Name: Wykrywanie i identyfikacja bakterii za pomocą czujników elektrochemicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metodę wykrywania bakterii za pomocą czujników elektrochemicznych opartą na hybrydyzacji rybosomalnego RNA. Ta technika umożliwia identyfikację drobnoustrojów w zaledwie 45 minut, znacznie skracając czas diagnostyki zakażeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsze badanie zostało sfinansowane z grantu Cooperative Agreement AI075565 (dla D.A.H.) przyznanego przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz z funduszu Wendy and Ken Ruby Fund for Excellence in Pediatric Urology Research. B.M.C. zajmuje stanowisko Judith and Robert Winston Chair in Pediatric Urology.

1. Funkcjonalizacja czujników elektrochemicznych
<ol>
	<li>Przygotować tiolowaną sondę wychwytującą o stężeniu 0,05 μM w 300 μM 1,6-heksanditiolu (HDT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 min. Inkubacja tiolowanej sondy wychwytującej z HDT zapewnia redukcję grupy tiolowej w sondzie, co prowadzi do uzyskania bardziej powtarzalnych wyników.</li>
	<li>Kierować strumień azotu na odsłonięte złote powierzchnie 16 matrycy czujników przez 5 s w celu usunięcia wilgoci i/lub cząstek.</li>
	<li>Nanieść 6 μl mieszaniny HDT i tiolowanej sondy wychwytującej na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników matrycy i przechowywać chipy w przykrytej płytce Petriego w temperaturze 4 °C przez noc. Tiolowane sondy wychwytujące wiążą się bezpośrednio z odsłoniętą elektrodą złotą, a HDT zapobiega zbyt gęstemu upakowaniu sond i utrzymuje je w rozciągniętej konformacji, co sprzyja hybrydyzacji z celem.</li>
	<li>Następnego dnia przemyć chip czujnika dejonizowaną wodą H2O przez 2-3 s i osuszyć strumieniem azotu przez 5 s.</li>
	<li>Nanieść 6 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 1 mM EDTA i 1 mM 6-merkapto-1-heksanolu (MCH) na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników i inkubować przez 50 min. Ta oraz wszystkie kolejne inkubacje chipów są przeprowadzane w przykrytej płytce Petriego w temperaturze pokojowej. MCH działa jako środek blokujący, wypełniając wszelkie luki na powierzchni elektrody, w których nie ma tiolowanej sondy wychwytującej ani HDT.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przenieś 1 ml kultury bakteryjnej w logarytmicznej fazie wzrostu (OD600 ≈ 0.1) do probówki do mikrowirówki i wiruj przy 16,000 x g przez 5 min. Usuń nadsącz kultury. Osad bakteryjny można przetworzyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.</li>
	<li>Dokładnie resuspenduj osad bakteryjny w 10 μl 1 M NaOH, przykładając końcówkę pipety do dna probówki do mikrowirówki i kilkukrotnie pipetując w górę i w dół. Inkubuj zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Zneutralizuj lizat bakteryjny, dodając 50 μl 1 M buforu fosforanowego o pH 7.2, zawierającego 2.5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 0.25 mM modyfikowanej fluoresceiną sondy detekcyjnej. Inkubuj zneutralizowany lizat przez 10 min w temperaturze pokojowej. Modyfikowane fluoresceiną sondy detekcyjne hybrydyzują z docelowymi cząsteczkami bakteryjnego rRNA.</li>
</ol>
3. Analiza za pomocą czujnika elektrochemicznego
<ol>
	<li>Przemyj chip czujnika z MCH odjonizowaną wodą H2O przez 2-3 s i osusz strumieniem azotu przez 5 s.</li>
	<li>Nanieś 4 μl zneutralizowanego lizatu bakteryjnego na elektrodę roboczą każdego z 14 czujników i inkubuj przez 15 min. Kompleksy sonda-detektor hybrydyzują z unieruchomionymi tiolowanymi sondami przechwytującymi.</li>
	<li>Nanieś 4 μl 1 nM oligonukleotydu łączącego w 1 M buforze fosforanowym o pH 7.2, zawierającym 2,5% BSA oraz 0,25 μM modyfikowanej fluoresceiną sondy detekcyjnej, na 2 czujniki kontrolne dodatnie (używane do normalizacji sygnału) i inkubuj przez 15 min.</li>
	<li>Przemyj chip czujnika odjonizowaną wodą H2O przez 2-3 s i osusz strumieniem azotu przez 5 s.</li>
	<li>Nanieś 4 μl 0,5 U/ml przeciwciała anty-Fluoresceina-HRP w 1 M buforze fosforanowym o pH 7.2, zawierającym 0,5% kazeiny, na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników i inkubuj przez 15 min. Przeciwciało anty-Fluoresceina-HRP wiąże się z unieruchomionymi modyfikowanymi fluoresceiną sondami detekcyjnymi.</li>
	<li>Przemyj chip czujnika odjonizowaną wodą H2O przez 2-3 s i osusz strumieniem azotu przez 5 s.</li>
	<li>Naklej naklejkę z dołkami filmowymi na powierzchnię chipu czujnika i zamocuj go w uchwycie do chipów. Pipetuj 50 μl podłoża TMB na wszystkie 16 czujników i zamknij uchwyt do chipów.</li>
	<li>Wykonaj pomiary amperometrii i woltamperometrii cyklicznej dla wszystkich 16 czujników przy użyciu czytnika Helios Chip Reader. Prąd amperometryczny jest proporcjonalny do szybkości redukcji TMB na powierzchni czujnika (patrz Rycina 1).</li>
</ol>

