Name: Ręczny drenaż embrionalnych komór mózgowych danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj metodę ręcznego drenażu płynu mózgowo-rdzeniowego z komór mózgowych embrionalnego danio pręgowanego. Technika ta umożliwia analizę składu płynu i jego roli w rozwoju układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez National Institute for Mental Health oraz National Science Foundation. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Jen Gutzman, dr Amandy Dickinson oraz pozostałych członków laboratorium Sive za liczne pomocne dyskusje i konstruktywną krytykę, a także do Oliviera Paugois za ekspercką opiekę nad rybami.

1. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji i tramwaju do komórek
<ol>
	<li>Napełnić mikroinżektor olejowy Eppendorf CellTram olejem mineralnym zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Przygotować igły do mikroiniekcji, wyciągając rurki kapilarne za pomocą wyciągarki igieł Sutter instruments.</li>
	<li>Zamocować igłę w mikromanipulatorze podłączonym do urządzenia Eppendorf CellTram.</li>
	<li>Ostrożnie złamać końcówkę igły. Aby uzyskać jednolity rozmiar końcówki, zmierzyć ją mikrometrem lub porównać z igłą referencyjną.</li>
	<li>Wypełnić długość igły olejem, używając urządzenia CellTram do przesunięcia oleju w dół igły, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>W naczyniu powleczonym 1% agarozą wykonać otwory za pomocą końcówki pipety 1-200 μl, a następnie usunąć korki agarowe. Naczynie napełnić pożywką dla embrionów (przygotowaną zgodnie z opisem Westerfield25).</li>
	<li>Za pomocą pincety przeprowadzić dechorionację embrionów pod stereomikroskopem.</li>
	<li>Przenieść zdechorionowane embriony do naczynia powleczonego agarozą.</li>
	<li>Aby znieczulić embriony, do naczynia z agarozą dodawać Tricaine (0,1 mg/ml) aż do momentu, gdy embriony przestaną się poruszać (przygotowany zgodnie z opisem Westerfield25).</li>
</ol>
3. Odprowadzanie eCSF
<ol>
	<li>Ustawić embriony tak, aby ich ogony znajdowały się w otworach agarozy, a strony tylne były najbliżej mikromanipulatora, co umożliwi wizualizację grzbietowej strony mózgu.</li>
	<li>Umieścić igłę w punkcie przegięcia rombomeru 0/1 lub w najszerszym punkcie komory tylnego mózgu (Rysunek 1A).</li>
	<li>Ostrożnie przebić płytkę dachową komory tylnego mózgu, dbając o to, aby nie przejść przez całą głębokość mózgu aż do żółtka.</li>
	<li>Odssać eCSF za pomocą urządzenia CellTram i zebrać płyn do igły do mikroiniekcji. Należy uważać, aby nie pobrać żadnych komórek.</li>
</ol>
4. Pobieranie eCSF do analizy składu
<ol>
	<li>Po pobraniu eCSF do igły, ostrożnie przerwij ssanie w urządzeniu CellTram.</li>
	<li>Wysuń szalkę spod igły i ostrożnie umieść igłę w probówce zawierającej odpowiedni bufor.</li>
	<li>Za pomocą urządzenia CellTram odprowadź eCSF z igły do buforu, starając się nie zanieczyścić roztworu olejem.</li>
	<li>Aby usunąć komórki aspirowane wraz z eCSF, odwiruj eCSF z prędkością 10 000 x g. Zbierz oczyszczony eCSF (nadstaw) i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz.</li>
</ol>
5. Reintrodukcja wybranych czynników
<ol>
	<li>Odprowadzać eCSF co 2 hr w wybranym przedziale czasowym, ponieważ płyn ten uzupełnia się w tym okresie. Pomiędzy punktami czasowymi odprowadzania należy wyjąć igłę i przechowywać embriony w temperaturze 28.5 °C lub innej wybranej temperaturze.</li>
	<li>Napełnić igłę drugiej mikropipety czynnikiem testowym.</li>
	<li>Umieścić igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikroinjektora.</li>
	<li>Ustawić objętość iniekcji na 1 nl, mierząc wielkość kropli w oleju i dostosowując czas oraz ciśnienie wtrysku.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1-2 nl do komór mózgowych zgodnie z wcześniejszym opisem26.</li>
</ol>

<ol><li>Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+target+for+polypeptides+and+site+of+their+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis.</a> Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).</li>
<li>Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus-cerebrospinal+fluid+system%3A+from+development+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).</li>
<li>Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cerebrospinal+fluid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production.</a> Neuroscience. 129, 957-970 (2004).</li>
<li>Praetorius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+and+solute+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Water and solute secretion by the choroid plexus.</a> Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).</li>
<li>Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+CSF+secretion+by+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus.</a> Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).</li>
<li>Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+choroid+plexus+morphogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish.</a> PLoS One. 3, e3090(2008).</li>
<li>Welss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+activity+of+the+inner+layer+of+the+embryonic+mid-brain+of+the+chick%2C+as+revealed+by+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture.</a> The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).</li>
<li>Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+mechanisms+in+the+brain%2C+II.+Immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).</li>
<li>Zheng, W., Chodobski, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZheng%2C+W+%22The+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%22">The blood-cerebrospinal fluid barrier</a>. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).</li>
<li>Salehi, Z., Mashayekhi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cerebrospinal+fluid+on+neural+cell+survival+in+the+developing+chick+cerebral+cortex%3A+an+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study.</a> Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).</li>
<li>Parada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+collaborates+with+the+isthmic+organizer+to+regulate+mesencephalic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression.</a> J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).</li>
<li>Mashayekhi, F., Salehi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+cerebrospinal+fluid+on+neural+cell+proliferation+in+developing+chick+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex.</a> Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).</li>
<li>Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).</li>
<li>Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).</li>
<li>Gato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival%2C+proliferation%2C+and+neurogenesis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).</li>
<li>Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+luminal+pressure+during+early+chick+embryonic+brain+growth%3A+descriptive+and+empirical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations.</a> Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).</li>
<li>Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+control+of+neurogenesis+induced+by+retinoic+acid+during+early+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development.</a> Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).</li>
<li>Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+supports+viability+and+proliferation+of+cortical+cells+in+vitro%2C+mirroring+in+vivo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebrospinal+Fluid+Res%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development.</a> Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2(2006).</li>
<li>Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+in+cell+proliferation+in+the+germinal+epithelium+of+the+HTx+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats.</a> Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).</li>
<li>Lehtinen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69, 893-905 (2011).</li>
<li>Zappaterra, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).</li>
<li>Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-CSF+barrier+function+controls+embryonic+CSF+protein+composition+and+homeostasis+during+early+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development.</a> Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).</li>
<li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).</li>
<li>Gato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+A+Comp.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).</li>
<li>Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Information+Network+%28ZFIN%29%3A+a+resource+for+genetic%2C+genomic+and+developmental+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research.</a> Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Brain+Ventricle+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Brain Ventricle Injection.</a> J. Vis. Exp. (26), e1218(2009).</li>
<li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinol+and+retinol-binding+protein+from+embryonic+cerebrospinal+fluid+exhibit+dynamic+behaviour+during+early+central+nervous+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development.</a> Neuroreport. 19, 945-950 (2008).</li>
<li>Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoproteins+from+embryonic+cerebrospinal+fluid+are+required+for+neural+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation.</a> J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).</li>
<li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros%2C+brain+and+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132, 1907-1921 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+classification+of+zebrafish+brain+morphology+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Zastosowanie tej techniki do manualnego drenażu eCSF z komór mózgu ryb zebrafish będzie przydatne w określaniu zapotrzebowania na eCSF podczas rozwoju. Ponadto technika ta pozwoli na opisanie profilu białkowego eCSF w trakcie rozwoju embrionalnego. Identyfikacja różnych białek w tym czasie umożliwi dalsze badanie funkcji CSF oraz jego potencjalnej roli w rozwoju mózgu. U amnionów niektóre czynniki zidentyfikowane w eCSF (IGF2, FGF2, kwas retinowy i apolipoproteiny) wykazują udokumentowaną rolę w przeżywalności, prolifera...

<table><tbody><tr><td>Olej Eppendorf CellTram</td><td>Eppendorf</td><td>516 000.025</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina w proszku</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>FHC Inc.</td><td>30-30-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ręczny drenaż komór mózgu zarodka danio pręgowanego

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) jest bogatym w białka płynem wypełniającym komory mózgu. Występuje on we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego kręgowców i utrzymuje się przez całe życie. Przyjmuje się, że u osobników dorosłych CSF amortyzuje mózg, usuwa produkty przemiany materii oraz transportuje wydzielane cząsteczki1,2. U dorosłych oraz w późniejszych stadiach rozwoju embrionalnego większość CSF jest wytwarzana przez splot naczyniowy, czyli szereg silnie unaczynionych obszarów wydzielniczych zlokalizowanych w sąsiedztwie komór mózgu3-5. U danio pręgowanego splot naczyniowy jest w pełni uformowany w 144 godzinach po zapłodnieniu (hpf)6. Przed tym etapem, zarówno u danio pręgowanego, jak i u innych embrionów kręgowców, w tym myszy, występuje znaczna ilość embrionalnego płynu mózgowo-rdzeniowego (eCSF). Dane te oraz badania na kurczętach sugerują, że neuroepithelium posiada właściwości wydzielnicze we wczesnej fazie rozwoju i może stanowić główne źródło eCSF przed rozwojem splotu naczyniowego7.
eCSF zawiera około trzykrotnie więcej białka niż płyn mózgowo-rdzeniowy dorosłych, co sugeruje, że może on odgrywać istotną rolę podczas rozwoju8,9. Badania na kurczętach i myszach wykazują, że wydzielane czynniki w eCSF, ciśnienie płynu lub ich kombinacja są ważne dla neurogenezy, ekspresji genów, proliferacji komórek oraz przeżywalności komórek w neuroepithelium10-20. Analizy proteomiczne eCSF ludzi, szczurów, myszy i kurcząt pozwoliły zidentyfikować wiele białek, które mogą być niezbędne dla funkcji CSF. Należą do nich składniki macierzy pozakomórkowej, apolipoproteiny, białka regulujące ciśnienie osmotyczne oraz białka zaangażowane w śmierć i proliferację komórek21-24. Niemniej jednak złożone funkcje eCSF pozostają w dużej mierze nieznane.
Opracowaliśmy metodę usuwania eCSF z komór mózgu danio pręgowanego, co umożliwia identyfikację składników eCSF oraz analizę zapotrzebowania na eCSF podczas rozwoju. Chociaż z innych systemów kręgowców z większymi embrionami można pobrać więcej eCSF, w przypadku danio pręgowanego pobieranie eCSF jest możliwe już od najwcześniejszych etapów rozwoju, a także w warunkach genetycznych lub środowiskowych prowadzących do nieprawidłowej objętości lub morfologii komór mózgu. Usuwanie i zbieranie eCSF pozwala na analizę spektrometryczną, badanie funkcji eCSF oraz ponowne wprowadzenie wybranych czynników do komór w celu oceny ich funkcji. Zatem dostępność wczesnego embrionu danio pręgowanego umożliwia szczegółową analizę funkcji eCSF podczas rozwoju.

Przykład opróżnionej komory mózgu przedstawiono na Rycini 1B-C. Komory mózgu są zapadnięte z powodu braku eCSF (Rycina 1B vs. C). Jak widać na obrazach grzbietowych (Rycina 1B-C oraz Rycina 2A-D), neuroepithelium rąbu mózgu zachowuje swoją charakterystyczną morfologię i wydaje się pozostać otwarte mimo braku eCSF, co jest prawdopodobnie wynikiem obecności silnych punktów przegięcia (hinge-points). Jednakże widoki boczne (Rycina 2A'-D') w...

Przedstawiamy metodę pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) oraz tworzenia układu pozbawionego CSF w obrębie układu komorowego embrionalnego mózgu rybki zebrafish. Pozwala to na dalsze badanie składu CSF oraz jego roli w rozwoju embrionalnego mózgu.

Ręczny drenaż komór mózgu zarodka danio pręgowanego

Płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) jest bogatą w białka cieczą znajdującą się w komorach mózgu. Występuje on podczas wczesnego rozwoju embrionalnego kręgowców i...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie układu pozbawionego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) wewnątrz embrionalnego układu komorowego mózgu. Osiąga się to poprzez wstępne ręczne odessanie embrionalnego płynu mózgowo-rdzeniowego (ECSF) z komór mózgu danio pręgowanego. Następnie ECSF jest zbierany do dalszej analizy składu.Następnie do opróżnionych komór mózgu ponownie wprowadza się potencjalne czynniki. Na koniec analizowana jest skuteczność usunięcia ECSF oraz ponownego wprowadzenia czynników wpływających na rozwój mózgu. Ostatecznie funkcję ECSF u rybek danio pręgowanych można wykazać poprzez monitorowanie aspektów rozwoju mózgu, takich jak podziały komórkowe, śmierć komórek oraz neurogeneza.Dodatkowo skład ECSF można określić za pomocą spektrometrii mas. Wykorzystując tę technikę, możemy rozpocząć badanie funkcji płynu mózgowo-rdzeniowego w okresie embrionalnym podczas rozwoju. Można ją również zastosować do innych układów, aby lepiej zrozumieć choroby zmieniające skład i objętość CSF, takie jak wodogłowie.Aby rozpocząć, napełnij urządzenie do wtryskiwania oleju olejem mineralnym zgodnie z instrukcją producenta. Po wyciągnięciu igieł do mikroiniekcji, zamontuj igłę w mikromani

manual-drainage-of-the-zebrafish-embryonic-brain-ventricles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ręczne drenażowanie komór mózgu zarodka danio pręgowanego

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Po uformowaniu się rurki neuralnej neuroepithelium ulega zwężeniu i fałdowaniu, podczas gdy rurka wypełnia się embrionalnym płynem mózgowo-rdzeniowym (eCSF), tworząc embrionalne komory mózgu. Opracowaliśmy tę technikę wstrzykiwania do komór, aby lepiej wizualizować wypełnioną płynem przestrzeń w kontraście do kształtu neuroepithelium w żywym embrionie.

Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru przepuszczalności mózgu zarodkowego rybki zebrafish u żywego zwierzęcia. Technika ta analizuje zdolność do zatrzymywania płynu mózgowo-rdzeniowego oraz cząsteczek o różnej masie cząsteczkowej w świetle rurki nerwowej i ilościowo określa ich przemieszczanie się poza komory mózgu. Metoda ta jest przydatna do określania różnic w przepuszczalności i dojrzewaniu nabłonka podczas rozwoju oraz w przebiegu chorób.

Analiza przepuszczalności neuroepitelium zarodka danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę mikrodysekcji mózgu dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta pomaga w uzyskaniu neuorosfer pochodzących z całego mózgu, które można dalej badać.

Sekcja mózgu danio pręgowanego: technika neurobiologii ryb

Ten film pokazuje powstawanie i różnicowanie pierwotnych neurosfer. Nerwowe komórki macierzyste danio pręgowanego, w obecności czynników wzrostu, namnażają się w swobodnie unoszące się neurosfery ze zdolnością do samoodnawiania, które później różnicują się w komórki glejowe i neurony.

Generowanie i różnicowanie pierwotnych neurosfer z nerwowych komórek macierzystych danio pręgowanego

Źródło: Schramm, P. et al. Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych poprzez usunięcie czaszki i skóry. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo neuronów móżdżku u transgenicznych larw danio pręgowanego, które wyrażają białka fluorescencyjne w neuronach Purkinjego. Proces polega na znieczuleniu larw, unieruchomieniu ich w agarozie i ostrożnym usunięciu pigmentowanej skóry w celu zwiększenia penetracji...

Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Tutaj oferujemy powtarzalną metodę badania neurogenezy u dorosłych za pomocą testu neurosfery pochodzącego z całego mózgu lub z obszaru kresomózgowia, tektalu lub móżdżku mózgu dorosłego danio pręgowanego. Dodatkowo opisujemy procedurę manipulowania ekspresją genów w neurosferach danio pręgowanego.

Izolacja i hodowla neurosfer mózgowych dorosłych danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Poznaj metodę ręcznego drenażu płynu mózgowo-rdzeniowego z komór mózgowych embrionalnego danio pręgowanego. Technika ta umożliwia analizę składu płynu i jego roli w rozwoju układu nerwowego.

Ręczny drenaż komór mózgu zarodka danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów