Name: Praktyczna i nowatorska metoda ekstrakcji genomowego DNA z zestawów do pobierania krwi w celu zachowania białka osocza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj nową metodę ekstrakcji DNA z próbek krwi w tubach P 100, umożliwiającą jednoczesne zachowanie osocza. Technika ta upraszcza pobieranie DNA z wyższą jakością niż tradycyjne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Pobieranie próbek
<ol>
 <li>Pobrać próbki krwi od osób po uzyskaniu odpowiedniej świadomej zgody. Od każdego uczestnika pobrać od 4 do 5 ml krwi do probówki P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). W celu porównawczym równolegle pobrać krew do probówki z EDTA.</li>
 <li>Probówki BD P100 zawierają 15,8 ml rozpylonego K2EDTA oraz liofilizowany, zastrzeżony koktajl inhibitorów proteaz o szerokim spektrum działania, aby zapobiec krzepnięciu i stabilizować białka osocza. Zawierają one również separator mechaniczny. Po pobraniu krwi pełnej przechowywać obie probówki w temperaturze pokojowej od 60 min do całej nocy, aż do momentu przetworzenia.</li>
 <li>Wirować probówki BD P100 z przyspieszeniem 2,500 g przez piętnaście minut w temperaturze pokojowej. Przenieść osocze zgromadzone nad separatorem mechanicznym do probówek do mikrocentryfugi.</li>
 <li>Przechowywać probówki P100 zawierające krew skompresowaną poniżej separatora w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia ekstrakcji DNA.</li>
</ol>
2.1 Z krwi z probówki P100 (P100_DNA)
<ol>
 <li>Probówki P100 są przechowywane w temperaturze -80 °C po ekstrakcji plazmy. W ciągu 3 do 4 miesięcy należy wyjąć z zamrażarki probówkę P100 zawierającą skondensowaną krew i rozmrozić ją w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 5 min (Rycina 1A). Usunąć resztki plazmy znajdujące się nad separatorem. Do probówek P100, powyżej separatora, dodać 2 ml 17% roztworu sacharozy (roztwór gradientu przetestowany wewnętrznie – dane niepublikowane) (Rycina 1B). Wirować probówki w temperaturze pokojowej przez 20 min przy 2,500 g; proces ten przesuwa mechaniczny separator do góry probówki i tworzy trzy warstwy roztworu, w tym warstwę leukocytarną (Rycina 1C). Ręcznie wyciągnąć separator za pomocą wysterylizowanego, zagiętego metalowego spinacza do papieru (Rycina 1D).</li>
 <li>Po wyjęciu mechanicznego separatora z każdej probówki (Rycina 1D), usunąć i odrzucić górną warstwę sacharozy. Przenieść środkową warstwę, reprezentującą warstwę leukocytarną (BC), do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Dodać bufor fosforanowo-solny (PBS), aby zwiększyć objętość warstwy leukocytarnej do 3 ml. Wyekstrahować DNA z warstwy leukocytarnej, używając odczynników z zestawu Qiagen Puregene Blood Kit zgodnie z zaleceniami producenta, z wyjątkiem prędkości wirowania 2,500 g (zamiast 2,000 g).</li>
 <li>Aby zlizować i usunąć erytrocyty (RBC), dodać 9 ml buforu do lizy RBC do 3 ml warstwy leukocytarnej. Odwrócić każdą probówkę kilka razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min, odwracając je sporadycznie podczas inkubacji. Odwirować każdą mieszaninę przy 2,500 g przez 5 min i odrzucić nadosad. Pozostały w każdej probówce osad potraktować 3 ml roztworu do lizy komórek i wymieszać na wirówce typu vortex przez 15 sec. Lizat potraktować 1 ml roztworu do precypitacji białek i wymieszać na vortexie przez 15 sec.</li>