<ol><li>Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+Surface+Monolayers+for+Ultrasensitive+%28Zeptomole%29+Amperometric+Detection+of+Nucleic+Acid+Hybridization+without+Signal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification.</a> Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).</li>
<li>Halford, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+by+Sensitive+Detection+of+Precursor+Ribosomal+RNA+Using+a+Novel+Electrochemical+Biosensing+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).</li>
<li>Campuzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+monolayers+as+DNA+recognition+interfaces+for+direct+and+sensitive+electrochemical+detection+in+untreated+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples.</a> Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).</li>
<li>Gau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+molecular+analysis+without+nucleic+acid+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification.</a> Methods. 37, 73-83 (2005).</li>
<li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Specific+Capture+Enhances+Sensitivity+of+Electrochemical+Detection+of+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).</li>
<li>Mastali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+probe+length+and+target+location+for+electrochemical+detection+of+selected+uropathogens+at+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature.</a> J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).</li>
<li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrochemical+DNA+biosensors+for+rapid+molecular+identification+of+uropathogens+in+clinical+urine+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).</li>
<li>Liao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+electrochemical+DNA+biosensor+for+bacterial+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection.</a> J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).</li>
<li>Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroanalytical+sensors+and+devices+for+multiplexed+detection+of+foodborne+pathogen+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms.</a> Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).</li>
<li>Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+disposable+nucleic+acid+biosensors+for+direct+bioelectronic+detection+in+raw+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples.</a> Talanta. 85, 1330-1337 (2011).</li>
<li>Ecker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibis+T5000%3A+a+universal+biosensor+approach+for+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).</li>
<li>Casalta, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+LightCycler+SeptiFast+test+in+the+rapid+etiologic+diagnostic+of+infectious+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są wynalazcami patentów dotyczących opisanych metod. Jeden z tych patentów został udzielony w licencji firmie Qvella Corporation. B.M.C. oraz D.A.H. posiadają udziały w Qvella Corporation. V.G. jest prezesem firmy GeneFluidics, która jest producentem opisanego w niniejszej pracy układu elektrod czujnika elektrochemicznego, uchwytu na chip oraz czytnika chipów.

Opisany tutaj test z użyciem czujnika elektrochemicznego umożliwia szybką detekcję docelowych kwasów nukleinowych. Czułość i swoistość zależą częściowo od wolnej energii hybrydyzacji celu z sondą, co z kolei zależy od długości i zawartości GC sondy wychwytującej oraz sondy detekcyjnej. Kroki hybrydyzacji wykonujemy zazwyczaj w temperaturze pokojowej (~20 °C) 5, 6. Jednak etapy hybrydyzacji (3.2 i 3.3) można również przeprowadzić w wyższych temperaturach w piecu do hybrydyzacji, pod warunkiem umieszczenia chipa...

Wykorzystanie rRNA jako cząsteczki docelowej do wykrywania i identyfikacji bakterii wiąże się z szeregiem zalet. Obfitość rRNA w komórkach bakteryjnych pozwala na osiągnięcie granicy czułości na poziomie zaledwie 250 bakterii na mililitr bez konieczności amplifikacji celu 1. Bakteryjne rRNA zawiera unikalne, gatunkowo specyficzne sekwencje, które są dostępne dla hybrydyzacji z sondami DNA. W związku z tym można zastosować macierz czujników elektrochemicznych do identyfikacji nieznanych bakterii, w której każdy czujnik jest funkcjonalizowany inną, gatunkowo specyficzną sondą wychwytującą. Należy uwzględnić czujniki kontroli pozytywnej dla syntetycznego oligonukleotydu docelowego, który „mostkuje” sondy wychwytującą i detekcyjną, tworząc wewnętrzny sygnał kalibracyjny.
Czujniki elektrochemiczne znajdują szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych i translacyjnych. Na przykład opisany tutaj test został wykorzystany do precyzyjnego pomiaru wpływu fazy wzrostu E. coli na liczbę kopii rRNA i pre-rRNA, co jest przedmiotem dużego zainteresowania badaczy fizjologii bakterii 2. Czułość testu z użyciem czujnika elektrochemicznego jest określana przez stosunek sygnału do szumu. Zbadano szereg metod wzmacniania sygnału i redukcji szumów. Ustalono, że kluczem do ograniczenia niespecyficznego wiązania sondy detekcyjnej i/lub enzymu HRP jest udoskonalenie chemii powierzchni czujnika. W szczególności stwierdzono, że mieszana monowarstwa alkanoditioli i merkaptokeksanolu redukuje tło, dokładniej pokrywając powierzchnię elektrody, przy jednoczesnym zachowaniu dostępności sondy wychwytującej dla hybrydyzacji z celem 3. Takie zabiegi w zakresie chemii powierzchni są szczególnie istotne w przypadku testów z wykorzystaniem złożonych próbek biologicznych.

<table><tbody><tr><td>6-merkapto-1-heksanol (MCH)</td><td>Sigma</td><td>451088</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>1,6-heksanoditiol (HDT)</td><td>Sigma</td><td>H-12005</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Tiolowane sondy wychwytujące</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>Przechowywać w stężeniu 100 &amp;mu;M w 0,1x TE w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sondy detekcyjne modyfikowane fluoresceiną</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>Przechowywać w stężeniu 100 &amp;mu;M w 0,1x TE w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Łączący oligonukleotyd</td><td>Operon</td><td>N/A</td><td>Przechowywać w stężeniu 100 &amp;mu;M w 0,1x TE w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fluoresceina-HRP, fragmenty Fab</td><td>Roche</td><td>11 426 346 910</td><td>Przechowywać w 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Czytnik chipów Helios</td><td>GeneFluidics</td><td>GFR-2009</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt chipa sensorowego</td><td>GeneFluidics</td><td>GFR-003</td><td></td></tr><tr><td>Naklejka na dołki filmu</td><td>GeneFluidics</td><td></td><td>Dostarczana z chipami sensorowymi</td></tr><tr><td>Chipy z macierzą 16 sensorów ze złota</td><td>GeneFluidics</td><td>SC1000-16X-B</td><td>Przechowywać w 100% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Seryjowa albumina wołowa (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Przechowywać w 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1M bufor fosforanowy, pH 7,2</td><td></td><td></td><td>0,35M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,65M K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, doprowadzone do pH 7,2</td></tr><tr><td>Kazeina blokująca w PBS</td><td>Pierce</td><td>37528</td><td>Rozcieńczyć równą objętością 1M buforu fosforanowego o pH 7,2, przechowywać w 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. Odczynniki i sprzęt.&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Czujniki elektrochemiczne są szeroko stosowane do szybkiego i dokładnego pomiaru poziomu glukozy we krwi i mogą być adaptowane do wykrywania szerokiej gamy analitów. Czujniki elektrochemiczne działają poprzez przekształcanie biologicznego zdarzenia rozpoznawczego w użyteczny sygnał elektryczny. Przetwarzanie sygnału odbywa się poprzez sprzęgnięcie aktywności enzymu redoks z elektrodą amperometryczną. Specyficzność czujnika jest albo cechą wrodzoną enzymu – w przypadku czujnika glukozy jest to oksydaza glukozowa – albo wynikiem powiązania enzymu z przeciwciałem lub sondą.
W niniejszej pracy opisujemy metodę testu z wykorzystaniem sensora elektrochemicznego do bezpośredniej detekcji i identyfikacji bakterii. We wszystkich opisanych przypadkach sondami są oligonukleotydy DNA. Metoda ta opiera się na hybrydyzacji typu kanapkowego sond wychwytującej i detekcyjnej z docelowym rybosomalnym RNA (rRNA). Sonda wychwytująca jest zakotwiczona na powierzchni sensora, natomiast sonda detekcyjna jest połączona z peroksydazą chrzanową (HRP). Po dodaniu substratu, takiego jak 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB), do elektrody z przywiązanymi do jej powierzchni kompleksami sonda wychwytująca-cel-sonda detekcyjna, substrat ulega utlenieniu przez HRP i redukcji przez elektrodę roboczą. Ten cykl redoks prowadzi do transportu elektronów przez substrat z elektrody do HRP, co generuje przepływ prądu w elektrodzie.

