Wykrywanie i identyfikacja bakterii za pomocą czujników elektrochemicznych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie i identyfikacja bakterii za pomocą czujników elektrochemicznych. Osiąga się to poprzez pierwsze uwolnienie rybosomalnego RNA z bakterii, aby umożliwić hybrydyzację z fluorowaną sondą detektora W drugim kroku rybosomalny RNA związany z sondą detektora jest dodawany do elektrody roboczej, co umożliwia hybrydyzację z sondą wychwytującą na powierzchni czujnika. Następnie koniugat peroksydazy chrzanowej anty fluoresceiny może związać się z sondą detektora fluorowanego.

Wreszcie, w prądzie interferometrycznym, którego natężenie jest skorelowane z liczbą rybosomalnych sond wychwytujących, można uzyskać kompleksy sondy detektora RNA na powierzchni czujnika. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami opartymi na hodowlach jest to, że bakterie można wykryć i zidentyfikować w ciągu około 45 minut, unikając wagi w ciągu nocy. Aby bakteria mogła utworzyć widoczną kolonię na płytce EDGAR, zastosowanie tej techniki poprawiłoby zarządzanie chorobami zakaźnymi.

Ponieważ wczesne wykrycie patogenów bakteryjnych ma zasadnicze znaczenie dla celowanej antybiotykoterapii i poprawy wyników klinicznych. Chociaż metoda ta jest przydatna w diagnostyce chorób zakaźnych, które można również zastosować do innych problemów diagnostycznych, takich jak immunodiagnostyka. Rozpocznij od inkubacji rozszerzonej sondy wychwytującej z heksanem di tiolem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że grupa tiolowa na sondzie wychwytującej zostanie zmniejszona, co spowoduje uzyskanie bardziej spójnych wyników.

Po inkubacji nanieś strumień azotu, aby zrodzić złoto. 16 chipów matrycy czujników przez pięć sekund, aby usunąć wilgoć lub cząstki, Małe objętości cieczy należy ostrożnie nanieść na elektrodę roboczą w układzie czujników. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie.

Prawidłowe wykonywanie technik pipetowania, mycia i suszenia znacznie zmniejsza zmienność między wiórami. Następnie nałóż sześć mikrolitrów mieszanki sondy wychwytującej HDT na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników układu czujników i przechowuj chipy czujnika na przykrytej szalce Petriego w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego dnia, umyj chipy czujnika wodą dejonizowaną przez dwie do trzech sekund, a następnie wysusz wióry pod strumieniem azotu przez pięć sekund. Teraz nałóż sześć mikrolitrów chlorowodorku sodu attri, roztworu EDTA MERCAPTOETHANOL na elektrodę roboczą wszystkich 16 czujników i inkubuj czujniki przez 50 minut na szalce Petriego w temperaturze pokojowej.

Przygotowanie próbek do testu z użyciem czujnika elektrochemicznego. Przenieś jeden mililitr kultury bakteryjnej w logarytmicznej fazie wzrostu do mikroprobówki wirówkowej, a następnie odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 16 000 g. Należy pamiętać, że z bakteriami chorobotwórczymi należy obchodzić się w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.

Po usunięciu szlafroku przyłożyć końcówkę pipety zawierającą 10 mikrolitrów jednego molowego wodorotlenku sodu na dno probówki mikrowirówki i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby dokładnie zawiesić osad. Po inkubacji zawiesiny w temperaturze pokojowej przez pięć minut, dodać 50 mikrolitrów PBS zawierającego albuminę surowicy bydlęcej lub BSA i sondę detektora zmodyfikowaną fluoresceiną w celu zneutralizowania lizatu bakteryjnego. Następnie inkubować zobojętniony lizat przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Rozpocznij ten krok od przemycia roztworu merkaptoetanolu z jednego z przygotowanych chipów czujnika wodą dejonizowaną przez dwie do trzech sekund. Po wysuszeniu chipa, jak właśnie pokazano, nałóż cztery mikrolitry zneutralizowanego lizatu bakteryjnego na elektrody robocze. 14 czujników.

Następnie nałóż cztery mikrolitry mostkującego oligonukleotydu w sondzie detektora zmodyfikowanego PBS plus BSA plus fluoresceina do dwóch czujników kontroli pozytywnej. Następnie po inkubacji czujników lizatu i kontroli pozytywnej przez 15 minut, umyj, a następnie wysusz cały chip czujnika jak poprzednio. Teraz nałóż cztery mikrolitry antyfluoresceiny, peroksydazy chrzanowej lub HRP w PBS zawierającej kazeinę na elektrody robocze wszystkich 16 czujników.

Po 15 minutach inkubacji umyj i wysusz chip czujnika. Następnie nałóż naklejkę z folią na powierzchnię chipa czujnika i załaduj chip do mocowania chipa czujnika, pipetuj 50 mikrolitrów podłoża TMB na wszystkie 16 czujników i zamknij mocowanie chipa czujnika. Na koniec użyj czytnika chipów Helios, aby uzyskać pirometrię i cykliczne pomiary telemetryczne dla wszystkich 16 czujników.

Właśnie opisany test elektrochemiczny ma strukturę podobną do kanapki, Eliza, jak pokazano na tym rysunku docelowa rybosomalna hybrydyzacja RNA z sondami wychwytującymi i detektorowymi jest rozwijana przez reakcję redoks katalizowaną przez HRP sprzężoną z fragmentami przeciwciała anty fluoresceinowego, które wiążą trzy wiązania fluoresceiny sosny na sondzie detektora. Ważnym elementem czułości testu jest skład chemiczny powierzchni złotej elektrody. Złota elektroda jest pokryta merkaptoetanolem i hinem i jest funkcjonalizowana przez dodanie rozszerzonych sond wychwytujących.

Hybrydyzacja warstwowa docelowego rybosomalnego RNA z sondą wychwytującą i sondą detektorową znakowaną fluoresceiną daje kompleks, który jest wykrywany przez dodanie koniugatu peroksydazy chrzanowej anty fluoresceiny i substratu TMB. Prąd parametryczny M jest generowany przez cykl redoks, który wynika z utleniania TMB przez peroksydazę chrzanową i redukcji TMB przez elektrony z elektrody. Zademonstrowane tutaj testy wykorzystują układ matrycy czujników Gene Fluidic 16.

Każdy z czujników w matrycy zawiera trzy elektrody, roboczą referencyjną i pomocniczą, które mają punkty styku na krawędzi chipa. Czytnik chipów posiada piny pogo, które łączą się z każdym z punktów styku. Czytnik chipów służy jako interfejs dla układu czujników z potencjometrem sterowanym algorytmem komputerowym.

W tym miejscu przedstawiono przykłady przepływu prądu przez czujnik elektrochemiczny. Przepływ prądu w czujnikach jest sztucznie zawyżony w czujnikach w ciągu pierwszych kilku sekund po rozpoczęciu pomiarów parametrycznych. Ze względu na akumulację utlenionego podłoża w czasie od nałożenia TMB na powierzchnię czujnika do zainicjowania algorytmu czytnika, przepływ prądu szybko osiąga stan ustalony, a dokładne odczyty czujnika można niezawodnie uzyskać w ciągu 60 sekund.

Zmienność między czujnikami jest względnie stała, więc możliwe jest równoległe wykonywanie 16 różnych testów czujników na chipie układu czujników gene fluidic 16 Kontrole dodatnie i ujemne są niezbędne jako kontrola pozytywna. W ten sposób stosuje się syntetyczny oligonukleotyd mostkujący DNA, który hybrydyzuje zarówno z sondą wychwytującą, jak i detektorową i służy jako syntetyczny cel o znanym stężeniu. Wyniki uzyskano przy użyciu funkcji oligonukleotydów mostkujących jako wewnętrznej kontroli kalibracji w celu zminimalizowania różnic między układami.

Im większy ujemny prąd elektrody, tym wyższy sygnał. Podczas testowania sond przechwytujących i detektorowych. Granicę wykrywalności należy określić poprzez seryjne rozcieńczanie próbki o znanym stężeniu, jak pokazano na tym rysunku, istnieje liniowa korelacja logarytmiczna między stężeniem próbki a sygnałem wyjściowym w zakresie dynamicznym testu.

Na tych wykresach słupkowych reprezentatywne wyniki dla próbek zawierających esia coli i kleb seal oraz amoniak, które często znajdują się w moczu pacjentów z infekcją dróg moczowych, pokazują, że sygnały dla większości czujników będą niskie i podobne, a te negatywne wyniki można zsumować, ponieważ reaktywność sygnału tła z parą sond KE odróżnia kanon od e. coli. Oligonukleotyd mostkowy służy jako kontrola pozytywna i wzorzec kalibracji wewnętrznej. Technika ta może być stosowana do wykrywania bakterii opornych na antybiotyki w próbkach klinicznych Mierząc fenotypową odpowiedź bakterii na antybiotyki.

Technika ta może być wykorzystana do określenia optymalnej terapii dla indywidualnego pacjenta. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać i identyfikować bakterie, porównując prądy atryczne w różnych czujnikach specyficznych dla gatunku w chipie.