Analiza przepuszczalności neuroepitelium zarodka danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie przepuszczalności neuroepithelium zarodkowego danio-pręgowanego. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie fitzy-dekstranu o masie 70 kilodalton do komór mózgowych, a następnie wykonanie serii obrazów w świetle białym i fluorescencyjnym w określonych odstępach czasu.

Następnie mierzy się odległość barwnika fluorescencyjnego od punktu zawiasowego przedmózgowia w każdym punkcie czasowym. Na koniec oblicza się przebytą w czasie odległość. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące zmiany w przepuszczalności neuroepithelium poprzez porównanie różnych tło genetycznych lub warunków środowiskowych.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie przepuszczalności w embrionalnym neuroepitelium danio pręgowanego. W celu przygotowania do iniekcji należy napełnić wcześniej przygotowaną igłę do iniekcji barwnikiem fluorescencyjnym, a następnie zamocować igłę w manipulatorze i aparaturze do mikroiniekcji. Za pomocą pęsety należy ostrożnie złamać igłę do mikroiniekcji, aby uzyskać szerokość około dwóch mikronów.

Zmierz wielkość kropli w oleju, dostosowując czas i ciśnienie wtrysku tak, aby każdy wtrysk dostarczał 1 nanoliter. Aby przygotować embriony, pokryj dwa szalki 1% agros w wodzie dla każdego z warunków, a następnie, używając końcówki do pipety 200 µL, wykonaj otwory w agros i usuń korki. Wypełnij szalki medium do embrionów pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj pęsety, aby wyłowić embriony, które znajdują się w 18. godzinie lub później po zapłodnieniu.

Następnie przenieś zarodki do jednej z naczyń powlekanych agaroza w celu ich znieczulenia. Dodaj tricain do naczynia i poczekaj, aż zarodki przestaną się poruszać. Zorientuj zarodki tak, aby widoczna była ich strona grzbietowa, umieszczając ogon zarodka w otworze.

Jeśli mikromanipulator znajduje się po prawej stronie, przesuń embrion tak, aby przodomózgie znajdowało się po lewej stronie, a ruda mózgu po prawej. Umieść igłę w najszerszym punkcie komory mózgu tylnego. Następnie ostrożnie przebij płytkę dachową komory mózgu tylnego, dbając o to, aby nie przejść przez całą głębokość mózgu do żółtka.

Następnie wstrzyknij od jednego do dwóch nanolitrów barwnika fluorescencyjnego do komór mózgu, upewniając się, że barwnik wypełnia całą długość komór. Przenieś zarodki do drugiej szalki agarowej wypełnionej pożywką dla zarodków i ponownie poddaj je anestezji. Przenieś je niezwłocznie do obrazowania w celu uzyskania danych czasowych.

Ustaw zero dla obrazowania embrionów. Zorientuj je tak, aby ogony znajdowały się w otworze, podobnie jak poprzednio, pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w oświetlenie przeświecające i fluorescencyjne. Wykonaj zdjęcie grzbietowe w jasnym polu.

Zachowaj stałe powiększenie dla wszystkich embrionów, aby umożliwić bezpośrednie porównanie bez przesuwania mikroskopu lub naczynia z embrionami. Wykonaj odpowiadający obraz w fluorescencji, powtarzając tę czynność dla każdego embrionu i każdego wybranego punktu czasowego. Aby ilościowo określić ruch barwnika, użyj programu Photoshop do nałożenia obrazów w polu jasnym i obrazów fluorescencyjnych.

Następnie, aby zmierzyć odległość, o którą przesunął się front barwnika, należy otworzyć plik scalony w programie ImageJ i za pomocą narzędzia linii narysować linię od punktu zawiasowego przedmózgowia do frontu barwnika pod kątem od 10 do 20 stopni względem neuroepithelium, a następnie wybrać narzędzie pomiarowe, aby obliczyć długość linii. Na koniec oblicz netto dystans, o który przesunął się front barwnika w czasie, odejmując odległość w punkcie czasowym zero od pozostałych punktów czasowych.

Nanieś ruchy na przedstawiony wykres. Poniżej znajduje się przykład wyników przepuszczalności neuroepithelium z wykorzystaniem embrionów typu dzikiego. Przedstawione tutaj połączone obrazy w polu jasnym zostały wykonane odpowiednio w 22. i 24. godzinie po zapłodnieniu.

Biała linia wskazuje odległość frontu D od komory przedmózgowia. Wykres przedstawia hipotetyczne dane dotyczące przepuszczalności próbek, obrazujące możliwość określenia wzrostu przepuszczalności (zaznaczonego na zielono) lub spadku przepuszczalności (zaznaczonego na czerwono) w porównaniu z embrionami kontrolnymi (zaznaczonymi na niebiesko). Aby precyzyjnie zróżnicować przepuszczalność, warto przetestować barwniki o różnych masach cząsteczkowych, aby zidentyfikować rozmiar, który w embrionach typu dzikiego lub kontrolnych wykazuje jedynie niewielki przeciek.

Umożliwia to identyfikację mutantów genetycznych lub warunków środowiskowych, które zwiększają lub zmniejszają przepuszczalność w ciągu 24 godzin. Neuroepithelium zarodka danio pręgowanego typu dzikiego po zapłodnieniu. Fitzy-dekstran o masie 70 kilodalton wycieka powoli w ciągu dwóch godzin, podczas gdy ten o masie 2000 kilodalton nie wycieka, a ten o masie 10 kilodalton wycieka niemal natychmiast.

Zatem 70 kilodaltonów jest idealną masą cząsteczkową do identyfikacji warunków, które zarówno zwiększają, jak i zmniejszają przepuszczalność neuroepithelium. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określać przepuszczalność neuroepithelium u embrionalnego danio pręgowanego.