Name: Test przepuszczalności zarodkowego nabłonka nerwowego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności zarodkowego nabłonka nerwowego danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnego dextranu 70 kDa. Technika ta pozwala ilościowo ocenić zmiany przepuszczalności w różnych warunkach genetycznych i środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była wspierana przez National Institute for Mental Health oraz National Science Foundation. Specjalne podziękowania kierujemy do członków laboratorium Sive za wiele pomocnych dyskusji i konstruktywną krytykę, a także do Oliviera Paugoisa za ekspercką opiekę nad rybami.

1. Przygotowanie do mikroiniekcji
<ol>
 <li>Przygotować igły do mikroiniekcji poprzez wyciąganie rurek kapilarnych za pomocą wyciągacza igieł firmy Sutter instruments.</li>
 <li>Napełnić igłę do mikroiniekcji barwnikiem fluorescencyjnym (FITC-Dextran).</li>
 <li>Zamocować igłę w mikromanipulatorze oraz aparaturze do mikroiniekcji.</li>
 <li>Ostrożnie złamać igłę do mikroiniekcji za pomocą pęsety tak, aby jej szerokość wynosiła około 2 μm; wartość ta może się jednak różnić w zależności od konfiguracji mikroinjektora. W przypadku naszych igieł do mikroiniekcji odpowiada to pierwszemu obszarowi igły od strony końcówki, który nie ulega zgięciu.</li>
 <li>Zmierzyć rozmiar kropli w oleju, dostosowując czas i ciśnienie iniekcji tak, aby każda iniekcja dostarczała 1 nl. Przykładowe ustawienia dla mikroinjektora Harvard Apparatus to: P balance = 1.4 psi, P out = 1.4 psi, P inject = 22.9 psi, P clear = 67.8 psi przy czasie iniekcji od .4 do .7 sec. Średnica naszej igły przy tych ustawieniach wynosi około 2 μm. Należy jednak pamiętać, że ustawienia są zależne od konkretnego mikroinjektora i różnią się w zależności od średnicy igły.</li>
</ol>
2. Przygotowanie embrionów
<ol>
 <li>Pokryj 2 płytki dla każdego stanu 1% agaroza w wodzie, wykonaj otwory w agarozie za pomocą końcówki pipety 1-200 μl i usuń korki z agarozy. Wypełnij płytki medium dla embrionów.</li>
 <li>Używając pęsety, usuń chorion z embrionów w wieku 18 hpf lub starszych pod stereomikroskopem. Etapy rozwoju embrionów określono zgodnie z metodą Kimmel et al.11 .</li>
 <li>Przenieś embriony po usunięciu chorionu do pierwszej płytki pokrytej agarozą.</li>
 <li>Aby znieczulić embriony, dodaj do płytki trikainę (0.1 mg/ml), aż embriony przestaną się poruszać (przygotowaną zgodnie z metodą Westerfield12).</li>
</ol>
3. Iniekcja do komór mózgu
<ol>
 <li>Zorientuj zarodki tak, aby widoczna była ich strona grzbietowa, umieszczając ogon zarodka w otworze. Jeśli mikromanipulator znajduje się po prawej stronie, przesuń zarodek tak, aby przedmózgowie było po lewej stronie, a rądmózgowie po prawej.</li>
 <li>Ustaw igłę w najszerszym punkcie komory rądmózgowia.</li>
 <li>Ostrożnie przebij płytkę dachową komory rądmózgowia, upewniając się, że igła nie przechodzi przez całą grubość mózgu do żółtka (Rycina 1A).</li>
 <li>Wstrzyknij 1-2 nl barwnika fluorescencyjnego do komór, upewniając się, że barwnik wypełnia całą długość komór mózgu.</li>
 <li>Przenieś zarodki do drugiej płytki powlekanej agaroza wypełnionej pożywką do zarodków i ponownie poddaj anestezji zgodnie z opisem w punkcie 2.4.</li>
 <li>NATYCHMIAST rozpocznij obrazowanie, zgodnie z opisem w sekcji 4, aby uzyskać obraz z czasu zero.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
 <li>Zorientuj zarodki tak, aby ich ogony znajdowały się w otworze, zgodnie z opisem w punkcie 3.1.</li>
 <li>Użyj mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem przechodzącym i fluorescencyjnym, aby wykonać obraz grzbietowy w polu jasnym. Zachowaj stałe powiększenie podczas obrazowania różnych zarodków. Pozwala to na bezpośrednie porównanie analiz przeprowadzonych w programie Image J (5.2-6).</li>
 <li>BEZ PRZESUWANIA zarodka, mikroskopu lub szalki wykonaj odpowiadający mu obraz fluorescencyjny.</li>
 <li>Powtórz czynność dla każdego zarodka w wybranych punktach czasowych.</li>
</ol>
5. Ilościowe określanie przemieszczania się barwnika
<ol>
 <li>Połącz obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne w programie Photoshop zgodnie z wcześniejszym opisem Gutzmana i Sive10.</li>
 <li>Zmień dystans, o jaki przemieścił się front barwnika, w programie Image J dostępnym pod adresem <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>.</li>
