Name: Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj test eksplantacyjny do badania zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji u myszy. Ta metoda umożliwia manipulacje farmakologiczne i obrazowanie na żywo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca jest finansowana z grantu R01-HD058629 przyznanego I.E.Z.

1. Przygotowanie naczyń hodowlanych lub szkiełek podstawkowych powlekanych ECM
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór stokowy ECM, rozpuszczając podłoże ECM w PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Invitrogen, #14040-133). Przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 mm (VWR, #28145-495) i zamroź w alikwotach w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozcieńcz roztwór stokowy ECM w PBS do pożądanego stężenia. W przypadku MaxGel rozcieńcz w DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Invitrogen, #11995-065).</li>
	<li>Jeśli planowane jest wykonanie immunofluorescencji, wysterylizuj okrągłe szklane szkiełka nakrywki o średnicy 12 mm (VWR, #89015-724), zanurzając je w etanolu, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Czynność tę należy przeprowadzić w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Jeśli immunofluorescencja nie będzie wykonywana, przejdź do kroku 1.5.</li>
	<li>Umieść wysterylizowane szkiełka nakrywki w każdym dołku płytki 24-dołkowej (Corning, #3526).</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml rozcieńczonego roztworu podłoża do każdego dołka płytki 24-dołkowej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 hr.</li>
	<li>Odsącz roztwór ECM i przemyj trzy razy w PBS.</li>
	<li>Odsącz PBS i użyj natychmiast lub owiń parafilmem i przechowuj w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie narzędzi do sekcji
Płytki Sylgard z dodatkiem węgla aktywnego przygotowuje się zgodnie z protokołem producenta. Odporne czarne tło tych płytek umożliwia stabilne przypięcie zarodka, a kolor zapewnia dobry kontrast, co ułatwia wizualizację przezroczystego zarodka.
<ol>
	<li>Aby przygotować płytki, odważyć bezpośrednio do zlewki trójwylewowej na wadze 150 g cieczy Część A, 15 g cieczy Część B oraz 1 g proszku węglowego (World Precision Instruments, #SYLG184). Wymieszać całość za pomocą drewnianego patyczka lub depresora języka. Prelać do szklanych lub plastikowych szalek o średnicy 100 cm. Użyć małego palnika butanowego trzymanego w odległości około 10–12 cali nad szalkami, aby wypalić pęcherzyki powietrza. Przykryć płytki pokrywkami i pozostawić na co najmniej 24 hr do stężenia.</li>
	<li>Aby przygotować narzędzia do sekcji, wsunąć szpilkę Minutien (średnica 0.1 mm) do uchwytu na szpilki (odpowiednio Fine Scientific Tools, #26002-10 i #26018-17); alternatywnie jako narzędzia sekcyjne można wykorzystać igły 26 G (BD, # 309597) zgięte pod kątem prostym przy pomocy pęsety. Naostrzyć pęsetę Student Dumont #5 (Fine Science Tools, #91150-20) za pomocą kamienia ostrzącego (Fine Scientific Tools, #29008-22).</li>
	<li>Przed użyciem wysterylizować wszystkie narzędzia do sekcji 70% etanolem.</li>
</ol>
3. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Eutanazyjnie uśmierć mysz w 8,5 dniu po kopulacji zgodnie z regulacjami komisji ds. wykorzystania zwierząt i wyjmij macicę.</li>
	<li>Umieść macicę w plastikowej szalce Petri z jałowym PBS.</li>
	<li>Przepłucz macicę raz jałowym PBS.</li>
	<li>Pod mikroskopem sekcyjnym ostrożnie wyjmij zarodek z decidua za pomocą pęsety.</li>
	<li>Usuń błony pozazarodkowe i zachowaj je do genotypowania, jeśli jest to konieczne.</li>
	<li>Określ stadium rozwoju zarodka poprzez policzenie somytów. Idealne stadia do przygotowania eksplantów w celu analizy zachowania komórek podczas unoszenia fałdów neuronalnych to stadia między 6 a 10 somytami, kiedy fałdy neuronalne dopiero zaczynają się unosić, a przed wystąpieniem głównej morfogenezy mezenchymy czaszkowej.</li>
	<li>Przepłucz zarodek w PBS. Umieść go w czarnej płytce sylgard z DMEM niezawierającym czerwieni fenolowej (Invitrogen, #21063-029). Usuń błony pozazarodkowe i zachowaj je do genotypowania, jeśli jest to konieczne.</li>
</ol>
4. Przygotowanie eksplantatów
<ol>
	<li>Ponownie ustaw ostrość mikroskopu przy najwyższym możliwym powiększeniu nad obszarem głowy zarodka.</li>
	<li>Wykonaj nacięcia za pomocą igieł sekcyjnych trzymanych w obu dłoniach. Użyj jednej igły do unieruchomienia tkanki, a drugiej do wykonywania nacięć.</li>
	<li>Odcię głowę zarodka przednio od rombomerów.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej, aby podzielić głowę na dwie równe połowy.</li>