Opisujemy test elektrochemiczny, który jest skonstruowany podobnie do testu ELISA typu kanapkowego. Jak pokazano na Rysunku 1, hybrydyzacja docelowego rybosomalnego RNA (rRNA) z sondami wychwytującymi i detekcyjnymi jest wykrywana poprzez reakcję redoks katalizowaną przez HRP skoniugowany z fragmentami przeciwciał antyfluoresceinowych, które wiążą się z łącznikiem fluoresceiny na końcu 3' sondy detekcyjnej. Ważnym elementem czułości testu jest chemia powierzchni elektrody złotej. Stwierdziliśmy, że trójs...

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Czujniki elektrochemiczne są powszechnie stosowane do szybkiego i dokładnego pomiaru poziomu glukozy we krwi i mogą zostać przystosowane do detekcji szerokiej gamy...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykrywanie i identyfikacja bakterii przy użyciu czujników elektrochemicznych. Osiąga się to poprzez najpierw uwalnianie rybosomalnego RNA z bakterii w celu umożliwienia hybrydyzacji z fluorowaną sondą detekcyjną, a w drugim kroku dodanie do elektrody roboczej rybosomalnego RNA związanego z sondą detekcyjną, co pozwala na hybrydyzację z sondą wychwytującą na powierzchni czujnika. Następnie umożliwia się związanie koniugatu przeciwciała antyfluoresceina-peroksydaza chrzanowa z fluorowaną sondą detekcyjną.Wreszcie, można uzyskać prąd interferometryczny, którego natężenie jest skorelowane z liczbą kompleksów sondy wychwytującej, rybosomalnego RNA i sondy detekcyjnej na powierzchni czujnika. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami opartymi na hodowlach jest możliwość wykrycia i identyfikacji bakterii w około 45 minut, co pozwala uniknąć oczekiwania przez całą noc, aż bakteria utworzy widoczną kolonię na płytce EDGAR. Zastosowanie tej techniki mogłoby usprawnić leczenie chorób zakaźnych.Wczesne wykrywanie patogenów bakteryjnych jest niezbędne dla celowanej terapii antybiotykowej i poprawy wyników klinicznych. Choć metoda ta jest przydatna w diagnostyce chorób zakaźnych, może ona zostać zastosowana również w innych problemach diagnostycznych, takich jak immunodiagnostyka. Należy rozpocząć od inkubacji rozcieńczonej sondy wychwytującej z heksanoditiolem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić redukcję grupy tiolowej na sondzie wychwytującej, co pozwoli na uzyskanie bardziej spójnych wyników.Po inkubacji skieruj strumień azotu na chipy z matrycą 16 czujników złota przez pięć sekund, aby usunąć wilgoć lub zanieczyszczenia stałe. Małe objętości cieczy należy ostrożnie nanosić na elektrodę roboczą w matrycy czujników. Kluczowa jest wizualna prezentacja tej techniki.Prawidłowe wykonanie technik pipetowania, płukania i suszenia znacznie redukuje zmienność między poszczególnymi chipami. Następnie nanieś 6 µL mieszaniny rozcieńczonej sondy wychwytującej HDT na elektrodę roboczą każdego z 16 sensorów w macierzy sensorowej i przechowuj chipy sensoryczne w przykrytej płytce Petri w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia przemyj chipy sensoryczne wodą dejonizowaną przez 2–3 s, a następnie osusz chipy strumieniem azotu przez 5 s. Teraz nanieś 6 µL roztworu chlorku attri, chlorku sodu, EDTA i mercaptoetanolu na elektrodę roboczą każdego z 16 sensorów i inkubuj sensory przez 50 min w płytce Petri w temperaturze pokojowej.W celu przygotowania próbek do analizy za pomocą czujnika elektrochemicznego, przenieś 1 mL kultury bakterii w logarytmicznej fazie wzrostu do probówki do mikrocentryfugi, a następnie wiruj komórki przez 5 minut przy 16 000 g. Należy pamiętać, że bakterie patogenne powinny być przetwarzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologicznym).Po usunięciu snatu, nanieś za pomocą końcówki pipety 10 µL 1 M wodorotlenku sodu na dno probówki do mikrocentryfugi i pipetuj w górę i w dół kilka razy, aby dokładnie resuspendować osad. Po inkubowaniu zawiesiny w temperaturze pokojowej przez pięć minut, dodaj 50 µL PBS zawierającego albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz modyfikowaną fluoresceiną sondę detekcyjną, aby zneutralizować lizat bakteryjny. Następnie inkubuj zneutralizowany lizat przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Krok ten należy rozpocząć od przemycia jednego z przygotowanych chipów sensorycznych wodą dejonizowaną, aby usunąć roztwór merkaptoetanolu, przez dwie do trzech sekund. Po wysuszeniu chipu w sposób przed chwilą zademonstrowany, należy nanieść 4 µL zneutralizowanego lizatu bakterii na elektrody robocze 14 sensorów.Następnie nanieś 4 µL oligonukleotydu