 <li>Otwórz połączony plik w programie Image J i użyj narzędzia linii, aby narysować linię od punktu zgięcia przedmózgu do frontu barwnika pod kątem 10-20 ° względem neuroepitelium (Rycina 1A). Wybrano ten obszar, ponieważ jest to pierwsze i najbardziej zauważalne miejsce wycieku barwnika z neuroepitelium typu dzikiego.</li>
 <li>Wybierz narzędzie pomiarowe, aby obliczyć długość linii.</li>
 <li>Powtórz czynność dla każdego punktu czasowego.</li>
 <li>Oblicz wypadkowy dystans przemieszczenia się frontu barwnika w czasie, odejmując dystans w t=0 od pozostałych punktów czasowych.</li>
 <li>Przedstaw wyniki na wykresie.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykład wyników uzyskanych w teście przepuszczalności neuroepithelium z użyciem embrionów typu dzikiego przedstawiono na Rysunku 1B-D. Aby dokładnie zróżnicować przepuszczalność, warto przetestować barwniki o różnych masach cząsteczkowych, aby zidentyfikować taką wielkość, która wykazuje jedynie niewielki wyciek w embrionach typu dzikiego lub kontrolnych (Rysunek 2). Pozwala to na identyfikację mutantów genetycznych lub warunków środowiskowych, które zwiększają lub zmniejszają przepuszczalność (Rysunek 1D, odpowiednio linie zielona i czerwona). W przypadku neuroepithelium danio przełomycznego w 24 hpf, dekstran FITC 70 kDa wycieka powoli w ciągu 2 hr, podczas gdy 2 000 kDa nie wycieka, a 10 kDa wycieka niemal natychmiast. Dlatego 70 kDa jest idealną masą cząsteczkową do identyfikacji warunków, które zarówno zwiększają, jak i zmniejszają przepuszczalność neuroepithelium.
Jeśli igła nie trafi w światło komory mózgu, w czasie t=0 fluorescencja pojawi się poza obszarem mózgu (przykład znajduje się w pracy Gutzman and Sive, 200910). Takie embriony należy odrzucić, ponieważ wstrzyknięty barwnik nie znajdował się początkowo wewnątrz mózgu, co uniemożliwia wyciągnięcie jasnych wniosków dotyczących przemieszczania się barwnika i przepuszczalności neuroepithelium.
W końcu, jeśli embriony mają małe lub niepod koniec wypełnione komory mózgu, przed wstrzyknięciem barwnika fluorescencyjnego można przeprowadzić wstępne wypełnienie komór roztworem soli fizjologicznej. Powoduje to rozszerzenie komór, co ułatwia ich późniejszą wizualizację podczas wstrzykiwania barwnika fluorescencyjnego. Należy przeprowadzić odpowiednie kontrole, aby ustalić, czy wstrzyknięcie soli fizjologicznej nie zaburza prawidłowego rozwoju cewy nerwowej.
<img alt="Schemat wstrzykiwania barwnika do komór mózgu; śledzenie FITC-Dextran, sekwencja czasowa, wykres danych o przepuszczalności." src="/files/ftp_upload/4242/4242fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Przebieg czasowy dla barwników o różnej masie cząsteczkowej. (A) Schemat doświadczenia. W pierwszej kolejności do komór mózgu wstrzykuje się barwnik fluorescencyjny. X = pozycja igły do wstrzyknięcia. Następnie w określonych odstępach czasu rejestrowane są obrazy grzbietowe. Na koniec mierzy się odległość, o którą przunął się front barwnika od punktu przegięcia przedmózgu (oznaczonego czerwoną linią). (B-C) Zestawione obrazy grzbietowe w świetle przechodzącym i fluorescencyjne w 22 hpf (t = 0 min, B) oraz 24 hpf (t = 120 min, C). Biała linia wskazuje odległość frontu barwnika od komory przedmózgu. (D) Hipotetyczne dane dotyczące przepuszczalności próbek. Kolor niebieski = typ dziki lub kontrola, czerwony = próbka o zmniejszonej przepuszczalności w stosunku do kontroli, zielony = próbka o zwiększonej przepuszczalności w stosunku do kontroli.
<img alt="Obrazowanie tkanek ryb; analiza dyfuzji FITC; schemat różnych mas cząsteczkowych; badanie fluorescencji." src="/files/ftp_upload/4242/4242fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
 Rysunek 2. Pomiar przepuszczalności neuroepitelium dla barwników o różnych masach cząsteczkowych. (A-E) Grzbietne nałożone obrazy w polu jasnym i fluorescencyjne embrionów typu dzikiego w 22 hpf w czasie t=0 min po wstrzyknięciu FITC-dekstranu o następujących masach cząsteczkowych: 10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) i 2 000 kDa (E). (A'-E') Ten sam embrion co w (A-E) w czasie t=120 min w 24 hpf. Strona przednia po lewej. F= przedmózgowie, M= śródmózgowie, H= rombencephalon. Gwiazdka = ucho.

<ol><li>Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+neurulation%3A+first+impressions+do+not+count%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+vertebrate+neurulation+and+a+re-evaluation+of+teleost+neural+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation.</a> Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).</li>
<li>Salehi, Z., Mashayekhi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cerebrospinal+fluid+on+neural+cell+survival+in+the+developing+chick+cerebral+cortex%3A+an+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study.</a> Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).</li>
<li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).</li>
<li>Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69, 893-905 (2011).</li>
<li>Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival%2C+proliferation%2C+and+neurogenesis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A.+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Totally+tubular%3A+the+mystery+behind+function+and+origin+of+the+brain+ventricular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system.</a> Bioessays. 31, 446-458 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+neuroepithelial+barrier+by+Claudin5a+is+essential+for+zebrafish+brain+ventricular+lumen+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Information+Network+%28ZFIN%29%3A+a+resource+for+genetic%2C+genomic+and+developmental+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research.</a> Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Demonstrujemy możliwość ilościowego oznaczenia przepuszczalności żywego mózgu embrionalnego danio pręgowanego, określonej dla wstrzykniętego barwnika o danej masie cząsteczkowej. Nasza obserwacja, że neuroepithelium embrionalnego danio pręgowanego wykazuje różną przepuszczalność dla barwników o różnych masach cząsteczkowych, sugeruje, że barwnik przemieszcza się poprzez przepuszczalność parakomórkową. Nie możemy jednak wykluczyć możliwości wkładu transkomórkowego w obserwowaną przepuszczalność. Technikę tę można zastosow...