	<li>Wykonaj nacięcia wokół zewnętrznych krawędzi głowy oraz wzdłuż linii pośrodkowej. Nacięcia te usuną przedmigracyjną grzebień i ektodermę powierzchniową na zewnętrznej granicy oraz płytkę przedstrunową w linii pośrodkowej. Pozostała tkanka będzie stanowiła eksplant i będzie zawierać migrującą czaszkową grzebień neuralną, mezodermę paraksjalną oraz ektodermę powierzchniową.</li>
	<li>W miarę wycinania tkanki usuwaj resztki z naczynia za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Zapobiegnie to pomyleniu eksplantu z odpadami sekcyjnymi.</li>
	<li>Delikatnie wypłucz eksplant, pipetując go w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety 20 μl i pipety automatycznej. Usunie to słabo przylegające komórki i zapobiegnie powstawaniu poszarpanych krawędzi eksplantów.</li>
	<li>Ostrocznie pobierz każdy eksplant w około 10 μl cieczy, używając końcówki do pipety 20 μl i pipety automatycznej, a następnie umieść go w centrum powleczonej studni hodowlanej.</li>
	<li>Dodaj 20 μl pożywki hodowlanej uzupełnionej o 15% FBS, aby przykryć eksplant.</li>
	<li>Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek z nawilżaniem (5% CO2, 37 °C) na 1-2 h, aby umożliwić przytwierdzenie się eksplantu do dna naczynia. Sprawdzaj okresowo, czy eksplant nie wysycha.</li>
	<li>Po przytwierdzeniu się eksplantu ostrożnie dodaj do każdej studni 250 μl DMEM uzupełnionego o 10% FBS, podgrzanego do 37 °C w łaźni wodnej. Po przytwierdzeniu eksplanty nie będą się przemieszczać podczas delikatnego potrząsania płytką pod mikroskopem.</li>
	<li>Wróć naczynie do inkubatora do hodowli tkanek.</li>
	<li>Po 24 h eksplanty będą mocno przytwierdzone, a komórki zaczną emigrować. W tym momencie do pożywki można dodać odczynniki farmakologiczne.</li>
	<li>48 h po wysianiu komórki wymigrują z eksplantów. Odległość migracji można zwizualizować i utrwalić na obrazach. Zazwyczaj kończymy hodowlę na tym etapie, ponieważ przy dłuższej inkubacji eksplanty zaczynają wykazywać oznaki zmniejszonej żywotności. Do sprawdzenia żywotności eksplantu można również użyć barwnika witalnego, takiego jak pomarańcz akrydynowy lub błękit trypanu.</li>
	<li>Na tym etapie można wykonać zdjęcia w celu udokumentowania odległości oraz liczby komórek migrujących z eksplantu. Alternatywnie, jeśli eksplanty zostały wysiane na szkiełkach podstawkowych, można je utrwalić i przeprowadzić analizy immunohistochemiczne w celu wizualizacji wybranych białek.</li>
</ol>
Kluczowe etapy protokołu
<ol>
	<li>Wytnij eksplanty o zbliżonej wielkości.</li>
	<li>Podczas preparowania usuwaj wszystkie resztki tkanek z płytki sekcyjnej, aby uniknąć pomylenia ich z pożądaną tkanką eksplantu.</li>
	<li>Podczas osadzania eksplantów w dołkach lub na szkiełkach nakrywkowych należy umieścić kroplę pożywki wraz z eksplantem w centrum dołka.</li>
	<li>Pozostaw eksplant na czas wystarczający do przytwierdzenia przed całkowitym wypełnieniem dołka pożywką.</li>
	<li>Warunki traktowania powinny być ustandaryzowane dla każdego użytego podłoża testowego i środka farmakologicznego.</li>
	<li>Z każdego embrionu można przygotować dwa eksplanty (jeden z lewej i jeden z prawej strony rurki neuralnej).</li>
	<li>Podczas badania migracji komórek z mutantowych linii myszy w różnych warunkach eksperymentalnych, jeden eksplant mutantowy należy umieścić w grupie kontrolnej, a drugi w grupie traktowanej.</li>
</ol>
Rozwiązywanie problemów
<ol>
	<li>Jeśli eksplanty nie przytwierdzają się do podłoża, należy wydłużyć czas przeznaczony na adhezję. W naszym doświadczeniu około połowa eksplantów nie przytwierdza się, przy czym większe eksplanty przylegają bardziej efektywnie.</li>
	<li>Jeśli eksplanty przytwierdzą się do obrzeży dołka, ich obrazowanie będzie utrudnione. Należy upewnić się, że eksplanty są umieszczone w centrum dołka.</li>
	<li>W idealnym przypadku eksplanty powinny mieć zbliżoną wielkość. Ewentualne różnice w rozmiarze eksplantów można jednak skorygować, przyjmując ich średnicę jako czynnik korekcyjny podczas ilościowego oznaczania migracji komórek z eksplantów.</li>
	<li>W przypadku wystąpienia kontaminacji należy upewnić się, że zachowano sterylne warunki pracy. Wszystkie narzędzia i powierzchnie robocze powinny zostać wysterylizowane 70% etanolem. Pipety i szalki Petriego powinny być nowe i sterylne.</li>
	<li>Jeśli eksplanty giną podczas sekcji, należy okresowo usuwać resztki tkankowe, aby zapobiec utracie eksplantu.</li>
	<li>Opanowanie techniki sekcji jest czasochłonne i wymaga praktyki. Pomocne jest zastosowanie optymalnego powiększenia, ostrych narzędzi sekcyjnych oraz igieł.</li>
</ol>

<ol><li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurulation+in+the+cranial+region--normal+and+abnormal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Neurulation in the cranial region--normal and abnormal.</a> Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).</li>
<li>Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+normal+and+abnormal+neurulation%3A+evidence+from+embryo+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies.</a> The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).</li>
<li>Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+mammalian+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of mammalian neurulation.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+fibronectin%2C+laminin+and+entactin+in+the+neurulating+rat+embryo+studied+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcian+blue+staining+of+glycosaminoglycans+in+embryonic+material%3A+effect+of+different+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22The+Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives.</a> The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+II.+Patterns+of+hyaluronate+synthesis+and+distribution+in+embryos+developing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+I.+Patterns+of+mesenchymal+cell+distribution+and+proliferation+in+embryos+developing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).</li>
<li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+mesenchymal+cell+and+hyaluronate+distribution+correlate+with+in+vivo+elevation+of+the+mouse+mesencephalic+neural+folds%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds.</a> Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).</li>
<li>Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+in+mammalian+craniofacial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme.</a> Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).</li>
<li>Noden, D. M., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+and+interactions+between+cranial+mesoderm+and+neural+crest+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations.</a> Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).</li>
<li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).</li>
<li>Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Streptomyces+hyaluronidase+on+tissue+organization+and+cell+cycle+time+in+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).</li>
<li>Morriss-Kay, G., Tuckett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localisation+of+chondroitin+sulphate+proteoglycans+and+the+effects+of+chondroitinase+ABC+in+9-+to+11-day+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos.</a> Development. , 106-787 (1989).</li>
<li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparitinase+treatment+of+rat+embryos+during+cranial+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation.</a> Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).</li>
<li>Sarkar, A. A., Zohn, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hectd1+regulates+intracellular+localization+and+secretion+of+Hsp90+to+control+cellular+behavior+of+the+cranial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).</li>
<li>Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hectd1+ubiquitin+ligase+is+required+for+development+of+the+head+mesenchyme+and+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure.</a> Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).</li>
<li>Chen, Z. F., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist+is+required+in+head+mesenchyme+for+cranial+neural+tube+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis.</a> Genes Dev. 9, 686-699 (1995).</li>
<li>Tzahor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonists+of+Wnt+and+BMP+signaling+promote+the+formation+of+vertebrate+head+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle.</a> Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).</li>
<li>Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+epithelium+and+the+role+of+neural+crest+cells+in+the+initiation+of+the+mammalian+tooth+germ%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ.</a> Development. 103, 155-169 (1988).</li>
<li>Newgreen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+explants+of+embryonic+chick+mesenchymes+and+epithelia+on+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin.</a> Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).</li>
<li>Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+ECM+mechanics+and+cytoskeletal+tension+as+important+regulators+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Zastosowana tutaj metoda stanowi potężne narzędzie analityczne do badania zachowania komórek mezenchymy czaszki. Oprócz przedstawionych tutaj analiz statycznych, do badania zachowania komórek w czasie rzeczywistym podczas ich migracji z eksplantu można wykorzystać eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek w jasnym polu lub w połączeniu z ekspresją białek znakowanych GFP. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek, eksplanty można znakować DiI, a w celu odróżnienia migracji grzebienia neuronalnego od mezodermy paraksjalnej można wykorzystać linie ROSA-YFP;Mesp1-cre, ROSA-YFP;Wnt1-cre lub inne linie transgeniczne. Wykorzystując ten test z eksplantami można również badać oddziaływania między mezenchymą czaszki a ECM. W niniejszej pracy wysiewamy eksplanty na różne podłoża ECM występujące w mezenchymie czaszki, aby wykazać, że komórki migrują po nich w różnym stopniu oraz że ECM wpływa na morfologię komórek. Ponadto eksplanty można osadzić w macierzy trójwymiarowej, aby ocenić zachowanie komórek w takim kontekście. Ten test z eksplantami nadaje się do analizy wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na zachowanie mezenchymy czaszki w celu analizy sygnałów wewnętrznych i zewnętrznych, które mogą regulować i modyfikować migrację. Na przykład wykorzystaliśmy ten test w naszych badaniach, aby rozpoznać rolę nadmiernej sekrecji Hsp90 w nieprawidłowym zachowaniu komórkowym w mezenchymie czaszki mutantów Hectd115. W tych eksperymentach traktowaliśmy eksplanty przeciwciałem anty-Hsp90, białkiem Hsp90, geldanamycyną oraz DMA (dimetyloamelorydem), aby zablokować sekrecję Hsp90 i wykazać, że nieprawidłowe zachowanie komórek mutantów Hectd1 wynika z nadmiaru zewnątrzkomórkowego Hsp9015. Podobne podejścia można zastosować do farmakologicznej analizy dodatkowych szlaków leżących u podstaw prawidłowej lub nieprawidłowej morfogenezy mezenchymy czaszki. Po zakończeniu testu eksplanty i migrujące komórki można analizować za pomocą szeregu metod. Na przykład analizy immunohistochemiczne mogą zostać wykorzystane do badania lokalizacji białek kluczowych dla ruchów komórkowych. Można również zastosować analizy transkryptomu, aby określić, w jaki sposób poszczególne zabiegi wpływają na ekspresję genów.
Istotnym ograniczeniem tej techniki jest fakt, że nie modeluje ona zachowań w trzech wymiarach w taki sposób, w jaki występują one in vivo. Aby rozwiązać ten problem, można by zastosować modyfikację protokołu, w której eksplantaty są osadzane w macierzy trójwymiarowej (np. matrigel) wraz z ekspresją komórkowych przedziałów znakowanych białkiem fluorescencyjnym. Nawet po wprowadzeniu tych modyfikacji konieczne byłyby dalsze eksperymenty w celu skorelowania zachowań obserwowanych w tym teście ex vivo z tymi występującymi in vivo. Inne ograniczenia obejmują konieczność wykorzystania dużej liczby embrionów w celu uzyskania wystarczającej ilości danych do wykazania istotności statystycznej. Co najważniejsze, choć sama sekcja jest stosunkowo prosta, opanowanie jej wymaga praktyki.

Zamknięcie cewy nerwowej w regionie czaszkowym u zarodka myszy zachodzi między 8,5 (E8.5) a 9,5 dniem embrionalnym. Brak prawidłowego zamknięcia cewy nerwowej w obrębie głowy prowadzi do anencefalii, częstej strukturalnej wady wrodzonej u ludzi, która jest niekompatybilna z życiem. Siły napędzające zamknięcie cewy nerwowej w części głownej są generowane zarówno przez samą tkankę nerwową, jak i otaczający ją naskórek oraz mezenchymę3. W szczególności uważa się, że ekspansja mezenchymy czaszkowej jest niezbędna do uniesienia fałdów nerwowych czaszki1,2. Mezenchyma czaszkowa jest bogata w białka ECM, zwłaszcza w białka glikozylowane, takie jak proteoglikany siarczanu heparanu, siarczany chondroityny i hialuronian4-8.
W przeciwieństwie do zarodka kurczaka, w którym komórki grzebienia neuronalnego emigrują z grzbietowej części rurki neuralnej po jej zamknięciu, grzebień neuronalny w zarodku myszy migruje w tym samym czasie, w którym zaczynają unosić się fałdy neuralne (po stadium 5 somytów). Zatem podczas neurulacji w zarodku myszy mezenchyma czaszkowa składa się z komórek pochodzących z grzebienia neuronalnego oraz mezojarmy paraksjalnej. Populacje grzebienia neuronalnego i mezojarmy paraksjalnej są indukowane w różnych momentach rozwoju; są zlokalizowane w różnych miejscach zarodka i przekształcają się w różne struktury9,10. Mezojarma paraksjalna pochodzi z prążka pierwotnego i migruje do przedniego regionu zarodka, aby znaleźć się pod domniemaną płytką neuralną. Grzebień neuronalny jest indukowany na styku płytki neuralnej i ektodermy epidermalnej, przechodzi przejście nabłonkowo-mezenchymalne i ulega delaminacji tuż przed uniesieniem fałda neuralnego w zarodku gryzonia. Komórki grzebienia neuronalnego migrują stereotypowymi drogami w podektodermalnej mezojarmie paraksjalnej do łuków skrzelowych oraz mezenchymy czołowo-nosowej i okołogałkowej. Mezojarma paraksjalna przyczyni się do powstania niektórych kości sklepienia czaszki i mięśni twarzy, podczas gdy grzebień neuronalny przyczyni się do powstania innych kości czaszki i twarzy, a także nerwów czaszkowych9-11. Linie komórkowe mezojarmy paraksjalnej i grzebienia neuronalnego mogą być różnicowo znakowane odpowiednio za pomocą transgenicznych linii myszy Mesp1-cre oraz Wnt1-cre 9.
Kluczową rolę mezenchymy czaszkowej w zamykaniu rurki neuralnej wywnioskowano z eksperymentów, w których traktowanie embrionów gryzoni czynnikami zaburzającymi ECM, takimi jak hialuronidaza, chondroitynaz ABC, heparytinaza lub diazo-okso-norleucyna (DON), podczas neurulacji upośledzało zamykanie rurki neuralnej7,12-14. W eksperymentach tych analiza histologiczna statycznych przekrojów po neurulacji ujawniła towarzyszącą dysmorfogenezę mezenchymy czaszkowej7,12-14. Jednakże, ponieważ czynnik teratogenny miał dostęp do wielu tkanek, należy jeszcze ustalić, czy mezenchyma czaszkowa jest rzeczywiście tkanką docelową. Na wsparcie wniosku, że tkanka ta jest niezbędna dla neurulacji, wskazuje fakt, że w niektórych mutantach myszy z ekscencefalą mezenchyma czaszkowa wydaje się nieprawidłowa w analizach histologicznych15-17. Niemniej jednak w większości przypadków wpływ mutacji na zachowanie komórkowe mezenchymy czaszkowej nie został zbadany.
Opracowaliśmy test z wycinkami ex vivo, aby bezpośrednio zbadać wpływ mutacji genetycznych lub manipulacji farmakologicznych na zachowanie komórek mezenchymy czaszkowej15. Test ten jest podobny do opisanego przez Tzahora et al w 2003 roku w celu oceny potencjału różnicowania mezenchymy czaszkowej leżącej pod rombomerami18, z tą różnicą, że zmodyfikowaliśmy sposób wycinania eksplantów, aby badać właściwości migracyjne populacji mezenchymy czaszkowej położonych bardziej przednio, pod przednią płytką neuronalną. Nasza metoda jest również modyfikacją testów z wycinkami przeprowadzanych na embrionach kurczaka w celu analizy zachowania migracyjnego grzebienia neuronalnego, z istotnymi różnicami. Wcześniejsze przygotowania obejmowały wycinanie grzebienia neuronalnego lub położonej bardziej tylnie mezodermy paraksjalnej19,20. Ponadto, podczas unoszenia fałdów neuronalnych u embrionu kurczaka, grzebień neuronalny nie wyemigrował jeszcze z grzbietowej części rurki neuralnej, w związku z czym eksplanty pobrane z przedniej mezodermy paraksjalnej nie zawierałyby komórek grzebienia neuronalnego. W naszym teście przygotowuje się eksplanty mezenchymy czaszkowej składające się z mezodermy paraksjalnej, grzebienia neuronalnego i ektodermy powierzchniowej, a następnie wysiewa się je na podłożu. Można przeprowadzać manipulacje eksperymentalne, takie jak izolacja eksplantów od mutantów genetycznych, wysiewanie eksplantów na różne ECM lub stosowanie preparatów farmakologicznych. Komórki migrują z eksplantu, a dystans, liczba i zachowanie mogą być analizowane i porównywane pomiędzy grupami badawczymi. Dodatkowo, przygotowanie to nadaje się do analizy migracji komórkowej za pomocą technik obrazowania na żywo. Po eksperymencie migracyjnym eksplanty można utrwalić i poddać analizom immunohistochemicznym, aby dokładniej wyjaśnić efekt zastosowanych zabiegów. Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół jest prostym testem ex vivo do badania zachowania mezenchymy czaszkowej. Jako reprezentatywny eksperyment wykorzystujemy ten test do zbadania migracji mezenchymy czaszkowej na różnych podłożach zewnątrzkomórkowych.

test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Ośrodkowy układ nerwowy pochodzi z płytki neuronalnej, która przechodzi serię złożonych ruchów morfogenetycznych prowadzących do powstania cewy neuronalnej w procesie zwanym neurulacją. Uważa się, że podczas neurulacji morfogeneza mezenchymy znajdującej się pod płytką neuronalną napędza unoszenie fałdów neuronalnych. Mezenchyma czaszki składa się z mezodermy paraksjalnej i komórek grzebienia neuronalnego. Komórki mezenchymy czaszki tworzą porowatą sieć złożoną z komórek o kształcie gwiaździstym oraz przeplatających się włókien macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które wspierają fałdy neuronalne. Podczas neurulacji mezenchyma czaszki przechodzi stereotypowe reorganizacje prowadzące do jej rozrostu; uważa się, że ruchy te stanowią siłę napędową unoszenia fałdów neuronalnych. Jednakże szlaki sygnałowe i zachowania komórkowe napędzające morfogenezę mezenchymy czaszki pozostają słabo zbadane. Interakcje między ECM a komórkami mezenchymy czaszki leżą u podstaw tych zachowań komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy prosty test z eksplantem ex vivo, opracowany w celu scharakteryzowania zachowania tych komórek. Test ten pozwala na zastosowanie manipulacji farmakologicznych w celu analizy zaangażowanych szlaków sygnałowych oraz obrazowania na żywo, aby dokładniej zbadać zachowanie tych komórek. Przedstawiamy reprezentatywny eksperyment wykazujący użyteczność tego testu w charakteryzacji właściwości migracyjnych mezenchymy czaszki na różnych komponentach ECM.

Wygląd komórek migrujących z eksplantów mezenchymy czaszki przedstawiono na Rysunku 2. Badano migrację na różnych podłożach ECM obecnych w mezenchymie czaszki podczas neurulacji, w tym na fibronektynie (100 mg/ml; Sigma #F1141), lamininie (100 mg/ml; Sigma #L2020), MaxGel ECM (rozcieńczenie 1:500 w DMEM; Sigma #E0282) oraz kwasie hialuronowym (1 mg/ml; Sigma, # 53747). Komórki nie migrują z eksplantu w przypadku braku ECM (dane nie zostały przedstawione), natomiast wszystkie testowane podłoża wspierały migrację komórek. Zarówno kształt, jak i wielkość komórek migrujących z eksplantów zależą od podłoża. Jest to spodziewane, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że siły mechaniczne generowane przez interakcję komórek z różnymi ECM wpływają zarówno na kształt, jak i właściwości migracyjne komórek21.
<img alt="Schematy procedur stomatologicznych przedstawiające metody przygotowania i wypełniania ubytków; przekrój poprzeczny zęba." src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Przygotowanie eksplantów. (A) W celu przygotowania eksplantów zarodki w stadium E8.5 są wycinane z decidua i tkanek pozazarodkowych. (B) Głowy zarodków są oddzielane od ciała przed rombomerami. Eksplanty przygotowuje się poprzez usunięcie tkanki z linii pośrodkowej oraz z zewnętrznych krawędzi głowy, aby usunąć odpowiednio płytkę przedstrunową w linii pośrodkowej oraz premigracyjną grzebień neuronalny i ektodermę powierzchniową na obwodzie. (C) Eksplanty przygotowuje się poprzez odcięcie tkanki z linii pośrodkowej i zewnętrznych krawędzi głowy, aby usunąć płytkę przedstrunową w linii pośrodkowej oraz premigracyjną grzebień neuronalny i ektodermę powierzchniową na obwodzie. (D) Eksplanty umieszcza się w małej objętości pożywki na naczyniach/szkiełkach podstawkowych pokrytych ECM i pozostawia do przyczepienia przed dodaniem większej ilości pożywki.
<img alt="Wydajność adhezji komórek na podłożach z fibronektyny, lamininy, MaxGel ECM i kwasu hialuronowego; mikroskopia." src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Migracja komórek mezenchymy czaszki z eksplantów wysianych na różnych podłożach. Eksplanty wysiano na fibronektynę, lamininę, MaxGel ECM lub kwas hialuronowy i sfotografowano po 48 hr hodowli. Pasek skali = 200 mm.

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Ośrodkowy układ nerwowy wywodzi się z płytki neuralnej, która przechodzi szereg złożonych ruchów morfogenetycznych, prowadzących do powstania...

Celem niniejszej procedury jest monitorowanie zachowania hodowli meen chiming czaszkowych w określonych warunkach hodowlanych. Pierwszym krokiem jest pobranie rogów macicy od myszy w określonym czasie ciąży.8,5 dnia po kopulacji. Po izolacji zarodki są usuwane z błony蜕szywej (decidua), a worek żółtkowy zostaje usunięty w celu genotypowania. Następnie fragmenty tkanek czaszkowych są mikrodysekcjowane i przenoszone na płytki hodowlane pokryte macierzą zewnątrzkomórkową.Wycięte fragmenty tkanek X pozostawia się do przytwierdzenia i hoduje przez maksymalnie 48 godzin w obecności lub przy braku określonych czynników farmakologicznych. Ostatecznie wykonuje się zdjęcia eksplantów, aby wykazać różnice w migracji komórek. Metoda ta jest przydatna do odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak: jakie szlaki sygnalizacyjne i białka macierzy zewnątrzkomórkowej biorą udział w kontrolowaniu zachowania grzebienia neuralnego podczas unoszenia fałdów neuronalnych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy mikrodysekcji są trudne do opanowania i wymagają cierpliwości oraz praktyki. Aby rozpocząć, jeśli planowane jest przeprowadzenie immunohistochemii, należy przygotować szkiełka nakrywkowe; w przeciwnym razie należy pominąć ten krok i bezpośrednio pokryć płytki do hodowli tkanek ECM. Sterylne okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm przygotowuje się poprzez zanurzenie ich w etanolu, a następnie pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Następnie do każdego dołka płytki 12-dołkowej należy włożyć sterylne szkiełko nakrywkowe.Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś 1 mL macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby pokryć szkiełka nakrywki lub dno płytki do hodowli tkanek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Po inkubacji odessać roztwór ECM i wypłukać trzykrotnie w PBS. Na tym etapie pokryte płytki można wykorzystać natychmiast lub zawinąć w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni.Pomaga w wizualizacji przezroczystego embrionu. Przygotowuje się płytki osłonowe z odpornym czarnym tłem, zgodnie z protokołem producenta.Przygotuj narzędzia do sekcji, wkładając szpilkę minutian do uchwytu na szpilki. Po przygotowaniu wszystkich elementów użyj ostrzałki do pęsety. Pobierz macicę od ciężarnej myszy w określonym czasie, 8,5 dnia po quot.Umieść wyizolowaną macicę w naczyniu ze sterylnym PBS i wypłucz. Pod mikroskopem sekcyjnym oddziel poszczególne miejsca implantacji (decidua) za pomocą nożyczek i pęsety. Usuń tkankę łączną macicy ruchem rozdzierającym, uważając, aby nie wywrzeć nacisku i nie wypchnąć zarodka z decidua.Za pomocą pęsety ostrożnie rozdarć tkankę macicy po stronie przeciwnej do łożyska. Aby odsłonić embrion zamknięty w pęcherzyku żółtkowym, należy pęsetą odseparować embrion wraz z pęcherzykiem żółtkowym od łożyska, a następnie usunąć tkankę macicy z naczynia. Następnie, delikatnie rozdzierając pęsetą, należy usunąć pęcherzyk żółtkowy z embrionu.Za pomocą pipety przenieś worek żółtkowy do probówki typu Eppendorf w celu genotypowania; po izolacji określ stadium rozwoju zarodka, licząc somity. Idealnie zarodek powinien znajdować się między szóstym a dziesiątym somitem, co odpowiada stadium 6–10. Na tym etapie fałdy neuronalne dopiero zaczynają się unosić, a główna morfogeneza mezenchymy czaszki jeszcze nie nastąpiła.Po określeniu stadium, przenieś embrion na czarną płytkę ochronną do komórek zawierającą DMEM bez czerwieni fenolowej. Najpierw, używając mikroskopu sekcyjnego z możliwie największym powiększeniem, skup się na głowie embrionu, trzymając w każdej ręce igłę sekcyjną, i przeprowadź sekcję głowy przedobwódkowo w stosunku do rmba. Następnie wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej, aby bi.Przeciąć głowę na dwie równe połowy, trzymając w każdej dłoni igłę sekcyjną. Wypreparować zewnętrzne krawędzie wzdłuż marginesu głowy zarodka oraz linii środkowej. Usunąć zbędne tkanki, aby zapobiec pomyleniu pożądanych struktur z tkanką niepożądaną.Wycinek będzie zawierał migrujący grzebień neuronalny czaszki, mezodermę osiową oraz ektodermę powierzchniową; należy usunąć luźno przytwierdzone komórki. Ostrożnie pipetuj ciecz w górę i w dół, używając końcówki do pipety 200 µL. Następnie ostrożnie pobierz wycinek za pomocą końcówki pipety.W około 10 µL DMEM umieść w centrum powlekanej studni do hodowli tkankowej 20 µL ciepłego DMEM uzupełnionego o 15% FBS; naczynie hodowlane można teraz przenieść do inkubatora do hodowli tkanek. Po około jednej do dwóch godzinach eksplant przylega do powierzchni, po czym można dodać kolejne 250 µL pożywki. Po około 24 godzinach eksplant będzie trwale przytwierdzony do szkiełka podstawowego.W tym momencie do pożywki można dodać środki farmakologiczne; po kolejnych 24 godzinach komórki wyjdą poza obszar przesiewu. Zazwyczaj wykonuje się zdjęcia, aby udokumentować odległość i liczbę komórek, które przemieściły się z obszaru przesiewu. W tym punkcie komórki zaczynają wykazywać oznaki obniżonej żywotności przy dłuższych czasach inkubacji.Oto przykłady komórek migrujących z tkanek czaszkowych i chix. Po 48 godzinach w różnych podłożach zarówno kształt, jak i wielkość komórek migrujących z eksplantu są od nich zależne. Migracja na podłożu była wspierana przez fibronektynę, lamininę, max gel, ECM oraz kwas hialuronowy.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak immunofluorescencja i obrazowanie na żywo, aby dalej badać szlaki regulujące zachowanie mezenchymy czaszkowej podczas podnoszenia fałdów neuronalnych.

an-explant-assay-for-assessing-cellular-behavior-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie eksplantacji do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

W niniejszym artykule opisano technikę transplantacji tkanek, która została opracowana w celu zbadania właściwości sygnalizacyjnych i wzorowania powierzchniowego ektodermy głownej podczas rozwoju kraniofacjalnego.

Ocena właściwości sygnalizacyjnych nabłonków ektodermalnych podczas rozwoju kraniofacjalnego

Opisano metodę analizy migracji wyizolowanych komórek (komórek grzbietu neuronalnego tułowia). Metoda ta jest niedroga, łagodna i pozwala odróżnić chemotaksję zarówno od chemokinezy, jak i od innych czynników wpływających na polaryzację migracyjną, takich jak oddziaływania międzykomórkowe w pierwotnej kulturze komórek grzbietu neuronalnego tułowia.

Analiza migracji komórek grzbietowych neuralnych tułowia z wykorzystaniem zmodyfikowanego testu w komorze Zigmonda

Chrząstki kraniofacjalne rozwijają się w bliskim kontakcie z innymi tkankami i są trudne do manipulacji u żywych zwierząt. Wykorzystujemy elektroporację do dostarczania narzędzi molekularnych podczas wzrostu szkieletu kraniofacjalnego, z pominięciem wczesnych efektów embrionalnych. Podejście to pozwoli nam na efektywne testowanie cząsteczek kandydackich in vivo.

Elektroporacja mezenchymy kraniofacialnej

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Ten film ilustruje technikę izolowania fałdów nerwowych czaszki od śródmózgowia zarodków piskląt. Przedstawiono szczegółowy proces rozwarstwiania fałdów nerwowych, ich rozmieszczenia i mocowania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, a następnie obserwację migracji komórek grzebienia nerwowego z fałdów nerwowych.

Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) protokół różnicowania in vitro, generujący neurosfery o powtarzalnych rozmiarach do produkcji komórek grzebienia nerwowego czaszki z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pokazujemy, że ta metodologia zmniejsza zmienność w porównaniu z poprzednimi protokołami i jak można ją wykorzystać do testu multipleksowego do badania rozwoju komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

Poznaj test eksplantacyjny do badania zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji u myszy. Ta metoda umożliwia manipulacje farmakologiczne i obrazowanie na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Przeglądaj więcej filmów