodnie z odpowiednimi krokami. Oznacz jedną probówkę stożkową o pojemności 15 ml dla każdej próbki przenoszonej do nowej probówki. Przenieś trzy mililitry 100% izopropanolu.

Po wytrąceniu i odwirowaniu białek w każdej probówce powinien znajdować się stosunkowo duży osad oraz przejrzysty, w większości wodnisty nadsącz. Zlej nadsącz zawierający DNA z każdej probówki do odpowiadającej mu probówki z izopropanolem przygotowanej podczas ostatniego wirowania; izopropanol powinien spowodować wytrącenie DNA z roztworu w postaci małych, białych, nitek. Odwróć wszystkie probówki 50 razy, aby zapewnić dokładne zmieszanie. Następnie wiruj wszystkie probówki przez trzy minuty przy 2 500 G, aby utworzyć osad DNA. DNA jest zazwyczaj widoczne jako mały, biały osad na dnie probówki. Jednakże, przy niskiej wydajności DNA może być niewidoczne dla oka. Kontynuuj wszystkie ekstrakcje aż do momentu pomiaru stężeń.

Niezależnie od obecności osadu DNA, odlej izopropanol. Przemyj DNA, dodając 70% ethanol. Usunie to wszelkie pozostałe niepożądane składniki, które mogłyby zakłócić późniejszą analizę; wiruj przez jedną minutę przy 2 500 G. Aby upewnić się, że osad DNA dobrze przylega do dna probówki, odlej cały 70% ethanol z probówek, a następnie odwróć je na czystym ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez jedną godzinę.

Przed kontynuacją protokołu w probówkach nie powinno być widocznych pozostałości etanolu. Ostatnim etapem ekstrakcji jest resuspensja DNA w roztworze. W większości ekstrakcji odpowiednim wyborem jest roztwór do nawodnienia DNA lub woda.

W przypadku próbek, w których powstają niewielkie lub żadne widoczne pasma lub granulki DNA, należy dodać o 250 µL mniej roztworu do hydratacji DNA. Następnie delikatnie i stopniowo wymieszać DNA za pomocą vortexa, aby uzyskać zawiesinę. Na koniec przenieść całe zawieszone DNA do probówki do wirówki. W tym momencie można określić stężenie i czystość DNA za pomocą NanoDrop lub innego spektrofotometru.

Zazwyczaj oczekuje się, że czystość DNA będzie zbliżona do czystości DNA wyekstrahowanego bezpośrednio z krwi pełnej pobranej do probówek z EDTA potasem wyłącznie w celu uzyskania DNA. Stężenie zależy od ilości materiału wyjściowego, ale może wynosić od 50 nanogramów na mikrolitr do niemal 1000 nanogramów na mikrolitr, osiągając średnio wartości w zakresie 200 nanogramów na mikrolitr. Korzyść z zastosowania tego protokołu jest dwukrotna. Po pierwsze, pozwala on klinicystom na wykorzystanie jednego pobrania krwi do przeprowadzenia dwóch testów klinicznych zamiast dwukrotnego pobierania krwi.

Po drugie, upraszcza to proces uzyskiwania dostępu do komórek zawierających DNA dzięki zastosowaniu nowoczesnych probówek z separatorami mechanicznymi zamiast tych z poprzednich generacji. W przypadku probówek z separatorami żelowymi starszej generacji, zarówno sam separator żelowy, jak i skrzep krwi stanowiły bariery dla komórek zawierających DNA. W probówkach P 100 separator mechaniczny można łatwo usunąć, stosując rozdział gęstościowy z użyciem 17%Sucrose.

Jest to zrzut ekranu z pomiaru NanoDrop dla średniej ekstrakcji DNA. Stosując tę metodę dla próbki P 109, ekstrakcja pozwoliła uzyskać 250 µL roztworu o stężeniu DNA wynoszącym 209 ng/µL. Całkowita wydajność wyniosła około 52 µg.