 <li>Wirować przy 2,500 g przez 5 min i przenieść nadosad do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml 100% izopropanolu. Odwrócić nowe probówki 10 razy i wirować przy 2,500 g przez 3 min. Odrzucić nadosad i dodać 1 ml 70% etanolu. Kilka razy odwrócić probówki stożkowe, aby oderwać i wypłukać osad DNA. Wirować przy 2,500 g przez 1 min. Pozostawić osad do wyschnięcia przez 3 min (umieścić probówkę do góry dnem) w temperaturze pokojowej, a następnie zawiesić DNA w 250 ml roztworu rehydratacyjnego w temperaturze 37 °C przez 10 min i przenieść do wcześniej oznakowanej mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
2.2 Z krwi z probówki z EDTA (EDTA_DNA)
<ol>
 <li>Krew pełną do rutynowych badań immunohematologicznych pobiera się do plastikowych probówek typu vaccutainer pokrytych rozpylonym K2EDTA w ilości 10,8 mg i przechowuje w temperaturze -80 °C. Ponieważ probówki nie zawierają separatora mechanicznego, ekstrakcja DNA nie obejmuje etapów związanych z separatorem mechanicznym (2.1.1 i 2.1.2).</li>
 <li>W ciągu 3 do 4 miesięcy przechowywania krwi DNA jest ekstrahowane przy użyciu systemu KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Jest to zautomatyzowany system ekstrakcji DNA oparty na technologii cząstek magnetycznych, składający się z lizy komórek i wiązania DNA, kilku etapów płukania oraz elucji DNA.</li>
 <li>Zestawem używanym do ekstrakcji DNA jest KingFisher Flex 24 DNA Blood kit (Qiagen, Niemcy).</li>
</ol>
3. Ocena ilości i jakości DNA
Ilość, jakość i integralność genomowego DNA oceniono za pomocą kombinacji metod obejmującej barwnik PicoGreen, spektroskopię oraz elektroforezę.
<ol>
 <li>Stężenie genomowego DNA określa się za pomocą pomiarów Nanodrop oraz kwantyfikacji picogreen.</li>
 <li>Czystość określa się na podstawie pomiaru stosunku 260/280 za pomocą spektrofotometru Nanodrop.</li>
 <li>Próbkę (500 ng) nanosi się również na 1% żel agarozowy w celu oceny integralności (stopnia degradacji) DNA.</li>
</ol>
4. Analizy genotypowania i kontrola jakości
<ol>
 <li>Do dalszej analizy z wykorzystaniem specjalistycznego Immunochipa (Immuno DNA Analysis BeadChip) losowo wybrano pięć próbek P100_DNA oraz odpowiadające im próbki EDTA_DNA. Immunochip to genotypowy chip Infinium zawierający 196 524 polimorfizmy, zaprojektowany do badań immunogenetycznych5.</li>
 <li>Dla każdej próbki 200 ng DNA zostaje poddanych amplifikacji, fragmentacji, wytrąceniu, a następnie resuspensji w odpowiednim buforze do hybrydyzacji.</li>
 <li>Zdenaturowane próbki są hybrydyzowane na Immunochipach w temperaturze 48 °C przez minimum 16 h.</li>
 <li>Po hybrydyzacji Immunochipy są poddawane reakcjom przedłużania pojedynczej zasady i barwieniu.</li>
 <li>Następnie Immunochipy są obrazowane za pomocą czytnika Illumina Hiscan Bead array, a znormalizowane dane o intensywności sygnału z kulek są ładowane do oprogramowania Illumina GenomeStudio i konwertowane na genotypy. Genotypy są wyznaczane przy użyciu algorytmu automatycznego wywoływania (autocalling) programu GenomeStudio. Kontrola jakości obejmuje wykluczenie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNPs) z odsetkiem wywołań (call rate) &lt;95%.</li>
 <li>Odsetek wywołań SNP jest wykorzystywany jako miara wydajności analizy Immunochip. Oblicza się go jako procent całkowitej liczby analiz na chipie (196 524 SNPs zakodowanych na każdym chipie), które osiągnęły wystarczającą intensywność i jakość sygnału, aby otrzymać automatyjne przypisanie genotypu. Oczekuje się, że wysokiej jakości DNA (stosunek 260/280 wynoszący 1,8 lub wyższy oraz brak degradacji) osiągnie co najmniej taki sam odsetek wywołań, jak kontrolne DNA HapMap zawarte w analizie Immunochip. Kontrola jakości obejmuje wykluczenie SNPs z odsetkiem wywołań &lt;95% w każdym zestawie danych.</li>
</ol>

<ol><li>Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intrinsic+proteolytic+activities+moderates+preanalytical+variability+and+instability+of+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma.</a> Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).</li>
<li>Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+method+for+extraction+of+DNA+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood.</a> Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).</li>
<li>Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedure+for+DNA+isolation+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood+useful+in+clinical+molecular+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing.</a> Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).</li>
<li>Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+DNA+purification+from+samples+of+highly+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood.</a> Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).</li>
<li>Cortes, A., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promise+and+pitfalls+of+the+Immunochip%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Promise and pitfalls of the Immunochip.</a> Arthritis Research & Therapy. 13, 101(2011).</li>
<li>Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+extraction+method+from+blood+clots+for+studies+requiring+both+host+and+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA.</a> Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).</li>
<li>Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+preparation+of+genomic+DNA+from+easily+obtainable+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood.</a> Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).</li>
<li>Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+genomic+DNA+purified+from+clotted+blood+samples+for+single+nucleotide+polymorphism+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).</li>
<li>Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymatic+extraction+of+DNA+from+blood+collected+into+serum+separator+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes.</a> Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).</li>
<li>Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+cryopreserved+clotted+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood.</a> BioTechniques. 15, 18-20 (1993).</li>
<li>Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+isolation+from+clotted+blood+extricated+rapidly+from+serum+separator+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes.</a> Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).</li>
<li>Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+method+for+extraction+of+DNA+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood.</a> Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).</li>
<li>Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedure+for+DNA+isolation+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood+useful+in+clinical+molecular+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing.</a> Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).</li>
<li>Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+sample+collection+and+storage+methods+for+multicenter+immunologic+research+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children.</a> Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).</li>
<li>Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+DNA+purification+from+samples+of+highly+clotted+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood.</a> Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).</li>
<li>Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+points+in+mapping+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fine points in mapping autoimmunity.</a> Nature. 43, 1173-1174 (2011).</li>
<li>Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+newly+identified+loci+for+autoimmune+thyroid+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2012).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wiele ludzkich chorób ma podłoże genetyczne, a badanie podstaw genetycznych tych schorzeń wymaga coraz większej ilości wysokiej jakości DNA. Najczęstszym źródłem DNA wykorzystywanym w badaniach genetycznych jest krew pełna z dodatkiem przeciwkrzepliwego. Ponieważ większość laboratoriów klinicznych w pierwszym etapie badania wyników fenotypowych przeprowadza testy biochemiczne, serologiczne i wirusologiczne, krew jest często pobierana do probówek do osocza. Po pobraniu osocza skondensowana krew jest często utylizowana. W ...

<table><tbody><tr><td>probówki BD P100</td><td>BD Diagnostics</td><td>366448</td><td></td></tr><tr><td>probówki z EDTA</td><td>BD Diagnostics</td><td>367863</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Spinacz do papieru</td><td>Produkt biurowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówka 15 ml</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Erytrocyty (RBC)</td><td>Qiagen</td><td>158389 (zestaw)</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowo-solny (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)</td><td>Qiagen</td><td>940054</td><td></td></tr><tr><td>mikroprobówki 1.7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit</td><td>Illumina</td><td>WG-352-1001</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik tablic koralików</td><td>Illumina</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GenomeStudio</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomowego dna z zestawów do pobierania krwi służących do konserwacji białek osocza

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Badania laboratoryjne mogą być przeprowadzane na komórkowych lub płynnych składnikach krwi. Zastosowanie różnych probówek do pobierania krwi determinuje frakcję krwi, która może zostać poddana analizie (całokrwistą, plazmę lub surowicę). Laboratoria zajmujące się badaniem genetycznych podstaw schorzeń ludzi opierają się na krwi pełnej z antykoagulantem, pobranej do vacutainera zawierającego EDTA, jako źródle DNA do analiz genetycznych i genomowych. Ponieważ większość laboratoriów klinicznych wykonuje badania biochemiczne, serologiczne i wirusologiczne jako pierwszy krok w badaniu efektów fenotypowych, krew z antykoagulantem pobierana jest również do probówki z heparyną (probówki do plazmy). W związku z tym, gdy do jednoczesnych i równoległych analiz danych genomowych i proteomicznych wymagane są zarówno DNA, jak i plazma, zwyczajowo pobiera się krew do probówek z EDTA oraz z heparyną. Gdyby krew mogła być pobierana do jednej probówki i służyć jako źródło zarówno plazmy, jak i DNA, metoda ta zostałaby uznana za udoskonalenie istniejących procedur. Wykorzystanie zagęszczonej krwi po ekstrakcji plazmy stanowi alternatywne źródło genomowego DNA, co minimalizuje ilość przetwarzanych próbek krwi i zmniejsza liczbę próbek wymaganych od każdego pacjenta. Pozwoliłoby to w ostateczności zaoszczędzić czas i zasoby.
System do pobierania krwi BD P100 do konserwacji białek osocza został stworzony jako ulepszona metoda w porównaniu do poprzednich probówek do pobierania osocza lub surowicy1, aby stabilizować zawartość białek w krwi, co umożliwia lepsze odkrywanie biomarkerów białkowych oraz prowadzenie eksperymentów proteomicznych z krwi ludzkiej. Probówki BD P100 zawierają 15,8 ml rozpylonego suszem K2EDTA oraz liofilizowany, zastrzeżony koktajl inhibitorów proteaz o szerokim spektrum działania w celu zapobiegania koagulacji i stabilizacji białek osocza. Zawierają one również separator mechaniczny, który stanowi fizyczną barierę między osoczem a osadem komórkowym po wirowaniu. Opracowano niewiele metod ekstrakcji DNA z próbek skrzepłej krwi pobranych do starych probówek z osoczem2-4. Problemy związane z tymi metodami wiązały się głównie z rodzajem separatora wewnątrz probówek (separator żelowy) i obejmowały trudności w odzyskiwaniu skrzepłej krwi, niedogodności przy fragmentacji lub rozpraszaniu skrzepu oraz utrudnianie ekstrakcji skrzepu przez żel separacyjny.
Przedstawiamy pierwszą metodę ekstrakcji i oczyszczania genomowego DNA z krwi pobranej do nowych probówek BD P100. Porównujemy jakość próbki DNA z probówek P100 z jakością DNA z probówek EDTA. Nasze podejście jest proste i wydajne. Obejmuje ono cztery główne etapy: 1) zastosowanie probówki do osocza BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) z separatorem mechanicznym do pobrania krwi, 2) usunięcie separatora mechanicznego przy użyciu kombinacji sacharozy i sterylnego metalowego haczyka wykonanego z spinacza, 3) oddzielenie warstwy tzw. buffy coat zawierającej leukocyty oraz 4) izolację genomowego DNA z warstwy buffy coat przy użyciu standardowego komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA lub podobnego standardowego protokołu.

Ocena jakości i pomiar stężenia DNA
Wydajność otrzymania P100_DNAs była znacznie niższa niż w przypadku EDTA_DNAs (Tabele 1 i 2). Czystość DNA, reprezentowana przez wartość stosunku 260/280, jest podobna dla obu zestawów próbek P100_DNA i EDTA_DNA (Tabele 1 i 2). Jakość DNA jest dość jednorodna w obrębie każdego zestawu próbek, choć w próbkach EDTA_DNA widoczna jest pewna degradacja, o czym świadczy lekki rozmycie (Rycina...

Opisujemy nową metodę izolacji DNA genomowego z krwi pełnej pobranej do badań osocza/serologii. Po pobraniu osocza zagęszczona krew jest zazwyczaj utylizowana. Nasza nowatorska metoda stanowi znaczną poprawę w stosunku do istniejących sposobów i umożliwia uzyskanie DNA oraz osocza z jednego pobrania, bez konieczności pobierania dodatkowej krwi.

Praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomowego DNA z zestawów do pobierania krwi służących do konserwacji białek osocza

Badania laboratoryjne mogą być wykonywane na składnikach komórkowych lub płynnych krwi. Zastosowanie różnych probówek do pobierania krwi determinuje część...

W niniejszym filmie opisana zostanie praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomicznego DNA z nowego systemu do konserwacji białek osocza BDP 100, zwanego probówkami P 100. Izolacja z probówek z surowicą lub osoczem była w przeszłości dość powszechną procedurą, jednak połączenie nowej probówki P 100 z zaprezentowaną tutaj metodą ekstrakcji oferuje nowatorskie i prostsze podejście do pozyskiwania DNA lepszej jakości przy znacznie mniejszym nakładzie pracy. Wnętrze probówki P 100 jest pokryte EDTA potasowym oraz inhibitorami proteaz.Zapobiega to koagulacji i stabilizuje białka osocza. Krew jest zbierana do tych probówek w celu pozyskania osocza do badań po wirowaniu. Krew umieszczona w probówce P 100 rozdzieli się na warstwy w zależności od gęstości: osocze na górze, erytrocyty na dole oraz leukocyty pomiędzy nimi.Warstwa Buffy coat znajduje się pomiędzy tymi dwiema warstwami. Głównym przeznaczeniem tych probówek jest zazwyczaj pozyskiwanie osocza. Wykorzystując to osocze, wykonuje się szereg pomiarów, takich jak oznaczenie poziomu przeciwciał i białek.Warstwa leukocytarna (buffy coat) jest zazwyczaj odrzucana, jednak jak zostanie pokazane w tym filmie, zawiera ona wystarczającą ilość DNA do przeprowadzenia kilku analiz, w tym sekwencjonowania, genotypowania, identyfikacji biomarkerów i innych. Zestawy P one hundreds składają się z trzech głównych elementów: nakrętki, probówki i separatora. Separator mechaniczny przemieszcza się do poziomu tuż nad warstwą leukocytarną.Aby uzyskać dostęp do warstwy leukocytarnej (buffy coat), konieczne jest zwiększenie odległości między separatorem a tą warstwą. Osiąga się to poprzez dodanie 17% sucrose. Warstwa leukocytarna jest zazwyczaj odrzucana wraz z P 102, jednak – jak zostanie pokazane w tym filmie – możliwe jest łatwe odzyskanie z tej warstwy wystarczającej ilości DNA do przeprowadzenia kilku testów analitycznych przed wyjęciem probówek P 100 z zamrażarki do -80°C.Podgrzać łaźnię wodną do 37°C, umieścić każdą probówkę P 100 w łaźni i inkubować przez około pięć minut, aby rozmrozić wszystkie próbki. Po całkowitym rozmrożeniu próbek należy usunąć wszelkie pozostałości surowicy znajdujące się powyżej separatora. Następnie powyżej separatora dodaje się 5 mL 17% sacharozy. Po dodaniu sacharozy wszystkie probówki wiruje się przez 20 minut przy 2 500 ×g. Gdy separator znajdzie się u góry probówki i zostanie oddzielony od warstwy leukocytarnej, można go łatwo usunąć.Nanieś 70% ethanol na chusteczkę laboratoryjną i wysterylizuj haczyk z klipsa do papieru, dokładnie przecierając jego całą powierzchnię. Trzymając probówkę P 100 pod kątem 45 stopni, użyj sterylnego klipsa. Zacznij wysuwać separator z probówki, delikatnie pociągając za jego krawędź i prowadząc go do worka na odpady biologiczne.Po wyjęciu separatora należy usunąć jak największą ilość warstwy 17% sacharozy, uważając, aby nie naruszyć warstwy leukocytowej (buffy coat) ani warstwy erytrocytów; warstwa leukocytowa powinna teraz znajdować się na samym wierzchu w probówce. Przenieś tę warstwę do nowej, opisanej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Objętość pobranej warstwy leukocytowej będzie różnić się dla każdej probówki, ale powinna być mniejsza niż trzy mililitry.Aby znormalizować objętość wszystkich probówek, należy dodać odpowiednią ilość PBS (soli fizjologicznej z buforem fosforanowym), aby objętość w każdej probówce wyniosła 3 mL. Po zawieszeniu wszystkich warstw białkowych (buffy coats) w jednakowej objętości, wszelkie pozostałe erytrocy należy usunąć poprzez dodanie 9 mL roztworu do lizy RBC (erytrocytów).Następnie kilkukrotnie odwróć probówki podczas 10 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, aby oddzielić lizowane krwinki czerwone od warstwy leukocytarnej. Wiruj przez pięć minut przy 2 500 G; wirowanie spowoduje powstanie osadu, z którego zostanie wyekstrahowany DNA. Odlej pozostałą ciecz z każdej probówki do pojemnika na odpady biologiczne, pozostawiając niewielką objętość, w której osad zostanie ponownie zawieszony. Wymieszaj probówkę na wortexie, aby odczepić i resuspenderować osad.Dodaj 3 ml roztworu do lizy komórek i energicznie wymieszaj na vortexu przez co najmniej 10 sekund. Po zlizowaniu komórek białka i DNA znajdują się w zawiesinie w roztworze i muszą zostać rozdzielone; należy rozpocząć od wytrącenia białek za pomocą 1 ml roztworu do wytrącania białek, a następnie mieszać na vortexu z dużą prędkością przez co najmniej 15 sekund. Następnie wiruj próbki w wirówce przez 5 minut przy 2 500 G, aby wytrącić białka w formie osadu podczas wirowania.Postępuj zgodnie z odpowiednimi krokami. Oznacz jedną probówkę stożkową o pojemności 15 ml dla każdej próbki przenoszonej do nowej probówki. Przenieś trzy mililitry 100% izopropanolu.Po wytrąceniu i odwirowaniu białek w każdej probówce powinien znajdować się stosunkowo duży osad oraz przejrzysty, w większości wodnisty nadsącz. Zlej nadsącz zawierający DNA z każdej probówki do odpowiadającej mu probówki z izopropanolem przygotowanej podczas ostatniego wirowania; izopropanol powinien spowodować wytrącenie DNA z roztworu w postaci małych, białych, nitek. Odwróć wszystkie probówki 50 razy, aby zapewnić dokładne zmieszanie. Następnie wiruj wszystkie probówki przez trzy minuty przy 2 500 G, aby utworzyć osad DNA. DNA jest zazwyczaj widoczne jako mały, biały osad na dnie probówki. Jednakże, przy niskiej wydajności DNA może być niewidoczne dla oka. Kontynuuj wszystkie ekstrakcje aż do momentu pomiaru stężeń.Niezależnie od obecności osadu DNA, odlej izopropanol. Przemyj DNA, dodając 70% ethanol. Usunie to wszelkie pozostałe niepożądane składniki, które mogłyby zakłócić późniejszą analizę; wiruj przez jedną minutę przy 2 500 G. Aby upewnić się, że osad DNA dobrze przylega do dna probówki, odlej cały 70% ethanol z probówek, a następnie odwróć je na czystym ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez jedną godzinę.Przed kontynuacją protokołu w probówkach nie powinno być widocznych pozostałości etanolu. Ostatnim etapem ekstrakcji jest resuspensja DNA w roztworze. W większości ekstrakcji odpowiednim wyborem jest roztwór do nawodnienia DNA lub woda.W przypadku próbek, w których powstają niewielkie lub żadne widoczne pasma lub granulki DNA, należy dodać o 250 µL mniej roztworu do hydratacji DNA. Następnie delikatnie i stopniowo wymieszać DNA za pomocą vortexa, aby uzyskać zawiesinę. Na koniec przenieść całe zawieszone DNA do probówki do wirówki. W tym momencie można określić stężenie i czystość DNA za pomocą NanoDrop lub innego spektrofotometru.Zazwyczaj oczekuje się, że czystość DNA będzie zbliżona do czystości DNA wyekstrahowanego bezpośrednio z krwi pełnej pobranej do probówek z EDTA potasem wyłącznie w celu uzyskania DNA. Stężenie zależy od ilości materiału wyjściowego, ale może wynosić od 50 nanogramów na mikrolitr do niemal 1000 nanogramów na mikrolitr, osiągając średnio wartości w zakresie 200 nanogramów na mikrolitr. Korzyść z zastosowania tego protokołu jest dwukrotna. Po pierwsze, pozwala on klinicystom na wykorzystanie jednego pobrania krwi do przeprowadzenia dwóch testów klinicznych zamiast dwukrotnego pobierania krwi.Po drugie, upraszcza to proces uzyskiwania dostępu do komórek zawierających DNA dzięki zastosowaniu nowoczesnych probówek z separatorami mechanicznymi zamiast tych z poprzednich generacji. W przypadku probówek z separatorami żelowymi starszej generacji, zarówno sam separator żelowy, jak i skrzep krwi stanowiły bariery dla komórek zawierających DNA. W probówkach P 100 separator mechaniczny można łatwo usunąć, stosując rozdział gęstościowy z użyciem 17%Sucrose.Jest to zrzut ekranu z pomiaru NanoDrop dla średniej ekstrakcji DNA. Stosując tę metodę dla próbki P 109, ekstrakcja pozwoliła uzyskać 250 µL roztworu o stężeniu DNA wynoszącym 209 ng/µL. Całkowita wydajność wyniosła około 52 µg.Stosunek 260/280, będący głównym wskaźnikiem czystości DNA, znajdował się w optymalnym zakresie od 1,8 do 1,9 i wyniósł 1,88. Pomiar pomocniczy czystości DNA, czyli stosunek 260/230, wyniósł 2,35, co jest wartością bliską oczekiwanemu zakresowi od 2 do 2,2.Są to dość typowe wyniki. W rzeczywistości wydajność i jakość ekstrakcji będą się różnić w zależności od objętości i stanu krwi przed ekstrakcją przy zastosowaniu standardowej elektroforezy żelowej z barwieniem bromkiem tioerymianem. Dalsze testy jakości wykazały, że genomowe DNA wyekstrahowane z probówek P 100 jest tak samo nienaruszone, jak DNA wyekstrahowane z krwi pełnej.Jest to widoczne dzięki jasnemu, grubemu prążkowi pojawiającemu się na górze każdej ścieżki zawierającej DNA genomiczne. Wykorzystanie tego protokołu zamiast poprzednich metod niesie ze sobą dwie główne korzyści. Po pierwsze, pozwala on na połączenie dwóch typowych pobrań krwi w jedno.Po drugie, niniejszy protokół jest szybszy i daje czystsze wyniki niż protokół z wykorzystaniem typowych probówek z separatorem żelowym SST. Dzięki wyeliminowaniu konieczności rutynowego rozbijania skrzepów krwi, klinicyści pobierają dwie probówki krwi w przypadku konieczności wykonania testów genetycznych i serologicznych. Zazwyczaj stosuje się probówkę z separatorem żelowym SST (tzw. złota nakrętka) oraz probówkę z EDTA potasem (tzw. fioletowa nakrętka); surowica jest pobierana z probówki SST, a DNA ekstrahowane z probówki z fioletową nakrętką. Zastosowanie tej metody pozwala na pobranie tylko jednej probówki P 100 z czerwoną nakrętką.Podczas gdy instytucje znające metodę ekstrakcji DNA z wykorzystaniem separatora żelowego mogą już pobierać jedną probówkę do testów serologicznych i genetycznych, metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu stanowi stopniową, lecz znaczącą poprawę w stosunku do istniejących metod z separatorem żelowym. Obie metody wymagają usunięcia pewnego rodzaju separatora, przy czym żel zazwyczaj sprawia więcej trudności w obsłudze niż separator plastikowy.Probówki z separatorem wymagają homogenizacji skrzepłej krwi przez siatkę drucianą przed ekstrakcją DNA. Proces homogenizacji może być uciążliwy, a ekstrakcja DNA staje się trudniejsza w przypadku obecności znacznej ilości erytrocytów, które nie zawierają DNA. Metoda ekstrakcji P 100 umożliwia oddzielenie zawierających DNA leukocytów od hematokrytu, dzięki czemu do próbki dostaje się niewielka liczba erytrocytów, które mogłyby zakłócać proces ekstrakcji DNA.Ten system izolacji DNA z probówki do osocza P 100, w przeciwieństwie do stosowanych wcześniej probówek z separatorem żelowym, oferuje wiele zalet. Probówki P 100 zawierają EDTA, który hamuje zależną od magnezu endonukleazę, oraz przeciwkrzepliwy środek zapobiegający krzepnięciu krwi. Efektem końcowym jest wyższa integralność DNA przy znacznie prostszym protokole ekstrakcji, polegającym w szczególności na uniknięciu konieczności rozbijania i homogenizacji skrzepniętej krwi.Dodatkowo, krew pozbawiona osocza może być przechowywana w probówkach typu P100 przez nieokreślony czas, do trzech lat, aż do momentu planowanej ekstrakcji DNA. Co więcej, klinicyści mogliby pozyskać bardziej użyteczne dane pacjentów przy mniejszej liczbie pobrań krwi, co zredukowałoby stres u pacjentów poddawanych tym procedurom.

a-practical-novel-method-to-extract-genomic-dna-from-blood-collection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Praktyczna i nowatorska metoda ekstrakcji DNA z genomowego zestawu do pobierania krwi w celu zachowania białek osocza

MikroRNA (miRNA) to specyficzne tkankowo, małe, niekodujące RNA regulujące ekspresję genów i mogą stanowić idealnych kandydatów do wczesnego wykrywania raka płuc. W przedstawionym protokole wyizolujemy mikroRNA z próbek krwi pacjentów w celu wczesnego badania przesiewowego w kierunku raka płuc.

Ekstrakcja miRNA: metoda ekstrakcji miRNA z próbki osocza

Ten film opisuje ekstrakcję krążącego mikroRNA z próbek osocza pacjentów z rakiem jelita grubego za pomocą ekstrakcji organicznej, a następnie wzbogacenia kolumny z włókna szklanego. miRNA są stabilne w płynach biologicznych, takich jak surowica i osocze, co czyni je idealnymi krążącymi biomarkerami do diagnozowania raka, rokowania oraz podejmowania decyzji dotyczących leczenia i monitorowania. Metoda ta pomoże zidentyfikować nowe krążące biomarkery zdolne do przewidywania wyników klinicznych u...

Ekstrakcja krążącego miRNA: metoda izolowania miRNA z próbek osocza poprzez ekstrakcję organiczną i wzbogacanie małego RNA

Ten film opisuje procedurę membranową opartą na krzemionce, mającą na celu izolację krążącego wolnego od komórek DNA lub cfDNA z próbki ludzkiego osocza. cfDNA jest obiecującym biomarkerem do diagnozowania i oceny raka.

Izolacja krążącego DNA wolnego od komórek (cfDNA): procedura membranowa na bazie krzemionki w celu ekstrakcji cfDNA z osocza krwi pacjentów z rakiem

Przedstawiamy metodologię przetwarzania krwi pełnej w celu uzyskania różnych składników do dalszej analizy. Zoptymalizowaliśmy uproszczony protokół, który umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych.

Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Ten manuskrypt opisuje analizę zmienności liczby kopii przeprowadzoną w DNA surowicy lub osocza przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację, ale może być również pouczająca w przypadku innych chorób.

Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej ekstrakcji kwasu nukleinowego wirusa z inaktywowanej wirusem krwi pełnej. Ekstrakcja odbywa się bezpośrednio w probówkach do pobierania krwi i nie wymaga żadnego sprzętu ani energii elektrycznej. Metoda nie jest zależna od zaplecza laboratoryjnego i może być stosowana wszędzie (np. w szpitalach polowych).

Szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół techniki nieinwazyjnej płynnej biopsji, w tym pobieranie krwi, separację osocza i kożucha, ekstrakcję cfDNA i DNA linii zarodkowej, kwantyfikację cfDNA lub DNA linii zarodkowej oraz analizę wzbogacania fragmentów cfDNA.

Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem

Płynna biopsja zrewolucjonizowała nasze podejście do badań translacyjnych w onkologii, a pobieranie, jakość i przechowywanie próbek są kluczowymi krokami dla jej udanego zastosowania klinicznego. W tym miejscu opisujemy ustandaryzowany i zwalidowany protokół dla dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia, który może być stosowany w większości laboratoriów badań translacyjnych.

Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Ten protokół przedstawia przystępny przewodnik do zbierania, przechowywania i rozmrażania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, odpowiedni do dalszych analiz i procesów takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA. Zademonstrowano również kolekcje płaszczy plazmowych i buffy.

Izolacja i kriokonserwacja wysoce żywotnych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej: przewodnik dla początkujących

Poznaj nową metodę ekstrakcji DNA z próbek krwi w tubach P 100, umożliwiającą jednoczesne zachowanie osocza. Technika ta upraszcza pobieranie DNA z wyższą jakością niż tradycyjne metody.

Praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomowego DNA z zestawów do pobierania krwi służących do konserwacji białek osocza

Przeglądaj więcej filmów