Name: Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Poznaj metodę wirusowego śledzenia obwodów neuronowych z wykorzystaniem receptora TVA i wirusa trans-synaptycznego. Technika umożliwia analizę mikroobwodów w układzie nerwowym z walidacją znanych połączeń synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Seanowi Whelanowi za pomoc w odzyskiwaniu rekombinowanych wariantów VSV, a Didem Goz i Ryanowi Chrenekowi za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez HHMI (CLC) oraz grant nr #NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wykorzystanie wirusów do badania obwodów neuronalnych jest stosunkowo wydajną metodą analizy połączonych neuronów. Jednak generowanie wirionów zarówno VSV, jak i RABV nie jest zadaniem trywialnym. Mimo przedstawionego powyżej protokołu odzyskiwania wirusa z cDNA, jest to wciąż zdarzenie o niskim prawdopodobieństwie. Poziomy każdego z plazmidów N, P i L muszą być precyzyjnie dostosowane, a w celu zapewnienia odzyskania wirusa konieczne jest przeprowadzenie wielu prób i powtórzeń. Formowanie cząsteczki rybonukleoproteinowe...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Hodowla tkanek&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>komórki nerki chomika (BSRT7)</td><td>dostępne na zapytanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccinia (vTF7-3)</td><td>dostępne na zapytanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plazmidy pN, pP, pl</td><td>dostępne na zapytanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>komórki HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60 mm szalka hodowlana traktowana TC</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; prostokątna kolba do hodowli komórkowej z ukośnym szyjką i nakrętką z filtrem</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS: płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2,000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka: strzykawka 5 ml Luer-Lock</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>filtry strzykawkowe</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: wysokopotencjalny liniowy PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Wirowanie wirusów&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>system filtracji próżniowej na górze probówki Corning 150 ml, pory 0,45 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>cienkościenne, ultra-przejrzyste probówki do ultrawirowania 38,5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>ultrawirowarka</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>rotor do ultrawirowarki SW28</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Iniekcje u myszy&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>kapilarne mikropipety</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>stereotaks</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>injektor Ump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>czterokanałowy mikrokontroler</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>silnik warsztatowy M.TXB z pokrętłem sterującym C.EMX-1, 115 V</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>szybkozmienny uchwyt H.10</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>wiertło stopniowe, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>uchwyt mikr&amp;#8211;elektrody</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>ksylazyna</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>igła do iniekcji G 30</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>ochronna maść okulistyczna</td><td>Doctors Foster and Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>jod</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Narzędzia chirurgiczne i do sekcji&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>pinceta standardowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>pinceta precyzyjna</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>sprężynowe nożyczki Vannasa</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>ostrza skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>szwy</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sekcja i barwienie przeciwciałami&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>surowica osła</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Przeciwciała&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>przeciwciała</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>anty-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała osie anty-kurczak Dylight 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała osie anty-kurczak Alexa Fluor 647</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Montowanie tkanek&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka zakrywkowe 22 x 22, grubość 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>elastomer silikonowy</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>przezroczysty lakier do paznokci</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik antyblaknący Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Klasyczne metody badania obwodów neuronalnych charakteryzują się dość niską wydajnością. W badaniach nad obwodami coraz popularniejsze stają się wirusy transsynaptyczne, w szczególności wirus rzekomej wścieklizny (PRV) i wirus wścieklizny (RABV), a ostatnio także wirus zapalenia jamy ustnej (VSV). Te metody o wyższej wydajności wykorzystują wirusy, które przenoszą się między neuronami w kierunku anterogradowym lub retrogradowym.
Niedawno opracowano zmodyfikowany wirus RABV do monosynaptycznego śledzenia retrogradnego (Rysunek 1A). W tej metodzie gen glikoproteiny (G) zostaje usunięty z genomu wirusa i dostarczony ponownie wyłącznie do wybranych neuronów. Specyficzność infekcji osiąga się poprzez zastąpienie prawidłowej RABV-G chimeryczną białkiem G, składającym się z domeny zewnątrzkomórkowej glikoproteiny ASLV-A i domeny cytoplazmatycznej RABV-G (A/RG)1. Ta chimeryczna G specyficznie infekuje komórki wykazujące ekspresję receptora TVA1. Gen kodujący TVA może być dostarczany różnymi metodami2-8. Po infekcji neuronu wykazującego ekspresję TVA przez RABV-G, wirus RABV może przenosić się do innych, połączonych synaptycznie neuronów w kierunku retrogradnym dzięki własnej glikoproteinie G, która została dostarczona wraz z receptorem TVA. Technika ta pozwala na znakowanie stosunkowo dużej liczby wejść (5-10%)2 do określonego typu komórek, zapewniając próbkowanie wszystkich wejść do zdefiniowanego typu komórki startowej.
Niedawno zmodyfikowaliśmy tę technikę, aby wykorzystać VSV jako znacznik transsynaptyczny9. VSV oferuje kilka zalet, w tym szybkość ekspresji genów. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy nowy system śledzenia wirusowego z użyciem VSV, przydatny do badania mikroobwodów z zwiększoną rozdzielczością. Podczas gdy pierwotne strategie opublikowane przez Wickershama et al.4 oraz Beiera et al.9 umożliwiają znakowanie wszelkich neuronów, które rzutują na pierwotnie zainfekowane komórki wykazujące ekspresję TVA, w tym przypadku VSV został zaprojektowany tak, aby przenosić się wyłącznie do komórek wykazujących ekspresję TVA (Rycina 1B). Wirus jest najpierw pseudotypowany białkiem RABV-G, aby umożliwić infekcję neuronów znajdujących się poniżej neuronów wykazujących ekspresję TVA. Po zainfekowaniu tej pierwszej populacji komórek, uwalniany wirus może infekować wyłącznie komórki wykazujące ekspresję TVA. Ponieważ transsynaptyczne rozprzestrzenianie się wirusa jest ograniczone do komórek wykazujących ekspresję TVA, obecność lub brak połączeń z określonymi typami komórek może być badana z wysoką rozdzielczością. Schemat blokowy tych eksperymentów przedstawiono na Rycynie 2. Przedstawiamy tutaj model obwodu – obwód selektywności kierunkowej w siatkówce myszy. Badamy połączenia komórek amacrynych typu starburst (SAC) z komórkami zwojowymi siatkówki (RGC).

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Klasyczne metody badania obwodów neuronalnych charakteryzują się stosunkowo niską przepustowością. Wirusy transsynaptyczne, w szczególności wirus pseudowściekuszy (PRV) i wirus wścieklizny...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie nowej techniki analizy mikroobwodów w ośrodkowym układzie nerwowym. Osiąga się to poprzez uprzednie zdefiniowanie populacji neuronów do infekcji za pomocą ekspresji receptora TVA. W drugim kroku do OUN wstrzykuje się wirusa transsynaptycznego, który infekuje wybrane neurony pierwotne.Następnie wirus będzie rozprzestrzeniać się transsynaptycznie wyłącznie do połączonych neuronów wykazujących ekspresję receptora TVA. Aby zbadać, czy neurony te są ze sobą połączone, uzyskano wyniki wykazujące, że technika ta może być wykorzystana do analizy mikroobwodów na podstawie walidacji znakowania znanych połączonych mikroobwodów. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak elektrofizjologia i mikroskopia, jest to, że stanowi ona wysokoprzepustową metodę analizy obwodów neuronalnych.Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy, gdy zapoznaliśmy się z pionierszą pracą Wickershama i współpracowników dotyczącą wirusowego śledzenia ograniczonego monosynaptycznie. Uznaliśmy, że wirusy można dodatkowo zmodyfikować inżynieryjnie, aby badać połączenia neuronalne w nowatorski sposób. Szczegółowe informacje na temat odzyskiwania VSV z CD NA przy użyciu systemu VACCINIA T seven w celu wygenerowania komórek do pasażowania znajdują się w protokole pisemnym.W przypadku VSV najpierw odessano pożywkę z czterech 10-centymetrowych płytek z komórkami TV eight 800, które osiągnęły 80% konfluencji po wysianiu w dniu poprzednim, a następnie zastąpiono ją 5 mL nieuzupełnionego DMEM. Każdą płytkę transfekowano 5 µg plazmidu kodującego wybrane glikoproteinę zgodnie ze standardowymi procedurami. Około sześć godzin po transfekcji wymieniono pożywkę na DMEM uzupełniony 10% FBS. Płytki inkubowano przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym na 34 °C z 5% CO2, aby umożliwić ekspresję glikoproteiny i jej akumulację na powierzchni.Po inkubacji odessać pożywkę i zastąpić ją pięcioma mililitrami DMEM z dodatkiem 10% FBS, a następnie zainfekować każdą płytkę wirusem VSV zawierającym chimeryczną glikoproteinę G wścieklizny MA z wielokrotnością infekcji (MOI) od 0,01 do 0,1 i inkubować w temperaturze 34 °C przez noc. Po 24 godzinach sprawdzić poziom infekcji na każdej płytce za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jeśli zainfekowanych zostało ponad 50% komórek, zebrać pożywkę.Wymień medium na 5 mL świeżego medium, a następnie zamroź zebrane medium w temperaturze -80 °C. Powtarzaj procedurę pobierania co 24 godziny przez kolejne trzy dni, tak aby łączny czas pobierania wynosił cztery dni. Zamrażaj każdą porcję zebranego medium po całkowitym zamrożeniu ostatniej porcji w temperaturze -80 °C; w tym momencie wszystkie zebrane porcje medium powinny znajdować się w temperaturze 37 °C. Powinno uzyskać się łącznie 80 mL zebranego medium. Przefiltruj zebrane medium przez filtry 0,45 µm na lodzie.Następnie przenieś 36 mililitrów wirusa do probówki do wirówki Beckman i skoncentruj nadsącz za pomocą ultrawirowania przy 80 000 ×g przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Upewnij się, że rotor jest odpowiednio zrównoważony; po wirowaniu wlej zawartość do naczynia z 10% wybielaczem i użyj aspiratora, aby usunąć ciecz ze ścianek probówki. Następnie wstrząsaj probówki zawierające wirusa przy 120 RPM przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i resuspenduj pellet wirusowy w jak najmniejszej objętości, która zazwyczaj wynosi około 30 mikrolitrów.Po resuspensji wirusa należy go skwantyfikować, infekując komórki 2 9 3 T w płytce 24-dołkowej z wykorzystaniem dziesięciokrotnej serii rozcieńczeń od 1 do 1 miliona, a następnie wykonując miareczkowanie około dwóch dni po infekcji. Zgodnie ze standardowymi procedurami, zainfekowane wirusem komórki można wykryć za pomocą fluorescencji. W eksperymentach tych ważne jest zastosowanie odpowiedniej linii komórkowej.Celem jest uzyskanie ekspresji receptora TVA w typach komórek, które mają zostać zmapowane. Można to osiągnąć poprzez ekspresję receptora TVA za pomocą metod wirusowych lub poprzez allel transgeniczny. W tym eksperymencie wykorzystano potrójnie transgeniczne myszy w wieku od sześciu do 10 tygodni.Myszy wykazujące kondycjonalny allel TVA zostaną skrzyżowane z myszami wykazującymi allel chat-Cre. Następnie myszy te zostaną skrzyżowane z linią wykazującą fluorescencyjny allel TD tomato. Końcowa mysz transgeniczna wykazuje TVA oraz kondycjonalny allel TD tomato we wszystkich komórkach wykazujących Cre, w tym w interesujących nas komórkach starburst omicron.Ekspresję tę można zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Sprawdź współrzędne stereotaktyczne dla obszaru zainteresowania w atlasie mózgu myszy i przygotuj aparat stereotaktyczny, włączając sterownik mikroinjektora oraz ustawiając tłok i uchwyt elektrody na odpowiednich pozycjach. Następnie wypełnij igłę od tyłu olejem mineralnym, aby stworzyć barierę z wirusem, i umieść igłę na tłoku, upewniając się, że w igle nie ma pęcherzyków powietrza.Wymroź wirusa i umieść go na lodzie. Ustaw mikroinżektor w tryb pobierania i przesuń probetkę z wirusem pod kapilarę mikroinżektora. Zanurz końcówkę kapilary w zawiesinie wirusa i pobierz ilość wirusa niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu.Po podaniu przedoperacyjnej dawki buprenorfiny zwierzę zostaje odpowiednio znieczulone zgodnie z wytycznymi instytucji. Należy wykonać ucisk palca stopy i upewnić się, że reakcja odruchowa nie występuje przed rozpoczęciem procedury.Umieść znieczuczoną mysz na macie grzewczej wspartej na ruchomym stojaku służącym do pozycjonowania zwierzęcia. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas znieczulenia. Następnie umieść mysz w aparacie stereotaktycznym, delikatnie wprowadzając pręty uszne do kanału słuchowego.Upewnij się, że głowa jest równoległa do podstawy stereotaktyki i nie przemieszcza się bocznie. Następnie dostosuj poprzeczkę gryzieniową, aby pomóc w stabilizacji głowy. Usuń sierść w obszarze nacięcia.Następnie obszar ten należy przemyć trzykrotnie etanolem, a potem trzykrotnie jodyną. Po wykonaniu nożyczkami cięcia strzałkowego skóry w celu odsłonięcia czaszki, należy odsunąć skórę za pomocą wykonanych samodzielnie haków chirurgicznych. Następnie należy ustawić mikrokapilarę za pomocą bgma i użyć pokręteł, aby przesunąć mikroinjektor do współrzędnych bocznego jądra obrączkowatego.Po zlokalizowaniu LGN należy wywiercić w czaszce mały otwór nad miejscem wstrzyknięcia. Należy umieścić kapilarę nad otworem i powoli opuszczać ją, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią mózgu. Jest to pozycja zero w układzie współrzędnych grzbietowo-brzusznych.Mikrokapilara powinna być wystarczająco ostra, aby przebić twardą oponę mózgu myszy. Należy ją zatem powoli opuścić na głębokość 2,75 mm i wstrzyknąć wymaganą ilość wirusa z prędkością około 100 nl/min. Igłę należy pozostawić w mózgu przez około siedem minut, aby umożliwić dyfuzję wirusa z miejsca wstrzyknięcia i zapobiec jego cofaniu się wzdłuż igły.Następnie, bardzo powoli, w ciągu dwóch minut, wycofaj igłę z miejsca wstrzyknięcia i z mózgu. Na koniec zszyj miejsce operacyjne i monitoruj zwierzęta do czasu wybudzenia z anestezji. Podawaj buprenorfinę co 12 godzin przez dwa dni.Zazwyczaj transsynaptyczne rozprzestrzenianie się VSV można zaobserwować około 24 godzin po wstrzyknięciu. Jednak dłuższy czas oczekiwania doprowadzi do większego rozprzestrzenienia. Po uśpieniu myszy poprzez inhalację dwutlenkiem węgla, wypreparuj oko do 4% formaldehydu i inkubuj przez jedną godzinę, upewniając się, że oko pozostaje całkowicie zanurzone.Następnie przenieś oko do płytki Petriego zawierającej PBS. Używając pęsety nr 55, szybko usuń rogówkę, a następnie poluzuj i oddziel siatkówkę od pozostałych tkanek. Analiza całego preparatu.Przetnij siatkówkę na szkiełku przedmiotowym tak, aby leżała płasko. Umieść odstępniki silikonowe wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, używając przedłużonego medium montażowego z gold, a następnie przykryj całość szkiełkiem nakrywkowym o zerowej grubości w celu analizy przekrojów siatkówki. Umieść siatkówkę w 30% sacharozy w PBS, aż siatkówka całkowicie się zanurzy.Następnie umieść siatkówkę w mieszaninie OCT i 30% roztworu sacharozy w stosunku 1:1 na trzy godziny. Na koniec zamroź siatkówkę metodą flash-freezing i przechowuj w temperaturze -80°C do momentu przygotowania skrawków. Ten obraz przedstawia eksperyment z przebiegiem czasowym, demonstrujący zakaźność komórek TVA 800 oraz komórek 2 9 3 T przez vsv A/rg.Górne panele przedstawiają komórki TVA 800 w sześć godzin, jeden dzień i dwa dni po infekcji. Dolne panele przedstawiają komórki 2 9 3 T w tych samych punktach czasowych. Wirus rozprzestrzenia się między komórkami wykazującymi ekspresję TVA w ciągu kilku godzin, natomiast rozprzestrzenianie się w komórkach 2 9 3 T, które nie wykazują ekspresji receptora TVA, choć również występuje, przebiega znacznie wolniej.Pasek skali odpowiada 100 mikronom. Obraz przedstawia reprezentatywną infekcję komórek zwojowych siatkówki u myszy niewyrażających TVA. Zwierzęta otrzymały wtrysk wirusa vsv A/RG do LGN.Przeprowadzono pseudotypowanie z użyciem R-A-B-V-G, a tkankę pobrano dwa dni po wstrzyknięciu. Widoczna jest tutaj rzadka infekcja, przy czym komórki zwojowe siatkówki zostały wskazane żółtymi grotami strzałek. Ten obraz przedstawia gęstszą infekcję.Można to osiągnąć przy zastosowaniu wyższego miana (TI) wirusa oraz wysokiej jakości wstrzyknięcia, co pokazano tutaj. Różne typy komórek zwojowych siatkówki można zidentyfikować na podstawie morfologii, w tym małe komórki zwojowe rozgałęzione, komórki zwojowe typu pierwszego zawierające melanopsynę, komórki zwojowe selektywne kierunkowo (DS GCs) oraz komórki off DS GCs. Tutaj pasek skali reprezentuje 50 mikronów, jak widać na następujących obrazach pochodzących od myszy wykazującej ekspresję TVA.Transmisja VSVA/RG z on-off DS GC do komórek Starburst omics przebiega zgodnie z oczekiwanym wzorcem. Komórki on-off DS GC, zaznaczone białą grotą strzałki i wypełnione na zielono, przekazują wirusa do wielu komórek Starburst omics, zaznaczonych żółtą grotą strzałki. Jak widać, wszystkie zielone komórki, które nie są DS GC, wykazują koekspresję z reporterem Cree, co wskazuje, że są to komórki Starburst omics wykazujące ekspresję TVA.Komórki zwojowe (GCs) typu DS wskazane białymi grotami strzałek z zielonym wypełnieniem oraz komórki starburst wskazane żółtymi grotami strzałek, rozwarstwiające odpowiednie warstwy wewnętrznej warstwy splotowej siatkówki (IPL); komórki, do których przedostaje się wirus, obejmują zarówno typ „on”, jak i „off”. Komórki starburst. Liczby na tej rycinie wskazują warstwy IPL. Po opanowaniu techniki cały eksperyment można przeprowadzić w jeden lub dwa dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Szybkość VSV jest jedną z jego głównych zalet po zastosowaniu tej procedury. W celu walidacji śledzenia obwodów wirusowych oraz analizy właściwości tych połączeń synaptycznych można przeprowadzić inne metody, takie jak kanał czerwony (channel red) czy mapowanie obwodów oparte na opsynach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć większość poszczególnych etapów śledzenia obwodów wirusowych – od hodowli wirusa, przez wstrzykiwanie in vivo, aż po analizę fluorescencyjnie znakowanych neuronów.

viral-tracing-of-genetically-defined-neural-circuitry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Śledzenie wirusowe genetycznie określonych obwodów neuronowych

Przedstawiamy praktyczny przewodnik po wprowadzaniu tracerów in vivo, wykorzystując drogę rdzeniowo-móżdżkową jako system modelowy do zaprezentowania kluczowych kroków niezbędnych do skutecznej analizy obwodów neuronalnych u myszy. Szczegółowo opisujemy nasz wszechstronny protokół śledzenia, który wykorzystuje aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA) sprzężoną z fluoroforami Alexa.

Ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach

Śledzenie transsynaptyczne stało się potężnym narzędziem do analizy centralnych eferentów regulujących cele obwodowe za pomocą obwodów wielosynaptycznych. Tutaj przedstawiamy protokół, który wykorzystuje transsynaptycznego wirusa wścieklizny rzekomej do identyfikacji i lokalizacji funkcjonalnego obwodu mózgu, a następnie klasyczne techniki śledzenia dróg w celu walidacji określonych połączeń w obwodzie między zidentyfikowanymi grupami neuronów.

Śledzenie transsynaptyczne od celów obwodowych z wirusem wścieklizny rzekomej, a następnie podwójne znakowanie toksyną i biotynylowanymi aminami dekstranu

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Ten protokół ma na celu generowanie bezpośrednio przeprogramowanych interneuronów in vivo, przy użyciu systemu wirusowego opartego na AAV w mózgu i reportera GFP sterowanego przez synapsynę FLEX, który pozwala na identyfikację komórek i dalszą analizę in vivo.

Bezpośrednie przeprogramowanie in vivo rezydentnych komórek glejowych na interneurony poprzez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę wirusowego śledzenia obwodów neuronowych z wykorzystaniem receptora TVA i wirusa trans-synaptycznego. Technika umożliwia analizę mikroobwodów w układzie nerwowym z walidacją znanych połączeń synaptycznych.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Przeglądaj więcej filmów