mostkującego w PBS z dodatkiem BSA oraz fluoresceinowo zmodyfikowanej sondy detekcyjnej na dwa sensory kontrolne dodatnie. Po inkubacji lizatu oraz sensorów kontrolnych dodatnich przez 15 minut, przemyj, a następnie wysusz cały chip sensoryczny w sposób opisany wcześniej. Teraz nanieś 4 µL antyfluoresceiny z peroksydazą chrzanową (HRP) w PBS zawierającym kazeinę na elektrody robocze wszystkich 16 sensorów.Po 15-minutowej inkubacji należy przemyć i osuszyć chip sensoryczny. Następnie na powierzchnię chipa nałóż naklejkę do tworzenia studzienek, a chip umieść w uchwycie. Napełnij wszystkie 16 sensorów 50 µL substratu TMB i zamknij uchwyt chipa. Na koniec użyj czytnika chipów Helios, aby uzyskać pomiary pyrometryczne i telemetrię cykliczną dla wszystkich 16 sensorów.Opisany powyżej test elektrochemiczny jest skonstruowany podobnie do testu typu kanapkowego ELISA, jak pokazano na tej ilustracji; hybrydyzacja docelowego rybosomalnego RNA z sondami wychwytującymi i detekcyjnymi jest wykrywana poprzez reakcję redoks katalizowaną przez HRP sprzężone z fragmentami przeciwciał antyfluoresceinowych, które wiążą łącznik fluoresceiny w pozycji 3' sondy detekcyjnej. Ważnym elementem czułości testu jest chemia powierzchni elektrody złotej. Elektroda złota jest pokryta merkaptoetanolem i hinolem, a następnie funkcjonalizowana poprzez dodanie rozcieńczonych sond wychwytujących.Hybrydyzacja typu „sandwich” docelowego rybosomalnego RNA z sondą wychwytującą oraz znakowaną fluoresceiną sondą detekcyjną prowadzi do powstania kompleksu, który jest wykrywany poprzez dodanie koniugatu peroksydazy chrzanowej przeciw fluoresceinie oraz substratu TMB. Prąd parametryczny M jest generowany przez cykl redoks wynikający z utleniania TMB przez peroksydazę chrzanową oraz redukcji TMB przez elektrony z elektrody. Przedstawione tutaj analizy wykorzystują matrycę czujników Gene Fluidic 16.Każdy z czujników w macierzy zawiera trzy elektrody: roboczą, odniesienia i pomocniczą, które posiadają punkty kontaktowe na krawędzi chipa. Czytnik chipa posiada piny pogo, które łączą się z każdym z punktów kontaktowych. Czytnik chipa służy jako interfejs dla macierzy czujników z potencjometrem sterowanym przez algorytm komputerowy.Poniżej przedstawiono przykłady przepływu prądu w czujniku elektrochemicznym. Przepływ prądu w czujnikach jest sztucznie wysoki podczas pierwszych kilku sekund po rozpoczęciu pomiarów parametrycznych. Ze względu na akumulację utlenionego substratu w czasie od aplikacji TMB na powierzchnię czujnika do uruchomienia algorytmu odczytu, przepływ prądu szybko osiąga stan stacjonarny, a dokładne odczyty z czujnika można niezawodnie uzyskać w ciągu 60 sekund.Zmienność między sensorami jest stosunkowo stała, dzięki czemu możliwe jest równoległe przeprowadzenie 16 różnych analiz sensorycznych na macierzy 16 sensorów Gene Fluidic. Niezbędne jest zastosowanie kontroli dodatniej i ujemnej. W tym celu wykorzystuje się syntetyczny mostkowy oligonukleotyd DNA, który hybrydyzuje zarówno z sondą wychwytującą, jak i detekcyjną, służąc jako syntetyczny cel o znanym stężeniu. Wyniki uzyskane przy użyciu oligonukleotydu mostkowego pełnią funkcję wewnętrznej kontroli kalibracyjnej, aby zminimalizować różnice między poszczególnymi chipami.Im większy ujemny prąd elektrody, tym wyższy sygnał. Podczas testowania sond przechwytujących i detekcyjnych granica wykrywalności powinna być określona poprzez seryjne rozcieńczanie próbki o znanym stężeniu; jak pokazano na tej ilustracji, w zakresie dynamicznym analizy występuje liniowa korelacja log-log między stężeniem próbki a sygnałem wyjściowym.Na tych wykresach słupkowych przedstawiono reprezentatywne wyniki dla próbek zawierających Escherichia coli, Klebsiella spp. oraz amoniak, które często występują w moczu pacjentów z zakażeniami dróg moczowych. Sygnały dla większości czujników będą niskie i zbliżone, a te negatywne wyniki można połączyć jako sygnał tła. Reaktywność z parą sond KE odróżnia Klebsiella od Escherichia coli. Oligonukleotyd mostkujący służy jako kontrola pozytywna i wewnętrzny standard kalibracyjny. Technikę tę można zastosować do wykrywania bakterii opornych na antybiotyki w próbkach klinicznych poprzez pomiar odpowiedzi fenotypowej bakterii na antybiotyki.Technikę tę można wykorzystać do wyznaczenia optymalnej terapii dla poszczególnych pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykrywania i identyfikacji bakterii poprzez porównywanie prądów w różnych czujnikach specyficznych dla gatunków w chipie.

bacterial-detection-identification-using-electrochemical-sensors

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wykrywanie bakterii i identyfikacja za pomocą elektrochemicznych czujników

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Źródło: Barber, A. E., et al. Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje wykrywanie określonych analitów za pomocą biosensora bakteryjnego. Pobiera się kulturę bakteryjną zawierającą plazmid z genem białka czerwonej fluorescencji (RFP) pod promotorem wrażliwym na analit. Po dokładnym wytarciu powierzchni testowej niewielką część chusteczki zanurza się w kulturze i...

Wykrywanie docelowego analitu za pomocą biosensora bakteryjnego

Ten film demonstruje technikę wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych w próbkach żywności i wody za pomocą nanosensorów. Docelowe bakterie chorobotwórcze są wykrywane poprzez połączenie modalności relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Wykrywanie skażenia bakteryjnego za pomocą nanoczujników magnetofluorescencyjnych

Wprowadzono bezetykietowy optyczny biosensor do szybkiego wykrywania bakterii. Bioczujnik oparty jest na nanostrukturalnym porowatym krzemie, który został zaprojektowany tak, aby bezpośrednio wychwytywać docelowe komórki bakteryjne na swojej powierzchni. Używamy przeciwciał monoklonalnych, unieruchomionych na porowatym przetworniku, jako sond wychwytujących. Nasze badania pokazują możliwość zastosowania tych bioczujników do wykrywania niskich stężeń bakterii w ciągu kilku minut bez...

Optyczne wykrywanie bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych

W tej pracy opisujemy nową metodę badania interakcji białko-białko za pomocą konduktometrycznego biosensora opartego na technologii hybrydowej β-laktamazy. Metoda ta polega na uwalnianiu protonów w wyniku hydrolizy β-laktamów.

Zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i kwantyfikacji nisko obfitych cząsteczek w złożonych roztworach za pomocą imprintingu molekularnego w połączeniu z biosensorem pojemnościowym.

Ultraczułe wykrywanie biomarkerów za pomocą biosensora pojemnościowego opartego na imprintingu molekularnym

Protokół jest prezentowany przy użyciu technik biologii syntetycznej do syntezy zestawu biosensorów bakteryjnych do analizy pozostałości po postrzałach oraz do testowania działania urządzeń pod kątem ich zamierzonego zastosowania za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej.

Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej

Poznaj metodę wykrywania bakterii za pomocą czujników elektrochemicznych opartą na hybrydyzacji rybosomalnego RNA. Ta technika umożliwia identyfikację drobnoustrojów w zaledwie 45 minut, znacznie skracając czas diagnostyki zakażeń.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Przeglądaj więcej filmów