Name: Modele przerzutów do kości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metody inokulacji komórek nowotworowych u myszy w celu badania przerzutów do kości. Protokół obejmuje wstrzyknięcie do lewej komory serca lub kości piszczelowej oraz długoterminowe monitorowanie wzrostu guza za pomocą technik obrazowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z następujących źródeł: P01CA040035 (FE/JAS) oraz VA Career Development Award (JAS).

1. Hodowla komórek
<ol>
 <li>Istnieje wiele subklonów MDA-MB-231 tworzących przerzuty do kości, które wykazują różną skłonność do kolonizacji i wzrostu w tkance kostnej. W naszych eksperymentach wykorzystujemy klon pochodzący z linii MDA-MB-231 z markerem GFP opracowanej w UTHSCA 2. Ten konkretny subklon tworzy widoczne osteolityczne zmiany kostne około 3 tygodnie po inokulacji, a uśmiercanie zwierząt następuje w 4. tygodniu.</li>
 <li>Komórki należy hodować w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS oraz 0,1 mg/ml penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5-8% CO27.</li>
 <li>Przesiewanie komórek należy przeprowadzać przy 80-90% konfluencji i ponowne wysiewać w rozcieńczeniu 1:10 (wartość ta różni się w zależności od typu komórek i rozmiaru płytki; dla komórek MDA-MB-231 w naczyniu T-75 jest to około 6x105), co odbywa się mniej więcej co 72 h.</li>
 <li>Komórki MDA-MB-231 zachowują zazwyczaj wygląd fibroblastyczny z licznymi pseudopodiami. Jakiekolwiek zaokrąglenie komórek świadczy o zbyt dużym zagęszczeniu lub innym niepożądanym stresie i należy go unikać, ponieważ może to wpłynąć na potencjał metastatyczny in vivo.</li>
 <li>Idealnie komórki powinny być utrzymywane w kulturze tylko przez krótki czas przed inokulacją (zalecamy mniej niż 1 tydzień lub do momentu uzyskania wystarczającej liczby komórek do eksperymentu), a w przypadku zaokrąglenia komórek lub zmian w tempie ich wzrostu należy rozmrozić nową ampułkę.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Przeprowadzić trypsynizację komórek przy 80-90% konfluencji, używając 0,15% Trypsyny/EDTA (rozcieńczyć 0,5% Gibco Trypsin EDTA w stosunku 1:2 w PBS). Stężenie to umożliwia szybkie odklejenie komórek (&lt;2 min) i ogranicza ich agregację.</li>
 <li>Niezwłocznie zebrać komórki z płytki, dodając 10 ml schłodzonego do temperatury lodowej DMEM zawierającego 10% FBS, przenieść pipetą do probówki stożkowej 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 min.</li>
 <li>Resuspendować osad w probówce stożkowej 50 ml w 25 ml schłodzonego do temperatury lodowej PBS (bez Ca i Mg) i przeprowadzić zliczenie.</li>
 <li>Wirować w celu ponownego zebrania osadu, a następnie resuspendować w schłodzonym do temperatury lodowej PBS do stężenia 106 komórek na ml (do iniekcji wewnątrzsercowych) lub 250 000 komórek/10 μl (do iniekcji wewnątrzpiszczelowych). Temperatura PBS jest istotna, aby zapobiec agregacji komórek i następczej embolii po iniekcji. Zawiesina komórkowa powinna pozostawać w lodzie podczas wykonywania iniekcji; komórki pozostają żywotne i nieagregowane przez 30 min. Choć dokładna liczba potrzebnych płytek zależy od badacza, zazwyczaj jedna płytka T-75 wystarcza dla 8-10 myszy.</li>
</ol>
3. Inokulacja wewnątrzsercowa
<ol>
 <li>Do tych eksperymentów wykorzystuje się samice myszy w wieku 4-6 tygodni (Foxn nu-/-: Harlan), choć w eksperymentach z ludzkimi komórkami nowotworowymi można stosować również inne myszy z niedoborami odporności (RAG1-/-, RAG2-/-, SCID, XID itd.).</li>
 <li>Myszy nude powinny być karmione dietą Teklad 2920x na 5-10 dni przed iniekcją, aby zmniejszyć śmiertelność wynikającą z procedury wstrzykiwania oraz ograniczyć fluorescencję tła w procedurach obrazowania (ponieważ karma jest wolna od lucerny).</li>
 <li>W przypadku stosowania myszy innych niż nu/nu, przed rozpoczęciem procedury należy usunąć sierść z brzusznej części jamy brzusznej poprzez golenie lub użycie preparatu Nair (według naszych doświadczeń Nair działa lepiej).</li>
 <li>Mysz należy znieczulić w komorze izolacyjnej przy użyciu waporyzatora izofluranu (2,5% Iso: 2-3 L/min O2) lub innej preferowanej metody znieczulenia (według naszych doświadczeń izofluran jest najlepiej tolerowany podczas inokulacji wewnątrzsercowych).</li>
 <li>Przenosi się pojedynczo każdą mysz do maski urządzenia do znieczulania wewnątrz wentylowanego kaptura ze stali nierdzewnej.</li>
 <li>Każdą mysz należy ułożyć na grzbiecie, klatką piersiową do góry.</li>
 <li>Klatkę piersiową należy przemyć tamponem lub roztworem 10% powidonu z jodem, a następnie 70% etanolem, powtarzając czynność 2 razy.</li>
 <li>Miejsce iniekcji na klatce piersiowej myszy należy zaznaczyć (używając sterylnego markera lub zaznaczając punkt nieco z boku, aby zachować sterylność miejsca wstrzyknięcia). Stosujemy oznaczenie w połowie odległości między wcięciem mostka a górną krawędzią wyrostka mieczowatego, lekko na lewo (anatomicznie) od mostka. Do strzykawki insulinowej 300 μl 28 g ½ należy nabrać małą pęcherzyk powietrza, aby stworzyć przestrzeń między tłokiem a meniskiem (co jest istotne dla obserwacji tętna serca), a następnie nabrać 100 μl zawiesiny komórek.</li>
 <li>Igłę należy trzymać pionowo. Napinając skórę myszy drugą ręką, należy wprowadzić igłę.</li>
 <li>Prawidłowe wprowadzenie igły do lewej komory serca powinno skutkować wyraźnym, jasnoczerwonym impulsem krwi w strzykawce. Na tej głębokości należy ostrożnie docisnąć tłok strzykawki (objętość 100 μl), unikając znaczących ruchów igły, aby nie przebić serca i nie wylać komórek do jamy klatki piersiowej.</li>
 <li>Po wstrzyknięciu komórek należy lekko cofnąć tłok, aby wytworzyć niewielkie podciśnienie, co ograniczy wyciekanie komórek do jamy klatki piersiowej.</li>
 <li>Igłę należy wyciągnąć bezpośrednio z klatki piersiowej, dbając o to, aby nie przechylać jej podczas usuwania, co mogłoby rozerwać ścianę serca i spowodować krwawienie.</li>
 <li>Należy delikatnie ucisnąć klatkę piersiową w miejscu iniekcji, aby zahamować krwawienie.</li>
 <li>Mysz należy wyjąć z maski i kontynuować lekki ucisk przez około 1 min.</li>
 <li>Mysz należy przenieść na matę grzewczą do czasu odzyskania pełnej świadomości.</li>
 <li>Jeśli po wybudzeniu mysz zaczyna wirować lub drżeć, prawdopodobną przyczyną jest zator. Należy wstrzyknąć myszy doprzebytonowo 80-120 mg/kg ketaminy, aby zwiększyć przepływ krwi i rzut serca przy jednoczesnym zmniejszeniu oporu naczyniowego. Powinno to pomóc myszy w usunięciu skrzepu. W takiej sytuacji zaleca się wymianę preparatu komórkowego, ponieważ świadczy to o agregacji komórek. Wymieniamy preparaty komórkowe mniej więcej co 8 myszy lub co 30 min.</li>
</ol>
4. Wewnątrzpiszczelowe
<ol>
 <li>Bezpośrednio przed zabiegiem wstrzyknąć myszy Buprenex (0.1 mg/kg) lub inny zatwierdzony lek przeciwbólowy.</li>
 <li>Uśpić mysz przy użyciu izofluranu, następnie przenieść pod maskę nosową i podtrzymać znieczulenie.</li>
 <li>Oczyścić obie kończyny za pomocą tamponu lub roztworu 10% powidonu z jodem, a następnie etanolu, powtarzając czynność 2 razy. Jeśli kończyny są owłosione, należy je depilować (używając preparatu Nair lub podobnego) przed oczyszczaniem.</li>
 <li>Delikatnie uchwycić kostkę boczną, kostkę przyśrodkową i dolną połowę piszczeli palcem wskazującym i kciukiem, a następnie zgiąć nogę (połączenie zgięcia i rotacji bocznej w taki sposób, aby kolano było widoczne i dostępne).</li>
 <li>Zwilżyć skórę 70% EtOH, aby zwiększyć widoczność leżącego pod nią więzadła rzepki, które powinno być widoczne jako wyraźna, gruba, biała linia. Trzymając mocno kostkę/nogę myszy, wprowadzić igłę 28g ½ pod rzepkę, przez środek więzadła rzepki do przedniej części obszaru międzykłykciowego w górnej części piszczeli.</li>
 <li>Podczas wprowadzania igły do piszczeli ostrożnie przeprowadzić ją przez płytkę wzrostu, stosując stały, mocny nacisk z lekkim ruchem świdrującym.</li>
 <li>Po przebiciu płytki wzrostu piszczeli opór podczas wprowadzania igły znacznie zmaleje.</li>
 <li>Zastosować delikatny ruch boczny igły, aby upewnić się, że znajduje się ona w piszczeli i przeszła przez płytkę wzrostu. Jeśli igła znajduje się w odpowiednim miejscu w piszczeli, ruch ten będzie ograniczony.</li>
 <li>Powoli nacisnąć tłok, aby wstrzyknąć 10 μl zawiesiny komórkowej. Na tym etapie opór powinien być znikomy lub żaden.</li>
 <li>Powoli wyciągnąć igłę.</li>
 <li>Postępując zgodnie z tą samą procedurą, przejść do następnej nogi i wstrzyknąć 10 μl PBS.</li>
 <li>Wybudzić mysz z narkozy i trzymać na podgrzewaczce aż do pełnego odzyskania sprawności.</li>
 <li>Monitorować myszy przez następne 24 hr i wstrzykiwać dodatkowy Buprenex co 12 hr, jeśli zwierzęta nadal będą wykazywać oznaki stresu.</li>
</ol>
5. Obrazowanie w serii czasowej
<ol>
 <li>Obrazowanie lucyferazowe: W stosownych przypadkach obrazowanie lucyferazowe należy stosować począwszy od 7. dnia po inokulacji komórek nowotworowych (choć w większości modeli przerzutów do kości sygnał jest wykrywalny bliżej 14. dnia). Myszy podaje się dootrzewnowo 150 mg/kg lucyferyny, następnie zwierzęta są znieczulane i poddawane obrazowaniu 8 min po iniekcji przy użyciu systemu IVIS 8.</li>
 <li>Obrazowanie GFP: Zazwyczaj guzy wykazujące ekspresję GFP stają się wykrywalne około 10–14. dnia w przypadku iniekcji do piszczeli oraz 16–21. dnia w eksperymentach z iniekcją wewnątrzsercową przy użyciu systemu obrazowania Maestro (CRi) 9. W skrócie, myszy są znieczulane izofluranem (3%) i utrzymywane w znieczuleniu poprzez stożek nosowy w komorze obrazowania Maestro. Dla naszych komórek wykazujących ekspresję eGFP stosujemy zestaw filtrów niebieskich (pobudzenie 498/emisja 515 dla eGFP) przy czasie ekspozycji 500 ms w krokach 10 nm.</li>
 <li>Faxitron (RTG): Zdjęcia rentgenowskie wykonuje się co tydzień, zaczynając od okresu między 7. a 14. dniem. Zmiany będą widoczne w modelu wewnątrzsercowym w 21. dniu, a tydzień wcześniej w przypadku iniekcji do piszczeli3. Nasze dane radiologiczne ex vivo i in vivo zostały pozyskane przy użyciu urządzenia Faxitron LX-60 przy 35 kV i czasie ekspozycji 8 sekund.</li>
 <li>Inne metody obrazowania: Metody obrazowania będą całkowicie zależne od specyfiki badania. Oprócz powyższych metod, cenne informacje może dostarczyć obrazowanie żywych zwierząt w oparciu o mikrotomografię komputerową 3D (μCT), mikrotomografię emisyjną pozytonów (μPET) oraz inne modalności 10,11.</li>
</ol>
6. Uśmiercenie myszy
<ol>
 <li>Każdy model charakteryzuje się nieco innym przebiegiem czasowym. W przypadku komórek MDA-MB-231 myszy zazwyczaj zapadają na kacheksję lub stają się paraplegiczne między 21. a 35. dniem, zazwyczaj około 28. dnia (myszy po wstrzyknięciu IT między 21. a 28. dniem).</li>
 <li>Gdy u kilku myszy rozwiną się zmiany, które zaczynają przebijać się przez kość korową, wystąpi paraplegia lub nastąpi utrata od 10-20% masy ciała, należy uśmiercić wszystkie myszy w badaniu poprzez przedawkowanie ketaminy/ksylazyny z dyslokacją szyjną (lub inną metodą zatwierdzoną przez IACUC).</li>
 <li>Należy pobrać kości niezbędne do dalszych badań i przechowywać je w buforowanym 4% formalinie.</li>
 <li>Myszy z guzami w klatce piersiowej są oznaką błędnego wstrzyknięcia i powinny zostać wykluczone z badania.</li>
</ol>
7. Analiza Ex Vivo
<ol>
 <li>μCT: skanowanie w 70% EtOH umożliwia pomiar parametrów strukturalnych i histologicznych na tym samym preparacie kostnym.</li>
 <li>Wykonaj konturowanie i analizę zgodnie z indywidualnym planem eksperymentalnym i dostępnym sprzętem10. Nasze dane uzyskano za pomocą Scanco μCT 40 przy rozdzielczości 12 μM.</li>
 <li>Histo-morfometria: Przetwórz preparaty przy użyciu preferowanych metod histologicznych i zabarw hematoksyliną i eozyną7</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Po inokulacji komórek nowotworowych dojamionowo lub doszpikowo do kości piszczelowej (Rysunek 1), myszy są monitorowane co tydzień za pomocą radiografii oraz fluorescencji (lub luminescencji). Zmiany stają się zazwyczaj widoczne w promieniach rentgenowskich między 2. a 3. tygodniem, natomiast w fluorescencji i luminescencji mogą być widoczne już w 2. tygodniu, w zależności od modelu (Rysunek 2). Zmiany są widoczne jako ciemne ubytki w kości i z czasem stają się bardziej wyraźne (Rysunek 3). Ilość zmian określono za pomocą analizy radiogramów w programie Metamorph, a fluorescencję za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy obrazowania Maestro (CRi). W miarę wzrostu zmian u myszy często rozwija się kacheksja. Eutanazja jest wymagana, gdy myszy utracą od 10-20% początkowej masy ciała. Stan myszy może zmieniać się gwałtownie i musi być monitorowany wielokrotnie w ciągu dnia. Między 3. a 4. tygodniem myszy zaczęły ciągnąć jedną lub obie kończyny tylne, po czym dokonano eutanazji wszystkich zwierząt w badaniu. Obrazy wykonano przed eutanazją. Po przedawkowaniu znieczulenia pobrano krew w celu pomiaru markerów przebudowy kości lub innych czynników. Po zwichnięciu stawu obręczy karkowej usunięto skórę myszy, a kości wycięto i oczyszczono do obrazowania ex vivo (Rysunek 3), co pozwala na wizualizację ognisk nowotworowych co najmniej 7 dni wcześniej niż techniki obrazowania in vivo. Po zakończeniu obrazowania kości umieszczono w oznakowanych kasetach i przechowywano w formalinie w celu utrwalenia i dalszego przetwarzania histologicznego lub analizy μCT. Na próbkach wykonano histomorfometrię w celu określenia obciążenia nowotworowego oraz BV/TV, a następnie przeprowadzono μCT kości piszczelowej, aby określić stopień destrukcji kości (Rysunek 4).
<img alt="Schematy rentgenowskie i anatomiczne przedstawiające rozmieszczenie guza i wprowadzenie igły w celu wykonania biopsji celowanej." src="/files/ftp_upload/4260/4260fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Prawidłowe rozmieszczenie miejsca iniekcji. Radiograficzny widok brzuszny (A) klatki piersiowej dorosłej myszy przedstawiający prawidłowe umieszczenie igły w 4tej przestrzeni międzyżebrowej i w lewej komorze w celu inokulacji wewnątrzsercowej. Punkty orientacyjne anatomiczne zaznaczono poziomymi liniami przerywanymi na mostku (obrysowanym na biało). Na skórze myszy punktami orientacyjnymi są wcięcie mostka oraz wyrostek mieczowaty, a igłę wprowadza się nieco na lewo od mostka. Radiograficzny widok brzuszny (B) nogi dorosłej myszy przedstawiający prawidłowe umieszczenie igły w bliższej części kości piszczelowej, wyrównanej pomiędzy kłykciami. Z perspektywy bocznej końcówka igły jest umieszczona za guzowatością piszczeli i głęboko względem płytki nasadowej. Idealne miejsce iniekcji zaznaczono białym okręgiem.
<img alt="Skanowanie kostne i obrazowanie fluorescencyjne wewnątrzpiszczelowe i wewnątrzsercowe; analiza wzrostu w ciągu 28 dni." src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Przebieg czasowy modeli przerzutów do kości. Progresja nowotworowej choroby kości przedstawiona na zdjęciach rentgenowskich i obrazach fluorescencyjnych GFP+ guzów in vivo po wstrzyknięciach wewnątrzpiszczelowych (A) oraz wewnątrzsercowych (B).
<img alt="Proces gojenia kości; obrazowanie fluorescencyjne; Maestro nad Faxitron; dni 0-28; analiza biologiczna." src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Przebieg czasowy modelu wewnątrzsercowego MDA-MB-231. Górny rząd: Obraz ex vivo pokazujący fluorescencję GFP w dniu 0, 14, 21 i 28 po wewnątrzsercowym wstrzyknięciu MDA-MB-231. Należy zauważyć, że ogniska nowotworowe w dniu 14 są widoczne ex vivo dopiero po usunięciu tkanek miękkich. Dolny rząd: Radiograficzne obrazy ex vivo tych samych kości udowych ilustrujące osteolityczne zmiany kostne. Należy zauważyć, że destrukcja kości zazwyczaj nie jest widoczna przed upływem 3 tygodni od wstrzyknięcia do serca.
<img alt="Analiza guza za pomocą obrazowania GFP, promieniowania rentgenowskiego, mikro-TK i histologii H&amp;E; badanie struktury kości." src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Kwantyfikacja progresji przerzutów do kości. Guz GFP+ zwizualizowany za pomocą obrazowania Maestro ex vivo kości piszczelowych myszy bez guza (A) oraz myszy 4 tygodnie po wewnątrzsercowym wstrzyknięciu subklonu MDA-MB-231 wykazującego ekspresję GFP (B). Ogniska nowotworowe korelują z obszarami destrukcji kości, co pokazano za pomocą Faxitron (D) w porównaniu do kości bez guza (C). Dane strukturalne i mineralne kości z pomiarów mikro-TK przedstawiono jako obrazy 3D zdrowej kości (E) oraz kości z guzem (F), gdzie obszary destrukcji kości są widoczne jako puste przestrzenie. Dalsze szczegóły kości i guza widoczne są na odpowiadających im przekrojach histologicznych barwionych H&amp;E (G i H).

<ol><li>Sterling, J. A., Edwards, J. R., Martin, T. J., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+biology+of+bone+metastasis%3A+how+the+skeleton+affects+tumor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Advances in the biology of bone metastasis: how the skeleton affects tumor behavior.</a> Bone. 48, 6-15 (2011).</li>
<li>Yoneda, T., Sasaki, A., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteolytic+bone+metastasis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Osteolytic bone metastasis in breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 32, 73-84 (1994).</li>
<li>Johnson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+promotion+of+Gli2-induced+expression+of+parathyroid+hormone-related+protein%2C+an+important+osteolytic+factor+in+bone+metastasis%2C+is+independent+of+canonical+Hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-beta promotion of Gli2-induced expression of parathyroid hormone-related protein, an important osteolytic factor in bone metastasis, is independent of canonical Hedgehog signaling.</a> Cancer Res. 71, 822-831 (2011).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TGF-beta+Responsiveness+in+Prostate+Stromal+Cells+Alters+Chemokine+Levels+and+Facilitates+the+Development+of+Mixed+Osteoblastic%2FOsteolytic+Bone+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lesions.</a> Mol. Cancer Res. , (2012).</li>
<li>Yoneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+bisphosphonate+on+bone+metastasis+in+animal+models+of+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Actions of bisphosphonate on bone metastasis in animal models of breast carcinoma.</a> Cancer. 88, 2979-2988 (2000).</li>
<li>Rose, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol. Cancer Res. 5, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hedgehog+signaling+molecule+Gli2+induces+parathyroid+hormone-related+peptide+expression+and+osteolysis+in+metastatic+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The hedgehog signaling molecule Gli2 induces parathyroid hormone-related peptide expression and osteolysis in metastatic human breast cancer cells.</a> Cancer Res. 66, 7548-7553 (2006).</li>
<li>Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+alpha4beta1-positive+osteoclast+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20, 701-714 (2011).</li>
<li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+myeloma+in+skeleton+of+mice+by+whole-body+optical+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Detection of myeloma in skeleton of mice by whole-body optical fluorescence imaging.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1701-1708 (2007).</li>
<li>Johnson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+live+animal+micro-CT+allows+for+quantitative+analysis+of+tumor-induced+bone+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Longitudinal live animal micro-CT allows for quantitative analysis of tumor-induced bone destruction.</a> Bone. 48, 141-151 (2011).</li>
<li>Sterling, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSterling%2C+J+%22Imaging+Techniques+for+the+Detection+and+Examination+of+Breast+Cancer+Metastasis+to+Bone%22">Imaging Techniques for the Detection and Examination of Breast Cancer Metastasis to Bone</a>. 46, Nova Science Publishers. (2011).</li>
<li>Steinbauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo%2C+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li>
<li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effects+of+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+on+osteolysis+and+tumor+burden+in+the+murine+5TGM1+model+of+myeloma+bone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease.</a> Blood. 102, 311-319 (2003).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Badania nad chorobami kości indukowanymi przez nowotwory opierają się na kilku modelach zwierzęcych, z których dwoma najczęściej stosowanymi są inokulacje wewnątrzsercowe i wewnątrzpiszczelowe. W wielu przypadkach inokulacja wewnątrzsercowa jest najlepszą opcją do badania przerzutów do kości; nie odzwierciedla ona jednak pełnego procesu metastazy, dlatego w tym celu najlepiej stosować iniekcje do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego lub inne iniekcje ortotopowe. W większości badań z wykorzystaniem ludzkich komórek kom...

<table><tbody><tr><td>Ludzkie komórki raka piersi MDA-MB-231</td><td>Pierwotnie ATCC – klonowane i selekcjonowane wewnętrznie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Mediatech Inc</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlas Biological</td><td>F-0050a</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>GIBCO</td><td>15400</td><td></td></tr><tr><td>Faxitron</td><td>Faxitron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maestro</td><td>CRi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner &amp;mu;CT</td><td>Scanco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myszy nago athymiczne</td><td>Harlan</td><td>Fox nu -/-</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe (300 &amp;mu;l, 28,5 g)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309300</td><td></td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Caliper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naświetlona dieta dla gryzoni</td><td>Teklad</td><td>2920x</td><td></td></tr></tbody></table>

modele przerzutów do kości

Models of Bone Metastasis

Przerzuty do kości są częstym zjawiskiem w kilku typach nowotworów złośliwych, w tym w raku piersi, prostaty i płuc. Po uplasowaniu się w kościach, guzy odpowiadają za znaczną chorobowość i śmiertelność1. Istnieje zatem ogromna potrzeba zrozumienia mechanizmów molekularnych kontrolujących powstawanie, wzrost i aktywność guzów w tkance kostnej. W celu badania tych zdarzeń opracowano kilka modeli in vivo, z których każdy posiada specyficzne zalety i ograniczenia. Najczęściej stosowany model wykorzystuje inokulację wewnątrzsercową komórek nowotworowych bezpośrednio do krwiobiegu tętniczego myszy BalbC beztymusowych (nude). Procedurę tę można zastosować do wielu różnych typów guzów (w tym raka prostaty PC-3, raka płuc oraz guzów tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy); w niniejszym opracowaniu skupimy się jednak na modelu raka piersi MDA-MB-231. W tym modelu wykorzystujemy klon o wysokiej selektywności względem kości, pierwotnie wyizolowany w grupie dr Mundy'ego w San Antonio2, który został następnie przetransfekowany w celu ekspresji GFP i ponownie wyklonowany przez naszą grupę3. Klon ten jest wariantem przerzutowym do kości o wysokim stopniu osteotropizmu i bardzo niskiej częstości przerzutów do płuc, wątroby lub nadnerczy. Choć iniekcje wewnątrzsercowe są najczęściej stosowane w badaniach nad przerzutami do kości2, w pewnych przypadkach bardziej odpowiednie są iniekcje wewnątrzpiszczelowe4 lub do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego. Iniekcje wewnątrzsercowe wykonuje się zazwyczaj przy użyciu ludzkich komórek nowotworowych w celu monitorowania późniejszych etapów przerzutowania, a konkretnie zdolności komórek rakowych do zatrzymania się w kości, przeżycia, proliferacji i tworzenia guzów, które rozwijają się w nowotworową chorobę kości. Iniekcje wewnątrzpiszczelowe wykonuje się, jeśli celem jest zbadanie relacji między komórkami rakowymi a kością po tym, jak guz przemieścił się do kości, co mniej więcej odpowiada ugruntowanej przerzutowej chorobie kości. Żaden z tych modeli nie odtwarza wczesnych etapów procesu przerzutowania poprzedzających zator i wniknięcie komórek nowotworowych do krwiobiegu. Jeśli celem jest monitorowanie wzrostu guza pierwotnego lub przerzutowania z miejsca pierwotnego do kości, zazwyczaj preferowane są inokulacje do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego; jednak bardzo niewiele linii komórek nowotworowych konsekwentnie przerzuca się do kości z miejsca pierwotnego, z wyjątkiem klonów 4T1 o preferencji kostnej, pochodzących z raka gruczołu mlekowego myszy 5,6.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury inokulacji oraz podkreśla kluczowe etapy analiz prowadzonych po inokulacji. W szczególności obejmuje on hodowlę komórkową, procedury inokulacji komórek nowotworowych drogą wewnątrzsercową i wewnątrzpiszczelową, a także zwięzłe informacje dotyczące cotygodniowego monitorowania za pomocą promieni rentgenowskich, fluorescencji oraz analiz histomorfometrycznych.

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do badania przerzutów nowotworowych do kości. W niniejszym protokole opiszemy dwie powszechne metody inokulacji guza w badaniach nad przerzutami do kości oraz krótko omówimy niektóre z analiz stosowanych do monitorowania i ilościowego określania tych modeli.

Modele przerzutów do kości

Przerzuty do kości są częstym zjawiskiem w kilku typach nowotworów złośliwych, w tym w raku piersi, prostaty i płuca. Po utrwaleniu się w kościach, guzy odpowiadają za...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wstrzyknięcie komórek nowotworowych w sposób, który wywoła ich wzrost w kości i następczą destrukcję tkanki kostnej. Osiąga się to poprzez uprzednie zawieszenie komórek nowotworowych w zimnym PBS i umieszczenie ich na lodzie. Następnie odpowiednią liczbę komórek wstrzykuje się do lewej komory serca lub do kości piszczelowej znieczulonej myszy.Następnie wzrost guza kostnego oraz parametry kostne są monitorowane wzdłużnie za pomocą wielu technik obrazowania. Na koniec przeprowadzana jest ilościowa ocena parametrów guza i kości w punkcie końcowym. Ostatecznie stosuje się kombinację fluorescencji lub luminescencji in vivo i ex vivo, radiografii 2D oraz obrazowania 3D.MikrotK oraz histologia są wykorzystywane do obrazowania wzrostu guza oraz zmian w mikrośrodowisku kostnym na poziomie komórkowym i strukturalnym. Metody te mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów nowotworowych, takie jak czynniki w kości umożliwiające kolonizację przerzutową raka piersi i prostaty. Przygotowanie komórek zaprezentuje Alisa Merkel, asystentka badawcza w moim laboratorium; utrzymuj komórki przez mniej niż jeden tydzień.Klon linii MDA-MB-231 z oznakowaniem GFP hodowano w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS oraz 0,1 mg/ml penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37°C w atmosferze 5-8% CO2. Komórki pasażowano przy 80-90% konfluencji, stosując rozcieńczenie od 1:10. W celu przygotowania komórek do szczepienia, przy 80-90% konfluencji, poddano je trypsynizacji przy użyciu 10 ml 0,15% trypsyny-EDTA.Przenieść natychmiast komórki do probówki stożkowatej o pojemności 50 ml z lodowatym DMEM z dodatkiem 10% FBS i wirować przez pięć minut. Resuspendować osad w probówce stożkowatej o pojemności 50 ml w 25 ml lodowatego PBS bez wapnia i magnezu, a następnie policzyć komórki. Przeszczepić komórki i resuspendować w lodowatym PBS do stężenia 10⁶ komórek/ml dla inokulacji wewnątrzsercowej oraz 250 000 komórek/ml dla wstrzyknięcia wewnątrzpiszczelowego.W eksperymentach tych wykorzystuje się samice myszy z niedoborem odporności w wieku od czterech do sześciu tygodni, które przez okres od pięciu do 10 dni przed iniekcją były karmione dietą Tela 29 20 x. Po znieczuleniu myszy w komorze przy użyciu 2,5% isofluorenu, należy przenieść zwierzę pod dygestorium do maski nosowej i ułożyć je na grzbiecie. Klatkę piersiową należy przemyć 10% roztworem powidonu jodowego, a następnie 70% Ethanolem.Zaznacz miejsce wstrzyknięcia na klatce piersiowej myszy w połowie odległości między wcięciem mostka a górną krawędzią wyrostka mieczowatego, lekko po lewej stronie mostka. Następnie, używając strzykawki insulinowej o pojemności 300 µL z igłą 28G o długości 1/2 cala, nabierz niewielką pęcherzykiem powietrza, aby stworzyć przestrzeń między tłokiem a meniskiem, a następnie pobierz 100 µL zawiesiny komórkowej, trzymając skórę myszy w naciągu jedną ręką.Utrzymaj igłę pionowo; prawidłowe wprowadzenie jej do lewej komory serca powinno spowodować pojawienie się w strzykawce wyraźnego, jasnoczerwonego impulsu krwi. Na tej głębokości ostrożnie wciśnij tłok strzykawki, unikając znaczących ruchów igły, aby nie przebić serca i nie doprowadzić do wycieku komórek do jamy klatki piersiowej. Aby ograniczyć ściekanie komórek do jamy klatki piersiowej, lekko pociągnij tłok do góry, aby wytworzyć niewielkie podciśnienie.Następnie wyciągnij igłę bezpośrednio z klatki piersiowej, uważając, aby nie przechylić jej podczas usuwania, co mogłoby doprowadzić do przerwania osierdzia i wykrwawienia. Przez około jedną minutę wywieraj lekki nacisk w miejscu wstrzyknięcia, aby ograniczyć krwawienie. Po zdjęciu stożka nosowego przenieś mysz na podkładkę grzewczą, aż odzyska pełną przytomność.Bezpośrednio przed procedurą wewnątrzpiszczelową podaj myszy buprenorfinę. Po znieczuleniu myszy i umieszczeniu jej w stożku nosowym, oczyść obie kończyny za pomocą 10% jodopowidonu, a następnie etanolu, wykonując ruchy czterema palcami i kciukiem.Delikatnie chwyć kostkę boczną, kostkę przyśrodkową oraz dolną połowę kości piszczelowej. Następnie zegnij nogę tak, aby kolano było widoczne i dostępne. Używając 70% etanolu, zwilż skórę w celu zwiększenia widoczności leżącego pod nią więzadła rzepki, które powinno być widoczne jako wyraźna, gruba biała linia podczas mocnego trzymania stawu skokowego.Wprowadź igłę 28G o długości pół cala pod rzepkę, przez środek więzadła rzepki, do przedniego obszaru międzykłykciowego w górnej części piszczeli. Stosując stały, mocny nacisk z lekkim ruchem wiercącym, ostrożnie przeprowadź igłę przez płytkę wzrostową. Po przebiciu się przez płytkę wzrostową piszczeli opór stawiany igle wyraźnie zmaleje.Wykonaj delikatny ruch igły w kierunku bocznym, aby upewnić się, że znajduje się ona w kości piszczelowej i przeszła przez płytkę wzrostu. Ruch będzie ograniczony, jeśli igła znajduje się w odpowiednim miejscu w obrębie kości piszczelowej. Powoli naciśnij tłok, aby wstrzyknąć 10 µL zawiesiny komórek.W tym momencie nie powinno być odczuwalnego oporu lub powinno być on znikome. Następnie powoli wyciągnij igłę. Wybudź mysz z anestezji i trzymaj ją na podgrzewaczu, aż do momentu pełnego wybudzenia.Monitoruj mysz dwa do trzech razy w tygodniu. U znieczulonych myszy przeprowadza się różne techniki obrazowania, takie jak lucyferaza, fluorescencja GFP i promieniowanie rentgenowskie. Fluorescencja wskazuje obszary guza.Skan estron jest wykorzystywany do lokalizacji zmian. Zmiany te korelują z obrazami fluorescencyjnymi. Dalsze szczegóły dotyczące technik obrazowania znajdują się w pisemnej części niniejszego protokołu.Od 21 do 35 dni po wstrzyknięciu. Uśmierć myszy metodą zatwierdzoną przez IACUC i przechowuj kości w 4% Formalinie; przeprowadź analizę ex vivo za pomocą mikro-CT oraz analizę histomorfologiczną z barwieniem hematyksyliną i eozyną (H&amp;E) oraz barwieniem DSN na wyizolowanych kościach. Szczegóły znajdują się w protokole pisemnym dotyczącym inokulacji komórek nowotworowych drogą wewnątrzsercową lub wewnątrzpiszczelową.Myszy są monitorowane co tydzień za pomocą radiografii oraz fluorescencji lub luminescencji. Zmiany zwykle stają się widoczne w promieniach rentgenowskich między drugim a trzecim tygodniem. Chociaż mogą być widoczne w fluorescencji i luminescencji już w drugim tygodniu, w zależności od modelu pokazanego tutaj, zmiany są widoczne jako ciemne ubytki w kości i mogą z czasem stawać się bardziej wyraźne. Zmiany ilościowo określono za pomocą analizy radiogramów i obrazów fluorescencyjnych w programie Metamorph.Ilościowo określono przy użyciu oprogramowania do akwizycji i analizy obrazowania Maestro. Na tej rycinie utrata kości została określona ilościowo za pomocą analizy mikro-CT. Dane o strukturze i mineralizacji kości z pomiarów mikro-CT przedstawiono jako obrazy 3D zdrowej kości oraz kości z nowotworem, gdzie obszary destrukcji kości widoczne są jako puste przestrzenie.Następnie w próbkach przeprowadzono analizę histomorfometryczną w celu określenia obciążenia nowotworem oraz stosunku objętości kości do objętości tkanki. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest zachowanie cierpliwości i staranne ułożenie każdej myszy oraz uważne monitorowanie zwierząt. Jeśli myszy zaczną ginąć, prawdopodobnie jest to spowodowane agregacją komórek i należy niezwłocznie przygotować nową zawiesinę komórek.Najgorszym rozwiązaniem jest pośpiech przy wykonywaniu procedur lub uleganie frustracji. Pamiętaj, że wraz z praktyką i czasem będziesz działać coraz sprawniej i szybciej. Opracowanie tych technik otworzyło badaczom nowotworów drogę do badania przerzutów do kości in vivo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W patogenezie przerzutów do kości angiogeneza jest procesem kluczowym, w związku z czym stanowi cel obrazowania i terapii. W niniejszej pracy przedstawiamy szczurzy model miejscowych przerzutów raka piersi do kości oraz opisujemy strategie nieinwazyjnego obrazowania angiogenezy in vivo z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultrasonografii.

Wielomodalne obrazowanie angiogenezy w modelu przerzutów raka piersi do kości u szczurów nago z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultradźwięków

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Ten manuskrypt zawiera szczegółową procedurę wstrzykiwania do tętnicy biodrowej (IIA), techniki dostarczania komórek rakowych specyficznie do tkanek kończyn tylnych, w tym kości, w celu ustalenia eksperymentalnych przerzutów do kości. Chociaż początkowo ustalono go na podstawie modeli guzów piersi, protokół ten można łatwo rozszerzyć na inne typy raka.

Iniekcja do tętnicy biodrowej w celu skutecznego i selektywnego modelowania mikroskopijnych przerzutów do kości

Bezpośrednie wstrzykiwanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia rakowego (EV) prowadzi do przeprogramowania szpiku kostnego, co wspomaga postęp nowotworu; jednak nie jest jasne, które komórki pośredniczą w tym efekcie. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół badania interakcji nowotworowo-mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) za pośrednictwem EV in vivo, ujawniając kluczową rolę MSC edukowanych przez EV w przerzutach.

Przedkliniczny mysi model kostniakomięsaka w celu zdefiniowania komunikacji za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych między guzem a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.

Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Tutaj prezentujemy protokół dosercowego wstrzykiwania ludzkich komórek raka prostaty w celu wygenerowania mysiego modelu ze zmianami przerzutowymi do kości.

Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości

Poznaj metody inokulacji komórek nowotworowych u myszy w celu badania przerzutów do kości. Protokół obejmuje wstrzyknięcie do lewej komory serca lub kości piszczelowej oraz długoterminowe monitorowanie wzrostu guza za pomocą technik obrazowania.

Modele przerzutów do kości

Przeglądaj więcej filmów