Modele przerzutów do kości

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wstrzyknięcie komórek nowotworowych w sposób, który wywoła ich wzrost w kości oraz późniejszą destrukcję tkanki kostnej. Osiąga się to poprzez uprzednie zawieszenie komórek nowotworowych w zimnym PBS i umieszczenie ich w lodzie. Następnie odpowiednią liczbę komórek wstrzykuje się do lewej komory serca lub do kości piszczelowej znieczuplonej myszy.

Następnie wzrost guza kostnego oraz parametry kości są monitorowane podłużnie za pomocą wielu technik obrazowania. Na koniec przeprowadza się końcową kwantyfikację parametrów guza i kości. Ostatecznie zastosowano kombinację fluorescencji lub luminescencji in vivo i ex vivo, radiografii 2D oraz obrazowania 3D.

Mikro-CT i histologia są wykorzystywane do obrazowania wzrostu guza oraz zmian w mikrośrodowisku kostnym na poziomie komórkowym i strukturalnym. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutowania nowotworów, takie jak czynniki w kości umożliwiające kolonizację przerzutową raka piersi i prostaty. Przygotowanie komórek zaprezentuje Alisa Merkel, asystentka badawcza w moim laboratorium, która utrzymuje hodowle komórkowe przez okres krótszy niż jeden tydzień.

Klon M-D-A-M-B 2 3 1 z tagiem GFP hodowano w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS oraz 0,1 mg/mL penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5-8% CO2. Komórki pasażowano przy 80-90% konfluencji w rozcieńczeniu od 1:10. W celu przygotowania komórek do szczepienia, przy 80-90% konfluencji, poddano je trypsynizacji przy użyciu 10 mL 0,15% trypsyny-EDTA.

Przenieś komórki do 50 ml probówki stożkowej za pomocą lodowatego DMEM z 10% FBS i wiruj przez pięć minut. Resuspenduj osad w 50 ml probówce stożkowej w 25 ml lodowatego PBS bez wapnia i magnezu i policz komórki, a następnie ponownie spionizuj komórki i resuspenduj w lodowatym PBS do stężenia 10⁶ komórek/ml dla inokulacji wewnątrzsercowej oraz 250 000 komórek/ml dla iniekcji wewnątrzpiszczelowej.

Do tych eksperymentów wykorzystuje się samice myszy z upośledzoną odpornością w wieku od czterech do sześciu tygodni, które otrzymywały dietę Tela 29 20 x na pięć do 10 dni przed iniekcją. Po znieczuleniu myszy w komorze 2,5% isofluranem, przenieś zwierzę pod wentylowany dygestorium do maski nosowej i ułóż je na grzbiecie. Do przemycia klatki piersiowej użyj 10% roztworu jodopowidonu, a następnie 70% etanolu.

Zaznacz miejsce wstrzyknięcia na klatce piersiowej myszy, w połowie odległości między wcięciem jagzylnym a górną krawędzią wyrostka mieczykowatego, nieco na lewo od mostka. Następnie, używając strzykawki insulinowej o pojemności 300 µL z igłą 28 G o długości 1/2 cala, nabierz niewielką pęcherzykiem powietrza, aby stworzyć przestrzeń między tłokiem a meniskiem, a następnie pobierz 100 µL zawiesiny komórek, trzymając skórę myszy w naciągu jedną ręką.

Utrzymując igłę w pozycji pionowej, wprowadź ją; prawidłowe wprowadzenie do lewej komory serca powinno skutkować wyraźnym, jasnoczerwonym pulsem krwi w strzykawce. Na tej głębokości ostrożnie naciśnij tłok strzykawki, unikając znaczącego ruchu igły, aby nie przebić serca i nie rozlać komórek do jamy klatki piersiowej. Aby ograniczyć wyciekanie komórek do jamy klatki piersiowej, lekko pociągnij tłok do góry, aby wytworzyć niewielkie podciśnienie.

Następnie wyciągnij igłę bezpośrednio z klatki piersiowej, dbając o to, aby nie przechylić jej podczas usuwania, co mogłoby doprowadzić do przerwania osierdzia i spowodować krwawienie. Przez około jedną minutę wywieraj delikatny nacisk w miejscu wstrzyknięcia, aby ograniczyć krwawienie. Po zdjęciu stożka nosowego przenieś mysz na podkładkę grzewczą, aż odzyska pełną przytomność.

Bezpośrednio przed procedurą wewnątrzpiszczelową wstrzyknij myszy buprenorfinę. Po znieczuleniu myszy i umieszczeniu jej w stożku nosowym, oczyść obie kończyny za pomocą 10% jodopowidonu, a następnie etanolu, wykonując ruchy czterema palcami i kciukiem.

Delikatnie chwyć kostkę boczną, kostkę przyśrodkową oraz dolną połowę piszczeli. Następnie zegnij nogę tak, aby kolano było widoczne i dostępne. Za pomocą 70% etanolu zwilż skórę, aby zwiększyć widoczność leżącego pod nią więzadła rzepki, które przy mocnym uchwycie kostki powinno być widoczne jako wyraźna, gruba biała linia.

Wprowadź igłę 28G o długości pół cala pod rzepkę, przechodząc przez środek więzadła rzepki, do przedniego obszaru międzykłykciowego w górnej części piszczeli. Stosując stały, mocny nacisk z lekkim ruchem wiercącym, ostrożnie poprowadź igłę przez płytkę wzrostu. Po przebiciu płytki wzrostu piszczeli opór stawiany igle wyraźnie zmaleje.

Wykonaj delikatny ruch igły na boki, aby upewnić się, że znajduje się ona w kości piszczelowej i przeszła przez płytkę wzrostu. Ruch będzie ograniczony, jeśli igła znajduje się w odpowiednim miejscu wewnątrz kości piszczelowej. Powoli naciśnij tłok, aby wstrzyknąć 10 µL roztworu komórek.

Na tym etapie nie powinno być odczuwalnego oporu lub powinno być on minimalne. Następnie powoli wyjmij igłę. Wybudź mysz z narkozy i trzymaj ją na podgrzewaczu, aż do pełnego odzyskania sprawności.

Monitoruj mysz dwa do trzech razy w tygodniu. U znieczulonych myszy przeprowadza się różne techniki obrazowania, takie jak lucyferaza, fluorescencja GFP oraz promieniowanie rentgenowskie. Fluorescencja wskazuje obszary guza.

Skan estron jest wykorzystywany do lokalizacji zmian chorobowych. Zmiany te korelują z obrazami fluorescencyjnymi. Więcej szczegółów na temat technik obrazowania znajduje się w części pisemnej niniejszego protokołu.

Od 21 do 35 dni po wstrzyknięciu. Uśmiercić myszy metodą zatwierdzoną przez IACUC i przechowywać kości w 4% formalinie; przeprowadzić analizę ex vivo za pomocą mikro-CT oraz histomorfometrii z barwieniem hematoksyliną i eozyną oraz barwieniem DSN na wyizolowanych kościach. Szczegóły znajdują się w protokole pisemnym dotyczącym inokulacji komórek nowotworowych drogą wewnątrzsercową lub wewnątrzpiszczelową.

Myszach monitoruje się co tydzień za pomocą radiografii oraz fluorescencji lub luminescencji. Zmiany chorobowe stają się zazwyczaj widoczne w badaniu RTG między drugim a trzecim tygodniem. Choć w zależności od modelu mogą być widoczne w fluorescencji i luminescencji już w drugim tygodniu, jak pokazano tutaj, zmiany objawiają się jako ciemne ubytki w kości i mogą z czasem stawać się bardziej wyraźne. Zmiany ilościowo oceniano przy użyciu analizy radiografii i fluorescencji w programie Metamorph.

Ilościowe oznaczenia przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów Maestro. Na tej rycinie ubytek kostny został określony za pomocą analizy mikro-CT. Dane dotyczące struktury i mineralizacji kości z pomiarów mikro-CT przedstawiono jako obrazy 3D zdrowej kości oraz kości z nowotworem, gdzie obszary destrukcji kostnej ukazane są jako puste przestrzenie.

Następnie przeprowadzono analizę histomorfometryczną próbek w celu określenia obciążenia nowotworowego oraz stosunku objętości kości do objętości tkanki. Podczas wykonywania tych procedur ważne jest zachowanie cierpliwości i staranne ułożenie każdej myszy oraz uważne monitorowanie zwierząt. Jeśli zaczną one ginąć, prawdopodobnie wynika to z agregacji komórek, w związku z czym należy niezwłocznie przygotować nową zawiesinę komórkową.

Najgorszym, co można zrobić, jest pośpieszne wykonywanie procedur lub uleganie frustracji. Pamiętaj, że wraz z większą praktyką i czasem będziesz robić to lepiej i szybciej. Po opracowaniu techniki te utorowały drogę badaczom nowotworów do badania przerzutów do kości in vivo.