<table><tbody><tr><td>Dekstran, fluoresceina, anionowy, wiązany do lizyny</td><td>Invitrogen</td><td>D7136, D7137, D1822, D1820, D1845</td><td></td></tr><tr><td>Proszek trikainy</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>FHC Inc.</td><td>30-30-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza przepuszczalności neuroepitelium zarodka danio pręgowanego

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

Układ komorowy mózgu jest konserwowany u kręgowców i składa się z serii połączonych ze sobą jam zwanych komorami mózgu, które powstają w najwcześniejszych etapach rozwoju mózgu i utrzymują się przez całe życie zwierzęcia. Układ komorowy mózgu występuje u kręgowców, a komory rozwijają się po sformowaniu rurki nerwowej, gdy centralny światło wypełnia się płynem mózgowo-rdzeniowym (CSF) 1,2. CSF to bogata w białka ciecz, która jest niezbędna dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu3-6.
U danio pręgowanegoy rozszerzanie komór mózgu rozpoczyna się około 18 godziny po zapłodnieniu (hpf), po zamknięciu rurki nerwowej. Z tworzeniem komór mózgu wiąże się wiele procesów, w tym formowanie neuroepithelium oraz tworzenie połączeń ścisłych, które regulują przepuszczalność i produkcję płynu mózgo-rdzeniowego. Wykazaliśmy, że Na,K-ATPase jest niezbędna do rozszerzania komór mózgu, wpływając na wszystkie te procesy 7,8, podczas gdy claudin 5a jest konieczna do tworzenia połączeń ścisłych 9. Dodatkowo wykazaliśmy, że „rozluźnienie” embrionowego neuroepithelium, poprzez inhibicję miozyny, wiąże się z rozszerzaniem komór mózgu.
Aby zbadać regulację przepuszczalności podczas pęcznienia komór mózgu u danio pręgowanego, opracowaliśmy test retencji barwnika w komorach. Metoda ta wykorzystuje wstrzykiwanie barwnika do komór mózgu żywego zarodka danio pręgowanego — technikę opracowaną wcześniej w naszym laboratorium10 — w celu fluorescencyjnego oznakowania płynu mózgowo-rdzeniowego. Następnie obrazowano zarodki w czasie, obserwując przemieszczanie się fluorescencyjnego barwnika przez komory mózgu i neuroepithelium. Ilościowo określono odległość, na jaką czoło barwnika przemieściło się od strony podstawnej (nieluminalnej) neuroepithelium w czasie, co stanowi miarę przepuszczalności neuroepithelium (Rysunek 1). Zaobserwowaliśmy, że barwniki o masie 70 kDa i mniejszej przenikają przez neuroepithelium i mogą być wykryte poza embrionalnym mózgiem danio pręgowanego w 24 hpf (Rysunek 2).
Ten test retencji barwnika może być wykorzystany do analizy przepuszczalności neuroepithelium w różnych konfiguracjach genetycznych, w różnych etapach rozwoju oraz po oddziaływaniach środowiskowych. Może być on również przydatny w badaniu patologicznego gromadzenia się płynu mózgowo-rdzeniowego. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta pozwala badaczom analizować rolę i regulację przepuszczalności podczas rozwoju i w przebiegu chorób.

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru przepuszczalności mózgu zarodkowego rybki zebrafish u żywego zwierzęcia. Technika ta analizuje zdolność do zatrzymywania płynu mózgowo-rdzeniowego oraz cząsteczek o różnej masie cząsteczkowej w świetle rurki nerwowej i ilościowo określa ich przemieszczanie się poza komory mózgu. Metoda ta jest przydatna do określania różnic w przepuszczalności i dojrzewaniu nabłonka podczas rozwoju oraz w przebiegu chorób.