Stosunek 260/280, będący głównym wskaźnikiem czystości DNA, znajdował się w optymalnym zakresie od 1,8 do 1,9 i wyniósł 1,88. Pomiar pomocniczy czystości DNA, czyli stosunek 260/230, wyniósł 2,35, co jest wartością bliską oczekiwanemu zakresowi od 2 do 2,2.

Są to dość typowe wyniki. W rzeczywistości wydajność i jakość ekstrakcji będą się różnić w zależności od objętości i stanu krwi przed ekstrakcją przy zastosowaniu standardowej elektroforezy żelowej z barwieniem bromkiem tioerymianem. Dalsze testy jakości wykazały, że genomowe DNA wyekstrahowane z probówek P 100 jest tak samo nienaruszone, jak DNA wyekstrahowane z krwi pełnej.

Jest to widoczne dzięki jasnemu, grubemu prążkowi pojawiającemu się na górze każdej ścieżki zawierającej DNA genomiczne. Wykorzystanie tego protokołu zamiast poprzednich metod niesie ze sobą dwie główne korzyści. Po pierwsze, pozwala on na połączenie dwóch typowych pobrań krwi w jedno.

Po drugie, niniejszy protokół jest szybszy i daje czystsze wyniki niż protokół z wykorzystaniem typowych probówek z separatorem żelowym SST. Dzięki wyeliminowaniu konieczności rutynowego rozbijania skrzepów krwi, klinicyści pobierają dwie probówki krwi w przypadku konieczności wykonania testów genetycznych i serologicznych. Zazwyczaj stosuje się probówkę z separatorem żelowym SST (tzw. złota nakrętka) oraz probówkę z EDTA potasem (tzw. fioletowa nakrętka); surowica jest pobierana z probówki SST, a DNA ekstrahowane z probówki z fioletową nakrętką. Zastosowanie tej metody pozwala na pobranie tylko jednej probówki P 100 z czerwoną nakrętką.

Podczas gdy instytucje znające metodę ekstrakcji DNA z wykorzystaniem separatora żelowego mogą już pobierać jedną probówkę do testów serologicznych i genetycznych, metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu stanowi stopniową, lecz znaczącą poprawę w stosunku do istniejących metod z separatorem żelowym. Obie metody wymagają usunięcia pewnego rodzaju separatora, przy czym żel zazwyczaj sprawia więcej trudności w obsłudze niż separator plastikowy.

Probówki z separatorem wymagają homogenizacji skrzepłej krwi przez siatkę drucianą przed ekstrakcją DNA. Proces homogenizacji może być uciążliwy, a ekstrakcja DNA staje się trudniejsza w przypadku obecności znacznej ilości erytrocytów, które nie zawierają DNA. Metoda ekstrakcji P 100 umożliwia oddzielenie zawierających DNA leukocytów od hematokrytu, dzięki czemu do próbki dostaje się niewielka liczba erytrocytów, które mogłyby zakłócać proces ekstrakcji DNA.

Ten system izolacji DNA z probówki do osocza P 100, w przeciwieństwie do stosowanych wcześniej probówek z separatorem żelowym, oferuje wiele zalet. Probówki P 100 zawierają EDTA, który hamuje zależną od magnezu endonukleazę, oraz przeciwkrzepliwy środek zapobiegający krzepnięciu krwi. Efektem końcowym jest wyższa integralność DNA przy znacznie prostszym protokole ekstrakcji, polegającym w szczególności na uniknięciu konieczności rozbijania i homogenizacji skrzepniętej krwi.

Dodatkowo, krew pozbawiona osocza może być przechowywana w probówkach typu P100 przez nieokreślony czas, do trzech lat, aż do momentu planowanej ekstrakcji DNA. Co więcej, klinicyści mogliby pozyskać bardziej użyteczne dane pacjentów przy mniejszej liczbie pobrań krwi, co zredukowałoby stres u pacjentów poddawanych tym procedurom.