Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Celem niniejszej procedury jest monitorowanie zachowania hodowli chimerycznej w czaszce. W określonych warunkach hodowlanych. Pierwszym krokiem jest pobranie rogów macicy od myszy w określonym czasie ciąży.

8,5 dnia po kopulacji. Po izolacji zarodki są usuwane z błony macierzowej, a worek żółtkowy jest usuwany w celu genotypowania. Następnie regiony głowowe są mikrodissekowane i przenoszone na płytki do hodowli tkankowych pokryte macierzą zewnątrzkomórkową.

Eksplanty X pozostawia się do przytwierdzenia i hoduje przez maksymalnie 48 godzin w obecności lub braku określonych czynników farmakologicznych. Ostatecznie wykonuje się zdjęcia eksplantów, aby wykazać różnice w migracji komórek. Metoda ta jest użyteczna w odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak to, jakie szlaki sygnalizacyjne oraz białka macierzy pozakomórkowej biorą udział w kontrolowaniu zachowania grzebienia neuronalnego podczas unoszenia fałdów neuronalnych.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy mikrodysekcji są trudne do opanowania i wymagają cierpliwości oraz praktyki. Aby rozpocząć, jeśli planowane jest wykonanie immunohistochemii, należy przygotować szkiełka zakryjące; w przeciwnym razie należy pominąć ten krok i bezpośrednio pokryć płytki do hodowli tkanek ECM. Sterylne, okrągłe szkiełka zakryjące o średnicy 12 mm przygotowuje się poprzez zanurzenie ich w etanolu. Następnie należy pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu. W kolejnym kroku do każdego dołka płytki 12-dołkowej należy umieścić sterylne szkiełko zakryjące.

Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś 1 mL macierzy pozakomórkowej (ECM), aby pokryć szkiełka nakrywki lub dno płytki do hodowli tkankowych. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Po inkubacji odessij roztwór ECM i przemyj trzy razy w PBS. W tym momencie pokryte płytki można wykorzystać natychmiast lub zawinąć i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie.

Pomaga w wizualizacji półprzezroczystego embrionu. Przygotowuje się płytki zabezpieczające z odpornym, czarnym tłem, zgodnie z protokołem producenta.

Przygotuj narzędzia do sekcji, wkładając szpilkę minutian do uchwytu na szpilki. Po przygotowaniu wszystkich elementów użyj bloku ostrzącego do naostrzenia pęsety. Pobierz macicę od ciężarnej myszy w określonym czasie inkubacji, 8,5 dnia po quot.

Umieść wyizolowaną macicę w naczyniu z jałowym PBS i przemyj. Pod mikroskopem sekcyjnym oddziel poszczególne miejsca implantacji (decidua), używając nożyczek i pęsety. Usuń tkankę łączną macicy ruchem rozdzierającym, uważając, aby nie wywrzeć zbyt dużego nacisku, co mogłoby spowodować wypadnięcie zarodka z błony macicznej.

Za pomocą pęsety ostrożnie rozerwać tkankę macicy po stronie przeciwnej do łożyska. Aby odsłonić zarodek zamknięty w pęcherzyku żółtkowym, użyć pęsety, aby uchwycić zarodek wraz z pęcherzykiem żółtkowym i oddzielić je od łożyska, a następnie usunąć tkankę macicy z naczynia. Następnie, delikatnie rozdzierając tkankę pęsetą, usunąć pęcherzyk żółtkowy z zarodka.

Za pomocą pipety umieść worek żółtkowy w probówce typu Eppendorf w celu przeprowadzenia genotypowania; po wyizolowaniu określ stadium rozwoju zarodka poprzez policzenie somytów. Idealnie zarodek powinien znajdować się między szóstym a dziesiątym somytem, co odpowiada stadium 6–10. Na tym etapie fałdy neuronalne dopiero zaczynają się unosić, a główna morfogeneza mezenchymy czaszkowej jeszcze nie nastąpiła.

Po określeniu stadium, przenieś zarodek na czarną płytkę zabezpieczającą komórki zawierającą DMEM bez czerwieni fenolowej. Najpierw, pod mikroskopem sekcyjnym przy najwyższym możliwym powiększeniu, skup się na głowie zarodka, trzymając igłę sekcyjną w każdej dłoni, i wysekwuj głowę przed przednią granicą rombencefalonu (rmba). Następnie wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej, aby.

Przeciąć głowę na dwie równe połowy, trzymając w każdej dłoni igłę preparacyjną. Wypreparować zewnętrzne brzegi wzdłuż krawędzi głowy embrionu oraz linii środkowej. Usunąć tkanki w stopniu niezbędnym do uniknięcia pomylenia pożądanej struktury z tkanką niepożądaną.

Eksplant będzie zawierał migrującą grzebień neuronalny czaszki, mezodermę paraksjalną oraz ektodermę powierzchniową w celu usunięcia słabo przylegających komórek. Należy ostrożnie pipetować roztwór w górę i w dół, używając końcówki do pipety 200 µL. Następnie należy ostrożnie pobrać eksplant za pomocą końcówki pipety.

Do około 10 µL DMEM nanieś na środek powlekanej studzienki naczynia do hodowli tkankowej 20 µL ogrzanego DMEM uzupełnionego o 15% FBS; naczynie z hodowlą można teraz przenieść do inkubatora do hodowli tkankowej. Po około jednej do dwóch godzinach eksplant przyczepi się do podłoża, po czym można dodać kolejne 250 µL pożywki. Po około 24 godzinach eksplant będzie trwale przytwierdzony do szkiełka podstawowego.

W tym momencie do medium można dodać środki farmakologiczne; po dodatkowych 24 godzinach komórki będą migrować z tych obszarów. Zazwyczaj wykonuje się obrazowanie, aby udokumentować dystans oraz liczbę komórek migrujących z tych obszarów. Na tym etapie, w przypadku dłuższej inkubacji, zaczynają pojawiać się oznaki obniżonej żywotności komórek.

Oto przykłady komórek migrujących z roślin cranial me i chix. Po 48 godzinach w różnych podłożach zarówno kształt, jak i rozmiar komórek migrujących z eksplantu są od nich zależne. Migracja na podłożu była wspierana przez fibronektynę, lamininę, matrigel, ECM oraz kwas hialuronowy.

Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak immunofluorescencja i obrazowanie żywych komórek, aby dalej badać szlaki regulujące zachowanie mezenchymy czaszkowej podczas unoszenia fałdów neuronalnych.