Analiza przepuszczalności neuroepitelium zarodka danio pręgowanego

Układ komorowy mózgu jest zachowany u kręgowców i składa się z serii połączonych ze sobą jam nazywanych komorami mózgu, które tworzą ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie przepuszczalności neuroepitelium zarodka danio prążkowanego. Cel ten osiąga się poprzez wstrzyknięcie w pierwszej kolejności FITC-dextranu o masie 70 kilodalton do komór mózgu. Następnie wykonuje się serię obrazów w świetle przechodzącym i fluorescencyjnych w określonych odstępach czasu.Następnie mierzy się odległość barwnika fluorescencyjnego od punktu zawiasowego przedmózgowia w każdym punkcie czasowym. Na koniec oblicza się dystans przebyty w czasie. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zmiany w przepuszczalności neuroepitelium poprzez porównanie różnych tłem genetycznych lub warunków środowiskowych.Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie przepuszczalności w embrionalnym neuroepitelium danio pręgowanego. Aby przygotować się do iniekcji, należy napełnić wcześniej przygotowaną igłę do iniekcji barwnikiem fluorescencyjnym, a następnie zamontować igłę na manipulatorze i w aparaturze do mikroiniekcji. Za pomocą pęsety należy ostrożnie złamać igłę do mikroiniekcji tak, aby jej szerokość wynosiła około 2 µm.Zmierz rozmiar kropli w oleju, dostosowując czas i ciśnienie wtrysku tak, aby każdy wtrysk dostarcza

an-assay-for-permeability-of-the-zebrafish-embryonic-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie przepuszczalności neuroepitelium zarodkowego rybki zebrafish

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje behawioralną reakcję danio pręgowanego na toksyczne związki poprzez monitorowanie lokomocji larw. W protokole przeanalizowano również przykład reakcji larw danio pręgowanego na zanieczyszczenie środowiska.

Test lokomocji larw: wysokoprzepustowa metoda badania neurobehawioralnej toksyczności związku w larwach danio pręgowanego

Ten film demonstruje nieinwazyjny test do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego. Po zmierzeniu zwijania ogona w zarodkach w wyniku spontanicznej depolaryzacji neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, stosuje się bloker kanału sodowego w celu zmniejszenia częstotliwości zwijania. Następnie zarodki są unieruchamiane w agarozie i umieszczane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Genetycznie zmodyfikowane neurony ruchowe wyrażają bioczujnik wykrywający napięcie z...

Nieinwazyjne podejście do badania elektrofizjologii neuronów ruchowych w zarodkach danio pręgowanego

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Przedstawiona tutaj jest metoda elektroporacji do dostarczania plazmidowego DNA i znakowania komórek ependymoglialnych u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Protokół ten jest szybką i skuteczną metodą wizualizacji i śledzenia pojedynczych komórek eścidendomoglialnych i otwiera nowe możliwości zastosowania elektroporacji w szerokim zakresie manipulacji genetycznych.

Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

Integralność bariery krew-mózg jest kluczowa dla funkcjonowania układu nerwowego. U Drosophila melanogaster bariera krew-mózg jest tworzona przez komórki glejowe podczas późnej embriogenezy. Protokół ten opisuje metody oznaczania tworzenia i utrzymywania bariery krew-mózg w zarodkach D. melanogaster i larwach trzeciego stadium rozwojowego.

Test integralności bariery krew-mózg u Drosophila melanogaster

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Protokół ten przedstawia wiarygodną metodę oceny integralności bariery krew-mózg (BBB) w modelu dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) przy użyciu oceny Evana opartej na niebieskim barwniku, umożliwiając zarówno jakościową, jak i ilościową analizę zaburzeń nerwowo-naczyniowych.

Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności zarodkowego nabłonka nerwowego danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnego dextranu 70 kDa. Technika ta pozwala ilościowo ocenić zmiany przepuszczalności w różnych warunkach genetycznych i środowiskowych.

Analiza przepuszczalności neuroepitelium zarodka danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów