Name: Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Poznaj metodę wirusowego śledzenia obwodów neuronowych z wykorzystaniem receptora TVA i wirusa trans-synaptycznego. Technika umożliwia analizę mikroobwodów w układzie nerwowym z walidacją znanych połączeń synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Seanowi Whelanowi za pomoc w odzyskiwaniu rekombinowanych wariantów VSV, a Didem Goz i Ryanowi Chrenekowi za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez HHMI (CLC) oraz grant nr #NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wykorzystanie wirusów do badania obwodów neuronalnych jest stosunkowo wydajną metodą analizy połączonych neuronów. Jednak generowanie wirionów zarówno VSV, jak i RABV nie jest zadaniem trywialnym. Mimo przedstawionego powyżej protokołu odzyskiwania wirusa z cDNA, jest to wciąż zdarzenie o niskim prawdopodobieństwie. Poziomy każdego z plazmidów N, P i L muszą być precyzyjnie dostosowane, a w celu zapewnienia odzyskania wirusa konieczne jest przeprowadzenie wielu prób i powtórzeń. Formowanie cząsteczki rybonukleoproteinowe...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Hodowla tkanek&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>komórki nerki chomika (BSRT7)</td><td>dostępne na zapytanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3)</td><td>dostępne na zapytanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plazmidy pN, pP, pl</td><td>dostępne na zapytanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>komórki HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60 mm szalka hodowlana traktowana TC</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; prostokątna kolba do hodowli komórkowej z ukośnym szyjką i nakrętką z filtrem</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2,000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka: strzykawka 5 ml Luer-Lock</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>filtry strzykawkowe</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: wysokopotencjalny liniowy PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Wirowanie wirusów&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>system filtracji próżniowej na górze probówki Corning 150 ml, pory 0,45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>cienkościenne, ultra-przejrzyste probówki do ultrawirowania 38,5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>ultrawirowarka</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>rotor do ultrawirowarki SW28</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Iniekcje u myszy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>kapilarne mikropipety</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>stereotaks</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>injektor Ump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>czterokanałowy mikrokontroler</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>silnik warsztatowy M.TXB z pokrętłem sterującym C.EMX-1, 115 V</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>szybkozmienny uchwyt H.10</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>wiertło stopniowe, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>uchwyt mikr&amp;#8211;elektrody</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>ksylazyna</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>igła do iniekcji G 30</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>ochronna maść okulistyczna</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>jod</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Narzędzia chirurgiczne i do sekcji&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>pinceta standardowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>pinceta precyzyjna</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>sprężynowe nożyczki Vannasa</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>ostrza skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>szwy</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sekcja i barwienie przeciwciałami&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>surowica osła</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Przeciwciała&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>przeciwciała</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>anty-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała osie anty-kurczak Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała osie anty-kurczak Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Montowanie tkanek&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka zakrywkowe 22 x 22, grubość 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>elastomer silikonowy</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>przezroczysty lakier do paznokci</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik antyblaknący Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Klasyczne metody badania obwodów neuronalnych charakteryzują się dość niską wydajnością. W badaniach nad obwodami coraz popularniejsze stają się wirusy transsynaptyczne, w szczególności wirus rzekomej wścieklizny (PRV) i wirus wścieklizny (RABV), a ostatnio także wirus zapalenia jamy ustnej (VSV). Te metody o wyższej wydajności wykorzystują wirusy, które przenoszą się między neuronami w kierunku anterogradowym lub retrogradowym.
Niedawno opracowano zmodyfikowany wirus RABV do monosynaptycznego śledzenia retrogradnego (Rysunek 1A). W tej metodzie gen glikoproteiny (G) zostaje usunięty z genomu wirusa i dostarczony ponownie wyłącznie do wybranych neuronów. Specyficzność infekcji osiąga się poprzez zastąpienie prawidłowej RABV-G chimeryczną białkiem G, składającym się z domeny zewnątrzkomórkowej glikoproteiny ASLV-A i domeny cytoplazmatycznej RABV-G (A/RG)1. Ta chimeryczna G specyficznie infekuje komórki wykazujące ekspresję receptora TVA1. Gen kodujący TVA może być dostarczany różnymi metodami2-8. Po infekcji neuronu wykazującego ekspresję TVA przez RABV-G, wirus RABV może przenosić się do innych, połączonych synaptycznie neuronów w kierunku retrogradnym dzięki własnej glikoproteinie G, która została dostarczona wraz z receptorem TVA. Technika ta pozwala na znakowanie stosunkowo dużej liczby wejść (5-10%)2 do określonego typu komórek, zapewniając próbkowanie wszystkich wejść do zdefiniowanego typu komórki startowej.
Niedawno zmodyfikowaliśmy tę technikę, aby wykorzystać VSV jako znacznik transsynaptyczny9. VSV oferuje kilka zalet, w tym szybkość ekspresji genów. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy nowy system śledzenia wirusowego z użyciem VSV, przydatny do badania mikroobwodów z zwiększoną rozdzielczością. Podczas gdy pierwotne strategie opublikowane przez Wickershama et al.4 oraz Beiera et al.9 umożliwiają znakowanie wszelkich neuronów, które rzutują na pierwotnie zainfekowane komórki wykazujące ekspresję TVA, w tym przypadku VSV został zaprojektowany tak, aby przenosić się wyłącznie do komórek wykazujących ekspresję TVA (Rycina 1B). Wirus jest najpierw pseudotypowany białkiem RABV-G, aby umożliwić infekcję neuronów znajdujących się poniżej neuronów wykazujących ekspresję TVA. Po zainfekowaniu tej pierwszej populacji komórek, uwalniany wirus może infekować wyłącznie komórki wykazujące ekspresję TVA. Ponieważ transsynaptyczne rozprzestrzenianie się wirusa jest ograniczone do komórek wykazujących ekspresję TVA, obecność lub brak połączeń z określonymi typami komórek może być badana z wysoką rozdzielczością. Schemat blokowy tych eksperymentów przedstawiono na Rycynie 2. Przedstawiamy tutaj model obwodu – obwód selektywności kierunkowej w siatkówce myszy. Badamy połączenia komórek amacrynych typu starburst (SAC) z komórkami zwojowymi siatkówki (RGC).

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Klasyczne metody badania obwodów neuronalnych charakteryzują się stosunkowo niską przepustowością. Wirusy transsynaptyczne, w szczególności wirus pseudowściekuszy (PRV) i wirus wścieklizny...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie nowej techniki analizy mikroobwodów w ośrodkowym układzie nerwowym. Osiąga się to poprzez uprzednie zdefiniowanie populacji neuronów do infekcji za pomocą ekspresji receptora TVA. W drugim kroku do OUN wstrzykuje się wirusa transsynaptycznego, który infekuje wybrane neurony pierwotne.Następnie wirus będzie rozprzestrzeniać się transsynaptycznie wyłącznie do połączonych neuronów wykazujących ekspresję receptora TVA. Aby zbadać, czy neurony te są ze sobą połączone, uzyskano wyniki wykazujące, że technika ta może być wykorzystana do analizy mikroobwodów na podstawie walidacji znakowania znanych połączonych mikroobwodów. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak elektrofizjologia i mikroskopia, jest to, że stanowi ona wysokoprzepustową metodę analizy obwodów neuronalnych.Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy, gdy zapoznaliśmy się z pionierszą pracą Wickershama i współpracowników dotyczącą wirusowego śledzenia ograniczonego monosynaptycznie. Uznaliśmy, że wirusy można dodatkowo zmodyfikować inżynieryjnie, aby badać połączenia neuronalne w nowatorski sposób. Szczegółowe informacje na temat o

viral-tracing-of-genetically-defined-neural-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Śledzenie wirusowe genetycznie określonych obwodów neuronowych

Przedstawiamy praktyczny przewodnik po wprowadzaniu tracerów in vivo, wykorzystując drogę rdzeniowo-móżdżkową jako system modelowy do zaprezentowania kluczowych kroków niezbędnych do skutecznej analizy obwodów neuronalnych u myszy. Szczegółowo opisujemy nasz wszechstronny protokół śledzenia, który wykorzystuje aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA) sprzężoną z fluoroforami Alexa.

Ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem do analizy centralnych eferentów regulujących cele obwodowe za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Tutaj przedstawiamy protokół, który wykorzystuje transsynaptycznego wirusa wścieklizny rzekomej do identyfikacji i lokalizacji funkcjonalnego obwodu mózgu, a następnie klasyczne techniki śledzenia dróg w celu walidacji określonych połączeń w obwodzie między zidentyfikowanymi grupami neuronów.

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Ten protokół ma na celu generowanie bezpośrednio przeprogramowanych interneuronów in vivo, przy użyciu systemu wirusowego opartego na AAV w mózgu i reportera GFP sterowanego przez synapsynę FLEX, który pozwala na identyfikację komórek i dalszą analizę in vivo.

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę wirusowego śledzenia obwodów neuronowych z wykorzystaniem receptora TVA i wirusa trans-synaptycznego. Technika umożliwia analizę mikroobwodów w układzie nerwowym z walidacją znanych połączeń synaptycznych.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Przeglądaj więcej filmów